DE19920004C1 - Neuer zellulärer Regulationsfaktor TTO 20 - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft den zellulären Regulationsfaktor TTO 20, DNA kodierend dafür, seine Herstellung und Verwendung, Antikörper bindend an TTO 20 sowie die Verwendung der DNA kodierend für TTO 20 und einen Antikörper bindend ab TTO 20 zur Verwendung in einem Diagnostik-Kit zur Feststellung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den zellulären Regulationsfaktor TTO 20 und DNA, kodierend dafür, sowie seine Herstellung und Verwendung zu Screening- Zwecken zur Auffindung von Modulatoren für die TTO 20-Aktivität.

Einleitung

Zu den vielen biologischen Effekten von Interleukin-1 (IL-1) gehört die Wirkung von IL-1 auf den Metabolismus vieler Zelltypen aus dem Bindegewebe. Ein Beispiel für solche Zellen sind artikuläre Chondrozyten. IL-1 inhibiert die Synthese von Proteoglykanen (PG) durch Chondrozyten und stimuliert die Produktion von Prostaglandin E₂ und Metallo-Proteinasen, welche fähig sind, Moleküle der extrazellulären Matrix zu degradieren.

Aufgrund experimenteller Resultate sowie dem Auffinden von IL-1, PG-Fragmenten und proteolytischen Enzymen in entzündlich veränderten Gelenken wurde geschlossen, daß IL-1 eine Rolle bei der Knorpeldegradation bei der Osteoarthrose und der rheumatischen Arthritis spielt (Beuton HP & Tyler JA, 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 154, 421-428; Aydelotte MB et al. Comm. Tiss. Res. 28, 143- 159, Wood DD et al., Arthritis Rheum. 26, 975-983; Lohmander LS et al., Frans. Orthop. Res. Soc. 17, 273). Matrix-Metalloproteasen sind potentielle Kandidaten für Ansatzpunkte für eine Therapie mit Wirkstoffen, die mit diesen Enzymen interagieren, jedoch sind bislang noch keine konkreten molekularen Ansatzpunkte identifiziert worden, die sich auf frühe Schritte in dem komplexen Geschehen beziehen, welches zur Knorpeldegradation führt. Aus diesem Grunde hat man verschiedene Ansätze gewählt, um solche molekularen Ansatzpunkte für eine medikamentöse Therapie von Osteoarthrose und rheumatoider Arthritis zu erhalten.

Ein solcher Ansatz ist in der europäischen Patentanmeldung EP 0 705 842 A2 beschrieben. Man ging dort der Frage nach, ob es möglich wäre, potentielle molekulare Ansatzpunkte für eine medikamentöse Therapie von IL-1β induziertem Knorpelabbau auf der RNA-Ebene bei menschlichen, artikulären Chondrozyten aus osteoarthritischem Knorpel zu erhalten.

Zu diesem Zwecke sollten Gene identifiziert werden, die differentiell in erkranktem Knorpel exprimiert werden. Es wurde Gesamt-RNA von IL-1β stimulierten und nicht­ stimulierten menschlichen Chondrozyten einem differentiellen Display von mRNA durch reverse Transkription und der Polymerasekettenreaktion (DDRT-PCR) unterworfen. Diese Methode kann zur Identifizierung und Isolierung von Genen verwendet werden, die in zwei Zellpopulationen unterschiedlich (differentiell) exprimiert sind (Liang P & Gardee AB 1992, Science 257, 967-971; Liang P et al., AB 1993, Nucl. Acids Res. 21, 3269-3275; Bauer D et al. 1993, Nucl. Acids Res. 21, 4272-4280). Das Schlüsselelement dieser Technologie ist die Benutzung eines Satzes von Oligonukleotid-Primern, von denen einer an den polyadenylierten Schwanz der mRNA bindet, die anderen hingegen Zufalls-Dekamere sind, die an verschiedenen anderen Stellen der mRNA binden. Solche mRNA Subpopulationen, die durch einen bestimmten Satz von Primen definiert sind, werden nach der reversen Transkription amplifiziert und auf DNA-Sequenzierungsgelen aufgetrennt. Es zeigen sich Bandenmuster, die charakteristisch für eine jede der studierten Zellinien sind. So sollten zum Beispiel 100 verschiedene Primer-Kombinationen 10000 verschiedene PCR-Produkte ergeben, welche immerhin ungefähr die Hälfte der überhaupt in einer Zellinie exprimierten Gene repräsentieren. Ein Vergleich der Bandenmuster zweier verschiedener Zellinien weist auf diejenigen Banden hin, die zu differentiell exprimierten Genen korrespondieren. Aufgrund dieser Information ist es nun möglich, Banden von differentiell exprimierten Genprodukten aus dem Gel zu extrahieren, zu reamplifizieren, zu subklonieren und zu sequenzieren.

