DE19913862C2

DE19913862C2 - Verfahren zur biokatalysierten Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substanzen

Info

Publication number: DE19913862C2
Application number: DE1999113862
Authority: DE
Inventors: Guenther Schmitz; Rald Takors; Dirk Weuster-Botz; Christian Wandrey
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2003-04-10
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: DE19913862A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung von in Wasser schwer löslichen Verbindungen in einem wässrigen Milieu mittels eines Biokatalysators.

Die Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substrate mit biologischen Systemen ist im einfachen Satzreaktor meist unökonomisch, wenn aufgrund geringer Wasserlöslichkeit nur geringe Substratkonzentrationen vorgelegt und damit geringe Produktkonzentrationen erreicht werden. Dies gilt gleichermaßen für eine Umsetzung mit einem zellfreien System, wobei die Umsetzung mit reinen Enzymen durchgeführt wird, als für eine Umsetzung mit bestimmten ausgesuchten Zellen.

Eine erste Verbesserung sieht vor, das Verfahren kontinuierlich mit Rückhaltung des Katalysators im Reaktionsraum durchzuführen. Diese Ausführung führt zu einer Verbesserung der Produktivität durch eine entsprechende Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute und dadurch zu einer Verringerung der Kapitalkosten. Die Produktkonzentration im Reaktionsraum bleibt jedoch weiterhin niedrig. Darüberhinaus muß unter Umständen noch eine Abtrennung des nicht umgesetzten Restsubstrates vom Produkt erfolgen.

Daher sieht eine weitere Verbesserung vor, dem Reaktionssystem üblicherweise eine organische Phase als zweite nichtmischbare Flüssigphase zuzusetzen (z. B. DE-A-44 36 149 und DE-A-39 13 367). Diese organische Flüssigphase wird so gewählt, dass aufgrund des Verteilungskoeffizienten des Substrates zwischen organischer Phase und Wasserphase keine Übersättigung der wässrigen Phase eintreten kann, in der die Reaktion stattfindet. Die organische Phase stellt also ein Substratreservoir dar. Gleichzeitig dient diese nicht mischbare organische Phase zur Extraktion des bei der Reaktion gebildeten Produktes. Durch eine 'Mixer-Settler'-Anordnung wird die organische Phase nach Ablauf der Reaktion von der wässrigen Phase mit dem Biokatalysator getrennt. In der organischen Phase können damit hohe Produktkonzentrationen erreicht werden. Der Auswahl der organischen Phase ist dabei selbstverständlich nicht frei, sondern wird durch das Löslichkeitsverhalten der umzusetzenden Verbindung vorgegeben.

Die Verwendung einer organischen Phase, die ideale Verteilungskoeffizienten für Substrat und Produkt ermöglicht, führt jedoch oft zu einer Zerstörung des biologischen Katalysators in der wässrigen Phase. Sowohl Proteine als auch intakte Zellen reagieren sehr empfindlich auf das Vorhandensein nicht- physiologischer Komponenten in ihrem Umfeld und bereits relativ geringe Mengen organischer Lösungsmittel können eine Denaturierung der Proteine oder eine Abnahme der Vitalität der Zellen hervorrufen. Zur Lösung dieses Problems wird deswegen versucht, durch den Einsatz von Membranverfahren einen direkten Kontakt zwischen Biokatalysator und organischer Phase zu verhindern (gemäß DE-C-35 33 615 und US-A-5,077,217). Die Bereitstellung einer großen Phasentrennfläche ist jedoch umständlich und scheidet dadurch sogar völlig aus, wenn das Verfahren in größerem Maßstab betrieben werden soll.

Ein anderer Ansatz zur Bereitstellung von schlecht wasserlöslichem Substrat ist die Suspendierung des Substrates als mikrokristalliner Feststoff im wässrigen Reaktionsmedium ('mikrokristalline Feststoff-Fermentation'). Das während der Reaktion gebildete Produkt fällt in der Regel ebenfalls im Reaktor aus, so dass nach vollständigem Umsatz lediglich eine Fest-Flüssig- und eine Fest-Fest- Trennung durchgeführt werden muss, um das Produkt zu erhalten. Dieses Verfahren ist jedoch nicht anwendbar, wenn das gebildete Produkt bei Konzentrationen unterhalb der Sättigungsgrenze für den Biokatalysator toxisch ist und ist auch wenig praktikabel, wenn bei der Reaktion eine Produkthemmung eintritt.

Es steht somit kein befriedigendes Verfahren zur Verfügung, um schlecht in Wasser lösliche Verbindungen mit Einsatz biologischer Hilfsmittel umzusetzen. Ein solches Verfahren wird jedoch als sehr wünschenswert angesehen, da die rein chemischen Umsetzungen, die selbstverständlich unter Einsatz sämtlicher verfügbarer organischer Lösungsmittel durchgeführt werden können, häufig nicht die gewünschte Reaktionsselektivität besitzen, was z. B. bei stereoselektiven Synthesen einen großen Nachteil darstellen kann. Außerdem wird man in solchen Fällen, wo das Produkt der Umsetzung an Versuchstieren oder Menschen verabreicht werden soll, sicherlich ein Herstellverfahren, das ohne Einsatz möglicherweise toxischer Lösungsmittel auskommt, bevorzugen.

Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Umsetzung einer ersten, schlecht in Wasser löslichen Verbindung (Substrat) in eine zweite Verbindung (Produkt) verfügbar zu stellen, das unter Einsatz biologischer Hilfsmittel abläuft und zu einer akzeptablen Ausbeute führt. Das Verfahren soll insbesondere geeignet sein, in technischem Maßstab benutzt zu werden. Außerdem soll das Verfahren sich zur Herstellung von jeglichen Produkten eignen, wobei es z. B. keine Rolle spielt, ob diese Produkte mehr oder weniger toxisch für den Biokatalysator sind.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine Trennung der Bestandteile des Verfahrens vorgenommen wird, wobei die erste Verbindung und der Biokatalysator in dem Bioreaktor verbleiben und die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor ausgeschieden wird, und wobei die erste Verbindung als mikrokristalline Kristalle vorliegt.

