DE19900135A1

DE19900135A1 - Verfahren zur Bestimmung der Temperatur einer einzelnen Zelle in einer Zellprobe oder Gewebebiopsie sowie Verfahren zu dessen Verwendung

Info

Publication number: DE19900135A1
Application number: DE1999100135
Authority: DE
Inventors: Sanford M Simon
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1998-01-07
Filing date: 1999-01-05
Publication date: 1999-08-05
Also published as: GB9900118D0; GB2333153A; JPH11258159A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft allgemein ein neues Verfahren zur Bestimmung der Temperatur einer einzelnen Zelle oder einer Gruppe von Zellen in einer Gewebeprobe. Verfahren des Einsetzens dieses Verfahrens zur Diagnose sind ebenfalls umfaßt

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Lebende Zellen benötigen eine stabile Stoffwechselge schwindigkeit. Daher unterliegt sowohl in Zellen als auch in den Organismen, welche die Zellen enthalten, eine solche Regulation einer strengen Kontrolle. Ungefähr 50% der gesamten Energie in den Kohlenhydraten wird zu ATP umgewan delt, und der Rest wird als Wärme freigesetzt [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (1989)]. Das ATP wird dann wieder während des Wachstums zur Biosynthese verwendet und wird andernfalls für Arbeit verwendet, und die Energie wird als Wärme freigesetzt. Die Freisetzung dieser Wärme wird verwendet, um den Körper in der Form von Temperatur aufzuwärmen. Ein Unvermögen, auf dem Niveau eines Organis mus ein stabiles Stoffwechselniveau aufrechtzuerhalten, ist ein pathologischer Zustand, welcher als Fieber bezeichnet wird - ein Anstieg bei der Temperatur eines Organismus. Variationen bei den Stoffwechselniveaus werden bei einer Vielzahl von pathologischen Zuständen angetroffen, ein schließlich während bakterieller oder viraler Infektionen, bei Krebs und bei der allgemeinen Aufzehrung, welche wäh rend einer Sepsis oder Kachexie angetroffen wird.

Die Temperatur eines Organismus wird oft als Anzeichen für die Gesundheit des Organismus angesehen. Selbst geringe Abweichungen bei der Temperatur können einen pathologischen Zustand anzeigen. Jedoch kann die Temperatur einer einzel nen Zelle aufgrund der Beschränkung der derzeitigen Techno logie nicht getestet werden. Somit ist es bisher nicht bekannt, in welchem Ausmaß die zelluläre Temperatur mit der Zeit innerhalb einer Zelle oder zwischen zwei verschiedenen Zellen variiert. Basierend auf Studien von großen Zellpopu lationen gibt es jedoch gute Gründe anzunehmen, daß einige pathologische Zustände nachweisbar sein könnten, indem die Temperatur auf dem Niveau von einzelnen Zellen gemessen wird.

Der zelluläre Metabolismus kann als die Bilanz für alle enzymatischen Reaktionen betrachtet werden, welche in der Zelle auftreten. Innerhalb dieses Zusammenhangs wird die folgende exotherme Aktivität als die Strahlung eines schwarzen Körpers angesehen, d. h. die Wärme, welche wir testen, wenn wir die Temperatur der Zelle messen. Frühere Untersuchungen der biologischen Stoffwechselaktivität haben die Kalorimetrie verwendet, welche auf dem Niveau eines gesamten Organismus oder wenigstens eines einzelnen Organs eingesetzt wird. Die Mikrokalorimetrie kann für so geringe Mengen wie 10 Zellen angewendet werden. Jedoch gibt es ern ste Beschränkungen bei der Grenze der derzeitigen Technolo gie, um die Wärmeproduktion von einzelnen Zellen aufzulösen [Kemp, Thermal and Energetic Studies of Cellular Biological Systems, A.M. James, Herausg. (Bristol: Wright), S. 147-166 (1987)]. Die empfindlichste Technik, welche auf die Messung des Stoffwechsels in Tumorzellen angewendet wird, ist der Cartesische Tauchapparat, welcher hunderte von Zellen auf lösen kann [Lutton und Kopac, Cancer Res., 31: 1564-1569 (1971)]. Diese Technik ist jedoch noch zu grob, um eine heterogene Population von Zellen aufzulösen, und sie macht eine Trennung der Zellen nötig. Ein Großteil der normalen Zellphysiologie ist ein dynamischer Prozeß, welcher eine zelluläre Wechselwirkung in einer dreidimensionalen Matrix nötig macht. Viele Zellaktivitäten werden durch Zell-Zell- Kontakte modifiziert. All dieses geht verloren, wenn die Zellen getrennt werden. Neuere Techniken wurden entwickelt, um Metaboliten wie z. B. ATP, Glucose und Lactat in lebenden Zellen zu messen [Hossman et al., Acta Neuropathologica, 69: 139-147 (1986); Okada et al., Journal of Neurosurgery, 77: 917-926 (1992)]. Diese Techniken benutzen einen photo graphischen Film [Hossman et al., 1986, Supra; Okada et al., 1992, supra] oder photonenzählende Kameras [Tamulevi cius und Streffer, British Journal of Cancer, 72: 1102-1112 (1995)] und haben eine beträchtliche Heterogenität beim Stoffwechsel in Tumoren gezeigt, wenn diese mit einer Auf lösung von einem Millimeter Raumauflösung getestet wurden.

