MXPA01010884A - Factor tto 20 de regulacion celular novedoso. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona al factor TTO 20 de regulacion celular, el ADN codificado por el mismo, su preparacion y uso, anticuerpos que se unen al TTO 20 y al uso de la codificacion de ADN para TTO 20 y un enlace de anticuerpo a TTO 20 para el uso en un juego de diagnosis para la deteccion de trastornos inflamatorios, en particular artritis reumatoide.

Description

FACTOR TTO 20 DE REGULACIÓN CELULAR NOVEDOSO DESCRIPCIÓN La presente invención se relaciona al factor TTO 20 5 de regulación celular y al ADN para el mismo, y su preparación y uso para seleccionar propósitos para el descubrimiento de moduladores para la actividad TTO 20.

Introducción 10 Los diversos multitud de efectos biológicos de interleucina-1 (IL-1) incluyen la acción de IL-1 en el metabolismo de diversos tipos de célula a partir del tejido conectivo. Un ejemplo de células de este tipo son condrocitos articulares. IL-1 inhibe la síntesis de proteoglicanos (PG) 15 por condrocitos y estimula la producción de prostaglandina E2 y metaloproteinasas, que son capaces de degradar moléculas de la matriz extracelular. En la base de los resultados experimentales, y el descubrimiento de IL-1, los fragmentos PG y las enzimas 20 proteoliticas en las uniones modificadas por inflamación, se concluye que IL-1 juega una parte en la degradación del cartílago en osteoartrosis y artritis reumatoide (Beuton HP & Tyler JA, 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 154, 421-428; Aydelotte MB et al. Comm. Tiss. Res. 28, 143-159, Wood DD et 25 al., Arthritis Rheu . 26, 975-983; Lohmander LS et al., J'*^ ^?É?riit?? "* *•*- «•*»-*- ••>*-> Trans. Orthop. Res. Soc. 17, 273). Las metaloproteasas matriz son candidatos potenciales para los puntos iniciales para una terapia con compuestos activos que interactúan con estas enzimas, pero hasta ahora ninguno de los puntos iniciales 5 moleculares actuales se han identificado los cuales se relacionan con las etapas anteriores en el proceso complejo que conduce a la degradación del cartílago. Por esta razón, diversos métodos se han seleccionado para obtener puntos iniciales moleculares de este tipo para una terapia médica de 10 osteoartrosis y artritis reumatoide. Se describe un método en la Solicitud de Patente Europea EP 0 705 842 A2. La cuestión es examinar alli acerca de si seria posible obtener puntos iniciales moleculares potenciales para una terapia médica de la degradación del 15 cartílago inducida por IL-Iß en el plano de ARN en humano, condrocitos articulares del cartílago osteoartritico. Para este propósito, los genes se identificarán los cuales se expresan diferencialmente en el cartílago enfermo. El ARN total de IL-lß estimulado y los condrocitos humanos no 20 estimulados se someten a una exposición diferencial de ARNm por transcripción inversa y la reacción en cadena de polimerasa (DDRT-PCR) . Este método puede utilizarse para la identificación y aislamiento de genes que son expresados diferencialmente en dos poblaciones celulares (Liang P & 25 Gardee AB 1992, Science 257, 967-971; Liang P et al., AB mwfriifím tíltimr -, ^^....i^i,. . . . . i . , ,,. __,_ .... , .. . . . . «*^ÉH 1993, Nucí. Acids Res. 21, 3269-3275; Bauer D et al. 1993, Nucí. Acids Res. 21, 4272-4280). El elemento clave de esta tecnología es el uso de un juego de cebadores de oligonucleótido, de los cuales uno une a la cola del 5 poliadenilado del ARNm, los otros, en la otra forma son decámeros aleatorios que se unen a otros diversos sitios de ARNm. Tales subpoblaciones de ARNm, que se definen por un juego especifico de cebadores, se aumentan después de la transcripción inversa y se separan en geles de secuenciación 10 de ADN. Se observan patrones de banda los cuales son característicos para una de cada una de las lineas celulares estudiadas. De esta manera, por ejemplo, 100 combinaciones de cebadores diferentes deben proporcionar 10,000 diferentes productos PCR, que representan por lo menos aproximadamente 15 la mitad de los genes expresados en una linea celular completamente. Una comparación de los patrones de la banda de dos diferentes lineas celulares indican aquellas bandas que corresponden a genes diferencialmente expresados. Una de las bases de esta información, es ahora posible extraer, 20 reamplificar, en el subclón y en las bandas de secuencia de los productos del gen diferencialmente expresados a partir del gel. Sin embargo, esto será habilitado expresando que este método tiene un número de dificultades: 25 1. Como un resultado de la alta sensibilidad del *«- <* -* *****-**- Ul..

DDRT-PCR, pueden resultar bandas ligeramente artificiales. 2. El análisis de los patrones de expresión del gen complejos se dificulta. 3. Únicamente pequeñas cantidades de ARN están 5 disponibles como material inicial. Estas dificultades provocan incertidumbre en los resultados obtenidos. En la Solicitud de Patente Europea EP 0 705 842 A2, se describen un número de secuencias de AD? cortas, las 10 cuales se han identificado en la forma descrita en lo anterior. Un análisis de las secuencias mostraron que algunas de ellas tuvieron identidad completa o muy amplia con las secuencias de genes ya conocidos: de este modo un fragmento de AD?c tiene 100% de identidad con la osteopontina humana, 15 otro fragmento de AD?c tiene 97.2% de identidad con la calnexina humana, y se encontró un fragmento adicional que tiene 99.5% de identidad con el gen 6 (TSG-6) estimulado por T?F humano. Más de los fragmentos encontrados, sin embargo, no pueden ubicarse en cualquier gen conocido del punto de 20 vista de la secuencia que los caracteriza. Este grupo de fragmentos AD?c también incluye el clon largo de 400 bp TTO 20/2(2), de aquella secuencia 152 bp de AD? que se ha interpreto. En el contexto de la presente invención, el clon 25 TTO 20/2 ahora se ha investigado más estrechamente. Los misíí ummm** "- "**- " ' ---—* ^ experimentos de antisentido asi llamados son un medio para la investigación del significado funcional del gen correspondiente o el producto de gen. La expresión del ARN de antisentido en las células 5 condrosarcoma humanas, que se estiman como células modelo para la diferenciación de cartílago, produjeron indicaciones de un papel de TTO 20/2. El método de antisentido se basa en la transformación de las células cultivadas con un vector que expresa el ARNm antisentido a TTO 20, pero al mismo tiempo 10 también una proteina indicadora cuya actividad indica si se forma el AR? antisentido. Los vectores de este tipo son llamados vectores bicistrónicos o dicistrónicos . El vector inicial para los constructores presentes son pED4, cuyo constructor se ha descrito por Kaufmann et al. (Kaufmann et 15 al., 1991, ?ucl. Acids Res. 19, 4485-4490). En la tecnología del antisentido, la formación de una proteina funcional se restringe o aún previene mediante la expresión de un AR? complementario (AR? de antisentido) que se une al AR?m codificado por la proteina (AR? sentido) . 