DE19935766A1

DE19935766A1 - Verfahren zur optischen Anregung von Fluorophor-markierter DNA und RNA

Info

Publication number: DE19935766A1
Application number: DE19935766A
Authority: DE
Inventors: Karsten Koenig; Karl-Juergen Halbhuber; Peter Fischer; Iris Riemann
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2001-02-01
Also published as: WO2001009591A9; JP2003506677A; US6528802B1; EP1117985A1; WO2001009591A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Anregung von Fluorophor-markierter DNA und von Fluorophor-markierter RNA, insbesondere von durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) markierten, spezifischen Lokalisationen der DNA und RNA. DOLLAR A Mit dem Verfahren soll mit geringem Aufwand eine kontrastreiche simultane Anregung von mehreren zu detektierenden und dreidimensional darstellbaren FISH-Fluorophoren unterschiedlicher Fluoreszenzcharakteristik ermöglicht werden. Die Anregung und Detektion der Fluorophore soll dabei in einer Tiefe des bilogischen Materials von mehr als 100 Mikrometern gewährleistet sein. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden die FISH-Fluorophore und DNA-Marker mit einer Multiphotonen-Anregung simultan durch gepulste oder ungepulste Strahlung einer einzigen Wellenlänge im Bereich von 700 nm bis 1000 nm, vorzugsweise zwischen 760 nm und 820 nm, zur Fluoreszenz angeregt. Insgesamt wurden 20 auf dem Markt befindliche FISH-Fluorophore und DNA-Marker getestet. Der Nachweis von simultan Multiphotonen-angeregten Fluorophoren gelang in allen untersuchten Fällen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Anregung von Fluorophor markierter DNA und von Fluorophor-markierter RNA, insbesondere von durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) markierten, spezifischen Lokalisationen der DNA und RNA. Das Verfahren eignet sich für die Anregung und räumlich-aufgelöste Detektion von FISH-markierten chromosomalen Strukturen und ermöglicht die simultane Anregung mehrerer Fluorophore. Die Methode empfiehlt sich daher für eine Multi-Gen- Detektion.

Es sind bereits Verfahren bekannt, Fluorophor-markierte DNA und RNA mittels optischer Strahlung von nichtkohärenten Lichtquellen (Lampen) oder von kohärenten Lichtquellen (Lasern) anzuregen und die Fluoreszenz mit geeigneten Detektoren zweidimensional oder auch dreidimensional zu detektieren: (beispielsweise US 5 792 610, US 5 759 781, DE 196 22 904, DE 42 16 949, Science 273 (1996), 430 und 494, Nature Genet. 12 (1996), 368, Hum. Mol. Genet. 2 (1993), 505, Cytometry 10(1989), 20 und 11 (1990), 126, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89 (1992), 1388). Die Markierung erfolgt einerseits mit unspezifischen DNA Markern, z. B. DAPI (4,6-diamidino-2- phenylindole hydrochlorid) und Hoechst 33342, andererseits durch spezifisch bindende Flurophore, die sowohl eine Detektion von kleinen Gen- und Chromosomenbereichen als auch von ganzen, speziellen Chromosomen ermöglichen. Die Kopplung des Fluorophors an die gewünschte DNA-Region erfolgt durch die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH).