Ausgangspunkt im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Umsetzung von schlecht in Wasser löslichen Verbindungen. Dabei ist keine Grenze zur Löslichkeit der ersten Verbindung in Wasser anzugeben. Es ist offensichtlich, dass bei Durchführung des Verfahrens in großtechnischem Maßstab bereits eine relativ geringfügige Einschränkung der Ausbeute durch verminderte Löslichkeit nicht hinnehmbar ist, wohingegen im Labormaßstab eine solche Einschränkung u. U. noch toleriert werden kann.

Die in Wasser schlecht löslichen Verbindungen sind als Gruppe nicht in irgendeiner Weise eingeschränkt. Sämtliche Verbindungen kommen im erfindungsgemäßen Verfahren grundsätzlich in Betracht. Bedarf kann in einer Reihe von theoretisch denkbaren Umständen angenommen werden. Es gibt viele Fälle, wo die reine Chemie zur Umsetzung einer ersten Verbindung in eine bestimmte weitere Verbindung versagt, weil aus irgendwelchen Gründen die Reaktion eine zu geringe Ausbeute aufweist, oder im Bioreaktor eine Mischung von Produkten und/oder Ausgangsverbindungen entsteht, welche sich unter Einsatz üblicher Verfahren und Hilfsmittel einer Aufreinigung verschließt. Es ist insbesondere bei Herstellungen die eine ganz bestimmte Konfiguration des Moleküls ansteuern, wie z. B. bei einer stereoselektiven Herstellung, manchmal ein unlösbares Problem, eine solche Herstellung befriedigend ablaufen zu lassen. Außerdem ist immer zu beachten, dass ein Verfahren gebraucht wird, das auch industriell anwendbar ist und deswegen keine unnötig aufwendigen und komplizierten Schritte aufweisen soll.

Es besteht desweiteren ein praktischer Bedarf, Metabolite von Arzneimitteln herstellen zu können. Solche Metabolite können z. B. dann von Interesse sein, wenn man sich von diesen Metaboliten eine andere therapeutische Wirkung oder eine Verbesserung der therapeutischen Breite verspricht oder wenn durch Anwendung der Metabolite eine Verbesserung der Aufnahme im Körper des Patienten bewirkt werden kann. Neben diesen Möglichkeiten, wo im Grunde der Metabolit selbst als Arzneimittel untersucht und weiterentwickelt werden soll, gibt es noch einen weiteren Bedarf, wo es sich um gezielte pharmakokinetische und toxikologische Untersuchungen innerhalb der Arzneimittelentwicklung handelt. Fragen nach besondere Eigenschaften der Metaboliten gehören allmählich zum Standardpaket einer Arzneimittelentwicklung und es ist eine ganz besondere Anforderung an einer Entwicklungsabteilung, die gewünschten Mengen der Metabolite bereitzustellen. Insbesondere solche Fragestellungen können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlich einfacher und mit weniger Aufwand aufgegriffen werden.

Die erste, schlecht in Wasser lösliche Verbindung liegt im Bioreaktor in teilweise festem Zustand vor. Dies ist logischerweise bedingt durch seine Eigenschaft der schlechten Löslichkeit in Wasser und durch die Tatsache, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine solche Ausführungsform aufweist, dass eine Berührung mit organischen Lösungsmitteln weitgehend ausgeschlossen ist. Die Möglichkeit, im Bioreaktor oder in einer dem Bioreaktor zugeordneten Anordnung eine zweite flüssige Phase vorzulegen, welche eine flüssige Phase auf der Grundlage eines organischen Lösungsmittels ist, wird im erfindungsgemäßen Verfahren bewusst umgangen. Es ist jedoch offensichtlich, dass eine Vorgehensweise, wo dem Bioreaktor die erste Verbindung einfach zugesetzt wird, dann zu weniger ansprechenden Ergebnissen führt, wenn lediglich eine äußerst niedrige Konzentration im wässrigen Milieu erzielt wird. Aus diesem Grund sieht das erfindungsgemäße Verfahren vor, dass die erste Verbindung im wässrigen Milieu in mikrokristalliner Form vorliegt. Als Mikrokristalle werden üblicherweise feste Partikel bezeichnet, die eine Korngröße im Bereich von 1 bis 30 µm aufweisen. Wenn die erste Verbindung im wässrigen Milieu eine Korngröße in diesem Bereich aufweist, wird überraschenderweise beobachtet, dass die Umsetzung der ersten Verbindung in die zweite Verbindung wesentlich schneller und mit einer größeren Ausbeute abläuft.