Einschränkend ist jedoch zu sagen, daß diese Methode eine Reihe von Schwierigkeiten mit sich bringt:

• 1. Durch die hohe Sensitivität der DDRT-PCR können leicht artifizielle Banden entstehen.
• 2. Die Auswertung komplexer Genexpressionsmuster ist schwierig.
• 3. Als Ausgangsmaterial stehen nur winzige RNA-Mengen zur Verfügung.

Diese Schwierigkeiten bedingen einige Unsicherheit der erhaltenen Ergebnisse.

In der europäischen Patentanmeldung EP 0 705 842 A2 sind eine Reihe von kurzen DNA-Sequenzen offenbart, die auf oben beschriebene Weise identifiziert wurden. Eine Analyse der Sequenzen zeigte, daß einige von ihnen völlige oder sehr große Identität zu den Sequenzen bereits bekannter Gene hatten: so wurde ein cDNA- Fragment mit 100%iger Identität zu menschlichem Osteopontin, ein anderes c-DNA- Fragment mit 97,2%iger Identität zu menschlichem Calnexin, ein weiteres Fragment mit 99,5%iger Identität zu menschlichem TNF-stimuliertem Gen 6 (TSG-6) gefunden. Die meisten der gefundenen Fragmente waren jedoch unter dem Gesichtspunkt der sie charakterisierenden Sequenz keinem bekannten Gen zuzuordnen. Zu dieser Gruppe von cDNA-Fragmenten zählt auch der 400 bp lange Klon TTO 20/2(2), von dessen DNA-Sequenz 152 bp entschlüsselt wurden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun der Klon TTO 20/2 näher untersucht. Ein Mittel zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung des korrespondierenden Gens bzw. Genprodukts sind sogenannte Antisense- Experimente.

Hinweise auf eine Rolle von TTO 20/2 lieferte die Expression von Antisense RNA in humanen Chondrosarcomzellen, die als Modellzellen für Knorpeldifferenzierung gelten. Der Antisense Ansatz beruht darauf, daß die kultivierten Zellen mit einem Vektor transformiert werden, der Antisense mRNA zu TTO 20 exprimiert, gleichzeitig aber auch die Expression eines Indikatorproteins, dessen Aktivität anzeigt, ob die Antisense RNA gebildet wurde. Derartige Vektoren werden bicistronische oder dicistronische Vektoren genannt. Ausgangsvektor für die vorliegenden Konstrukte war pED4, dessen Konstruktion von Kaufmann et al. beschrieben wurde (Kaufmann et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19, 4485-4490).

In der Antisensetechnologie wird über die Expression einer komplementären RNA (Antisense-RNA), die an die proteinkodierende mRNA (Sense-RNA) bindet, die Ausbildung eines funktionalen Proteins eingeschränkt oder sogar verhindert. Im besonderen kann, wie die vorliegenden Beispiele belegen, Antisense RNA zu Teilbereichen der kodierenden mRNA sowie zum 3' oder 5' untranslatierten Bereich eingesetzt werden, um die Bildung des Zielproteins zu verhindern. Mit Hilfe des Vektors können somit EST Fragmente, die keinen definierten offenen Leserahmen haben, genutzt werden, um die Wirkung des Proteins herauszuarbeiten, welches vom zugehörigen Gen letztlich kodiert wird, indem der "Antisense exprimierte" EST die Ablesung der kodierenden Sense - mRNA ausschaltet oder verringert. Spielt die so blockierte Synthese des Zielproteins eine wichtige Rolle in der Zelle, hat dies direkte oder indirekte Auswirkungen auf Zellteilung, Zellwachstum, Synthese regulierter, exprimierter Proteine etc. Behindert beispielsweise die Antisense Expression die Ausbildung eines Faktors, der in Signalkaskaden eine Rolle spielt, wird diese gestört.

Ist der Faktor ein Transkriptionsfaktor, wird die Expression mehrerer Gene gestört. Dies kann beispielsweise erkannt werden an morphologisch sichtbaren Veränderungen, die auf veränderte Expression sekretierter Proteine, besonders von Proteasen, zurückgeführt werden können.

Die so identifizierten Gene bzw. deren Produkte können als therapeutische Targets für die Suche nach pharmakologisch aktiven Stoffen eingesetzt werden. Ebenso können damit transformierte Zellen verwendet werden in Screening Systemen, indem versucht wird, die Wirkung der Antisense RNA zu blockieren.

