DE19916749A1 - Anordnung zur Untersuchung von Proben - Google Patents
Anordnung zur Untersuchung von ProbenInfo
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Abstract
Anordnung zur Untersuchung von einer oder mehreren in Probengefäßen oder auf Probenträgern angeordneten Proben im Durchlicht oder Auflicht, DOLLAR A mittels der Abbildung und/oder Erfassung mindestens eines Teils des Probenvolumens durch das Probengefäß oder den Probenträger hindurch eine CCD-Kamera, der eine Auswerteeinheit nachgeordnet ist, DOLLAR A wobei eine Auflichtbeleuchtung ebenfalls durch das Probengefäß oder den Probenträger hindurch erfolgt und die DOLLAR A Beleuchtung der Anregung der Probenemission, vorzugsweise der Fluoreszenzanregung dient, mit der Abbildung und/oder Erfassung auf einer von einer der Einfüllvorrichtung abgewandten Seite durch ein Probengefäß über eine CCD-Kamera, der eine Auswerteeinheit nachgeordnet ist.
Description
Die Erfindung betrifft ein inverses automatisiertes 1-Kanal-Mikroskop
mit einem Autofokussystem und einer oder mehreren
Probenkammern oder einem Probenträger.
Die Abbildung der Probe wird von einer Bildanalyse-Software
ausgewertet.
Die Proben sind beispielsweise Zellen (in Lösung) am Boden
von Mikrotiterplatten (MTP), aber auch Proben auf
Probenträgern wie Biochips, auf planparallelen Platten aus
Glas, Quarzglas oder Kunststoff.
Die MTPs oder Probenträger werden vorzugsweise automatisiert,
aber auch manuell zugeführt, und das Autofokussystem
fokussiert beispielsweise auf die Grenzschicht Lösung/MTB-Bo
den.
Nach erfolgter Fokussierung und Auswahl des Anregungsfilters
werden beispielsweise bei der Fluoreszenzerfassung mittels
einer XBO- oder HBO-Lampe die Farbstoffe in der Probe
angeregt.
Das Fluoreszenzlicht der Probe passiert den jeweils gewählten
Emissionsfilter, und die Probe wird auf den Chip der CCD-Ka
mera abgebildet.
Nach der Bildaufnahme werden evt. Anregungs- und
Emissionsfilter gewechselt und ein neues Bild aufgenommen.
Anschließend wird das Bild ausgewertet und ein xy-Scanning
tisch fährt zum nächsten Bildfeld/nächsten MTP-Topf,
der Autofokus wird wieder aktiviert, und der Ablauf beginnt
von neuem.
Die Erfindung wird anhand der schematischen Zeichnungen näher
erläutert:
Es zeigen:
Fig. 1 Den Meßstrahlengang
Fig. 2 eine Ansicht des Autofokusstrahlengangs in Richtung A
in Fig. 1
Fig. 3 eine Ansicht des Autofokusstrahlengangs in Richtung B
in Fig. 2a
Fig. 4 Eine Justiereinrichtung der Lichtquelle im
Beleuchtungsstrahlengang
Fig. 5 Den Strahlverlauf beim Autofokus
Fig. 6 Eine schematische Gesamtanordnung
An einer Standardwechselstelle WS für die Beleuchtung ist
beispielsweise ein nicht dargestelltes Lichtleitkabel
angeschlossen oder es kann eine Lampe (Weißlichtquelle: Xenon
oder Quecksilber) vorgesehen sein.
Das eingekoppelte Licht gelangt auf eine Einkoppellinse KL
zur Kollimierung
und über einen Shutter S sowie eine mehrlinsige
Beleuchtungsoptik BO1-3 sowie eine Aperturblende AB zwischen
BO1 und BO2 und Leuchtfeldblende LF zwischen BO2 und BO3 auf
einen Reflektorrevover RR mit vorzugsweise auswechselbaren
Strahlteilern zur Trennung von dem Anregungsstrahlengang in
Richtung des Objektives O und Auswertestrahlengang in
Richtung des Empfängers CCD.