Das erfindungsgemäße Verfahren sieht konkret vor, dass die erste schlecht in Wasser lösliche Verbindung mikrokristallin in dem wässrigen Milieu mit dem Biokatalysator suspendiert wird. Die Herstellung einer solchen Suspension kann mit geläufigen Methoden durchgeführt werden. Eine vorteilhafte Art der Zugabe des Substrates in einen Reaktor kann die Verwendung eines vollständig mit Wasser mischbaren Lösungsmittels darstellen, in dem die erste Verbindung gut lösbar ist. Durch Zugabe eines kleinen Lösungsmittelpulses mit dem gelösten Substrat in einen Bereich höchster Turbulenz im Reaktor wird das mit Wasser vollständig mischbare Lösungsmittel schlagartig verteilt. Dabei fällt das zuvor gelöste Substrat im Reaktor mikrokristallin aus. Diese Zugabe, welche manuell oder gemäß einer bevorzugten Ausführungsform rechnergesteuert durchgeführt werden kann, hat sich als sehr effektiv und gut durchführbar erwiesen. Es widerspricht zwar dem Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens, um ohne organische Lösungsmittel auszukommen, aber es hat sich gezeigt, dass die erforderliche Menge des organischen Lösungsmittels gering ist und die schlagartige Verteilung in dem wässrigen Milieu zu einer äußerst niedrigen Konzentration des organischen Lösungsmittels in dem wässrigen Milieu führt. Aus diesem Grund stellt die Anwesenheit des organischen Lösungsmittels keine Belastung des Verfahrens dar. Sollte trotzdem im Rahmen eines bestimmten Prozesses für die Herstellung der mikrokristallinen Suspension eine größere Menge eines unverträglichen Lösungsmittels erforderlich sein, hat der Fachmann immerhin die Möglichkeit zunächst die Suspension der mikrokristallinen ersten Verbindung herzustellen und im zweiten Schritt, also bevor der Biokatalysator zugefügt wird, das organische Lösungsmittel zu entfernen oder zumindest seine Konzentration auf einem akzeptablen Niveau zu reduzieren. Da dieser Schrift das Verfahren jedoch kompliziert, sieht diese bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens jederzeit vor, zur Herstellung der mikrokristallinen Suspension eine Lösung der ersten Verbindung in einem verträglichen Lösungsmittel vorzulegen.

Die Umsetzung der ersten schlecht in Wasser löslichen Verbindung wird im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem biologischen System (Biokatalysator) durchgeführt. Der Biokatalysator kann ein bestimmtes Enzym oder eine Kombination mehrerer Enzyme sein. Diese meist einfache Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne Anwesenheit von Ganzzellen hat viele praktische Vorteile, wird jedoch häufig nicht zum gewünschten Erfolg führen, wenn es mehr komplizierte Umsetzungen betrifft. Ein solcher Biokatalysator kann im Rahmen der Erfindung ebenfalls ein System sein, das bestimmte Zellen umfasst. Dabei wird die Auswahl der Zellen sich nach der Fragestellung richten. Wenn das Verfahren mit Mikroorganismen durchführbar ist, wie z. B. mit Bakterien, Pilzen oder Hefen, wird es viele Vorteile haben, diese Variante zu wählen. Es gibt jedoch genausogut die Überlegung zur Durchführung des Verfahrens pflanzliche Zellen oder Zellen tierischen Ursprungs zu wählen. Es wurde bereits vorstehend erwähnt, dass eine Anwendung zur Herstellung von Metaboliten von Arzneimitteln im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nahe liegt. Eine solche Herstellung kann naturgemäß hervorragend mit den natürlichen metabolisierenden Zellen, wie z. B. Leberzellen von Mensch oder Tier, durchgeführt werden.

Es ist außerdem davon auszugehen, dass die Verbesserung der gentechnologischen Verfahren zu weiteren Möglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens führen wird.

Die erste, in Wasser schwer lösliche Verbindung wird durch den Biokatalysator in eine zweite Verbindung umgesetzt. Die Art der Umsetzung ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht in irgendwelcher Weise eingeschränkt. Es kann sich somit um jede mit Biokatalysatoren durchführbare Reaktion handeln. Da das erfindungsgemäße Verfahren als Merkmal aufweist, dass eine in Wasser schwer lösliche Verbindung umgesetzt wird, wird die zweite Verbindung häufig eine mehr polare Verbindung sein, welche durch einen oxidativen Reaktionsvorgang aus der ersten Verbindung entstanden ist. Es sind jedoch ebenfalls Reaktionen denkbar, wo die zweite Verbindung die gleiche Polarität wie die erste Verbindung aufweist und die Löslichkeit in Wasser sich u. U. nicht verändert hat. Es wird im Rahmen der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens von einer ersten, schwer in Wasser löslichen Verbindung gesprochen, welche das Ausgangsprodukt im Verfahren darstellt und somit auch als Substrat bezeichnet werden kann. Diese erste Verbindung wird durch den Biokatalysator in eine zweite Verbindung umgesetzt. Diese zweite Verbindung ist die Verbindung, welche am Ende des Verfahrens aus dem Bioreaktor gewonnen wird. Es ist demnach nicht erforderlich, dass die zweite Verbindung in einem einzelnen Schritt aus der ersten Verbindung entstanden ist, es ist in vielen Fällen sogar bekannt, dass die Umsetzung eine Kette von einzelnen Schritten umfasst, wobei die erste Verbindung demnach zunächst in eine andere Verbindung umgesetzt wird bevor am Ende des Verfahrens die zweite Verbindung gebildet wird. Auch solche Reaktionen werden jedoch ausdrücklich vom erfindungsgemäßen Verfahren umfasst.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Bioreaktor durchgeführt. Als Bioreaktor werden die Behältnisse bezeichnet, in denen biologische Umsetzungen mit Biokatalysatoren durchgeführt werden. Bioreaktoren sind speziell entworfen, um die erforderlichen optimalen Bedingungen für die Umsetzung herzustellen. Jeder Biokatalysator benötigt sehr spezifische Bedingungen hinsichtlich Temperatur, pH-Wert und Nährstoffkonzentration und der Bioreaktor ist mit solchen Hilfsmitteln ausgestattet, um diese Bedingungen optimal erfüllen zu können. Der Bioreaktor ist üblicherweise mit einem Rührsystem ausgestattet, um eine gute Vermischung der Bestandteile zu gewährleisten, mit einem Wärmetransportsystem um die optimale Temperatur einstellen zu können und mit Mitteln um Nährstoffe und Sauerstoff zuzuführen. Außerdem kann es erforderlich sein, den Bioreaktor mit Hilfsmitteln auszustatten, welche es ermöglichen, das Verfahren steril durchzuführen, was insbesondere bei Verfahren die mit Ganzzellsystemen durchgeführt werden, üblicherweise eine Anforderung sein wird. Auch die Auswahl des Trennverfahrens spielt eine Rolle bei der genauen Ausgestaltung des Bioreaktors.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird naturgemäß in einem wässrigen Milieu durchgeführt werden. Ein wässriges Milieu kann demineralisiertes Wasser, destilliertes Wasser, Leitungswasser oder gepuffertes Wasser sein, üblicherweise jedoch wird im Rahmen der Erfindung eine Nährlösung benutzt werden, die Wasser als flüssige Phase aufweist, aber ein Reihe von Komponenten aufweist, die zur optimalen Funktion der Zellen erforderlich sind. Zur Instandhaltung einer gleichbleibenden Produktivität einer Zellkultur wird es erforderlich sein, dem Milieu, welches die Zellen enthält, eine konstante Zusammensetzung zu verschaffen. Dabei ist auf einen pH-Wert innerhalb eines bestimmten kleinen Rahmens zu achten, sowie auf die permanente Anwesenheit ausreichender Mengen an Grundstoffen, und es ist ebenfalls zu gewährleisten, dass bestimmte Stoffwechselprodukte ständig aus dem Milieu entfernt werden. Verfahren und Mittel, um konstante Bedingungen im Verfahren einzuhalten, sind dem Biotechnologen bekannt und werden nicht weiter erörtert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur biokatalysierten Umsetzung schlecht wasserlöslicher Substanzen zeichnet sich dadurch aus, dass das Substrat in dem wässrigen Reaktionsmedium mit dem Biokatalysator suspendiert wird und eine Trennung der Bestandteile im Verfahren vorgenommen wird. Die erste, in Wasser schlecht lösliche Verbindung und der Biokatalysator verbleiben im Bioreaktor, während die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor ausgeschieden wird. Diese Maßnahme stellt eine überraschende Verbesserung der bekannten Verfahren dar und führt zu erheblich höheren Ausbeuten der gebildeten zweiten Verbindung. Es ist an sich keine unbekannte Maßnahme im Rahmen biotechnologischer Prozesse, Endprodukte aus dem Reaktor zu entfernen, wie z. B. bei der Herstellung von Produkten, die selber eine negative Auswirkung auf den Reaktionsablauf haben. Bei diesen bekannten Verfahren liegt die Notwendigkeit und der Vorteil der Entfernung der zweiten Verbindung primär in der Eigenschaft dieser zweiten Verbindung, einen Einfluss auf die Reaktion im Reaktor auszuüben. Demgegenüber lässt sich der Vorteil der Abtrennung der zweiten Verbindung beim erfindungsgemäßen Verfahren bei solchen Umsetzungen feststellen, die von einer ersten, schlecht in Wasser löslichen und als mikrokristalline Kristalle vorliegenden Verbindung ausgehen.