20 En particular, como lo confirman los presentes ejemplos, el AR? antisentido puede emplearse para subregiones del AR?m codificado y para la región 3' o 5' no traducida para prevenir la formación de lá proteina objeto. Con la ayuda del vector, los fragmentos EST que no se han definido en el marco 25 de lectura abierto pueden de esta manera utilizarse para »«***il e*í¿**je*» , , y , L i.* . , , . , , , , . .. , ..•.. m?tff| concluir la acción de la proteina que finalmente se codifica por el gen asociado en el que el EST "antisentido expresado" intercambia o disminuye la lectura del codificador ARNm sentido. Si la síntesis de la proteina objeto que se bloquea en esta forma juega un papel importante en la célula, esto tiene efectos directos o indirectos en la división celular, y el crecimiento celular, síntesis de proteínas reguladas y expresadas, etc. Si la expresión de antisentido, previene, por ejemplo, la formación de un factor que juega un papel en cascadas de señal, esto se desestabiliza. Si el factor es un factor de transcripción, la expresión de un número de genes se desestabiliza. Esto puede reconocerse, por ejemplo, de los cambios morfológicamente visibles que pueden atribuirse a la expresión alterada de las proteínas secretadas, particularmente de proteasas. Los genes o productos de los mismos identificados de esta manera pueden emplearse como objetos terapéuticos por la búsqueda para sustancias farmacológicamente activas. De otra manera, las células transformadas en esta forma pueden utilizarse en sistemas de tamización en los cuales se intenta bloquear la acción del AR? antisentido. La tecnología del chip AD? permite el análisis directo de los cambios en que los perfiles de transcripción de las células transformadas se comparan con células no transformadas o transformadas en forma simulada. La comparación entonces permite conclusiones que se obtienen como si un EST juega un papel crucial en el contexto de una pintura clínica y de esta manera es adecuado como un objeto tamizado. El uso del vector es de esta manera también 5 adecuado para el descubrimiento de objetos novedosos y para el perfil de medicamentos novedosos. El vector es particularmente adecuado para la síntesis de los sistemas HTS para la validación objeto. Convenientemente, los clones EST son cultivados en formatos HTS tales como placas de 10 microtitulo de 96 pozos para esto, el ADN inserto es amplificado por medio de PCR utilizando cebadores PCR adecuados que, por ejemplo, generan un sitio de desdoblamiento PST en el lado 3 ' y un sitio de desdoblamiento Eco Rl en el lado 5' para clonar en uno de los derivados pED4 15 descritos. En una segunda etapa, los fragmentos PCR generados en esta forma, son desdoblados utilizando Pstl y Eco Rl y el vector EGFP dicistrónico se une en el vector. El formato de tamización aqui se retiene. El vector ligado se pipetea en células eucarióticas previamente preparadas utilizando robots 20 pipeteados comercialmente obtenibles con agentes de transfección adecuados tales como CaP04, Fugeno 6 (fabricante: Boehringer, Mannheim; lipofectamina, Life Technologies, Eggenstein) u otros y las células se transforman de acuerdo a procesos acostumbrados. Aqui 25 también, el formato de tamización se retiene. Las células se --3^-fejaite- H *u incuban en presencia de C02 de acuerdo a procesos acostumbrados, y probados por la emisión de fluorescencia después de 24-72 horas bajo condiciones automatizadas en un barrido de fluorescencia. Los pozos con células 5 transformadas, fluorescentes entonces se evalúan para cambios en el crecimiento y cambios en la morfología celular, etc., comparados con las células de control transformadas que se transfectan con el vector sin el inserto Pstl - Eco Rl . Si los cambios de este tipo ocurren, esto indica una acción 10 esencial del ARN antisentido expresado. El aislamiento del ADN clonado y el análisis de secuencia subsecuente dando una indicación de la secuencia de nucleótido y de esta manera, el gen o la proteina codificada involucrada. De esta manera, las primeras indicaciones funcionales de las actividades de gen 15 pueden encontrarse cuya función no puede por si misma derivarse por medio del EST. La invención por lo tanto se relaciona a la proteina TTO 20 que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la Tabla 1. 20 Un objeto adicional de la invención es un codificador de ADN para la proteina mencionada, seleccionada del grupo que comprende (a) la secuencia ADN como en la Tabla 1, en particular nucleótidos 1 a 1305; 25 (b) un ADN que es por lo menos 80% idéntico con el H^| ^ ^ ^ M?M ADN como en (a) ; o (c) un ADN que, con respecto al código genético, se degenera en los ADNs de (a) y (b) . La invención de otra manera se relaciona con un anticuerpo que se une a la proteina TTO 20. Objetos adicionales de la invención son un vector de expresión para la expresión del ADN descrito en lo anterior y una célula huésped transfectada o transformada con este vector de expresión. La invención también se relaciona a un proceso para la preparación de la proteina TTO 20, que comprende las etapas de: (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones que hacen posible la expresión de la proteina TTO 20; y (b) aislamiento de la proteina TTO 20 a partir de las células huésped o el medio de cultivo, y una proteina TTO 20 obtenible por el proceso descrito. Un objeto adicional de la invención es un proceso para la identificación de lineas celulares, células o tejidos que expresan la proteina TTO 20, en la cual una sonda de ácido nucleótido se utiliza que se hibridiza con un ARN en una muestra biológica con la cual se deriva del AD? como se describió en lo anterior. La invención además se relaciona al uso de la codificación de ADN para la proteina TTO 20 de acuerdo a la Tabla 1 para el término de ADN y la secuencia de proteina como en la Tabla 1 por medio de hibridación y/o procesos PCR. Un objeto adicional de la invención es el uso de la proteina TTO 20 para la determinación de su estructura tridimensional y el diseño de inhibidores o activadores de la proteina TTO 20. La invención se relaciona asi mismo al uso de TTO 20 para el descubrimiento de moduladores de la actividad TTO 20. Los objetos adicionales de la invención son un juego de diagnosis para la diagnosis de trastornos inflamatorios, en particular artritis reumatoide, que comprende un anticuerpo tal como se describió en lo anterior y un juego de diagnosis para la diagnosis del trastorno inflamatorio, en particular artritis reumatoide particular, que comprende un ADN descrito en lo anterior.