Vor der Einkoppeloptik BO1 ist bei der Fluoreszenzerfassung
ein Anregungsfilter AF angeordnet.
Im Auswertestrahlengang sind Emissionsfilter EF vorgesehen,
um das reflektierte bzw. elastisch gestreute Anregungslicht zu
blockieren.
Vorteilhafte Wellenlängenbereiche für AF, EF sind:
Anregung der Farbstoffe 350-700 nm
Emission der Farbstoffe 420-800 nm
Anregung der Farbstoffe 350-700 nm
Emission der Farbstoffe 420-800 nm
Die Filter AF, EF sind auswechselbar oder für andere
Anwendungen auch ausschwenkbar.
Über eine Tubuslinse TL und einen Spiegel SP CCD gelangt
das Auswertelicht zur CCD-Kamera.
Der vorteilhafte Autofokusstrahlengang, eingekoppelt über
einen Farbteiler FT zwischen RR und O, wird anhand Fig. 2 und 3
und 6 erläutert.
Zur Fokuskorrektur wird die gestrichelt dargestellte Einheit
E, die das Objektiv, den Einkoppelfarbteiler FT und den
Autofokusstrahlengang enthält, senkrecht zur Objektebene
verschoben.
Eine der Laserlichtquellen LA2, LA3 (die andere ist
ausgeschaltet) wird über ein Prisma P parallel eingekoppelt
und über eine Optik FO fokussiert.
Zwei Laserlichtquellen können dann vorteilhaft sein, wenn das
Objektiv O auswechselbar ist und wegen der unterschiedlichen
Austrittpupille der Objektive ein unterschiedlicher axialer
Versatz des Lichtquellenbildes über unterschiedliche
Positionen der Laser zum Prisma P eingestellt werden soll.
Das Laserlicht gelangt über Umlenkspiegel ULS1,2, einen
teildurchlässigen Spiegel ST2, eine Zerstreuungslinse ZS,
einen Umlenkspiegel USSP, eine in Fig. 2 dargestellte
Sammellinse SL und einen dem Revolver RR in Richtung der
Mikrotiterplatte MTP nachgeordneten Farbteiler FT vor der
Objektivanlagefläche OA in Richtung des OBJEKTIVES O.
Der Farbteiler weist vorteilhaft eine hohe Transmission über
einen breiten Spektralbereich (350-780 nm) auf, d. h. vom
kurzwelligen Anregungslicht einer HBO-Lampe bis zum
langwelligen Emissionsspektrum von roten Farbstoffen, aber
eine hohe Reflexion für Wellenlängen über 800 nm, d. h. für das
Licht des Autofokuslasers.
Besonders vorteilhaft ist die Einkopplung des Autofokus-Strahlen
gangs direkt vor dem Mikroskopobjektiv, weil nur
wenige senkrechte optische Grenzflächen zu nur geringen
Lichtverlusten und damit zur Genauigkeitserhöhung führen, und
der Farbteiler FF über einen breiten Spektralbereich,
außerhalb der für den Autofokus verwendeten IR-Wellenlänge,
das Fluoreszenzlicht ungehindert passieren läßt, und dadurch
nur die Reflexe der IR-Fokussierlaser in den
Autofokusstrahlengang zurückreflektiert.
Durch die Stelle der Einkopplung in Beleuchtungsrichtung nach
der Beleuchtung, ist eine Unabhängigkeit des Autofokus vom
Justierzustand beispielsweise der Einkoppelelemente für die
Beleuchtung gegeben.
Aufgrund der geringen Intensität des Fluoreszenzlichtes, das
in der Probe angeregt werden kann, sind herkömmliche, auf
der Auswertung des Bildkontrastes beruhende Autofokusverfahren
ungeeignet, da für jedes einzelne Bild mehrere Sekunden
integriert werden müßte, um überhaupt ein auswertbares
Regelsignal zu erhalten.
Mit dem vorliegenden Verfahren lassen sich Fokussierungszeiten
von unter einer Sekunde realisieren, was sich vorteilhaft auf
die Gesamt-Meßzeit auswirkt.