Die DNA Chip Technologie erlaubt die direkte Analyse solcher Änderungen, indem man die Transkriptprofile von transformierten mit untransformierten bzw. Mock­ transformierten Zellen vergleicht. Der Vergleich läßt dann auch Rückschlüsse zu, ob ein EST im Rahmen eines Krankheitsbildes eine entscheidende Rolle spielt und sich somit als Screening Target eignet. Die Verwendung des Vektors ist somit auch zum Auffinden neuer Targets und zur Profilierung von neuen Medikamenten geeignet. Der Vektor ist insbesondere geeignet zum Aufbau von HTS-Systemen für die Targetvalidierung. Zweckmäßigerweise werden dazu EST Klone in HTS-Formaten wie 96 well Mikrotierplatten angezüchtet, die Insert DNA mit geeigneten PCR Primern über PCR amplifiziert, die beispielsweise für eine Klonierung in einem der beschriebenen pED4-Derivate an der 3'-Seite eine PST-Schnittstelle und der 5'-Seite eine Eco RI-Schnittstelle generieren. In einem zweiten Schritt werden die so genierten PCR-Fragmente mit PstI und Eco RI geschnitten und in den Vektor dicistronischen EGFP Vektor ligiert. Dabei bleibt das Screening Format erhalten. Der ligierte Vektor wird mit kommerziell erhältlichen Pipettierrobotern mit geeigneten Transfektionsagenzien wie CaPO₄, Fugene 6 (Hersteller: Boehringer, Mannheim; Lipofectamin, Life Technologies, Eggenstein) o. a. auf vorbereitete eukaryontische Zellen pipettiert und die Zellen nach gängigen Verfahren transformiert. Auch hier bleibt das Screening Format erhalten. Die Zellen werden in Gegenwart von CO₂ nach gängigen Verfahren bebrütet und nach 24-72 Stunden automatisiert in einen Fluoreszenz-Scanner auf die Fluoreszenzemmission hin geprüft. Wells mit transformierten, fluoreszierenden Zellen werden anschließend gegenüber transformierten Kontrollzellen, die mit dem Vektor ohne PstI-Eco RI Insert transfiziert wurden, ausgewertet auf Veränderungen im Wachstum sowie Veränderungen in der Zellmorphologie, etc. . Treten derartige Veränderungen auf, deutet dies auf eine essentielle Wirkung der exprimierten Antisense RNA hin. Die Isolierung der klonierten DNA und die anschließende Sequenzanalyse geben den Hinweis auf die Nukleotidsequenz und damit das beteiligte Gen bzw. das kodierte Protein. Auf diese Weise lassen sich erste funktionelle Hinweise für Genaktivitäten finden, deren Funktion durch das EST selbst nicht abgeleitet werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist daher der zelluläre Regulationsfaktor TTO 20 enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 1.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine DNA kodierend für das genannte Protein, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend

• a) die DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1, insbesondere Nukleotide 1 bis 1305;
• b) eine DNA die wenigstens zu 80% identisch zu einer DNA gemäß (a) ist; oder
• c) eine DNA, die im Hinblick auf den genetischen Code zu den DNA's aus (a) und (b) degeneriert ist.

Ebenfalls ist Gegenstand der Erfindung ein Antikörper, der an das TTO 20-Protein bindet.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Expressionsvektor zur Expression der oben beschriebenen DNA und eine Wirtszelle transfiziert oder transformiert mit diesem Expressionsvektor.

Auch ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des TTO 20- Proteins, enthaltend die Schritte:

• a) Kultivierung einer Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des TTO 020-Proteins ermöglichen; und
• b) Isolierung des TTO 20-Proteins aus den Wirtszellen oder dem Kulturmedium,

und ein TTO 20-Protein erhältlich durch das beschriebene Verfahren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, Zellen oder Geweben, welche das TTO 20-Protein exprimieren, bei dem eine Nukleinsäuresonde benutzt wird, die mit einer RNA in einer biologischen Probe hybridisiert, die von einer DNA wie oben beschrieben abgeleitet wird.

Darüberhinaus ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der DNA kodierend für das TTO 20-Protein gemäß Tabelle 1 zur Komplettierung der DNA- und Proteinsequenz gemäß Tabelle 1 durch Hybridisierungs- und/oder PCR-Verfahren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des TTO 20-Proteins zur Bestimmung seiner dreidimensionalen Struktur und dem Design von Inhibitoren oder Aktivatoren des TTO 20-Proteins. Ebenfalls ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von TTO 20 zum Auffinden von Modulatoren der TTO 20-Aktivität.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, enthaltend einen Antikörper wie oben beschrieben und ein Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von entzündlichen Erkrankungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, enthaltend eine oben beschriebene DNA.