Eine weitreichende Anwendung der FISH-Technik ist durch die Verwendung von mehreren Fluorophoren mit unterschiedlichem Emissionsverhalten für die Lokalisation spezifischer DNA-Bereiche gegeben, die so eine Multi-Gen- Detektion durch den "Multi-Color-Nachweis" ermöglichen. Diese spezielle Technik wird Multiplex-FISH, M-FISH oder auch Multi-Color-FISH genannt. Typischerweise werden für die Anregung der verschiedenen Fluorophore verschiedene Anregungswellenlängen eingesetzt. Diese werden entweder durch mehrere unterschiedliche Lichtquellen oder durch Lichtquellen mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen bereit gestellt. Letztere Emissionen werden z. B. durch Filterräder zeitlich versetzt (nicht-simultan) oder durch Spezialfilter mit Transmission für mehrere Anregungswellenlängen (z. B. Dan Pinkel Filter) oder einen Multi-Line-Output eines Lasers (z. B. US-Patent 5,127,730) gleichzeitig (simultan) bereitgestellt. Zum Beispiel wird bei einer zytogenetischen Untersuchung von humanen Chromosomen oft die UV- Emission einer Lichtquelle, z. B. einer Quecksilber- oder Xenonhochdruck lampe, für die Fluoreszenzanregung eines unspezifischen DNA-Markers (auch als counterstain bezeichnet) eingesetzt, sowie eine blaue Emission der Lichtquelle für die Anregung eines FISH-Fluorophors mit Fluoreszenz im grünen Bereich und die Grünemission der Lichtquelle für eine Anregung eines FISH-Fluorophors mit Fluoreszenz im roten Bereich. Eine drei dimensionale Darstellung (3D) mit hoher räumlicher Auflösung ist mit diesen nichtkohärenten Anregungsquellen nicht möglich.

Die Nutzung unterschiedlicher Anregungswellenlängen verursacht erhebliche Probleme infolge chromatischer Abberation der Optik (unterschiedliche Fokuslängen), der Notwendigkeit von UV-Optiken und durch die aufwendige Separation von Anregungs- und Fluoreszenzphotonen im Fall der simultanen Anregung. Bei einer nichtsimultanen Anregung bestehen Probleme bei der Strahljustierung und infolge aufwendiger Schaltvorrichtungen, z. B. beim Betrieb von schaltbaren Filterrädern.

Alle bekannten derartigen Verfahren zur optischen Anregung und Detektion von durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) markierten, spezifischen Lokalisationen der DNA und RNA beruhen auf einer linearen Anregung bzw. einer Einphotonen-Anregung. Bei einer Einphotonen-Anregung wird die Fluoreszenz durch Photonen induziert, die über eine ausreichende Photonenenergie verfügen, um den Fluorophor in einen energiereichen elektronischen Zustand zu überführen. Fluoreszenz erfolgt infolge des strahlenden Übergangs in den Grundzustand des Fluorophors. Bei der Einphotonen-Anregung ist die Anregungswellenlänge stets kleiner als die Fluoreszenzwellenlänge. Eine Fluoreszenzanregung erfolgt innerhalb des gesamten von der Fluoreszenzanregungsstrahlung getroffenen Probenberei ches. Auch außerhalb des Fokusvolumens kommt es dadurch zu Proben- und Fluorophorzerstörungen. Um eine hochauflösende 3D-Fluoreszenzdarstellung von FISH-Fluorophoren zu erhalten, wurden bislang konfokale Laser scanningmikroskope eingesetzt, die durch die Verwendung von Lochblenden die Detektion des Fluoreszenzsignals aus verschiedenen Probentiefen ermöglichen. Auch hier besteht das Problem der Proben- und Fluorophor zerstörung außerhalb der Detektionsebene durch das große Anregungs volumen. Dreidimensional aufgelöste M-FISH-Technik ist mit dem konven tionellen konfokalen Laserscanningmikroskop nicht oder nur sehr einge schränkt möglich, da in der Regel nur sehr wenige Anregungswellenlängen zur Verfügung stehen. Typischerweise werden 3D-Aufnahmen mit den blaugrünen Anregungswellenlängen des Argonionenlasers bei 488 nm und 514 nm sowie mit den Wellenlängen 536 nm und 633 nm des He-Ne-Lasers durchgeführt. Üblicherweise verfügen derartige Laserscanning-Mikroskope nicht über eine zusätzliche UV-Lichtquelle für die 3D Anregung der unspezifischen DNA-Marker Hoechst und DAPI.