Die Trennung der im Bioreaktor vorliegenden Bestandteile ist ein wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Dabei ist vorgesehen eine Trennung der zweiten Verbindung von den weiteren Bestandteilen im Bioreaktor, insbesondere von dem Biokatalysator und der ersten Verbindung vorzunehmen. Die Trennung bietet daraufhin die Möglichkeit, die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor auszuscheiden. Die erste Verbindung und der Biokatalysator verbleiben weiterhin in dem Bioreaktor. Es spricht von selber, dass diese Ausführungsform des Verfahrens sich am besten eignet in einem kontinuierlichen Prozess angewandt zu werden. Die umgekehrte Vorgehensweise, wobei die erste Verbindung und der Biokatalysator aus dem Bioreaktor ausgeschieden werden, kommt zwar grundsätzlich ebenso in Betracht, eignet sich jedoch weniger für eine kontinuierliche Durchführung. Das Verfahren kann jedoch jederzeit als einen einzigen Ansatz durchgeführt werden und bei Versuchsvorhaben, welche lediglich eine einmalige Herstellung einer bestimmten zweiten Verbindung vorsehen, gibt es auch keinen Grund, das Verfahren nicht als einziger Ansatz durchzuführen, aber es wird doch vermutet, dass die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sich am ehesten bei einer Anwendung in einem kontinuierlichen Prozess zeigen werden.

Durch die Ausscheidung der ersten Verbindung aus dem Bioreaktor wird ihre Konzentration auf einem ständig niedrigen Niveau gehalten, was für den Ablauf der Reaktion äußerst günstig ist. Es ist im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dem Bioreaktor mit einem Erfassungssystem auszustatten, damit die Konzentration der zweiten Verbindung ständig überwacht werden kann. Es ist eine mehr bevorzugte Ausführungsform, dieses Erfassungssystem so auszubilden, dass die Erfassung on-line durchgeführt werden kann und die Regelung der Trennung automatisch gesteuert wird. Die on-line-Erfassung der zweiten Verbindung kann beliebig durchgeführt werden, bevorzugt wird ein apparativ einfaches Vorgehen, wie z. B. eine spektrophotometrische Erfassung der Konzentration der zweiten Verbindung. Kompliziertere Systeme sind jedoch ebenfalls denkbar und dem Fachmann stehen in der Literatur eine Reihe von Maßnahmen zur Verfügung.