Über Empfängerstrahlteiler EFST und Empfänger EF wird das an
der MTP reflektierte Licht detektiert.
In Fig. 4 ist die Justage bei Einkopplung einer Lichtquelle
dargestellt.
Der Strahlengang ist hierbei ab dem Reflektorrevolver in
Richtung des Spiegels SP CCD um 90 Grad um die optische Achse
der Einkopplung verdreht.
Durch Verschiebung von Spiegel ST3 und Strahlteiler ST4 wird
in den in Fig. 1 dargestellten Beleuchtungsstrahlengang nach
der Einkoppellinse KL bei eingeschobenem Spiegel SP3 das
Licht der Lichtquelle in einer Justageposition auf eine
Mattglasscheibe MGS umgelenkt, wodurch die Lage des
Lichtquellenbildes zur optischen Achse von der Bedienperson
justiert werden kann.
Auch bei der Einkopplung über eine Lichtleitfaser kann diese
Anordnung zur Kontrolle der Lage dienen.
In der Normalstellung bei eingeschobenem Strahlteiler ST4
gelangt ein geringer Teil der Lichtintensität (etwa 4%) zur
Erfassung und Regelung der Lichtleistung auf eine
Monitordiode MTD. Dem Strahlteiler ist ein Wärmeschutzfilter
WSF vorgeordnet.
Ein Autofokussystem ist zur genauen Fokussierung
beispielsweise auf den Boden der MTP vorteilhaft, da diese
zwar an sich parallel ist, aber im allgemeinen stark gewölbt
(Größenordnung 200-300 µm), so daß ein Fest-Fokus nicht
funktioniert.
Höchste Priorität hat die Geschwindigkeit des Autofokus: nach
Laden einer neuen Platte und erstmaliger
Einrichtung/Fokussierung soll die Zeit für die Fokussierung
(erforderlich z. B. nachdem die Platte verfahren wurde, um ein
anderes Töpfchen auszuwerten) deutlich unter 1 sec liegen.
In Fig. 5 ist dargestellt, daß sowohl von der
Plattenunterseite als auch von der Plattenoberseite Reflexe
R2, R1 des eingestrahlten Lasers des Autofokus entstehen und
auf dem Empfänger EF registriert werden können.
Die Reflexe liegen lateral versetzt, je nach Dicke der Platte
bekommt man entweder beide Signale auf die CCD-Zeile oder
bei großer Dicke liegen die Reflexe so weit auseinander, daß
auf der CCD-Zeile nur ein Reflex erfaßt wird.
Wenn das Objektiv aus einer vom Objekt weit entfernten
Position auf das Objekt zugefahren wird, erscheint zunächst
der untere Reflex.
Bei Erfassung beider Reflexe ist anhand der Intensität der
stärkere von der Oberseite vom schwächeren auf der Unterseite
unterscheidbar.
Bei vorgegebener Dicke ist auch bestimmbar, ob aufgrund der
Anordnung nur ein Reflex oder beide Reflexe auf dem Empfänger
EF liegen werden.
Mit einem Regelalgorithmus wird bei Auftreten beider Reflexe
der stärkere Reflex, d. h. der höhere Peak vernachlässigt und
nur das Maximum des schwachen Peaks zur Fokuskontrolle
herangezogen. Aus der Geometrie der Anordnung ist bei zwei
vorhandenen Reflexen ohnehin bestimmbar, welcher von der
Plattenunterseite stammt.
Die Eigenschaften des optischen Readersystems
(Objektivparameter) einerseits und des Objektes (Dicke des
Bodens der Mikrotiterplatte) andererseits legen also fest, ob
ein oder zwei Reflexe vom Objekt gleichzeitig auf den Detektor
des Autofokussystems (CCD-Zeile) abgebildet werden, wenn
sich das Objekt in der Fokuslage befindet.
Ablauf der Regelung:
- 1. Analyse der auf der CCD-Zeile abgebildeten Kurve anhand von Maxima, Minima, und Kehrwerten. Sub-Pixel-Auf lösung führt dabei zur Erhöhung der Genauigkeit.