Beispiel 1 Identifizierung von cDNAs mit der TTO20/2 Sequenz

In der Europäischen Patentanmeldung EP 0 705 842 A2 wird die mit TTO20/2 bezeichnete Teilsequenz von 152 bp offengelegt. Um Informationen über die komplette klonierte Sequenz zu erhalten, wurde die gesamte DNA von TTO 20/2 mit Hilfe des SP 6 Primers sequenziert. Die Sequenzierreaktionen wurden nach der Kettenabbruch-DNA-Sequenziermethode durchgeführt wie sie bei Sanger et al. (Sanger, F. et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) beschrieben wurde. Aus der Sequenzierung ergab sich eine Gesamtlänge für das klonierte Insert von 272 bp. Mit dieser Sequenz wurde eine Homologiesuche in der GenBank (NCBI) und der EMBL-Datenbank durchgeführt. Dazu wurden die BLAST und FASTA Algorithmen genutzt, die Bestandteil des GCG DNA-Analysepaketes der Genetics Computer Group, Madison, USA, sind.

Die Homologiesuche ergab signifikante Ähnlichkeiten zu zwei EST-Klonen in der öffentlichen Datenbank mit der Genbank Zugangsnummer M 51303 (Sequenz ID: g1192469) und der Zugangsnummer H 05077 (Sequenz ID: g868629). Die entsprechenden Klone mit der Klon-ID 283071 bzw. 43508 wurden bei der Firma Genome Systems, St. Louis, USA, bestellt und komplett durchsequenziert. Der Klon mit der Klon-ID 283071 zeigte das größte Insert von ca. 2580 bp, der Klon mit der ID 43508 ist mit einer Insertgröße von 2200 bp deutlich kleiner, weist aber 100% Sequenzhomologie zum Klon 283071 auf. Die komplette Sequenz des Klons 283071 ist in der Tabelle 1 dargestellt und beginnt bei Nucleotid 706.

Beispiel 2 Identifizierung eines offenen Leserahmens

Mit Hilfe des Programms "Translate" aus dem GCG Analysepaket wurde die sequenzierte DNA des Klons 283071 auf das Vorkommen von offenen Leserahmen (ORF) hin untersucht. Danach befindet sich am 5'-Ende der Sequenz ein offener Leserahmen, der für 200 Aminosäuren kodiert. Dem Stopkodon TAA folgend findet sich eine ca. 1950 bp lange, untranslatierte Region, gefolgt von einem Polyadenylierungssignal und endend mit einem Poly A Schwanz. Die Sequenz entspricht der in Tabelle 1 von Nukleotid 706 bis Nukleotid 3262 angegebenen Sequenz.

Mit der 5' gelegenen DNA-Sequenz sowie mit der Proteinsequenz, die der offene Leserahmen definiert, wurde in öffentlichen Datenbanken eine Homologiesuche durchgeführt. Diese ergab, daß der offene Leserahmen perfekt homolog ist zu einer 184 Aminosäuren kodierenden Sequenz, die auf einer cDNA namens KIAA0282 lokalisiert ist (Genbank Zugangsnummer: g87458). Die Homologie zu KIAA0282 bricht nach der Aminosäuresequenz LQTSEG abrupt ab und ist auf der Nukleotidebene auf 552 bp beschränkt. Der Leserahmen in Klon 283071 geht 15 Aminosäuren weiter und wird dann mit einem TAA Stopkodon beendet.

Dem gegenüber geht der Leserahmen im KIAA0282 ORF 123 Aminosäuren weiter. Dieser Bereich sowie die komplette 3' untranslatierte Region von ca. 2000 bp des KIAA0282 Sequenz ist unterschiedlich zur Sequenz von Klon 283071. Zur Veranschaulichung siehe Fig. 1.

Beispiel 3 Verifizierung der Verbindung vom 3'-Bereich von TTO20 mit dem 5'-Bereich von KIAA0282

Um zu belegen, daß der 5'-kodierende Bereich des ORFs von KIAA0282 mit dem 3'- Bereich von TTO20 verknüpft ist, wurden weitere öffentlich zugängliche EST-Klone sequenziert. Dazu gehören neben dem oben erwähnten Klon 43508 auch der Klon 47831 sowie der Klon 36563, die von der Firma Genome Systems erhältlich sind. Die Sequenzen belegen eindeutig die Korrektheit der für TTO20 bestimmten Sequenz.