Nachteile der bisherigen M-FISH-Verfahren, die auf Einphotonen-Anregun gen basieren, sind somit

1. die Verwendung von mehreren Anregungswellenlängen, einschließlich ultravioletter Strahlung mehrerer Lichtquellen oder Multilinien/Multiban den-Output einer Lichtquelle bei simultaner oder nichtsimultaner Fluorophor-Anregung und damit verbundener Probleme durch chroma tische Abberation,
2. die fehlende oder stark eingeschränkte Möglichkeit der 3D Darstellung hoher räumlicher Auflösung,
3. das Auftreten erheblicher Filterprobleme, insbesondere bei der simultanen Anregung von mehreren Fluorophoren mit verschiedenen Anregungs wellenlängen,
4. die geringe Eindringtiefe der Fluorophor-Anregungsstrahlung, insbeson dere der UV-Strahlung
5. das große Anregungsvolumen und die damit auftretenden Prozesse der weiträumigen Fluorophor-Zerstörung durch Photobleaching und Photo destruktion sowie der möglichen weiträumigen Zerstörung des biolo gischen Präparates und
6. die Untergrundfluoreszenz und damit verbundenen erheblichen Kontrast problemen.

Darüber hinaus ist an sich eine Multiphotonenanregung bekannt, die bereits 1931 durch Göppert-Meyer (Ann. Phys. 9(1931)273) vorausgesagt und 1961 erstmals realisiert wurde. Für Multiphotonen-Anregungen biologischer Proben wird bevorzugt Strahlung im Nahen Infaroten (MR) Spektralbereich verwendet, da dort nur wenige effiziente zelleigene Absorber vorhanden sind und so thermische oder photochemische Schädigungen durch lineare Absorption nahezu ausgeschlossen werden können.

Multiphotonenanregungen mit NIR-Anregungsstrahlung erfordern typischer weise Lichtintensitäten von mehr als 100 MW/cm². Derartige hohe Intensitäten können mittels kontinuierlich emittierendem (cw) Laser oder gepulstem Laser bevorzugt im Pikosekundenbereich und Femtosekunden bereich moderater Laserleistung durch hohe Fokussierung, z. B. durch beugungsbegrenzte Fokussierung mit Objektiven hoher numerischer Apertur, erzielt werden (z. B. Science 248 (1990), 73-76; Nature 377 (1995), 20-21; J. Microsc. 1 (1998), 28). Im Patent US 5.034.613 bzw. in der Zeitschrift Science 248 (1990), 73-76 wird ein Zweiphotonenmikroskop zur Fluores zenzdetektion und zur photoinduzierten Stofffreisetzung vorgestellt, bei dem Laser mit Pulsbreiten im Subpikosekundenbereich zum Einsatz kommen. Mit Multiphotonen-Mikroskopen wurde z. B. die nichtlineare Anregung der DNA-Fluoreszenzfarbstoffe DAPI und Hoechst demonstriert (Gryczynski et al. Bioimaging 4 (1996), 138-148). Eine Anwendung der Multiphotonen- Anregung zur Untersuchung von FISH-Fluorophoren und zur Realisierung einer Multiplex-FISH-Darstellung ist jedoch nicht bekannt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren anzugeben, welches mit geringerem Aufwand eine kontrastreiche simultane Anregung von mehreren zu detektierenden und dreidimensional darstellbaren FISH- Fluorophoren unterschiedlicher Fluoreszenzcharakteristik ermöglicht sowie die Anregung und Detektion der Fluorophore in einer Tiefe des biologischen Materials von mehr als 100 Mikrometern gewährleistet und welches die oben aufgeführten Nachteile bisheriger Verfahren nicht aufweist.

Erfindungsgemäß werden die FISH-Fluorophore und die unspezifischen DNA-Marker mit Anregungsstrahlen nur einer Wellenlänge im Bereich von 700 nm bis 1000 nm angeregt, wobei die Strahlung sowohl ungepulst als auch gepulst vorliegen kann und die Lichtintensität in einem räumlich eng begrenzten Volumen mehr als 100 MW/cm² beträgt.