Ejemplo 1: Identificación de los ADNc que utilizan la secuencia TTO 20/2 La secuencia parcial de 152 bp designada por TTO 20/2 se describe en la Solicitud de Patente Europea EP 0 705 842 A2. Para obtener información acerca de la secuencia clonada completa, el ADN • completo de TTO 20/2 se secuencia con la ayuda del cebador SP 6. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en el método de ??it?M - t f l l'tbi í «Wm-r riri , „, „ , n, - ^ T -—nr , i r ., ..,..««. - . . . . , . ... , , ,, , . . ^*t M* secuenciación de ADN de terminación de cadena co o se describió en Sanger et al. (Sanger, F., et al. 1977, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). De la secuenciación, una longitud total para el inserto clonado de 272 bp resultó. Utilizando esta secuencia, una búsqueda de homología se llevó a cabo en el banco de gen (NCBI) y la base de datos EMBL. Al hacer esto, los algoritmos BLAST y FASTA se utilizaron, los cuales son parte del paquete de análisis de GCG ADN de Genetics Computer Group, Madison, USA. La búsqueda de homología mostró similaridad significativa en dos clones EST en la base de datos pública que tiene el número de acceso de banco de gen M 51303 (secuencia ID: gll92469) y el número de acceso H 05077 (secuencia ID: g868629) . Los clones correspondientes que tienen el clon ID 283071 ó 43508 se ordenaron de Genome Systems, St. Louis, USA, y se secuenciaron completamente. El clon que tiene el clon ID 283071 mostró el inserto menos largo desde aproximadamente 2580 bp, el clon que tiene el ID 43508 es notablemente más pequeño con un tamaño de inserto de 2200 bp, pero tiene homología de secuencia al 100% con el clon 283071. La secuencia completa del clon 283071 se muestra en la Tabla 1 y comienza en el nucleótido 706.

Ejemplo 2: Identificación de una estructura de lectura abierta ^^^^^^^^ •i-üaua«sa«a> Con ayuda del programa de Traducción del paquete de análisis GCG, la secuencia ADN del clon 283071 se investigó para la ocurrencia de las estructuras de lectura abierta (ORF) . Consecuentemente, se encuentra una estructura de lectura abierta que codifica para 200 aminoácidos en el extremo 5' de la secuencia. Siguiendo el codón de detención de TAA, se encontró una región sin traducir de aproximadamente 1950 bp larga, seguida por una señal de poliadenilación y terminando con una cola Poli A. La secuencia que corresponde a la secuencia indicada en la Tabla 1 de 706 nucleótidos en el nucleótido 3262. Una búsqueda de homologia se llevó a cabo en las bases de datos públicas que utilizan la secuencia ADN 5' y utilizan la secuencia de proteina que clona la estructura de lectura abierta. Esto mostró que la estructura de lectura abierta es perfectamente homologa con 184 aminoácidos que codifican la secuencia, que se localizan en un ADNc por el nombre de KIM0282 (número de acceso de banco de gen: 987458) . La homologia en los extremos KIAA0282 abruptamente después de la secuencia de aminoácidos LQTSEG y se restringe en el nivel de nucleótido en 552 bp. La estructura de lectura en el clon 283071 continúa para 15 aminoácidos y entonces termina con un codón de detención TAA. Sin embargo, la estructura de lectura en los KIAA0282 ORF continúa para 123 aminoácidos. Esta región y la i .. - t A. *. , j . región sin traducir 3' completa de aproximadamente 2000 bp de la secuencia KIAA0282 se difiere de la secuencia de clon 283071. Para ilustración, véase Figura 1.

Ejemplo 3: Verificación del enlace de la región 3' de TT020 en la región 5' de KIAA0282 Para confirmar que la región de codificación 5' del ORF de KIAA0282 se une a la región 3' de la región TTO20, además se secuenciarón clones EST públicamente accesibles. En adición a los clones 43508 antes mencionados, estos también incluyen el clon 47831 y el clon 36563, que se obtienen de Genome Systems. Las secuencias claramente confirman la exactitud de la secuencia determinada para TTO20. Para hacer clara la conexión entre la región 5' de KIAA y la región 31 de TTO20 utilizando un proceso independiente, la siguiente estrategia PCR se selecciona. Dos cebadores adelantados se derivan de la región 51 de KIAA0282. Cebador 1: 5'-CAACTCC TGTAT CACC-3' (SEC. DE IDENT. NO.: 1), cebador 2: 5'-AGTGCGATGTCTTCTACTG-3' (SEC. DE IDENT. NO.: 2). Los cebadores 3 y 4 traseros se derivan de la región 3' del clon 283071. Cebador 3: 5' -TCTAAAGGCAG GAGAGGAAC-3 (SEC. DE IDENT. NO.: 3). Cebador 4: 5' -TTCATGTGTCTTGCTTACTC-3 ' (SEC. DE IDENT. NO.: 4). En la región conectada, un fragmento de tamaño 2097 bp tendrían que ser capaz de amplificar utilizando los cebadores 1 y 4, y un fragmento 1211 bp en tamaño utilizando el par de cebador 2 y 3. Estos ADNs se utilizan como matrices para la reacción de cadena de polimerasa: ADNc cerebral a partir del Panel Humano 1 de ADNc de Tejido Múltiple (número de orden: K1420-1, Clontec, Heidelberg, Alemania) y ADNc cerebral fetal del panel ADNc Fetal Humano (número de orden: K1425-1, Clontech, Heidelberg, Alemania). Se introdujeron alícuotas de 0.5-1 µl en una reacción PCR con el par 1 y 4 de cebador. La reacción PCR se llevó a cabo como sigue utilizando el amortiguador recomendado por el fabricante de las enzimas: mezcla de polimerasa: 19 partes de polimerasa AmpliTaq ADN (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania) y 1 parte de polimerasa pfu (Stratagen, La Jolla, USA) . Concentración del cebador: 10 pM. ADN Cycler (Perkin Elmer, Model 480) . Las condiciones de PCR para un ciclo: 94°C, 2 min.; 94°C, 30 sec.; 59°C, 30 sec; 72°C, 30 sec.; 72°C, 7 min, volumen de reacción: 50 µl . Después de 25-30 ciclos, la reacción se enfrió a 4°C y la mezcla de reacción se analizó en un gel de agarosa de 1.2% de resistencia. Fue posible amplificar el fragmento de PCR correspondiente del tamaño de aproximadamente 2100 bp ambos del ADNc cerebral y del ADNc cerebral fetal. Si las alícuotas de 0.5-1 µl de estas muestras se emplean en una adición, la reacción PCR "anidada" que utiliza condiciones idénticas, pero con los cebadores 2 y 3, un fragmento PCR de un tamaño de 1200 bp resulta. Esto claramente indica la presencia de un ^ ^^^^ ADNc que tiene una adhesión 5' homologa de KIAA0282 y la región 3' de TTO20. Para confirmación adicional, el fragmento 2100 bp de ADN en tamaño se remueve del gel de agarosa y el ADN se 5 eluye electroforéticamente (Ausubel et al.). El ADN eluido se toma hasta en 10 µl de agua estéril y se clona en el vector pCR2.1 de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Invitrogen BV, Groningen, Holland) . La clonación de los fragmentos PCR se llevan a cabo con la ayuda del juego de 10 clonación TA del mismo fabricante utilizando el procedimiento especificado por el fabricante. La secuenciación del fragmento ADN clonado se llevó a cabo por el método de terminación de cadena de acuerdo a Sanger et al. con la ayuda de los terminadores de tinción y 15 un secuenciador de modelo 377 (Perkin Elmer, Langen, Alemania) . La secuenciación confirma exactamente el descubrimiento obtenido por el análisis PCR. Consecuentemente, la secuencia indicó en la Tabla 1 (nucleótidos 685 a 3262) que puede extenderse en el lado 5' 20 por secuencia de ADN especificada por KIAA0282. La secuencia completa se mostró en la Tabla 1 (nucleótidos 1 a 3262) .