Um den Zusammenhang zwischen dem 5'-Bereich von KIAA und dem 3'-Bereich von TTO20 mit einem unabhängigen Verfahren deutlich zu machen, wurde folgende PCR-Strategie gewählt. Aus dem 5'-Bereich von KIAA0282 wurden zwei Vorwärtsprimer abgeleitet. Primer 1: 5'-CAACTCC TGTAT CACC-3' (SEQ ID NO.: 1), Primer 2: 5'-AGTGCGATGTCTTCTACTG-3' (SEQ ID NO.: 2). Aus dem 3'-Bereich von Klon 283071 wurden die Rückwärtsprimer 3 und 4 abgeleitet. Primer 3: 5'- TCTAAAGGCAG GAGAGGAAC-3' (SEQ ID NO.: 3). Primer 4: 5'- TTCATGTGTCTTGCTTACTC-3' (SEQ ID NO.: 4). Bei einem zusammenhängenden Bereich müßte sich unter der Verwendung der Primer 1 und 4 ein 2097 bp großes Fragment amplifizieren lassen, sowie mit dem Primerpaar 2 und 3 ein 1211 bp großes Fragment. Als Matrize wurden für die Polymerase-Kettenreaktion folgende cDNAs benutzt: Gehirn cDNA aus dem Multiple Tissue cDNA Panel Human 1 (Bestellnummer: K1420-1, Firma Clontech, Heidelberg, Deutschland) sowie Fötale Gehirn cDNA aus der Human Fetal cDNA Panel (Bestellnummer: K1425-1, Firma Clontech, Heidelberg, Deutschland). 0,5-1 µl Aliquots wurden in eine PCR-Reaktion mit dem Primerpaar 1 und 4 eingebracht. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der vom Hersteller der Enzyme empfohlenen Puffer wie folgt durchgeführt: Polymerasegemisch: 19 Anteile AmpliTaq DNA-Polymerase (Firma Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland) und 1 Teil pfu-Polymerase (Firma Stratagen, La Jolla, USA). Primerkonzentration: 10 pM. DNA Cycler (Perkin Elmer, Modell 480). PCR-Bedingungen für einen Zyklus: 94°C, 2 Min.; 94°C, 30 Sek.; 59°C, 30 Sek.; 72°C, 30 Sek., 72°C, 7 Min, Reaktionsvolumen: 50 µl. Nach 25-30 Zyklen wurde die Reaktion auf 4°C abgekühlt und das Reaktionsgemisch in einem 1,2 %igen Agarosegel analysiert. Sowohl aus der Gehirn cDNA wie auch aus der fötalen Gehirn cDNA konnte das entsprechende PCR-Fragment in der Größe von ca. 2100 bp amplifiziert werden. Setzt man 0,5-1 µl aliquots dieser Proben in eine weitere, "nested" PCR-Reaktion ein unter Verwendung gleicher Bedingungen, aber mit den Primern 2 und 3, entsteht ein PCR-Fragment in der Größe von 1200 bp. Dies zeigt eindeutig das Vorhandensein einer cDNA mit zusammengehörigen 5'-Bereich von KIAA0282 und dem 3'-Bereich von TTO20 an.

Zur weiteren Bestätigung wurde das 2100 bp große DNA-Fragment aus dem Agarosegel herausgeschnitten und die DNA elektrophoretisch eluiert (Ausubel et al.). Die eluierte DNA wurde in 10 µl sterilem Wasser aufgenommen und in den Vektor pCR2.1 gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Firma Invitrogen BV, Groningen, Holland) einkloniert. Die Klonierung der PCR-Fragmente erfolgte unter Zuhilfenahme des TA-Cloning-Kits des gleichen Herstellers unter Verwendung des vom Hersteller vorgegebenen Verfahrens.

Die Sequenzierung des klonierten DNA Fragments erfolgte nach der Kettenabruchmethode nach Sanger et al. unter Zuhilfenahme der Dye-Terminatoren und eines Sequenzierers Modell 377 (Firma Perkin Elmer, Langen, Deutschland). Die Sequenzierung bestätigt exakt den durch die PCR-Analyse erhaltenen Befund. Danach kann die in Tabelle 1 (Nukleotide 685 bis 3262) angegebene Sequenz 5'- seitig um die von KIAA0282 vorgegeben DNA-Sequenz erweitert werden. Die komplette Sequenz ist in Tabelle 1 (Nukleotide 1 bis 3262) wiedergegeben.

Beispiel 4 Funktionshinweise

Die Herkunft der ESTs aus verschiedenen Geweben deuten auf eine Beteiligung des exprimierten Gens bei entzündlichen Prozessen hin. Die RNA-Analysen (siehe EP-A 0 705 842) belegen eine mehr als vierfache Induktion der Expression des Gens in Interleukin 1β-stimulierten Chondrozyten. Aufgrund der bioinformatischen Analysen schlagen die Entdecker der cDNA für KIAA0282 eine Homologie des kodierten Proteins mit einem Zinkfingerprotein vor. Zinkfingerproteine können als Transkriptionsfaktoren wirken, spielen also eine essentielle Rolle bei der Regulation des Zellgeschehens. Um eine unmittelbare Information über eine mögliche Funktion von TTO20 zu erhalten, wurde ein Antisense Expressionsansatz mit einem Teilbereich der Sequenz (Nukleotid 705-Nukleotid 3198 der Tabelle 1) gewählt. Dieser Bereich schließt sowohl einen Teil des kodierenden wie auch den nicht kodierenden 3'-Bereich der cDNA ein.