Die Art der Trennung kann beliebig ausgestaltet werden. Sie wird praktisch dadurch bedingt sein, wie sich im speziellen Fall die Eigenschaften der zweiten Verbindung von jenen der ersten Verbindung und dem Biokatalysator unterscheiden. Eine relativ einfache Trennung kann durchgeführt werden, wenn die zweite Verbindung ein verändertes Löslichkeitsprofil in Wasser zeigt, wobei dieses veränderte Löslichkeitsprofil im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens häufig eine Erhöhung der Löslichkeit in Wasser sein wird. Da die erste Verbindung in Wasser lediglich in sehr geringen Mengen vorliegt, kann für die Trennung der ersten Verbindung von der zweiten Verbindung ein Filtrationsverfahren gewählt werden, wobei das Filtrat in gelöster Form die zweite Verbindung aufweist und die Oberfläche des Filtermittels die dispergierten Teilchen der ersten Verbindung zurückhält. Da das Verfahren die erste Verbindung als Mikrokristalle vorsieht, muss selbstverständlich eine ausreichende Filtrationsleistung des Filtermittels beachtet werden. Ob bei dem Trennvorgang, insbesondere bei einem Filtrationsvorgang, der Biokatalysator ebenfalls mit der ersten Verbindung zusammen abgetrennt wird, wird dadurch bedingt ob dieser ebenfalls wie die erste Verbindung abtrennbar ist. Liegt der Biokatalysator als Mikroorganismus oder als Zellen vor, so wird er einfach mit der ersten Verbindung von der flüssigen Phase abgetrennt werden. Sogar wenn der Biokatalysator ein Enzym umfasst, welches nicht an feste Partikel gebunden ist, sondern frei gelöst in dem wässrigen Milieu vorliegt, scheidet eine Abtrennung durch Filtration nicht aus, muss jedoch eine spezielle Methode selektiert werden. Es müssen dann Filtermittel (Membrane) eingesetzt werden, die eine Trenngrenze unterhalb der Größe der eingesetzten Enzyme haben, wie Ultrafiltrationsmembrane mit einem entsprechenden cut-off, im Gegensatz zu Mikrofiltrationsmembranen. Entsprechendes gilt, wenn der Biokatalysator mehr als ein Enzym umfasst.

Eine Filtration stellt sicherlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine bevorzugte Ausführungsform zur Abtrennung der zweiten Verbindung dar. Filtrationsverfahren stellen generell in der Technik und insbesondere auch in biotechnologischen Verfahren eine gut bekannte und bevorzugte Methode dar und werden in vielen denkbaren Fällen als Mittel der Wahl angesehen werden. Die Ausführung der Filtration kann dabei als Oberflächenfiltration ausgestaltet sein, wobei allerdings die Bildung eines Filterkuchens im Rahmen eines kontinuierlichen Prozesses häufig keinen Vorteil darstellen wird, weshalb hier bevorzugt die Querstromfiltration angewandt wird, wobei eine Strömung parallel zur Filteroberfläche erzeugt wird und sich keinen Filterkuchen bildet. Es stellt ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform dar, als Filtrationsprinzip ein Rotationsfilter zu verwenden.

Die Ausgestaltung des Bioreaktors wird durch das ausgewählte Trennverfahren stark beeinflusst werden. Bei einer Ausgestaltung als Filtration wird der Filtrationsvorgang üblicherweise in einem dem Bioreaktor zugeordneten Bypass durchgeführt werden. Bei der bevorzugten Querstrom-Filtration wird die wässrige Suspension an dem Filter in einem solchen Bypass vorbeigeführt. Demgegenüber kann ein Rotationsfilter direkt in der Flüssigphase des Bioreaktors installiert werden und wird die Anordnung des Bioreaktors keinen Bypass enthalten. Sieht das Verfahren ein Rotationsverfahren vor, so kann der Bioreaktor selbst als drehbare Zentrifuge ausgestaltet sein. Diese Anordnung des Bioreaktors enthält ebenfalls keinen Bypass.

Die Abtrennleistung der Fest-Flüssig-Trennung muss mit Hilfe des Volumenstroms des abgetrennten wässrigen Reaktionsmediums mit dem gelösten Produkt so eingestellt werden, dass weder eine toxische Konzentration der zweiten Verbindung im Reaktor überschritten wird, noch eine Ausfällung des Produktes im Reaktor erfolgt.

Eine Regelung des Volumenstroms des abgetrennten wässrigen Reaktionsmediums mit der gelösten zweiten Verbindung kann durch die online- Messung der Produktkonzentration im wässrigen Reaktionsmedium ermöglicht werden: Bei Überschreitung einer vorgegeben Grenzkonzentration wird der Volumenstrom des abgetrennten wässrigen Reaktionsmediums erhöht. Bei Unterschreitung wird dieser Volumenstrom reduziert.

Um eine sichere kontinuierliche Abtrennung von Biokatalysator und mikrokristallinem Substrat zu erreichen, müssen die physikalischen Eigenschaften auf denen die gewählte Fest-Flüssig-Trennung beruht, zwischen Biokatalysator und dem Substrat möglichst ähnlich sein.

Wird eine Querstromfiltration zur kontinuierlichen Abtrennung eingesetzt, müssen die Partikelgrößen von Biokatalysator und Substrat oberhalb der Porengröße der verwendeten Membran liegen.

Wird ein Zentrifugalseparator, Sedimenter oder Dekanter zur kontinuierliche Abtrennung eingesetzt, müssen die Sinkgeschwindigkeiten von Biokatalysator und Substrat größer als die notwendige Grenzsinkgeschwindigkeit sein.

Die aufkonzentrierten Feststoffe (Biokatalysator und Substrat) werden nach der Fest-Flüssig-Trennung in den Suspensionsreaktor zurückgeführt.

Das abgetrennte wässrige Reaktionsmedium mit dem gelösten Produkt wird kontinuierlich abgeführt.

Um ein gewünschtes Reaktionsvolumen aufrecht zu erhalten, wird gleichzeitig ein entsprechender Volumenstrom Wasser für die Biokatalyse in den Suspensionsreaktor dosiert, wobei dem Wasser gegebenenfalls Nährstoffe oder Cosubstrate zugesetzt sein können.