Überraschend wurde festgestellt, daß eine Vielzahl herkömmlicher FISH- Fluorophore und unspezifischer DNA-Marker auch durch intensitätsreiche nahe infrarote Laserstrahlung einer einzigen geeigneten Wellenlänge simultan angeregt werden kann, obwohl im Einphotonen-Anregungsspektrum keine Absorptionsbanden bei der Anregungswellenlänge und erhebliche Unter schiede im Absorptionsverhalten der einzelnen Fluorophore mit unterschied lichen Absorptionsbanden im ultravioletten und sichtbaren Bereich auftreten. So zeigte es sich, daß mit gepulster Laserstrahlung einer Wellenlänge von 770 nm, einer Pulsdauer von 200 fs, einer Pulsfolgefrequenz von 76 MHz und einer Lichtintensität von etwa 500 GW/cm² zwanzig kommerziell erhältliche FISH-Fluorophore und unspezifische DNA-Marker effizient und kontrastreich sowie mit der Möglichkeit einer dreidimensionalen Darstellung zur Fluoreszenz angeregt werden konnten. Das Fluoreszenzmaximum variierte dabei in einem Bereich von 480 nm bis 650 nm und lag damit mindestens 150 nm von der Anregungswellenlänge entfernt. Die Separation von Anregungsphotonen und Fluoreszenzphotonen bereitete daher keine Probleme und wurde durch die Verwendung eines einfachen Kurzpaßfilters, der z. B. nur Strahlung kleiner 700 nm transmittiert, realisiert. Die Fluorophore waren dabei an humane Chromosomen gebunden.

Die Lichtanregung mit dem intensiven Laserstrahl im nahen Infrarotbereich basiert im Gegensatz zu konventionellen FISH-Verfahren auf einer Multi photonen-Anregegung, bei der zwei Photonen (Zweiphotonen-Anregung) oder drei Photonen (Dreiphotonen-Anregung) simultan absorbiert werden und jedes Photon nur einen Bruchteil der notwendigen Energie für einen Übergang in den angeregten elektronischen Zustand bereitstellt (vgl. Fig. 1).

Eine derartige Multiphotonen-Anregung, bei der zwei Photonen (Zweiphoto nen-Anregung) oder drei Photonen (Dreiphotonen-Anregung) simultan absor biert werden und jedes Photon nur einen Bruchteil der notwendigen Energie für einen Übergang in den angeregten elektronischen Zustand bereitstellt (vgl. Fig. 1), ist der Fachwelt zur Untersuchung von FISH-Fluorophoren und DNA- Markern sowie zur Realisierung einer neuartigen Multiplex-FISH-Darstellung nicht bekannt.

Unter Verwendung eines Laserscanning-Mikroskops mit einem Phasenkon trast-Objektiv hoher numerischer Apertur (63x, 1,25) und einer motorisierten Tiefenverstellung der Probe konnten die Erfinder mit dem Laserstrahl sowohl bei 770 nm als auch bei 800 nm dreidimensionale Multiplex-FISH-Aufnah men von humanen fluoreszenzmarkierten Chromosomen nach Mehrfach- FISH-Markierung mit einer lateralen Auflösung von weniger als 500 nm und einer axialen Auflösung von weniger als 1000 nm ohne Verwendung von Lochblenden erstellen. Die Probe wurde dabei durch den intensitätsreichen Laserstrahl abgerastert. Die verschiedenen, vom nahen infraroten Laserstrahl angeregten Fluoreszenzen wurden unter Verwendung entsprechender dichroi tischer Spiegel und Breitbandfilter sowie mit unterschiedlichen Detektoren simultan dargestellt. Teilweise erfolgte auch zunächst die Detektion der FISH-Fluorophore und anschließend die Markierung und Detektion der DNA mit dem Fluorophor DAPI.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Es zeigen

Fig. 1 Prinzipdarstellung einer 1-, 2- und 3-Photonenabsorption Fig. 2 dreifach-Fluorophor-markierte Fruchtwasserzelle mit erfindungs gemäßer Fluoreszenzanregung Fig. 3 tiefenaufgelöste optische Schnitte einer Vierfachfärbung der Zell kerne zweier im NIR zur Fluoreszenz angeregter Fruchtwasser zellen In Fig. 1 ist das Wirkprinzip der Multiphotonen-angeregten sichtbaren Fluoreszenz mit intensiver naher infraroter Laserstrahlung im Vergleich zu einer Einphotonenanregung dargestellt. Zwei oder drei Photonen werden jeweils gleichzeitig absorbiert und liefern zusammen die notwendige Energie, um den erforderlichen energiereichen Zustand zu besetzen, von dem die Fluoreszenzemission ausgeht.