Ejemplo 4: Indicaciones de función El origen de los ESTs de varios tejidos indicó una 25 intervención de gen expresada en los procesos inflamatorios. --*-''••- -""—""-i Los análisis de ARN (véase EP-A 0 705 842) confirman una inducción de más de cuatro veces de expresión en el gen en los condrocitos lß-estimulados por interleucina. En la base de los análisis bioinformáticos, los descubridores de ADNc para KIAA0282 proponen una homologia de la proteina codificada por una proteina de dedo de zinc. Las proteínas de dedo de zinc pueden actuar como factores de transcripción, es decir juegan un papel esencial en la regulación del proceso celular. Para obtener información inmediata acerca de una función posible de TTO20, una expresión de antisentido se establece con una subregión de la secuencia (nucleótido 705 -nucleótido 3198 de la Tabla 1) se seleccionó. Este rango incluye parte de la codificación y la región sin codificar 3' del ADNc. 4.1. Construcción del vector de expresión antisentido La selección del vector inicial fue el vector dicistrónico de pED 4 (Figura 2; Kaufman et al., Nucleic Acids Research 19, 448 - 4490 (1991)). Para este vector, cuya construcción se describe en detalle en Kaufman et al. y cuyo plásmido pMT2 precursor se obtiene bajo el No. ATCC 67122 en ATCC, se ha mostrado que el ARN antisentido puede expresarse por medio del primer cistrón. El vector concierne los siguientes elementos estructurales: origen de réplica para la réplica en las células eucarióticas, el mejorador de i l l— ' —*- - ->-< - - mmtt expresión SV40, el Promotor Tardío Principal de adenovirus, la secuencia lectora constructora del ARN Mensajero Tardía Principal de adenovirus, un intron híbrido con un sitio de empalme, la secuencia conductora de virus encefalocarditis, la reductasa de dihidrofolato marcadora de selección, la señal de poliadenilación SV40, el gen VI adenovirus ARN, un origen de réplica y un marcador de selección para la réplica del vector en el recombinante E. coli. En una primera etapa, el marcador de sección de reductasa dihidrofolato mostró entonces intercambiarse por el gen para la proteina fluorescente verde (GFP) . La expresión del GFPs mediante el segundo cistrón de esta manera sirve en los experimentos de expresión transitoria como una medida visible de la expresión de la construcción de antisentido. El ADN de plásmido aislado de pED4 fue capaz de desdoblarse utilizando Clal y Xhol de endonucleasas de restricción. Para el aislamiento del gen para GFP, del vector ADN pEGFP comercialmente obtenible (Clontech, Heidelberg, Alemania) fue capaz de desdoblarse utilizando las enzimas de Salí y Notl de restricción. Los fragmentos ADN se separaron por electroforesis de gel. Como el sitio de desdoblamiento singular de Clal ya sea aproximadamente 350 bp después de la secuencia reductasa dihidrofolato de codificación en el gen VA, un tercer fragmento se necesitó para la restauración de la parte PoliA y la sección gen VA. Por medio de los A^-a-jj-my^- fragmentos PCR, un ADN del vector pED4 que tiene un sitio capaz de desdoblarse Not en el extremo 5' y un sitio capaz de desdoblarse Cía en el extremo 3' y el cual comprende la secuencia de la parte PoliA y del gen VA se amplificó. 5 Cebadores utilizados: Cebador Not L delantero: 5' - ATMGAATGCGGCCGCTAAACTATCAGGAAGATGCTTTCAAGTTC - 3' (SEC. DE IDENT. NO. : 5) 10 Cebador Cía R Trasero: 5'-ACAGGCTCTCCTTTTGCAC-3* (SEC. DE IDENT. NO.: 6) El producto PCR se asimiló con Notl y Clal, separado de nucleótidos por electroforesis de gel y se aisló. 15 Los tres fragmentos se pipetearon juntos en relación equimolar, se mezclaron con amortiguador, ligasa ATP y T4 y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en células DH5 a E. coli y se colocaron en placas de selección de ampicilina. Después del ADN de plásmido de los 20 transformadores, los ADN se verificaron por su tamaño de fragmento por medio de una digestión de restricción BamHl. El vector pED4 original tuvo tres sitios de desdoblamiento BamHl que proporcionaron tres fragmentos ADN de tamaño de aproximadamente 2950 bp, 2190 bp y 220 bp. Como un resultado 25 del intercambio de gen, el vector T782 novedoso tiene cuatro teJ-»-^»-aiiM-ai> sitios de desdoblamiento BamHl que conducen en una digestión BamHl del plásmido ADN, para cuatro fragmentos ADN de aproximadamente 2950 bp, 1315 bp, 1075 bp y 220 bp. La secuencia correcta del gen indicador integrado novedoso se 5 confirmó por secuenciación. El mapa de plásmido del vector T782 se muestra en la Figura 3. Para la expresión antisentido del ARN de TTO20, la secuencia TTO20 se amplificó con la ayuda de PCR y cebadores apropiados y se clonaron en el vector T782 GFP mediante el 10 sitio de desdoblamiento Eco Rl.