Unglücklicherweise gibt es derzeit eine Anzahl von wichtigen Problemen, welche nicht angegangen werden können, da der Metabolismus einer einzelnen Zelle nicht bestimmt werden kann. Beispielsweise können wir derzeit keine hete rogenen Populationen von Zellen untersuchen und die Aktivi tät der einzelnen Zellen statt des Durchschnitts der Mischung auflösen. Beispielsweise besteht ein Tumor aus Krebszellen, normalen Zellen und eingedrungenen Immunzel len, welche jeweils mit sehr unterschiedlichen Geschwindig keiten metabolisieren. In diesem Fall kann die Messung des durchschnittlichen Metabolismus des Tumors nicht den tat sächlichen Metabolismus der einzelnen Zellen widerspiegeln. Bei den meisten Zellen ist die aerobe Atmung für fast die gesamte Produktion von ATP verantwortlich, wobei die anae robe Glykolyse für den Rest aufkommt. Es wurde vor über fünfzig Jahren festgestellt, daß die anaerobe Atmung bei Ascites-Tumorzellen in Bezug auf Nichttumorzellen wesent lich erhöht ist [Warburg et al., The Metabolism of Tumors, Herausg. O. Warburg, Constable & Company LTD., London, S. 129-170 (1930a); Warburg et al., The Metabolisin of Tumors, Herausg. O. Warburg, Constable & Company LTD., London, S.

254-265 (1930b)]. Dieses führte zu der Hypothese, daß die aerobe Atmung bei Tumorzellen geschädigt war [Warburg, Science, 123: 309-314 (1956)]. Als in den dazwischenliegen den Jahren mehr über den Stoffwechsel in Erfahrung gebracht wurde, wurde gefunden, daß die aerobe Atmung bei Tumorzel len normal ist, die anaerobe Atmung aber erhöht ist. Der Mechanismus, welcher für diesen Anstieg bei der anaeroben Atmung verantwortlich ist, ist derzeit nicht bekannt. Ein Hauptbegrenzungsfaktor beim Verstehen des Mechanismus ist die Unfähigkeit, die relativen Stoffwechselniveaus von ein zelnen Zellen zu testen. Wie oben erwähnt wurde, ist ein besonderes Problem, daß die Tumoren aus einer Mischung von normalen, bösartigen und Immunzellen bestehen. Die gegen wärtige Technologie erlaubt nur die Messung des durch schnittlichen Stoffwechsels dieser gemischten Population von Zellen. Ein zweites Problem ist die beträchtliche Hete rogenität, sogar innerhalb der Tumorzellen. In Tumoren ist beispielsweise die Oxygenierung oft geschwindigkeitsbe schränkend für das Tumorwachstum [Kallinowski et al., J. Cel. Physiol., 138: 183-191 (1989)]. Somit wird bei schnell wachsenden Tumoren das Wachstum durch die Angiogenese, das Wachstum neuer Blutgefäße für die Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen, begrenzt.

Die Chemotherapie ist ein wirkungsvolles Werkzeug, das verwendet wird, um Tumoren zu bekämpfen. Jedoch entwickeln Tumorzellen häufig eine Resistenz gegenüber Chemotherapeu tika. Diese Resistenz wird als eine verminderte Empfind lichkeit gegenüber einem breiten Spektrum von chemothera peutischen Mitteln beobachtet, und solche Zellen wurden als multiresistent bezeichnet [Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3497-3504 (1994)]. Obwohl diese Zellen ursprünglich als "Superzellen" angesehen wurden, welche in der Lage sind, jeglicher therapeutischen Herausforderung zu widerstehen, gibt es nun einen wachsenden Beweis dafür, daß multiresistente Zellen sich der Chemotherapie entziehen, indem sie sich mehr wie normale Zellen benehmen; und in mancher Hinsicht scheinen diese Zellen eine "umgekehrte" Transformation bei ihren Eigenschaften durchgemacht zu haben [Biedler et al., Cancer & Metastasis Reviews, 13: 191-207 (1994)]. Wenn die chemotherapeutischen Arzneimittel entfernt werden, kehren diese Zellen zu ihren aggressiven bösartigen Eigenschaften zurück. Es ist nicht bekannt, was mit dem Stoffwechsel von multiresistenten Zellen während dieser Periode passiert. Indirekte Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Niveau der anaeroben Atmung bei diesen Zellen zu den Niveaus zurückgekehrt ist, welche bei nicht trans formierten Zellen angetroffen werden [Miccadei et al., Oncology Research, 8: 27-35 (1996)]. Daher besteht ein Bedarf, den Stoffwechsel von einzelnen Zellen zu messen, welche multiresistent sind, um zu diagnostizieren, wann sich Tumoren aus ihrer ruhigen multiresistenten Phase in ein bösartigeres Stadium verlagern. Weiterhin besteht ein Bedarf, ein Verfahren zur Messung der Temperatur von ein zelnen Zellen zur Verfügung zu stellen, um die metaboli schen Änderungen zu bestimmen, welche entweder bei normalen oder Tumorzellen auftreten. Zusätzlich besteht ein Bedarf für eine Methodik zur Messung der Temperatur einer Zelle aus einer frischen Biopsie von lebendem Gewebe, um das Gewebe schnell auf das Vorliegen von Tumorzellen hin zu diagostizieren.