4.1. Konstruktion des Antisense Expressionsvektors

Als Ausgangsvektor wurde der dicistronische Vektor pED 4 gewählt (Fig. 2; Kaufman et al., Nucleic Acids Research 19, 448-4490 (1991). Für diesen Vektor, dessen Konstruktion detailliert bei Kaufman et al. beschrieben und dessen Vorläuferplasmid pMT2 unter der Nr. ATCC 67122 bei der ATCC erhältlich ist, war bereits gezeigt worden, daß über das erste Cistron Antisense RNA exprimiert werden kann. Der Vektor enthält folgende Strukturelemente: Replikationsursprung für die Replikation in eukaryontischen Zellen, den SV40 Expressionsenhancer, den Adenovirus Major Late Promotor, die Leadersequenz des Adenovirus Major Late Messenger RNA, ein hybrides Intron mit Spleiß-Stelle, die Enzephalomyokarditis Virus Leadersequenz, den Selektionsmarker Dihydrofolatreduktase, das SV40 Polyadenelierungssignal, das Adenovirus V1 RNA-Gen, einen Replikationsursprung sowie einen Selektionsmarker für die Vermehrung des Vektors in rekombinantem E. coli. In einem ersten Schritt sollten nun der Selektionsmarker Dihydrofolatreduktase ausgetauscht werden gegen das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP). Die Expression des GFPs über das zweite Cistron dient somit bei transienten Expressionsexperimenten als sichtbares Maß für die Expression des Antisense Konstrukts.

Isolierte Plasmid DNA von pED4 wurde mit den Restriktionsendonukleasen Cla1 und Xho1 geschnitten. Für die Isolierung des Gens für GFP wurde DNA des kommerziell erhältliche Vektors pEGFP (Firma Clontech, Heidelberg, Deutschland) mit den Restriktionsenzymen Sal1 und Not1 geschnitten. Die DNA-Fragmente wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Da die singuläre Schnittstelle von Cla1 ca. 350 bp nach der kodierenden Dihydrofolatreduktasesequenz im VA-Gen liegt, wird ein drittes Fragment zur Wiederherstellung des PolyA-Teils und des VA-Genabschnitts benötigt. Mittels PCR wurde ein DNA-Fragment aus dem Vektor pED4 amplifiziert, das am 5'-Ende über eine Not-Schnittstelle und am 3'-Ende über eine Cla- Schnittstelle verfügt und die noch fehlende Sequenz des PolyA-Teils und des VA- Gens beinhaltet.

Verwendete Primer

Vorwärtsprimer Not L:

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATCAGGAAGATGCTTTCAAGTTC-3' (SEQ ID NO.: 5)

Rückwärtsprimer Cla R:

5'-ACAGGCTCTCCTTTTGCAC-3' (SEQ ID NO.: 6)

Das PCR-Produkt wurde mit Not1 und Cla1 verdaut, gelelektrophoretisch von Nukleotiden getrennt und isoliert. In äquimolarem Verhältnis wurden die drei Fragmente zusammenpipettiert, mit Puffer, ATP und T4-Ligase versetzt und ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli DH5 α-Zellen transformiert und ausplattiert auf Ampicillin Selektionsplatten. Nach Isolierung der Plasmid-DNA aus Transformanden wurde über einen BamH1 Restriktionsverdau die DNAs auf ihre Fragmentgröße überprüft. Der Ursprungsvektor pED4 verfügt über drei BamH1-Schnittstellen, die drei DNA-Fragmente von ca. 2950 bp, 2190 bp und 220 bp Größe ergeben. Durch den Genaustausch verfügt der neue Vektor T782 über vier BamH1-Schnittstellen, die bei einem BamH1-Verdau der Plasmid-DNA zu vier DNA-Fragmenten von ca. 2950 bp, 1315 bp, 1075 bp und 220 bp führen. Die korrekte Sequenz des neu integrierten Indikatorgens wurde durch Sequenzierung abgesichert. Die Plasmidkarte des Vektors T782 ist in Fig. 3 wiedergegeben.

Für die Antisense Expression der RNA von TTO20 wurde mit Hilfe von PCR und entsprechenden Primern die TTO20-Sequenz amplifiziert und über die Eco R1- Schnittstelle in den GFP-Vektor T782 einkloniert.