Cebadores utilizados: Cebador delantero: 5 ' -GGAATTCGATCAGATCTCTCACTGCAC-3 * (SEC. DE IDENT . NO. : 7) 15 Cebador trasero: 5'-GGAATTCACTTCTGTGCAGTAACAGAG-3' (SEC. DE IDENT. NO.: 8) El fragmento resultante de tamaño de aproximadamente 2500 bp se asimiló completamente utilizando 20 la enzima Eco Rl de restricción, separada por electroforesis de gel aislada. El fragmento aislado se clonó en el vector GFP que fue asi misma desdoblada con Eco Rl . Para asegurar que el fragmento clonado se clonó en la dirección antisentido, varios clones recombinantes se desdoblaron 25 utilizando la enzima Pstl de restricción después de la transformación de E.coli DH5 a y los fragmentos se analizaron por electroforesis de gel. Debido al hecho de que un sitio de desdoblamiento Pstl singular está disponible para el sitio de clonación Eco Rl por medio del vector, un fragmento Pstl de 5 aproximadamente 310 bp en tamaño adicionalmente resulta con la orientación correcta del fragmento ADN en el vector, mientras un fragmento de aproximadamente 810 bp en tamaño se pierde en el patrón de los fragmentos Pst. El mapa del plásmidos del vector T814 antisentido bicistrónico se muestra 10 en la Figura 4. 4.2. Transfección de las células del condrosarcoma humanas que utilizan el vector antisentido Las células de condrosarcoma por lo tanto son de 15 interés particular, debido a que pueden servir como un modelo para trastornos de unión. Las células de crecimiento adherentemente crecen en frascos de cultivo (75 centímetro) que contienen 20 ml de Dulbecco' s MOD Eagle Médium (DMEM con 4.5 de glucosa/L) y los aditivos siguientes: suero bovino 20 fetal al 10%, L-glutamina 200 mm, piruvato de sodio 5 mm, amortiguador de pH Hepes 20 mm 7.2, 0.02 µg/ml de hidrocortisona, 0.1 µg/ml de insulina, 0.025 mg/ml de ácido ascórbico y 0.05 mg/ml de gentamicina. Cada 3-4 dias, las células se separan de los frascos de cultivo por 25 tripsinización, se recuperaron en 10 ml de medio de cultivo fresco, librados de tripsina por centrifugación, diluidos en la relación 1:5-1:10 y reinoculados. Para la tripsinización, se utilizó tripsina/EDTA, se usó en una concentración de 0.25% tripsina y 1 mm EDTA. 1 ml de esta solución permaneció 5 en las células durante 2-5 minutos a 37 °C. El cultivo de reserva de células condrosarcoma se almacenaron a -80°C en DMSO al 10% y 90% del medio de cultivo. Para la transfección de ADN en células condrosarcoma, varios métodos se probaron, entre ellos el 10 método de fosfato de calcio, el método de dextrano DEAE, los métodos de transfección mediados por liposoma, el uso de dendrimeros activados, y electroforación. Proporciones de transfección se lograron cuando el agente de transfección utilizado fue Fugene 6 (Boehringer Mannheim, Mannheim, 15 Alemania) . Entre células 2 x 10° y 4 x 105 se inocularon en 1 pozo cada una de una placa de cultivo celular de 6 pozos (Bekton & Dickinson, Heidelberg, Alemania) . Las células fueron en aproximadamente 2 ml de solución nutritiva. 0.5-2 20 µg cada uno de ADN que se aisló y purificó con la ayuda de Qiafilter Plasmid Midikit (Qiagen, Hilden, Alemania) se emplearon para la transfección. Para esto, las células primero se incubaron con 5% de C02 durante 18-24 h a 37°C en un incubador. Las células mostraron tener crecimiento de 25 confluencia al 50-80%. Las proporciones de transfección se lograron cuando se incubaron 4 x 105 células/pozo, y 2 µg de ADN y 6 µl de Fugeno/100 µl de medio libre de suero se utilizaron. La transfección se llevó a cabo a las instrucciones del fabricante. 5 4.3. Expresión de Antisentido en las células condrosarcoma Las células condrosarcomas transformadas primero se probaron durante un periodo de 16-48 horas después de la transfección para la apariencia de la fluorescencia verde las 10 cuales tomaron lugar debido a la expresión de la proteina GFP de fluorescencia verde. Incluso después de 16 horas, las células de fluorescencia verde pudieron detectarse después de la excitación de fluorescencia, que incrementó marcadamente sobre un periodo de 20 h. 15 Para la detección del ARN antisentido formado, las células de dos pozos en cada caso de una placa de 6 pozos se utilizó. Para el aislamiento del ARN, un RNeasy Miniprep Kit de Qiagen (Hilden, Alemania) se utilizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las muestras de ARN se 20 recuperaron en 30 µl de agua libre de Rnasa y se almacenaron a -20°C. El ARN se analizó con la ayuda de tinciones Northern (Ausubel, F.M. et al. Current Protocolsin Molecularbiology, Vol. 1-3, John Wiley and Sons, New York, 1997) utilizando muestra de ADN etiquetada por digoxigenina. El etiquetado del 25 ADN se llevó a cabo en una reacción PCR por medio de DIG Probé Synthesis Kit de Boehringer (Mannheim, Germany) . La matriz utilizada fue el fragmento PCR previamente purificado que contiene la porción TT020 alrededor de 2.5 kb en tamaño, que estuvo libre de nucleótidos. En la hibridación con esta 5 sonda, la expresión del ARN antisentido en las células condrosarcoma transfectadas se volvieron claramente visibles en una forma dependiente del tiempo. Comparadas con las células condrosarcoma no transformadas, la forma de las células transformadas no se 10 cambiaron marcadamente. Sin embargo, una distribución diferente de la fluorescencia GFP se comparó visible con una transfección controlada que se llevó a cabo utilizando un vector correspondiente, el cual en lugar del antisentido TTO20 contuvo el ARN antisentido de cofilin, con una proteina 15 que regula el citoesqueleto. La distribución de fluorescencia patrón permite la sospecha que el citoesqueleto de la célula se modifica comparado con los controles. Esto indica una función directa del ARN antisentido expresado en la supresión AR? de la proteina formada de TTO20. 20 Leyenda de las Figuras: Figure 1: Representación esquemática de los clones 283071, 43508, KiAA 0282, TT020/2 y 9 868629 Figure 2: Representación esquemática del plásmido pED4; 25 abreviaturas: SV40 = mejorador y origen de réplica ?^ ??**t lllíllm¡t l , 1 ; f . ,t„ _,, t!,_„ _.^^_..

SV40; MLP = promotor "Tardío principal" de adenovirus; TPL = ARNm "Retardo Principal de Adenovirus" secuencia conductora; IVS = híbrido intron con sitio de empalme; EM C-L = secuencia conductora de encefalomiocarditis; DHFR = reductosa de dihidrofolato marcador de selección; poliA = señal de poliadenilación SV40; VA 1 = gen VA 1 AR? de adenovirus. Figure 3: Representación esquemática del plásmido T 782; para abreviaciones véase Figura 2. Figure 4: Representación esquemática del plásmido T 814; para abreviaciones véase Figura 2.