Die Emission fast aller Fluorophore wird durch die Tem peratur beeinflußt, jedoch wurde die Verwendung von Fluoro phoren, die für die Temperatur besonders empfindlich sind, zuerst von Kolodner et al., [Appl. Phys. Lett. 40: 782-784 (1982); Appl. Phys. Lett. 42: 782-784 (1983)] als eine Tech nik zur Kalibrierung der Temperatur verwendet. Kolodner verwendete einen Fluorophor, Eu(TTA)₃, welcher in ein Poly mer, PMMA, eingebettet war, um Temperaturauflösungen von 0,07°K und eine Raumauflösung von 10 µM zu erreichen. Die ser temperaturempfindliche Fluorophor konnte somit verwen det werden, um Temperaturen zu quantifizieren.

Eine Vielzahl von Fluorophoren, einschließlich Eu(TTA)₃, wurde in verschiedenen Lösungsmitteln und Polyme ren solubilisiert und verwendet, um Flugzeugflügel in dem Labor von John P. Sullivan (Pursue University, siehe Tabel le 1, modifiziert ausgehend von [Campbell et al., 1994, supra]) "anzustreichen". Die Änderung bei der Fluoreszenz kann verwendet werden, um beispielsweise die Temperaturän derungen des Flugzeugflügels in einem Windkanal zu überwa chen. Bisher wurden temperaturempfindliche Fluorophore in der Diagnostik mit integrierten Schaltkreisen verwendet [Kolodner et al., Appl. Phys. Lett. 42: 117-119 (1983)], um einen Grenzflächenübergang bei einem zweidimensionalen Flü gel festzustellen und um die Wechselwirkung zwischen den Vorderkantenwirbeln und der Oberfläche eines Deltaflügels sichtbar zu machen [Campbell et al., beim 6. Internat. Symp. über die Anwendungen der Lasertechnik auf die Strö mungslehre, Lissabon, Portugal (1992); Campbell et al., Temperature Measurement Using Fluorescent Molecules, Abstract (1992); Campbell et al., Temperature Sensitive Fluorescent Paint Systems, 18: 94-2483 (1994); Hamner et al., A Scanning Laser System for Temperature and Pressure Sensitive Paint, 32: 94-0728 (1994)].

Die Zitierung von irgendwelchen Referenzen hierin soll te nicht als Zugeständnis ausgelegt werden, daß eine solche Referenz für die vorliegende Anmeldung als "Stand der Tech nik" verfügbar ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt in ihrer breitesten Ausführungsform ein Mittel zum Messen der Temperatur einer Zelle unter Verwendung eines temperaturempfindlichen Fluo rophors zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung setzt eine Stoffwechselsonde ein, welche ein festes Substrat umfaßt, das einen temperaturempfindlichen Fluorophor eingebettet in ein Polymer enthält. Wenn der Fluorophor mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht angeregt wird, emittiert der Fluorophor ein nachweisbares Fluores zenzsignal. Wenn eine lebende Zelle auf der Stoffwechsel sonde angeordnet wird, wird die Intensität des Fluoreszenz signals durch die Stoffwechselgeschwindigkeit der Zelle bewirkt.

Vorzugsweise enthält die Stoffwechselsonde einen Fluo rophor, welcher während er in ein Polymer eingebettet ist, in der Nähe einer wäßrigen Lösung für wenigstens eine Stun de bei Anregung mit ultraviolettem Licht bei 37°C und bei ca. pH 7,5 ein stabiles Fluoreszenzsignal emittieren kann. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung verur sacht eine Zelle, welche auf der Stoffwechselsonde angeord net wird, eine 2,5%ige Änderung bei der Intensität des Fluoreszenzsignals pro Grad Celsius Anstieg bei der Tempe ratur.

In einer Ausführungsform ist der temperaturempfindliche Fluorophor, welcher in der Stoffwechselsonde enthalten ist, Eu(TTA)₃. In einer anderen Ausführungsform ist das Polymer der Stoffwechselsonde Poly(methylmethacrylat). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer Poly(methyl methacrylat) und der temperaturempfindliche Fluorophor ist Eu(TTA)₃. Das feste Substrat der vorliegenden Erfindung kann aus irgendeinem inerten Material gefertigt werden, ist aber vorzugsweise ein Glas oder ein Kunststoff. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform dieses Typs ist das feste Substrat ein Deckgläschen (glass cover slip).

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Feststellen der Temperatur einer Zelle zur Verfügung. Eine solche Ausführungsform umfaßt ein Anordnen einer Zelle auf einer Stoffwechselsonde, welche ein festes Substrat umfaßt, das einen temperaturempfindlichen Fluorophor eingebettet in ein Polymer enthält. Wenn der Fluorophor mit dem richtigen ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht angeregt wird, emittiert er ein nachweisbares Fluoreszenzsignal. Wenn eine lebende Zelle auf der Stoffwechselsonde angeord net wird, wird die Intensität des Fluoreszenzsignals durch die Temperatur der Zelle bewirkt.