Das erfindungsgemäße Verfahren ruft eine Reihe von Verbesserungen hervor. Nicht nur eignet sich das Verfahren zur Durchführung der Umsetzung von schlecht in Wasser löslichen Verbindungen, ebenfalls wird es möglich sein, das Verfahren einzusetzen, wenn eine erste Verbindung umgesetzt werden soll, welche stark toxische Eigenschaften besitzt, was bei der Anwendung von Mikroorganismen oder Zellen als Biokatalysator einen großen Nachteil darstellt. Bei einer solchen toxischen ersten Verbindung ist demnach das Problem nicht, dass keine höhere Konzentrationen im wässrigen Milieu erreichbar sind, sondern dass solche höhere Konzentrationen im Hinblick auf einen dauerhaften Betrieb der Umsetzung zu vermeiden sind.

Ein weiterer Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt die Möglichkeit dar, relativ gut in Wasser lösliche Substrate vor der Umsetzung in eine schwer lösbare Form zu überführen, um diese kristallin im Reaktor zurückzuhalten. Eine Möglichkeit ist die Komplexierung gut in Wasser löslicher Substrate mit Cyclodextrinen. Ein solcher Komplex ist schwer in Wasser löslich. Das Verfahren wird in der Technik bereits eingesetzt, um in der Umwelttechnik toxische Verbindungen für Mikroorganismen verfügbar zu machen (siehe z. B. A. Schwartz, R. Bar; Appl. Environ. Microbiol. 61, 7 (1995): 2727-2731).

Auch die Möglichkeit, die das erfindungsgemäße Verfahren bietet, gleichzeitig den Biokatalysator und sein Substrat im Bioreaktor zurückzuhalten, ist sehr vorteilhaft. Insbesondere im Rahmen eines kontinuierlichen Verfahrens, wobei es das Ziel ist, über längere Zeiträume eine bestimmte Umsetzung vorzunehmen, wobei während des Verfahrens die Ausscheidung des Reaktionsprodukts vorgenommen wird, macht es keinen Sinn, ein Trennverfahren zu wählen, das auch eine Trennung von Biokatalysator und erster Verbindung hervorruft, weil diese beide Bestandteile im Verfahren ohnehin später wieder zusammengeführt werden müssen. Das Verfahren so auszugestalten, dass nur abgetrennt wird, was abgetrennt werden muss und zusammen lässt, was zusammen bleiben soll, entspricht nicht nur der Logik des Verfahrenstechnikers, sondern es vermeidet auch jegliche unnötige Verschwendung von Aufwand und Ressourcen.

Wenn bei einer Umsetzung eine toxische zweite Verbindung gebildet wird, hat das erfindungsgemäße Verfahren den großen Vorteil, auf einfacher Weise diese toxische Verbindung aus dem Bioreaktor abtrennen zu können. Es ist kein Problem, das Verfahren so auszugestalten, dass die Konzentration der toxischen zweiten Verbindung durch eine angepasste Regelung des Trennvorgangs, welcher, wie vorstehend ausgeführt, geschickterweise durch eine on-line- Überwachung gesteuert wird, unterhalb eines vorgegebenen niedrigen Wertes zu halten. Es ist offensichtlich, dass dabei diese ausgesprochen nützliche Möglichkeit sogar angewandt werden kann, wenn sowohl erste wie zweite Verbindung wasserlöslich sind, da es in diesem Fall sehr vorteilhaft ist, die erste Verbindung durch entsprechende Vorbereitung als Mikrokristalle im Bioreaktor vorzulegen. Durch diese Anpassung der Korngröße der ersten Verbindung, welche bei dieser besonders bevorzugten Ausführungsform wasserlöslich sein kann, wird die einfache Möglichkeit der Abtrennung der toxischen zweiten Verbindung im Verfahren auf künstliche Weise hergestellt.

Daß das erfindungsgemäße Verfahren außerdem auf sehr vorteilhafte Weise die Anwendung von einer zusätzlichen organischen flüssigen Phase vermeidet, ist im Anbetracht der vorstehenden Beschreibung nunmehr offensichtlich.

Dieses Vermeiden ist in mehrerer Hinsicht vorteilhaft. Nicht nur wird eine Kostenerhöhung bedingt durch die Anschaffung solcher Lösungsmittel vermieden, am Ende wird auch eine weitere finanzielle Konsequenz vermieden, wenn es um die Entsorgung solcher Lösungsmittel geht. Auch hier kann angemerkt werden, dass bereits relativ geringe Kostenvorteile im industriellen Maßstab eine große Bedeutung erhalten können.

Da das erfindungsgemäße Verfahren auf geschickte und überraschende Weise verschiedene Aspekte eines Umsetzungsverfahrens vereint, kann mit dem Verfahren eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute erzielt werden.

Die folgenden Anwendungsgebiete bieten sich für das erfindungsgemäße Verfahren an: eine biotechnologische Produktion von Pharmazeutika in der Pharmaindustrie, eine biotechnologische Produktion von Feinchemikalien in der Chemieindustrie und eine biotechnologische Produktion von Aromastoffen in der Lebensmittelindustrie.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Abbildungen näher erläutert:

Fig. 1 stellt die schematische Abbildung eines Bioreaktors zur Durchführung des Verfahrens dar,

Fig. 2 ist die Darstellung der regioselektiven Oxidation von Terfenadin im Rührreaktor.