*M y * -~~. t U- .. ^j.^*... .. » Al-B í '*- - Tabla 1: Gen TTO 20-2 del 1 al 3262 1 GCCCTGGCCCCGGTGCCCCGCAACTCCTGTATCACCTGCCCCCAGTGTCACCGCAGCCTC 1 A L A P V P R N S C I T C P Q C H R S L 61 ATCCTGGA GACCGGGGGCTCCGCGGC TCCCCAAGAATCGCGTACTGGAAGGGGTAATT 21 1 L D D R G L R G F P K N R V L E G V I 121 GACCGCTACCAGCAGAGCAAAGCCGCGGCCCTCAAGTGCCAGCTCTGCGAGAAGGCGCCC 41 D R Y Q- Q. S K A A A L K C Q L C E K A P 181 AAGGAAGCCACCGTCATGTGCGAACAGTGCGATGTCTTCTACTGCGATCCGTGCCGCCTG 61 K E A T V M C E Q C D V F Y C D P C R L 2 1 CGCTGCCACCCGCCCCGGGGGCCCCTAGCCAAGCACCGCCTGGTGCCCCCGGCCCAGGGT 81 C H P P R G P L A K H R L V P P A Q G 301 CGTGTGAGCCGGAGGCTGAGCCCACGCAAGGTCTCCACCTGCACAGACCACGAGCTGGAG 101 R V S R R L. S P R K V S T C T D H E L E 361 AACCACAGCATGTACTGCGTGCAATGCAAGATGCCCGTGTGCTACCAGTGCTTGGAGGAG 121 N H S M Y C V Q C K M P V C Y Q C L E E 421 GGCAAACAC CCAGCCACGAAG CAAGGCTCTGGGGGCCATGTGGAAACTACATAAGAGC 141 G K H S S H E V K A L G A M W K L H K S 81 CAGCTCTCCCAGGCGCTGAACGGAC GTCAGACAGGGCC AAAGAAGCCAAGGAGTTTCTG 161 Q L S Q A L N G L S D R A K E A K E F L 541 GTACAGC GCGCAACATGGTCCAGCAGATCCAGGAGAACAGTGTGGAGTTTGAAGCCTGT 181 V Q L R N M V Q Q I Q E N S V E F E A C 601 CTGGTGGCCCAATGTGA GCCCTCATCGATGCCCTCAACAGAAGAAAAGCCCAGCTGCTG 201 L V A Q C D A L I D A L N R R K A Q L L 661 GCCCGCGTCAACAAGGAGCATGAGCACAAGCTGAAGGTGGTTCGAGATCAGATCTCTCAC 221 A R V N K E H E H K L K V V R D Q I S H 721 TGCACAGTGAAATTGCGCCAGACCACAGGTCTCATGGAGTAC GCTTGGAGGTGATTAAG 241 C T V K L R Q T T G L M E Y C L E V I K 781 GAAAA GATCCTAG GG TTTTTGCAGATTTCTGACGCCCTCATAAGAAGAGTGCACCTG 261 E N D P S G F L Q I S D A L I R R V H L 841 ACTGAGGATCAGTGGGG AAAGGCACACTCACTCCAAGGA GACCACGGACrrTGACTTG 281 T E D Q W G K G T L T P R M T T D F D L 901 AGTCTGGACAACAGCCCTCTGCTGCAATCCATCCACCAGCTGGATTTCGTGCAAGTGAAA 301 S L D N S P L L Q S I H Q L D F V Q V K 961 GC CCTCTCCAGTCCCAGCAACCCCTATCCTACAGCTGGAGGAATGTTGTACCCACAAC 321 A S S P V P A T P I L Q E E C C T H N 1021 AACAGCGCTACGTTGTCCTGGAAACAGCCACCTCTGTCCACGG GCCCGCCGATGGATAC 341 N S A T L S W K Q P P L S T V P A D G Y 1081 ATTCTGGAGCTGGATGATGGCAACGGTGGTCAATTCCGGGAGGTGTATGTGGGGAAGGAG 361 I E L D D G N G G Q F R E V Y V G K E 1141 ACAATG GCACTGTGGATGGTCTTCACTTCAACAGCACATACAACGCTCGGGTCAAGGCC 381 T M C T V D G L H F N S T Y N A R V K A 1201 TTCAACAAAACAGGAGTCAGCCCGTACAGCAAGACCC GGTCCTCCAAACGTCtGAGGGT 401 F N K T G V S P Y S K T L V L Q T S E G 1261 AAGGCCCT CAGCAGTATCCCTCAGAGCGAGAACTGCGTGGCATCTAAAGTGGCTGGCAA 421 K A Q Q Y P S E R E L. R G I * (SEC. IDENT. NO.: 10) 1321 GCCCGGAGG AACCCCACCACTGCCCACATTCCTGAAGTGT TCCA GACTTGCTCTGCA 1381 TTCTGCACAGAGCCGCTGT CC CTCC GCCTTTAGAGAGCCTATGGTA GTGGATGTGA 1441 TCAAACCAAAGATTCCACATCGGCAGTTCCAA GGCTTGGGCCGGCGGCTTCCTTTGATA 1501 ACAATCTAAATAAGCTGCAGTTGAAGAAGCTGAAAAATGAAGGCCTGAATGTGCCCCTGG 1561 TG GTAAGACAAATGTATCTAGGCTCTAGAGCAGGC CCCATTCTCCACCGATACACATC 1621 ATG GCCAG TGCCCAGATGATTCTAAATTACTCTGTAGtACTTGCTTGTTCTGAGGG 1681 TGGGACCTAGGTTCTTTCCAGTCGTGGATTTGTATGACTGAATGTGTTTCAAATGGGTGG 17 1 TGGGGTGCTAGAGCTGTT AGAGAGGGCCTGT GGCTGCTCCTGGCTTACCCACTTAGAC 1801 TGCCTCCGTTTCATACCCAAAGCGGAGGCCGTCAGCACCAGGATTGAGACTTCCTGTGGG 1861 CACCAAACAGGAAGAGACCAGCAACTTCGCATTACCCGCCATTTTCATCT TGCCAGTCC 1921 CT CAGTCTTGGCTAGGCTACCGAGAGCCACCATACAAGGTTCATCTCTAGAGAATTTTT 1981 GCT CTTAGCTATACTTTAAATATTTTGGTCATCAAAGACAAG AATGTGTCTCAGATGA 20 1 GAGGCTTGAATTTGATGGCCAGATATAACCTCTGAGGCTTTTAACATTT CATTTTAAGA 2101 GTAAGCAAGACACATGAAATTAAACCTACAAGGAGGTATT GTGGCTGGTGCCAAAGCAT 2161 TCTGACACTTTGGGGTGTCAT TTAATCAAAGAAATCACCCCCCCACC CACCGGGATTC 2221 TCCATAACTTCCCTCTGCAGAACTAATTATGTTGATTTTGTTCAAGTTCAAGATGTTAGC 2281 TAAAAGAACTATGGTGGTGTTTT TTTCCCACTTCCCACAAACCTCAACATGTGCCAGTC 23 1 ACCCTAAAATGCTTCACAT^GTTAAAAACAAGCACAATTTTGAATCCTACAGCAAGGATG 2401 AAAGGCCCCTAGCCGTGAAAACAGTGCTTTGGGGAGCAGTTGTCAGTCTAAGTGATGCTA 2461 TTCCAAGAGAAGGATATGCTGAGGGAAAATGCCCACATGACCTGTTCCCATTTGGAGTAC 2521 AGTGATGTGGTAGCTACAGCTTCCCCCAGAATTATCATT TAGCACCTTCTCTCAGGGAT 2581 GACCTATCAGTT GAGAGCAGTTGCCTCTTTTCTCAAAATACCATACTAACTGCTAAAGC 26 1 CCTCCAAGAGTCTTTCCTAGATGCAACGCAGAAGGCCCTTGCTGGTGATGGCCTCATTTC 2701 CCATGTGTGTACAAGGTGGTTTGATTGAAGAGTGAAGTGCATGCCTGCAGAGCAGAGAGA 2761 AATTTGTAGCAATGTTGCTAATATGTGTTATCAGATCTCCGGGAAAACTATTTCTATTCA 2821 TAATACATCATGGGAATCATACTATTCTGGTAAAAATCAGTTATTAGCATAACAGCCTGA 2881 GCACTTATGTCTCTCGTTTCATCCTGCAGGAGGATGTAGCGCCTCAGTTTATTTTAATGT 2941 TCATAAGATTATGGTGTCTAATTTAATAAATTACAGGATTGGAACTGCGATCCTTGGTAC 3001 CACAGTCACAGAACTGGGGGTCATTTTCTAGATGAAACAAACGGAACAAGTTCTCTTCCA 3061 ACAAAGAAACTGTACTGTAGAAATTAATTTCCTCCATGAATTTTATATATTGTGTACAAA 3121 TATAAGGTATGTATCTGAATACAAAGAAAAGCCTATCATCATATAGATATCAGTATTCTC 3181 TGTTACTGCACAGAAGTAATTTTCTCATGATGAAATAAAGTTCACACACATACTTTCTCC 3241 ATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3262 (SEC. IDENT. NO.: 9) LISTA DE SECUENCIAS <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> FACTOR TTO 20 DE REGULACIÓN CELULAR NOVEDOSO <130> HMR 1999/L026 