In einer spezifischen Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Polymer ein nichtaromatisches synthetisches Poly mer. In einer bestimmten Ausführungsform dieses Verfahrens kann der Fluorophor bei Anregung mit ultraviolettem Licht für wenigstens eine Stunde bei 37°C, pH 7,4, ein stabiles Fluoreszenzsignal emittieren.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfah ren zum Feststellen der Stoffwechselaktivität einer Zelle. Eine solche Ausführungsform umfaßt ein Feststellen der Tem peratur einer Zelle durch ein Anordnen der Zelle auf einer Stoffwechselsonde der vorliegenden Erfindung, Anregen des Fluorophors der Sonde mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht und Nachweisen des Fluo reszenzsignals, wobei die Intensität des Fluoreszenzsig nals, welche nachgewiesen wird, ein Anzeichen für die Tem peratur der Zelle ist. Die gemessene Temperatur wird dann mit der Stoffwechselaktivität der Zelle korreliert. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Typs ist die Zelle eine Tumorzelle.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfah ren zum Nachweisen des Vorliegens einer Tumorzelle in einem lebenden Gewebe, welches ein Feststellen der Temperatur der Zelle durch ein Anordnen der Zelle auf einer Stoffwechsel sonde der vorliegenden Erfindung (wie oben beschrieben), Anregen des Fluorophors der Stoffwechselsonde mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht und Nachweisen des Fluoreszenzsignals umfaßt. Die Intensi tät des nachgewiesenen Fluoreszenzsignals kann mit der Tem peratur der Zelle korreliert werden. Von dem Metabolismus von Tumorzellen ist bekannt, daß er signifikant höher ist als der von nicht transformierten Zellen. Die vorliegende Erfindung erlaubt den Nachweis von Tumorzellen mitten unter einer Masse von normalen (z. B. nicht transformierten) Zel len durch ein Bestimmen der Temperatur der Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Typs wird das lebende Gewebe aus einer Tumorbiopsie erhalten. In einer verwandten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Ver fahren zum Nachweisen des Vorliegens eines anomalen Metabo lismus einer Zelle, welche von gesundem Gewebe umgeben ist (mitten unter einer Masse von normalen Zellen), zur Verfü gung, welches ein Feststellen der Temperatur der Zelle durch ein Anordnen der Zelle auf einer Stoffwechselsonde der vorliegenden Erfindung (wie oben beschrieben), Anregen des Fluorophors der Stoffwechselsonde mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht und Nach weisen des Fluoreszenzsignals umfaßt. Ein Unterschied bei der Temperatur der Zelle in Bezug auf eine Kontrollzelle ist ein Anzeichen dafür, daß die Zelle einen anomalen Meta bolismus durchmacht. In einer solchen Ausführungsform ist der anomale Metabolismus der Zelle ein Anzeichen für eine Zelle mit einer ultravioletten Schädigung. In einer anderen Ausführungsform ist der anomale Metabolismus der Zelle ein Anzeichen dafür, daß die Zelle eine Kachexie durchmacht. In einer dritten Ausführungsform ist der anomale Metabolismus der Zelle ein Anzeichen dafür, daß die Zelle eine Apoptosis durchmacht.

In einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Stoffwechselsonde auf einem Mikroskop angeordnet, der Fluorophor wird angeregt und seine Emission wird unter Verwendung des Mikroskops nachgewiesen. In einer solchen Ausführungsform ist das Mikroskop ein konfokales Lasermikroskop, das mit einem Ultraviolettlaser zur Anre gung ausgerüstet ist. In einer anderen solchen Ausführungs form ist das Mikroskop ein Fluoreszenzmikroskop, welches mit einer Hg/Xenon-Lampe mit einem Ultraviolett-Anregungs filter und einem Emissionsfilter im sichtbaren Bereich mit 615 nm ± 10 nm ausgerüstet ist.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfah ren zur Herstellung der Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung. Eine solche Ausführungsform umfaßt ein In-Kon takt-Bringen eines Polymers mit einem temperaturempfindli chen Fluorophor in einem mischbaren Lösungsmittel, worin eine Lösung des Fluorophors und des Polymers gebildet wird. Die Lösung wird als nächstes auf dem festen Substrat ange ordnet, und das Polymer wird dann in das feste Substrat eingebrannt (annealed to).

Das feste Substrat, welches in diesem Verfahren verwen det wird, ist vorzugsweise ein Glas oder ein Kunststoff. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform dieses Verfahrens ist das feste Substrat ein Deckgläschen. In einer bevorzug ten Ausführungsform dieses Verfahrens wird das Deckgläschen in eine starke Säure (z. B. 70% Salpetersäure) eingetaucht, bevor der Polymer-Fluorophor auf dem Glasscheibchen ange ordnet wird. In einer anderen Ausführungsform dieses Ver fahrens wird das feste Substrat während des Einbrennens eines Polymers auf dem festen Substrat gedreht.

In noch einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist das verwendete Polymer Poly(methylmethacrylat). In noch einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist der temperaturempfindliche Fluorophor Eu(TTA)₃. In noch einer anderen Ausführungsform ist das Lösungsmittel Nitroethan.

In einer besonderen Ausführungsform dieses Typs wird die Stoffwechselsonde durch ein Verfahren hergestellt, wel ches ein In-Kontakt-Bringen einer Lösung von 0,1 mM Poly(methylmethacrylat) in 96% Nitroethan mit 200 mM Eu(TTA)₃ in 96% Nitroethan umfaßt. Die Fluorophor/Polymer lösung wird dann auf einem mit Säure gewaschenen Glas scheibchen angeordnet (welches vorher in 70%ige Salpeter säure eingetaucht wurde, mit destilliertem Wasser gewaschen wurde, mit Ethanol gespült wurde und dann in einem Vakuum ofen getrocknet wurde). Das Glasscheibchen wird dann auf einem Rotor befestigt und gedreht. Das Glasscheibchen wird als nächstes bei 100°C für eine Stunde in einem Vakuumofen gebrannt, um das polymer einzubrennen.

Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden besser durch Bezug auf die folgenden Zeichnungen und die detaillierte Beschreibung gewürdigt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt die Änderung der Fluoreszenzintensität mit der Temperatur für Eu(TTA)₃/PPMA dar. Die Anregungswel lenlänge war 365 nm und die Emissionswellenlänge war 621 nm.

Die Fig. 2A und 2C sind Zellen, wie sie in dem Bei spiel beschrieben werden, sichtbar gemacht durch Absorpti onsspektroskopie.

Die Fig. 2B und 2D stellen Fluoreszenzdifferenzspek tren dar, welche aus den Zellen der Fig. 2A bzw. 2C erhalten wurden, nach der Zugabe von FCCP. Die Zellen wur den bei 355 nm angeregt, und die Emission wurde bei 614 nm überwacht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verwen dung einer Stoffwechselsonde, wie sie hierin beschrieben ist, zur Verfügung, um die Temperatur und/oder metabolische Änderungen einer einzelnen Zelle oder einer Gruppe von Zel len zu überwachen. Die Zelle kann entweder von anderen Zel len losgelöst sein oder ein Teil einer Zellprobe sein. Wenn die Zelle eine Tumorzelle ist, hilft eine solche Überwa chung bei dem Verständnis der Zellbiologie von Tumorzellen. Die Stoffwechselsonden und die damit zusammenhängende Methodik der vorliegenden Erfindung können ebenfalls ver wendet werden, um zu bestimmen, ob Tumorzellen in einer frischen Biopsie von lebendem Gewebe vorhanden sind, in einem Zeitrahmen, welcher erlauben würde, daß die Diagnose während der Tumorbiopsie erhalten wird. Auf diese Weise könnte die Analyse der Biopsie unmittelbar nach der Entfer nung des Gewebes durchgeführt werden, was dem praktizieren den Arzt erlaubt, unmittelbar eine Entscheidung zu treffen, ob weiteres Gewebe entfernt werden muß, oder alternativ um zu bestimmen, daß keine weitere Operation nötig ist. Ein solches Verfahren hat viele Vorteile gegenüber der gegen wärtigen Technologie, welche eine anfängliche Biopsie nötig macht, dann typischerweise eine 7- bis 10-tägige Untersu chung des Gewebes, auf welche in vielen Fällen ein weiterer chirurgischer Eingriff folgt. Somit erlaubt die vorliegende Erfindung, daß der praktizierende Mediziner einen chirurgi schen Eingriff durchführt und sofort auf die Gewebeanalyse reagiert, wodurch eine weitere Verschlechterung des Gewebes während der Zeitspanne der Analyse verhindert wird.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Verfahren zum Feststellen der Temperatur einer Zelle unter Verwendung der Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung. Die Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung umfassen ein festes Substrat, welches einen temperaturempfindlichen Flu orophor enthält, der in ein Polymer eingebettet wurde. Wenn der Fluorophor mit dem geeigneten ultravioletten, sichtba ren oder infraroten Licht angeregt wird, emittiert er ein nachweisbares Fluoreszenzsignal. Dieses Fluoreszenzsignal wird durch die Stoffwechselgeschwindigkeit einer Zelle bewirkt, welche auf der Stoffwechselsonde angeordnet ist. Somit kann durch ein Anregen des Fluorophors mit dem geeig neten Licht und dann einem Nachweisen der Intensität des Fluoreszenzsignals die Temperatur der Zelle bestimmt wer den.

Daher sollen die folgenden Begriffe, wenn sie hierin erscheinen, die unten aufgeführten Definitionen aufweisen:

Wie hierin verwendet, umfaßt eine "Stoffwechselsonde" ein festes Substrat, welches einen temperaturempfindlichen Fluorophor eingebettet in ein Polymer enthält, worin, wenn der Fluorophor mit der geeigneten Lichtwellenlänge angeregt wird (z. B. ultraviolett, sichtbar oder infrarot), der Fluo rophor ein nachweisbares Fluoreszenzsignal emittiert und worin, wenn eine lebende Zelle (allein, oder als ein Teil einer Zellprobe) auf der Stoffwechselsonde angeordnet wird, das Fluoreszenzsignal aufgrund der Wärme, welche von der Zelle emittiert wird (z. B. wie als die Temperatur und/oder der metabolische Zustand der Zelle gemessen wird), poten ziert wird (d. h. steigt oder fällt).

Wie hierin verwendet, kann ein "festes Substrat" aus irgendeinem festen Material gefertigt werden, vorzugsweise einem Kunststoff, Metall oder Glas, und noch bevorzugter, einer Glaslinse.

Wie hierin verwendet, umfaßt "ca. pH 7,5" pH 7,0 bis pH 8,0.

Bei einer Anwendung der vorliegenden Erfindung wird die Temperatur einer Zelle bestimmt, welche aus einer Zellprobe von einem Patienten erhalten wurde, der in dem Verdacht stand, an Kachexie zu leiden. Kachexie ist ein Krankheits zustand, welcher den Körper auszehrt und oft tödlich endet. Kachexie, welche durch den Tumornekrosefaktor ausgelöst wird, ist mit einer erhöhten Produktion von Milchsäure ver bunden und es wird angenommen, daß sie das Ergebnis der Aktivierung eines nutzlosen Substratzyklus zwischen Fructo se-6-phosphat und Fructose-1,6-biphosphat ist. Dieser ver brennt das zelluläre ATP [Zentella et al., Cytokine, 5: 436-447 (1993)]. Somit ist eine Bestimmung einer erhöhten Tem peratur für Zellen, welche von einem Patienten erhalten wurden, der in dem Verdacht steht, eine Kachexie zu haben, mit der Diagnose einer Kachexie konsistent.