Verwendete Primer

Vorwärtsprimer:

5'-GGAATTCGATCAGATCTCTCACTGCAC-3' (SEQ ID NO.: 7)

Rückwärtsprimer:

5'-GGAATTCACTTCTGTGCAGTAACAGAG-3' (SEQ ID NO.: 8)

Das entstehende, ca. 2500 bp große Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym Eco R1 komplett verdaut, gelelektrophoretisch aufgetrennt und isoliert. Das isolierte Fragment wurde in den ebenfalls mit Eco R1 geschnittenen GFP-Vektor einkloniert. Um sicherzustellen, daß das einklonierte Fragment in Antisenserichtung einkloniert wurde, wurden verschiedene rekombinante Klone nach Transformation von E. coli DH5 α mit dem Restriktionsenzym Pst1 geschnitten und die Fragmente gelelektrophoretisch analysiert. Dadurch, daß vor der Eco R1-Klonierungsstelle über den Vektor eine singuläre Pst1-Schnittstelle zur Verfügung gestellt wird, entsteht bei korrekter Orientierung des DNA-Fragments in dem Vektor zusätzlich ein ca. 310 bp großes Pst 1-Fragment, während ein ca. 810 bp großes Fragment im Muster der Pst- Fragmente fehlt. Die Plasmidkarte des bicistronischen Antisense-Vektors T814 ist in Fig. 4 wiedergegeben.

4.2. Transfektion von humanen Chondrosarkomzellen mit dem Antisense-Vektor

Chondrosarkomzellen sind deshalb von besonderem Interesse, weil sie als Modell für Gelenkserkrankungen dienen können. Die adhärent wachsenden Zellen wurden in Kulturflaschen (75 cm²) mit 20 ml Dulbecco's MOD Eagle Medium (DMEM mit 4,5 g Glukose/L) und folgenden Zusätzen angezogen: 10% fötales Kälberserum, 200 mM L-Glutamin, 5 mM Natriumpyruvat, 20 mM Hepespuffer pH 7,2, 0,02 µg/ml Hydrokortison, 0,1 µg/ml Insulin, 0,025 mg/ml Ascorbinsäure und 0,05 mg/ml Gentamycin. Alle 3-4 Tage wurden die Zellen durch Trypsinierung von den Kulturflaschen abgelöst, in 10 ml frischen Kulturmedium aufgenommen, durch Zentrifugation vom Trypsin befreit, im Verhältnis 1 : 5-1 : 10 verdünnt und neu ausgesät. Zur Trypsinierung wurde Trypsin/EDTA in einer Konzentration von 0,25% Trypsin und 1 mM EDTA benutzt. 1 ml dieser Lösung blieb für 2-5 Minuten bei 37°C auf den Zellen. Die Stammkultur von Chondrosarkomzellen war in 10% DMSO und 90% des Kulturmediums bei -80°C eingelagert.

Für die Transfektion von DNA in Chondrosarkomzellen wurden verschieden Methoden ausgetestet, darunter die Calciumphosphatmethode, die DEAE- Dextranmethode, Liposomen vermittelte Transfektionsmethoden, Verwendung aktivierter Dendrimere, und Elektroporation. Die besten Transfektionsraten wurden erreicht, wenn das Transfektionsagenz Fugene 6 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) verwendet wurde.

Zwischen 2 × 10⁵ und 4 × 10⁵-Zellen wurden in jeweils 1 Well einer 6-Well- Zellkulturplatte eingesät (Firma Bekton & Dickinson, Heidelberg, Deutschland). Die Zellen befanden sich in ca. 2 ml Nährlösung. Jeweils 0,5-2 µg isolierte und mit Hilfe des Qiafilter Plasmid Midikit (Firma Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigte DNA wurden für die Transfektion eingesetzt. Dazu wurden die Zellen zunächst bei 37°C in einem Brutschrank mit 5% CO₂ für 18-24 h inkubiert. Die Zellen sollten zu 50- 80% konfluent gewachsen sein. Beste Transfektionsraten erreicht man, wenn man 4 × 10⁵ Zellen/Well einsät, 2 µg DNA und 6 µl Fugene/100 µl serumfreiem Medium verwendet. Die Transfektion wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

4.3. Antisenseexpression in Chondrosarkomzellen

Die transformierten Kondrosarkomzellen wurden über einen Zeitraum von 16-48 Stunden nach Transfektion zunächst auf die Erscheinung der grünen Fluoreszenz, die durch die Expression des grün floureszenten Proteins GFP zustande kommt, hin überprüft. Bereits nach 16 Stunden konnten grün feuchtende Zellen nach Fluoreszenzanregung erkannt werden, die sich über einen Zeitraum von 20 h deutlich verstärkte.