5 <140> 19920004.1 <141> 1999-05-03 <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 10 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caactcctgt atcacc 16 15 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 20 agtgcgatgt cttctactg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens 25 <400> 3 ^^.a * * ** Ad üáaL?. ^H^ tctaaaggca ggagaggaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA 5 <213> Homo sapiens <400> 4 <210> 5 <211> 45 <212> DNA 10 <213> Secuencia sintética <400> 5 ataagaatgc ggccgctaaa ctatcaggaa gatgctttca agttc 45 <210> 6 <211> 19 15 <212> DNA <213> Secuencia sintética <400> 6 acaggctctc cttttgcac 19 <210> 7 20 <211> 27 <212> DNA <213> Secuencia Sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: cebador PCR 25 <400> 7 -?*¿^***-"- á ggaattcgat cagatctctc actgcac 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Secuencia Sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: cebador PCR <400> 8 ggaattcact tctgtgcagt aacagag 27 <210> 9 <211> 3262 <212> DNA l*~t » a J... faa^., , „. ... .. ,?*^,,..., .._^ *á <400> 9 gccctggccc cggtgccccg caacccccgc accacccgcc cccagrgtca ccgcagcccc tio atcctggacg accggggget ccgcggcc c cccaagaatc gcgtaccgga ag??gcaatt 120 gaccgccacc ageagageaa agccgcggcc etcaagtgee agccccgcga gaaggcgccc 190 aaggaagcca ccgccacgcg cgaacagCgc gacgccctcc act?cgaccc gtgccgcccg 240 cgctgccacc c?ccccgggg gcccccagcc aagcaccgcc tggtgccccc ggcccagggc 300 cgtgcgagcc ggaggc gag cccacgcaag gcccccaccc gcacagacca cgagccggag 360 aaccacagca cgcaccgcgt gcaacgcaag atgcccgcgt gctaccagcg cctggaggag 420 ggcaaacact ccagccacga agccaaggct ccgggggcca cgcggaaaec acacaagage 480 cagccccccc a??cgctgaa cggaccgcca gacagggcca aagaag caa ggagcctccg 540 gtacagc gc gcaacatggt ccagcagatc caggagaaca gtgtggagtt ccaagcct?t 600 ctggtggccc aatgcgatgc ccccaccgac gccctcaaca gaagaaaagc ccagccgccg 660 gcecgcgcca acaaggag a cgagcacaag ctgaaggcgg Ctcgagatca gaccccccac 720 cgcacagcga aaccgcgcca ga acaggc cccacggagt actgeccgga gscgatcaag 7T0 gaaaacgace ceagcggccc cccgcagacc cccgacgccc ceacaagaag agcgcacccg 840 actgaggatc agtgggg aa aggcacactc actccaagga Cgaccacgga etttgaettg 900 agt tggaca acagcccrccc gccgcaaccc acccaccagc tggaccxcgc gcaagcgaaa 960 gcttcccccc cagccccagc aacccccacc ccacagctgg aggaacgtcg cacccacaac 1020 aacagcgcCa cgccgccccg gaaacag ca cctctgccca cggtgcccgc cgatggatac 1080 attctggagc cggacgatgg caacggcggt caaccccggg aggtgtatge ggggaaggag 1140 acaaegtgca eegtggaegg cccccacctc aacagcacac acaacgcccg ggccaaggcc 1200 tccaacaaaa caggagccag cccgcacagc aagaccctgg Ccccccaaac c ctgagggt 1260 aaggcecttc agcagtaccc etcagagega gaactgcgcg gcacccaaag tggccggcaa 1320 gcceggaggt aaccccacca c gceeacat ccctgaagtg CCCccatgac ttgctctgca 1380 ttctgcacag agccgccgtc cccctcctgc et tagagag cctatggtat gtggatgcga 1440 tcaaaccaaa gaccccacac cggcagttcc aacggcccgg gccggcggcc tcccccgata 1500 acaaCcCaaa Caagccgcag CCgaagaagc cgaaaaatga aggcccgaac gcgccccegg 1560 cgfcgtaagac aaatgcaCcc agg tccaga g?aggccccc accccccacc gacacacacc 1620 acgtgccagt ctcgcccaga cgaccctaaa ccactccgta gtactCgctc gccctgaggg 1680 tgggacctag gtttctttcca gtcgtggatt cgtacgactg aatgcgtetc aaacgggcgg 1740 tggggtgcta gagctgttta gagaggg ct gccggecgcc cccggctcac ccacttagac 1800 tgcctccgcc tcatacccaa agcggaggcc gccagcacca ggaccgagac tccctgcggg 1B60 caccaaaeag gaagagacca gcaaccccgc aecacccgcc acctecatce Ctgccagtcc 1920 cttcagtctt ggccaggcca ccgagagcca ccacacaagg cccacctcta gagaactt t 1980 gctcctcagc cacaccteaa acaccccggc caccaaagac aagcaacgcg tetcagatga 2040 gaggcccgaa cccgatggcc agacacaacc tccgaggctc ccaacacctc caccccaaga 2100 gtaagcaaga cacacgaaac caaacccaca aggaggcact Cgcggccggt gccaaagcaC 2160 cctgacactt tggggtgtca ttccaaccaa agaaatcacc cccccacccc aecgggattc 2220 tecataaett ccctccgcag aaccaatcaC gctgattctg cccaagccca ag gttage 2280 caaaagaacc acggcggtge tttccccccc accccccaca aaccccaaca cgtgccagcc 2340 accccaaaat gcctcacacg gctaaaaaca agcacaaccc cgaaccccac agcaaggatg 2400 aaaggcccct agccgcgaaa acagtgctcc ggggagcagt cgccagccca agtgatgcta 2460 ccccaagaga aggacacgct gagggaaaac gcccacacga cccgccccca tttggagcac 2520 agcgacgtgg cagccacagc ctcccccaga actaccacct cagcaccctc cc cagggac 2580 gac tatcag tttgagagca gctgcccctc tcctcaaaac accacactaa ecgccaaage 2640 cccccaagag cctcccccag atgcaacgca gaaggcccct gcCggCgatg gcctcatttc 2700 L?. ?J , ccatgcgcgc acaaggcggc tcgaccgaag a cgaagcgc atgcctgcag agcagagaga 2760 aatctgcagc aatgttgcta atacgtgcca ccagacccgc gggaaaacca cccccaccca 2820 taacacatca cgggaaccac accaccccgg caaaaaccag ccattagcac aacagcccga 2880 gcacttatgc cccccgtccc accctgcagg aggatgcagc gccccagccc acccca»eSc 2S40 ccacaagacc acggcgccca actcaacaaa ccacaggacc ggaaccgcga cccttggcac 3000 cacagccaca ga.ccggggg ccacccccca gac aaacaa acggaaeaag W?CT? T?