Unter einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Mechanismus eines induzierten Fiebers durch das entzündliche Makrophagenprotein sondiert werden. Das Fieber kann in Tieren durch einen Faktor hervorgerufen werden, welcher von Makrophagen freigesetzt wird: das entzündliche Makrophagenprotein [Myers et al., Neurochemical Research, 18: 667-673 (1993)]. Während bekannt ist, daß dieser Faktor die Nahrungsaufnahme durch das Tier moduliert, ist derzeit noch nicht bekannt, wo oder wie diese Wirkungen auf die Zellen aufweisen, um den Stoffwechsel zu erhöhen und die Temperatur zu erhöhen. Somit kann die Bestimmung, welche bestimmten Zellen (oder Zelltypen) die überschüssige Wärme emittieren, die das Fieber verursacht, erreicht werden, indem die Temperatur der einzelnen Zellen (oder des Zell typs) festgestellt wird.

Unter einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfin dung wird die Temperatur von kultivierten Zellen bestimmt. In einer solchen Ausführungsform werden Populationen von Brusttumorzellen verwendet. In einer weiteren solchen Aus führungsform werden arzneimittelresistente Brusttumorzellen verwendet. In noch einer anderen Ausführungsform werden nicht transformierte Brustzellen verwendet. In einer bevor zugten Ausführungsform werden zwei dieser Zelltypen verwen det. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform werden alle drei Zelltypen verwendet. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform kommen die Brusttumorzellen aus einer humanen Quelle. In einer besonderen Ausführungsform werden braune Fettgewebszellen aus der Tumorzellinie HIB 1B verwendet.

In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird ein Scheibchen des Brustgewebes als die Quelle von Zellen verwendet. Ein Scheibchen von der Brust umfaßt Fettzellen (welche mit großen Fettglobuli gefüllt sind, die sehr niedrige Stoffwechselniveaus aufweisen) und Duktuszellen, welche aktiv metabolisieren und sezernieren. Die Grundgeschwindigkeit des Stoffwechsels der Tumorzellen ist signifikant höher als die von "normalen" Zellen. Tests unter Verwendung einer Oberflächentemperaturmessung von Hauttumoren zeigen eine Temperaturdifferenz (bei Belich tung) von bis zu 3,3°C.

In der gegenwärtigen medizinischen Praxis wird heraus geschnittenes Gewebe, welches während einer Biopsie erhal ten wurde, für histologische Tests präpariert, welche 7-10 Tage dauern. Somit befindet sich der Patient nicht mehr im Operationsraum, wenn die Ergebnisse bestimmt werden. Daher muß oft eine nachfolgende Operation angesetzt werden. Das Verfahren des Feststellens der Temperatur von Zellen in den Scheibchen unter Verwendung der Methodik der vorliegenden Erfindung erlaubt, daß die Zellen in den Gewebescheibchen sofort getestet werden, wobei ein standardmäßiges Fluores zenzmikroskop verwendet wird, um zu bestimmen, ob es loka lisierte "Hot spots" einer Stoffwechselaktivität (d. h. Zel len, welche größere als die normalen Mengen an Wärme emit tieren) als einen Fingerzeig für Tumorzellen gibt. Solche Bestimmungen erlauben dem Chirurgen, unmittelbar zu ent scheiden, ob oder nicht weiteres Gewebe herausgeschnitten werden muß.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung umfaßt die Bestimmung der Temperatur/des Metabolismus von einzelnen Zellen, um die Verschiebung von ruhigen multiresistenten Zellen zu dem bösartigeren Zustand hin zu überwachen. In diesem Fall wäre ein Ansteigen der Temperatur mit einer solchen Verschiebung konsistent. Ein solches Überwachen wäre während einer Chemotherapie und insbesondere nach dem Ende einer solchen Behandlung besonders nützlich.

In einer bestimmten Ausführungsform wird eine Zell- oder Gewebebiopsie auf einer Stoffwechselsonde angeordnet und dann mit einem konfokalen Lasermikroskop erfaßt, das mit einem Ultraviolettlaser zur Anregung ausgerüstet ist, was gleichzeitige Emissionsmessungen von dem temperaturemp findlichen Fluorophor erlaubt. In einer weiteren solchen Ausführungsform wird die Erfassung mit einem Fluoreszenz mikroskop durchgeführt, das mit einer Hg/Xenon-Lampe mit einem Ultraviolett-Anregungsfilter und einem Emissionsfil ter im sichtbaren Bereich ausgestattet ist.