Zum Nachweis der gebildeten Antisense RNA wurden Zellen von jeweils zwei Wells einer 6-Well-Platte verwendet. Für die Isolierung der RNA wurde ein RNeasy Miniprep Kit der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Die RNA-Proben wurden in 30 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen und bei -20°C aufbewahrt. Die Analyse der RNA erfolgte mit Hilfe von Northernblots (Ausubel, F. M. et al. Current Protocols in Molecularbiology, Vol. 1- 3, John Wiley und Sons, New York, 1997) unter Verwendung von Digoxygenin­ markierter DNA-Sonde. Die Markierung der DNA wurde in einer PCR-Reaktion mittels der DIG Probe Synthesis Kits der Firma Boehringer (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Als Matrize diente das zuvor gereinigte, von den Nukleotiden befreite PCR-Fragment mit dem ca. 2,5 kb großen TTO20 Anteil. Bei Hybridisierung mit dieser Sonde wird zeitabhängig deutlich die Expression der Antisense RNA in den transfektierten Chondrosarkomzellen sichtbar.

Gegenüber nichttransformierten Chondrosarkomzellen ist die Zellform der transformierten Zellen nicht deutlich verändert. Jedoch ist eine ungleiche Verteilung der GFP-Floureszenz gegenüber einer Kontrolltransfektion sichtbar, die mit einem entsprechenden Vektor, der anstelle TTO20 Antisense die Antisense RNA von Cofilin, einem Cytoskelett regulierenden Protein, durchgeführt wurde. Die fleckenhafte Fluoreszenzverteilung läßt vermuten, daß das Cytoskelett der Zellen gegenüber den Kontrollen verändert ist. Dies weist auf eine direkte Funktion der exprimierten Antisense RNA auf die Unterdrückung des von TTO20 gebildeten Proteins hin.

Figurenlegende

Fig. 1: Schematische Darstellung der Klone 283071, 43508, KiAA 0282, TTO20/2 und g 868629

Fig. 2: Schematische Darstellung des Plasmids pED4; Abkürzungen: SV40 = SV40 Enhancer und Ursprung der Replikation; MLP = Adenovirus "Major Late" Promotor; TPL = Leadersequenz "Adenovirus Major Late" mRNA; IVS = hybrides Intron mit Spleißstelle; EM C-L = Encephalomyocarditis Leadersequenz; DHFR = Selektionsmarker Dihydrofolatreduktase; polyA = SV40 Polyadenylierungssignal; VA I = Adenovirus VA I RNA-Gen.

Fig. 3: Schematische Darstellung des Plasmids T 782; Abkürzungen siehe Fig. 2

Fig. 4: Schematische Darstellung des Plasmids T 814; Abkürzungen siehe Fig. 2

Tabelle 1

TTO 20-2 Gen von 1 bis 3262

Claims (12)

1. Zellulärer Regulationsfaktor TTO 20 enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 1 (SEQ ID NO.: 10).

2. DNA, kodierend für den zellulären Regulationsfaktor nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend

• a) die DNA-Sequenz gemäß Tabelle 1 (SEQ ID NO.: 9), insbesondere Nukleotide 1 bis 1305;
• b) eine DNA die wenigstens zu 80% identisch zu einer DNA gemäß (a) ist;

oder

• a) eine DNA, die im Hinblick auf den genetischen Code zu den DNA's aus (a) und (b) degeneriert ist.

3. Antikörper, der an den zellulären Regulationsfaktor nach Anspruch 1 bindet.

4. Expressionsvektor zur Expression einer DNA gemäß Anspruch 2.

5. Wirtszelle transfiziert oder transformiert mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 4.

6. Verfahren zur Herstellung des zellulären Regulationsfaktors TTO 20 gemäß Anspruch 1, enthaltend die Schritte:

• a) Kultivierung einer Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression TTO 20 ermöglichen; und
• b) Isolierung von TTO 20 aus den Wirtszellen oder dem Kulturmedium.

7. Verfahren zur Identifizierung von Zellinien, Zellen oder Geweben, welche den zellulären Regulationsfaktor gemäß Anspruch 1 exprimieren, bei dem eine Nukleinsäuresonde benutzt wird, die mit einer RNA in einer biologischen Probe hybridisiert, die von einer DNA gemäß Anspruch 2 abgeleitet wird.

8. Verwendung der DNA gemäß Anspruch 2(a) zur Komplettierung der DNA- und Proteinsequenz gemäß Tabelle 1 durch Hybridisierungs- und/oder PCR- Verfahren.

9. Verwendung des zellulären Regulationsfaktors TTO 20 gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung seiner dreidimensionalen Struktur und dem Design von Inhibitoren oder Aktivatoren von TTO 20.

10. Verwendung des zellulären Regulationsfaktors TTO 20 gemäß Anspruch 1 zum Auffinden von Substanzen, welche die Aktivität von TTO 20 beeinflussen.

11. Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von rheumatoider Arthritis, enthaltend einen Antikörper gemäß Anspruch 3.

12. Diagnostik-Kit zur Diagnostizierung von rheumatoider Arthritis, enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 2.