^ acaaagaaac cgcaccgcag aaaccaatcc cctccacgaa ccccacacac cgtgcacaaa 3120 cacaaggtac gtacccg.ac acaaagaaaa gcccaccacc acaca acac cagcatcccc 3130 tgcc.ccgca cagaagcaac ctcctcacga tgaaataaag cccacacaca cactctcccc 3240 ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3262 <210> 10 <211> 43S <212> PHT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala L u Ala Pro Val Pro ?rg Asa Ser Cys lis Thr Cys Pro Cía Cys 1 5 " 1S His Arg ser Leu lie Leu Asp Asp Arg Gly Leu Arg Giy Pae Pro Lys 20 as « Aso Arg Val Leu Glu Gl? al r e ASO Arg Tyr Gln Gla ser Ly* Ala 35 40 45 Ala Ala Leu Lys Cy. Gla Leu Cys Glu Lys Ala Pro Lys Glu Ala Tbr 50 SS «0 Val Met Cvs Glu Gla Cyß Asp Val Phe Tyr Cys Asp Pro Cys Arg Leu 65 " 70 ß0 Arg Cys His Pro Pro Arg Gly Pro Leu Ala Lys Eis Arg Leu Val Pro as 90 9S Pro Ala Gla Gly Arg Val Ser Axg Arg Leu Ser Pro Arg Lys Val Ser aoo ios 110 Tar Cys Tar Asp His Glu Leu Glu Asn Kis Ser Met Tyr Cys Val ßla US 120 "5 Cys LY «ec Pro val Cys Tyr Ola Cys Leu Glu Olu Gly Lys His Ser 130 135 *« Ser His Glu Val Lvs Ala Leu Gly Ala Mee Trp Lys Leu His Lys Ser 145 150 1S5 160 G a Leu Ser Gla Ala Leu Asn Giy Leu Ser Asp Arg Ala Lys Glu Ala 165 170 175 Lys Glu Phe Leu Val Gla Leu Arg Asa Met Val Gln Gla lie Gla Glu 180 IBS 190 Asa Ser Val Glu Phe Glu Ala Cys Leu Val Ala Glp Cys Asp Ala Leu 195 200 20S He Asp Ala Leu Asn Axg Arg Lys Ala Gln Leu Leu Ala Arg Val Asn 210 215 220 Lys Glu Sis Glu Hzs Lys Leu Lya Val Val Arg Asp Gla lie Ser His 225 230 235 240 Cys Thr Val Lys Leu Arg Gla thr Tax Gly Ley Mee Glu Tyr Cys Leu 245 2S0 255 Glu v»l He Lys Glu Asn Asp Pro Ser Gly Phe Leu Gla lie Ser Asp 260 26S 270 Ala Leu He Arg Arg Val His Leu thr Glu Asp Gln Trp Gly Lys Gly 275 280 285 Thr Leu Thx Pro Arg «ec thr thr Asp Phe Asp Leu Ser Leu Asp Asn 390 295 300 S*r Pro Leu Leu Gla Ser He Sis Gln Leu Asp Phe Val Gis Val Lys 305 310 315 320 Ala Ser Ser Pro Val Pro Ala Thr Pro He Leu Gln Leu Glu Glu Cys 325 330 335 Cys Thr Bis Asa Asa Se Ala Thr Leu Ser Trp Lys Gln Pro Pro Leu 340 345 350 Ser rhr Val pro Ala Asp Gly Tyr He Leu Glu Leu Asp Asp Gly Asa 355 360 365 Gly Gly Gla Phe Arg Clu Val Tyr Val Gly Lys Glu Thr Mee cys Thr 370 375 380 Val Asp Gly Leu His Phe As Ser Tai Tyr Asa Ala Axg Val Lys Ala 38S 390 395 400 Phe Asa Lys Thx Gly Val Ser Pro Tyr Ser Lys thr Leu Val Leu Gla 405 410 415 t at ß i-^j^^ Tar Ser Glu Gly Lys Ala Leu Cía Glp Tyr Pro Ser Glu Arg Glu Leu 420 42S 430 Arg Gly He

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. La proteina TTO 20 que comprende la secuencia de aminoácido como en la Tabla 1 (SEC. DE IDENT. NO.: 10). 2. El ADN, que codifica para la proteina como se 5 reclamó en la reivindicación 1, seleccionada del grupo que comprende (a) secuencia de ADN como en la Tabla 1 (SEC. DE IDENT. NO.: 9), en nucleótidos 1 a 1305 particulares; (b) un ADN que es por lo menos 80% idéntico con un 10 ADN como en (a) ; o (c) un ADN el cual, con respecto al código genético, se degenera en los ADNs de (a) y (b) . 3. El anticuerpo que se une a la proteina como se 15 reclamó en la reivindicación 1. 4. El vector de expresión para la expresión de un ADN como se reclamó en la reivindicación 2. 5. La célula huésped transfectada o transformada con un vector de expresión como se reclamó en la 20 reivindicación 4. 6. El proceso para la preparación de la proteina TTO 20 como se reclamó en la reivindicación 1, que comprende las etapas de: (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones 25 que hacen posible la expresión de la proteina TTO 020; mK m?i rtt ,, ......^ ....... , .. .„. ......... «..fe.. y (b) aislamiento de la proteina TTO 20 de las células huésped por el medio de cultivo. 7. La proteina TTO 20 como se reclamó en la reivindicación 1, obtenible por un proceso como se reclamó en la reivindicación 6. 8. El proceso para la identificación de las lineas celulares, células o tejidos que expresan la proteina TTO 20 como se reclamó en la reivindicación 1, en el cual una sonda de aminoácido se utiliza la cual se hibridiza con un ARN en una muestra biológica que se deriva del ADN como se reclamó en la reivindicación 2. 9. El uso del ADN como se reclamó en la reivindicación 2 (a) para el complemento del ADN y la secuencia de proteina como en la Tabla 1 por medio de la hibridación y/o procesos de PCR. 10. El uso de la proteina TTO 20 como se reclamó en la reivindicación 1, para la determinación de su estructura tridimensional y el diseño de inhibidores o activadores de la proteina TTO 20. 11. El uso de la proteina TTO 20 como se reclamó en la reivindicación 1, para encontrar substancias que influyen la actividad de TTO 20. 12. El juego de diagnóstico para la diagnosis de trastornos inflamatorios, en particular artritis reumatoide, que comprende un anticuerpo como se reclamó en la reivindicación 3. 13. El juego de diagnóstico para la diagnosis de trastornos inflamatorios, en particular artritis reumatoide, que comprende un ADN como se reclamó en la reivindicación
2. 2.