Wie oben erwähnt wurde, ist ein bevorzugter Fluorophor Eu(TTA)₃, welcher ein Anregungsmaximum von 360 nm aufweist und ein Emissionsmaximum von 614 nm aufweist. Noch bevor zugter wird Eu(TTA)₃ mit dem Polymer Poly(methylmeth acrylat), (PMMA), kombiniert und in ein festes Substrat eingebrannt, um eine Stoffwechselsonde zu bilden. Jedoch werden andere geeignete Kombinationen durch die vorliegende Erfindung abgedeckt. Solche möglichen Kombinationen sind beispielhaft in Tabelle 1 dargestellt. Diese und andere Kombinationen können getestet werden, um ihre Eignung zu bestimmen, als Komponenten der Stoffwechselsonde zu dienen. Insbesondere sind die Schlüsselkriterien zur Auswahl einer Fluorophorverbindung die, daß der Fluorophor: (i) eine maximale Änderung der Fluoreszenz bei einer Änderung der Temperatur bei 37°C zeigt; (ii) die Fähigkeit aufweist, in einem Polymer und abseits von der wäßrigen Lösung eingebet tet zu werden; und (iii) für lebende Zellen nicht toxisch ist. Somit kann ein solches Testen das Bestimmen der Emp findlichkeit des Fluorophors auf Temperaturänderungen bei 37°C, die Stabilität des Fluorophors in einer wäßrigen Umgebung, die Stabilität des Fluorophors während des Ein bettens in das Polymer und die Beständigkeit des Fluoro phors gegenüber einem Ausbleichen durch Licht (eine solche Beständigkeit wird für Langzeitbeobachtungen und anschlie ßende Kalibrierungen benötigt) umfassen. Je größer die Emp findlichkeit des Fluorophors gegenüber einer Temperaturän derung bei 37°C ist, je größer seine Stabilität unter den oben erwähnten Bedingungen ist, einschließlich einer Resi stenz gegenüber dem Ausbleichen durch Licht, desto mehr ist der Fluorophor als ein Bestandteil der Stoffwechselsonde geeignet. In ähnlicher Weise wird das Polymer so ausge wählt, daß es eine optimierende Wirkung auf den temperatur empfindlichen Fluorophor aufweist. Schließlich muß die Flu orophor/Polymer-Kombination mit den lebenden Zellen kompa tibel sein, d. h. sie sollten die Lebensfähigkeit der Zellen nicht nachteilig beeinflussen. In dem nachfolgenden Bei spiel werden diese und/oder andere Faktoren beschrieben.

Die vorliegende Erfindung kann besser durch Bezug auf das folgende nicht beschränkende Beispiel verstanden wer den, welches als beispielhaft für die Erfindung angegeben wird. Das folgende Beispiel wird dargestellt, um die bevor zugten Ausführungsformen der Erfindung vollständiger darzu stellen. Es sollte jedoch nicht so ausgelegt werden, daß es den breiten Umfang der Erfindung beschränkt.

BEISPIEL Bestimmung von geeigneten Fluorophoren und Polymeren für eine Stoffwechselsonde Einführung

Mehrere Kriterien wurden aufgestellt, um einen geeigne ten Fluorophor und ein Polymer für die Stoffwechselsonden der vorliegenden Erfindung auszuwählen. Beispielsweise ist die Empfindlichkeit des Fluorophors für Temperaturänderun gen bei 37°C ein wichtiges Kriterium, wobei eine größere Empfindlichkeit wünschenswert ist. In ähnlicher Weise wird der Fluorophor im Hinblick auf seine Stabilität in einer wäßrigen Umgebung ausgewählt, da eine lebensfähige Zelle in einer wäßrigen Umgebung am stabilsten ist. Zusätzlich wird ein Fluorophor im Hinblick auf seine Stabilität während seiner Einbettung in ein Polymer ausgewählt. Beispielsweise müssen die Zellproben durch eine Dicke des Polymers von ungefähr 50 nm von dem Fluorophor getrennt werden, um sicherzustellen, daß Änderungen der Fluoreszenz eine Folge der Temperaturemission von der Zelle sind, und nicht von einer Sezernierung eines Proteins, Metaboliten oder Ions, welche die Eigenschaften des Fluorophors modifizieren könn ten.

Weiterhin wird ein Polymer ausgewählt, welches die Eigenschaften unseres temperaturempfindlichen Fluorophors optimiert. Ein solches Polymer sollte im Hinblick auf die relative Beständigkeit gegenüber einem Ausbleichen durch Licht (eine Eigenschaft, welche für Langzeitbeobachtungen und nachfolgende Kalibrierungen nötig ist) ausgewählt wer den. Weiterhin sollten ein Polymer und der Fluorophor mit lebenden Zellen kompatibel sein, um sicherzustellen, daß das Polymer und der Fluorophor die Lebensfähigkeit der Zelle nicht nachteilig beeinflussen.

Materialien und Methoden Beschichten von Deckgläschen mit temperaturempfindli chen Fluorophoren Materialien

Farbstoff: Europiumthenoyltrifluoracetonat, abgekürzt als Eu(TTA)₃

oder EuTTA (Advanced Materials, New Hill, NC)
Polymer: Poly(methylmethacrylat), abgekürzt als PMMA (Aldrich, Milwaukee, WI 18,226-5)
Lösungsmittel: 96% Nitroethan (Aldrich, Milwaukee, WI 13.020-6)

Mischen von Farbstoff/Polymer

Die Standardkonzentration des Polymers (PMMA) in dem Lösungsmittel (Nitroethan) betrug 0,1 mM (100 mg PMMA in 5 ml Nitroethan). Verschiedene Konzentrationen von Eu(TTA)₃ wurden verwendet. Das beste Fluoreszenzsignal war das mit 200 mM Eu(TTA)₃ in Lösungsmittel (100 mg EuTTA in 5 ml Nitroethan). Die Farbstoff/Polymermischung wurde mit einem Magnetrührer gerührt, bis sie vollständig gelöst war, und dann durch einen Filter mit 0,45 µm Porengröße filtriert (Gelman Sciences, Acrodisc 13CR PTFE), wonach eine völlig klare Lösung zurückblieb. Um Probleme mit einer Hydratisie rung zu minimieren, wurden der Farbstoff und das Polymer unter N₂ gelagert und das Lösungsmittel wurde mit Moleku larsieben gelagert.