Die Abb. 1 zeigt einen Bioreaktor 1, welcher sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet. Der Bioreaktor 1 besteht im wesentlichen aus einem Behältnis aus rostfreiem Stahl, das von einem Mantel 2, welcher Heiz- bzw. Kühlmittel zur Einhaltung der optimalen Temperatur aufweist, umgeben wird. Im Bioreaktor 1 befindet sich die Reaktionslösung 6, welche eine wässrige Lösung ist. Der Bioreaktor 1 ist mit einer Leitung 3 zum Zufuhr von Sauerstoff oder Luft (oder ein anderes Sauerstoff haltendes Gasgemisch) ausgestattet. Ein Motor 4 treibt ein Rührmittel 5 an. Eine Anfuhrleitung 7 führt die erste Verbindung zum Reaktor, wird diese erste Verbindung als Mikrokristalle im System gewünscht, wird über dieser Anfuhrleitung die Lösung der ersten Verbindung in einem organischen Lösungsmittel in die wässrige Lösung 6 geschossen. Eine weitere Zufuhrleitung 8 führt die wässrige Lösung an, welche wässrige Lösung gegebenenfalls Cosubstrat oder weitere im Prozess benötigte Hilfsstoffe enthält. Über noch eine weitere Zufuhrleitung 9 kann ein eventuell erforderliches Korrekturmittel zugeführt werden, was z. B. eine Chemikalie zur Einstellung des richtigen pH-Wertes sein kann. Über eine Leitung 10 kann ein Teil der Gasphase entfernt werden. Dem Bioreaktor 1 ist ein Bypass zugeordnet, welcher ein Filter 13 und eine Leitung 12 stromaufwärts und eine Leitung 14 stromabwärts des Filters umfasst. In der Leitung 12 befindet sich eine Pumpe 11.

Nicht dargestellt in der Abbildung sind Mittel um die Konzentration der zweiten Verbindung in der wässrigen Lösung zu bestimmen. Solche Mittel werden zweckmäßig in der Leitung 12 angeordnet. Für eine automatische Steuerung des Verfahrens werden solche Mittel in einem ebenfalls nicht dargestellten Rechnersystem integriert werden, das zur Regelung der Filterleistung die Wirkung der Pumpe 11 steuert.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in einer Anlage wie in der Abb. 1 dargestellt durchgeführt wird, wird die wässrige Reaktionslösung 6, welche das wässrige Milieu, den Biokatalysator und die erste Verbindung sowie die zweite Bindung enthält durch die Wirkung der Pumpe 11 durch das Filter 13 gepumpt. Das Filter 13 kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ein Querstrommikrofilter sein.

Durch die Filterwirkung wird eine Trennung erzielt, wobei sich in der Leitung 14 eine aufkonzentrierte Suspension befindet, welche die erste, schlecht in Wasser lösliche Verbindung und den Biokatalysator aufweist und das Filtrat 15 das abgetrennte wässrige Milieu mit der gelösten zweiten Verbindung darstellt. Die aufkonzentrierte Suspension wird über die Leitung 14 in den Bioreaktor zurückgeführt. Das Filtrat mit der gelösten zweiten Verbindung wird kontinuierlich abgeführt.

In einer nicht gezeigten Anordnung wird die Isolierung der zweiten Verbindung aus dem Filtrat vorgenommen. Diese Isolierung kann mit gängigen Mitteln vorgenommen werden. Nach Entfernung der zweiten Verbindung aus dem Filtrat kann dieses wieder im Verfahren benutzt werden, um ein gewünschtes Reaktionsvolumen aufrecht zu erhalten. Sollte im Verfahren nicht vorgesehen werden, das Filtrat nach der Isolierung der zweiten Verbindung wiederzuverwenden, muss durch eine andere Maßnahme gewährleistet sein, dass das Volumen im gesamten System konstant bleibt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert werden. Dieses Beispiel betrifft die regioselektive Oxidation von Terfenadin.

Beispiel Terfenadin

Bei Terfenadin handelt es sich um ein Antihistaminikum, welches aufgrund seiner nicht-sedativen Wirkung seit seiner Markteinführung im Jahre 1985 bis ca. 1991 den Markt dominiert hat. Wegen seiner Nebenwirkungen (Herzrhythmusstörungen bei Überdosierung bzw. bei bestimmten Kombinationen mit weiteren Medikamenten) hat es seit 1991 stetig an Marktanteil verloren und lag Ende 1996 bei ca. 18% (Medical Sci. Bull., 1996; 19 (2), 3).

Genauere Untersuchungen der Wirkung von Terfenadin ergaben, dass es in der Leber durch Cytochrom P450 (CYP3A4) zu Fexofenadin oxidiert wird (J. E, Coutant, Journal of Chromatography, 1991; 570,139-148).

Erst dieses Oxidationsprodukt ist pharmakologisch wirksam. Von großem Interesse war dabei, dass die Nebenwirkungen aber durch das nicht-oxidierte Terfenadin erzeugt werden.

Aus diesem Grund wurde 1998 der Wirkstoff Fexofenadin als verschreibungspflichtiges Antihistaminikum in Deutschland eingeführt, um die Nebenwirkungen von Terfenadin zu umgehen.

Zur Synthese von Fexofenadin sind inzwischen verschiedene Wege veröffentlicht (S. H. Kawei, Journal of org. Chem., 1994; 59, 2620-2622; S. Patel, Synthetic Communication, 1996; 4699-4710; Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996; 44, 731-734).

Von offensichtlichem Interesse ist jedoch eine Syntheseroute, bei der man auf den bestehenden Produktionskapazitäten von Terfenadin aufbauen könnte und somit nur den letzten Schritt, also die regioselektive Oxidation zusätzlich durchführt. Dies ist mit rein chemischen Methoden in guten Ausbeuten nicht durchführbar.

Alternativen bietet hier die Möglichkeit der Biotransformation mit ganzen Zellen. So ist die prinzipielle Fähigkeit der Oxidation von Terfenadin-ähnlichen Substanzen durch den Pilz Cunninghamella blakesleeana durch Schwartz et al. (Schwartz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996; 44, 731-734) gezeigt worden. Das Reaktionsschema zeigt die Umsetzung von Terfenadin I in seine Carbonsäure III über den Alkohol II.

Es war im Rahmen der Erfindung das Ziel, eine Aktivierung der tertiären Butylgruppe zu erzielen. Eine Umsetzung der Ausgangsverbindung I in den Alkohol II stellt eine erhebliche Verbesserung dar, weil die weitere Umsetzung des Alkohols II in das eigentliche Fexofenadin - also die Carbonsäure III - ohne große Probleme durchführbar ist.