- 2. Aus den Ergebnissen feststellen, ob ein oder zwei Reflexe vorhanden sind.
- 3. Sind zwei Reflexe vorhanden, wird aus der Ablage des relevanten Reflexes zum definierten Fokuspunkt auf der CCD-Zeile der Stellwert für den Fokustrieb berechnet.
- 4. Ist nur einer der beiden Reflexe auf der Zeile abgebildet, ist die Lage des vorhandenen Reflexes zur Fangbereichsgrenze für die erste Fahrt in Richtung Fokuspunkt relevant, bis der zweite Reflex auf der CCD-Zeile erscheint.
Ablauf der Regelung:
- 1. Analyse der auf der CCD-Zeile abgebildeten Kurve anhand von Maxima, Minima, und Kehrwerten. Sub-Pixel-Auf lösung führt dabei zur Erhöhung der Genauigkeit.
- 2. Bei eingerasteter Regelschleife wird aus der Ablage des Reflexes zum definierten Fokuspunkt auf der CCD-Zeile der Stellwert für den Fokustrieb berechnet.
- 3. Ist zum Startzeitpunkt der Regelschleife kein Reflex auf der CCD-Zeile vorhanden oder ist nicht sichergestellt, daß sich der Reflex der Mikrotiterplatten-Innenseite im Fangbereich der Regelschleife befindet, muß zuerst ein Reflex-Such lauf von einer definierten Z-Position in Richtung der Mikrotiterplatte erfolgen.
Besonders vorteilhaft kann der Autufokus auch noch um einige
µm elektronisch so korrigiert werden, daß nicht auf den Boden
(oder den Probenträger) sondern in die Probenlösung (die
Probe) hinein fokussiert wird.
Das erfolgt entweder durch einen automatischen elektronischen
Korrekturwert des Autofokus vor der Objektivansteuerung oder
über die Objektivverstellung selbst, die nach erfolgter
Fokussierung automatisch um einen geringen Betrag verstellt
wird.
In Fig. 6 ist eine Gesamtanordnung dargestellt, mit einer
Mikrotiterplatte MTP auf einem X/Y-Tisch und einem Pipettor
zur Probeneinführung auf die MTP und der in Fig. 1-5
dargestellten, hier schematisierten optischen Anordnung.
WS Standard- Wechselstelle
KL Einkoppellinse
BO Beleuchtungsoptik
AP Aperturblende
S Shutter
LF Leuchtfeldblende
AF Anregungsfilter
EF Emissionsfilter
RR Reflektorrevolver
FFT Farbteiler
O Objektiv
SPCCD Spiegel zur CCD
CCD Kamera
Laser LA2, LA3 für Autofokus
P Prisma
FO Fokussieroptik
ULS1,2 Umlenkspiegel
ST2 Strahlteiler
ZS Zerstreuungslinse
EFST Empfängerstrahlteiler
EF Empfänger
USSP Umlenkspiegel
ST3,4 Strahlteiler
MTD Monitordiode
MGS Mattglasscheibe
WSF Wärmeschutzfilter
PI Pipettor
MTP Mikrotiterplatte
KL Einkoppellinse
BO Beleuchtungsoptik
AP Aperturblende
S Shutter
LF Leuchtfeldblende
AF Anregungsfilter
EF Emissionsfilter
RR Reflektorrevolver
FFT Farbteiler
O Objektiv
SPCCD Spiegel zur CCD
CCD Kamera
Laser LA2, LA3 für Autofokus
P Prisma
FO Fokussieroptik
ULS1,2 Umlenkspiegel
ST2 Strahlteiler
ZS Zerstreuungslinse
EFST Empfängerstrahlteiler
EF Empfänger
USSP Umlenkspiegel
ST3,4 Strahlteiler
MTD Monitordiode
MGS Mattglasscheibe
WSF Wärmeschutzfilter
PI Pipettor
MTP Mikrotiterplatte
Claims (21)
1. Anordnung zur Untersuchung von einer oder mehreren in
Probengefäßen oder auf Probenträgern angeordneten Proben im
Durchlicht oder Auflicht,
mittels der Abbildung und/oder Erfassung mindestens eines
Teils des Probenvolumens durch das Probengefäß oder den
Probenträger hindurch über eine CCD-Kamera, der eine
Auswerteeinheit nachgeordnet ist.
2. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Auflichtbeleuchtung ebenfalls durch das
Probengefäß oder den Probenträger hindurch erfolgt.
3. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Beleuchtung der Anregung der Probenemission, vorzugsweise der
Fluoreszenzanregung dient.
4. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit der
Abbildung und/oder Erfassung auf einer von einer der
Einfüllvorrichtung abgewandten Seite durch ein Probengefäß
über eine CCD-Kamera, der eine Auswerteeinheit nachgeordnet
ist.
5. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei sich
mehrere Probengefäße auf einer Mikrotiterplatte befinden.
6. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
zur genauen Fokussierung der Abbildung ein Autofokussystem
vorgesehen ist, das einem Abbildungsobjektiv in Richtung der
Abbildung unmittelbar nachgeordnet ist.
7. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei über mindestens einen Strahlteiler eine Trennung von
Anregungs- und Abbildungsstrahlengang erfolgt.
8. Anordnung nach Anspruch 7, wobei
das Autofokussystem zwischen einem Abbildungsobjektiv und
diesem Strahlteiler eingeblendet wird.
9. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Einblendung des Autofokus über einen Farbteiler erfolgt.
10. Anordnung nach Anspruch 9, wobei der Farbteiler eine hohe
Transmission über einen breiten Spektralbereich (350-780 nm)
aufweist, d. h. vom kurzwelligen Anregungslicht einer HBO-Lampe
bis zum langwelligen Emissionsspektrum von roten
Farbstoffen, aber eine hohe Reflexion für Wellenlängen über
800 nm, insbesondere für das Licht eines Autofokuslasers.
11. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Autofokussystem in Richtung der Beleuchtung nach
der Lichtquelle/der Einkoppelstelle für die Beleuchtung
eingeblendet wird.
12. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einer Fokussierung auf Zellen am oder in der Nähe des
Bodens der Probengefäße.
13. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
mit einem x/-y Tisch zur Einbringung unterschiedlicher
Probengefäße in den Anregungsstrahlengang.
14. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
für jede Probe eine separate Fokussierung erfolgt.
15. Anordnung zur Justage bei Einkopplung einer Lichtquelle zur
Probenbeleuchtung nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei von einem einschiebbaren Spiegel das Licht der
Lichtquelle in einer Justageposition auf eine
Mattglasscheibe MGS umgelenkt wird, wodurch die Lage des
Lichtquellenbildes zur optischen Achse von der Bedienperson
justiert werden kann.
16. Anordnung nach Anspruch 15,
wobei in einer Normalstellung mit eingeschobenem
Strahlteiler ST4 ein geringer Teil der Lichtintensität
(etwa 4%) zur Erfassung und Regelung der Lichtleistung auf
eine Monitordiode MTD gelangt.
17. Verfahren zur automatischen Fokussierung, insbesondere nach
einem der vorangehenden Ansprüche, wobei über mindestens einen
Fokussierstrahl das Probengefäß von unten beleuchtet wird und
die vom Probengefäß reflektierten Strahlungsanteile mittels
eines CCD-Empfängers ausgewertet werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17,
wobei von unterschiedlichen Grenzschichten des Probengefäßes
stammende Strahlungsanteile identifiziert werden und eine
Fokussierung auf eine Grenzschicht erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei eine Fokussierung auf den Gefäßboden erfolgt.
20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei das Probengefäß eine Mikrotiterplatte ist.
21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei bei der Fokussierung ein Korrekturwert für den
Autofokus und/oder eine Verstelleinrichtung zur Fokussierung
auf die Probe/ins Innere des Probengefäßes
berechnet und/oder eingestellt wird.
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