Fig. 2 zeigt tiefenaufgelöste Aufnahmen von einer Dreifach-Fluorophor markierten Fruchtwasserzelle, die mit NIR-Strahlung der Wellenlänge 770 nm zur Fluoreszenz bestrahlt wurde. Zur sichtbaren Fluoreszenz angeregt wurden der unspezifische DNA Marker DAPI sowie die FISH-Fluorophore Rhodamin (Zentromer des Chromosoms 18 markiert) und FITC (Zentromer des Chromosoms 8 markiert) durch eine vorgenannte Zweiphotonen-Anre gung. Das Auftreten von drei Rhodamin Hybridisierungssignalen weist in diesem Fall der untersuchten Fruchtwasserzelle auf eine genetische Schädigung in Form einer Trisomie 18 hin. Die Zentromere der Chromoso men 8 und 18 liegen nicht in einer Ebene, können jedoch durch die Möglich keit der 3D Darstellung in Form tiefenaufgelöster optischer Schnitte mit einer einer axialen Entfernung von 1 µm lokalisiert werden.

Fig. 3 zeigt tiefenaufgelöste optische Schnitte einer Vierfachfärbung der Zellkerne zweier Fruchtwasserzellen mit den FISH-Fluorophoren Spectrum Aqua (Zentromer des Chromosoms 18 markiert), Spectrum Green (Zentromer des X-Chromosoms markiert) und Spectrum Orange (Zentromer des Y- Chromosoms markiert) sowie dem unspezifischen DNA-Marker DAPI unter Verwendung von 800 nm Anregungsstrahlung. Spectrum Aqua weist im Einphotonen-Absorptionsspektrum und im Fluoreszenzspektrum Banden bei 433 nm und 480 nm, Spectrum Green bei S09 nm und S38 nm, Spectrum Orange bei 559 nm und S88 nm, sowie DAPI bei 3S8 nm und S61 nm auf. Die in Fig. 3 dargestellten Fluoreszenzaufnahmen der Kerne weisen rot und grün fluoreszierende FISH-Signale auf, die auf ein weibliches Embryo deuten. Einer der Kerne weist dabei zudem drei blaufluoreszierende Signale auf, die eine Trisomie 18 anzeigen. Die Aufnahmen, die in unterschiedlichen Ebenen des Zellkerns mit einem axialen Abstand von 0,5 µm erstellt wurden, zeigen die räumliche Anordnung der Zellkerne anhand der DAPI Fluoreszenz sowie die räumliche Position der FISH-markierten Zentromere in den ca. 10 µm großen Zellkernen.

Claims

1. Verfahren zur optischen Anregung von Fluorophor-markierter DNA und RNA, bei dem gleichzeitig mehrere zu detektierende Fluorophore mit unterschiedlichem Fluoreszenzspektrum durch Strahlung zur Fluoreszenz im sichtbaren Spektralbereich angeregt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluorophore simultan durch Strahlung einer einzigen Wellenlänge im Bereich zwischen 700 nm und 1000 nm zur Fluoreszenz angeregt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz anregung mit Strahlung einer Wellenlänge zwischen 730 nm und 820 nm erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung zur Fluoreszenzanregung durch Fokussierung in einem räumlich eng begrenzten Volumen eine Intensität von mindestens 100 MW/cm² und höchstens 10 TW/cm² aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz anregung mit ungepulster Strahlung erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz anregung mit gepulster Strahlung erfolgt.