Reaktionsbedingungen

Ein 1.2 l Rührkesselreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration (Microdyn MD020TP2N, Porengröße 0.2 µm, 3 Rohre mit einem Innendurchmesser von 5.5 mm und einer Länge von 0.75 m aus Polypropylen, Membranfläche 0.036 m²) im Bypass, der mit 1.8 l sterilem Medium (siehe Tab. 1) gefüllt ist, wird mit einer 4 Tage alten sporulierten Agar-Kultur nach Homogenisation per Ultra-Turrax (30000 rpm, 30 s) beimpft. Der Bypassvolumenstrom wird auf 2.0 l/min eingestellt.

Tabelle 1 Verwendetes Minimalmedium

Glucosemonohydrat	20,0 g/l
(NH₄)₂SO₄	12,0 g/l
KH₂PO₄	2,8 g/l,
MgSO_4.7H₂O	2,5 g/l
CaCl_2.2H₂O	0,2 g/l
Elementlösung	2,0 ml/l

Elementlösung

MnCl_2.4H₂O	2,0 g/l
ZnSO_4.7H₂O	4,0 g/l
CuSO_4.5H₂O	2,0 g/l
FeNH₄Citrat	20,0 g/l
Na₂MoO_4.2H₂O	0,03 g/l
CoCl_2.6H₂O	0,01 g/l
EDTA	5,0 g/l

Es wird eine Reaktionstemperatur von 30°C und ein pH zwischen 6.5-7.2 im Reaktor eingeregelt. Der pO₂ wird mit der Begasungsrate als Stellgröße (20- 1000 ml/min) auf 60% geregelt (Rührerdrehzahl: 1200 rpm). Nach Verbrauch der vorgelegten Glucosemenge (off-line überprüft durch Glucosemessung) werden jeweils 20 g/l, Glucosemonohydrat zudosiert, bis eine Gesamtmenge von 60 g/l Glucosemonohydrat erreicht ist. Danach werden 6 g/(ld) Glycerin zudosiert.

Verfügbarkeit von Terfenadin

Die Löslichkeit von Terfenadin ist sehr gering (21 mg/l, bei pH 7.5 in Wasser). Um eine möglichst hohe Umsetzungsgeschwindigkeit im Rührreaktor zu erreichen, muss sichergestellt sein, dass zumindest die Löslichkeitsgrenze zu jedem Zeitpunkt im Rührreaktor erreicht wird. Daher wurde die Reaktion als 'mikrokristalline Fermentation' durchgeführt: Hierzu wird Terfenadin in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie z. B. Methanol, Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und in den Rührreaktor eingetragen. Wenn sich das Lösungsmittel im wässrigen Medium verteilt, kristallisiert Terfenadin aus. Um eine möglichst feine Dispergierung des Eduktes, und damit eine große Feststoffoberfläche im Reaktor zu erreichen, erfolgte der Eintrag der Terfenadinlösung an der Stelle im Rührreaktor mit höchster lokaler Energiedissipation.

Die Terfenadinzugabe wurde automatisiert, indem rechnergesteuert definierte Mengen einer alkoholischen Terfenadinlösung mit Druckluftimpulsen (4 bar) in den Rührreaktor 'geschossen' wurden.

Rückhaltung von Substrat und Biokatalysatoren durch Mikrofiltration im Bypass

Es wurde mit Beginn der Glycerindosierung ein Filtralvolumenstrom von 50 ml/h aus dem Rührreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration im Bypass entnommen (siehe Abb. 1). Die Ergebnisse einer mikrokristallinen Fermentation zur regioselektiven Oxidation von Terfenadin in diesem Rührreaktor mit Querstrom-Mikrofiltration sind in Abb. 2 dargestellt.

In dieser Abb. 2 stellen die rechteckigen Symbole die real gemessenen Werte der Konzentration des Alkohols II im Verfahren dar, während die kreisförmigen Symbole fiktive Werte sind, welche die Konzentration des Alkohols II in dem Bioreaktor darstellen, welche ohne Abtrennung durch Filtration theoretisch in dem Bioreaktor realisiert wären.

Man erkennt, dass durch Einstellung des Filtratvolumenstroms auf 50 ml/h die Konzentration des Alkohols II im Reaktor auf ca 200 mg/l, begrenzt werden konnte. Die insgesamt erzeugte Produktmenge übersteigt mit (bilanzierten) 900 mg/l, die bei der mikrokristallinen Fermentation ohne Mikrofiltration nach 200 h maximal erzeugte Menge um 50%.

Integrierte Produktabtrennung durch selektive Adsorption

Darüberhinaus ist es möglich, den gebildeten Alkohol II mit einem Adsorptionsverfahren (XAD-4 Adsorberharz) selektiv aus dem Filtratstrom zu entfernen und in einem Schritt um den Faktor 10 zu konzentrieren (Eluation mit Methanol, Ausbeute: 95%).

Claims

1. Verfahren zur Umsetzung einer ersten Verbindung (Substrat) in eine zweite Verbindung (Produkt) in einem ein wässriges Milieu enthaltenden Bioreaktor mittels eines Biokatalysators, wobei die erste Verbindung eine schlecht in Wasser lösliche Verbindung ist, und
eine Trennung der Bestandteile des Verfahrens vorgenommen wird, wobei die erste Verbindung und der Biokatalysator im Bioreaktor verbleiben und
die zweite Verbindung aus dem Bioreaktor ausgeschieden wird, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Verbindung als mikrokristalline Kristalle vorliegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trennung der Bestandteile kontinuierlich durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Biokatalysator ein Mikroorganismus ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Abtrennung der Bestandteile mit einem Membran-Trennverfahren vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Membran-Trennverfahren eine Querstromfiltration ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Abtrennung der zweiten Verbindung durch on-line-Erfassung seiner Konzentration geregelt wird.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 zur Umsetzung von Terfenadin.