Die Dicke der Schicht kann eingestellt werden, indem die Polymerkonzentration (je höher, desto dicker) und die Rotationsgeschwindigkeit (je langsamer, desto dicker) vari iert werden.

Vorbereitung der Deckgläschen

Alle Deckgläschen wurden in Salpetersäure mit Säure gewaschen. Die Deckgläschen wurden für 5 Minuten in 70%ige Salpetersäure eingetaucht, mit dH₂O gespült, mit 95% Etha nol gespült und dann in einem Vakuumofen bei 100°C getrock net. Die Säurewäsche war nötig, damit das Polymer-Fluoro phor fest und stabil auf dem Glas verankert blieb.

Rotationsbeschichtungsverfahren. Das Deckgläschen wurde auf einem Rotor befestigt und mit der Polymer/Fluorophor/Lösungs mittelprobe bedeckt. Das Deckgläschen wurde mit einer typischen Geschwindigkeit von 600 Upm für 1 Minute rotiert. Das Deckgläschen wurde dann für eine Stunde bei 100°C in einem Vakuumofen gebrannt, um das Polymer einzu brennen.

Charakterisierung der Beschichtungen. Die Beschichtun gen auf den Deckgläschen wurden durch mehrere Verfahren charakterisiert. Die Homogenität wurde unter einem Phasen kontrastmikroskop getestet, wobei ein 20×- oder ein 40×- Objektiv verwendet wurde. Die Homogenität wurde ebenfalls unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Diaphot) getestet, wobei ein 40×-Objektiv verwendet wurde, oder auf einem kon fokalen Lasermikroskop (Ultima, Meridian Instruments, Oke mos, MI), wobei ein 60×-Objektiv verwendet wurde. Die Absorption der beschichteten Deckgläschen wurde bei 365 nm mit einem Diodenarrayspektrophotometer (Milton Roy Spectro nic, Array 3000) getestet. Die Temperaturempfindlichkeit der verschiedenen Mischungen von Fluorophoren, Polymeren, Lösungsmitteln wurde anfangs in einer Küvette mit einer kontrollierten Temperatur in einem Fluoreszenzspektrofluo rimeter (Aminco Bowman 2, SLM Aminco) getestet. Die Deck gläschen wurden geschnitten und bei einem Winkel von 45 Grad in die mit Wasser gefüllten Küvetten eingepaßt. Diese Konfiguration wurde verwendet zur Bestimmung von:

- dem optimalen Anregungs- und Emissionsspektrum durch ein Aufzeichnen von Anregungs- und Emissionsabtastun gen;
- der Geschwindigkeit des Ausbleichens durch Licht und der Stabilität der Schicht in Wasser (getestet durch ein Aufzeichnen des durchschnittlichen Fluoreszenzsig nals über die Zeit); und
- dem Temperaturkoeffizienten (Änderung der Intensität pro Grad), welcher durch ein Aufzeichnen der Änderungen der Fluoreszenzintensität während Temperaturänderungen von normalerweise 1°C bestimmt wurde.

Zellwachstum auf den Deckfläschen

Zellen der humanen Brusttumorlinie MCF-7 wurden auf den Beschichtungen wachsen gelassen. Die Wachstumsgeschwindig keit auf den Beschichtungen war etwas langsamer als auf der Polystyroloberfläche der Kulturschalen, aber die Lebensfä higkeit war höher als 80%.

Zellkultur

Die MCF-7/ADR-Zellen sind eine Zellinie, die gegenüber Chemotherapeutika resistent ist und welche von einem huma nen Brustkarzinom abgeleitet ist. Sie werden in modifizier tem Eagle-Medium mit Phenolrot, Rinderinsulin 10 µg/ml und L-Glutamin und 10% FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C und 5% pCO₂ (Forma Scientific, OH) aufrechterhalten. Zusätzlich werden die MCF-7/ADR-Zellen kontinuierlich in 0,8 µM Adriamycin gehalten.

Die Zellen werden in einem Olympus-Fluoreszenzmikroskop beobachtet, welches mit einer Xenon-Lampe, einem Uniblitz- Verschluß (Vincent and Associates, Rochester NY) und Fil terrädern auf der Anregungs- und Emissionsseite ausgestat tet ist. Das Verschließen der Lichtquelle wird mit einem Computer gesteuert. Ein Filterhalter wurde hergestellt, um die 450 nm- und 490 nm-Anregungsfilter zu halten. Die Daten werden auf einer gekühlten ladungsgekoppelten Vorrichtung Hamamatsu 4972 (Hamamatsu Photonics) gesammelt und mit einer Software digitalisiert, welche von National Instru ments Lab View geschrieben wurde. Die Zellen werden in einer Kammer mit kontrollierter Temperatur bei einer kon stanten Perfusion von Medium sichtbar gemacht.

Die Zellen werden mit einer λex von 355 nm und einer λem von 614 angeregt. Wenn das Verhältnis von aufeinander folgenden Bildern aufgenommen wurde, konnten die Zellen nicht nachgewiesen werden. Bei Einschluß von FCCP, einem Protonenionophor, welcher die Protonendurchlässigkeit der Mitochondrien erhöht und somit die Hydrolyse von ATP erhöht, gibt es jedoch eine erhöhte Fluoreszenzemission, die mit einem Anstieg der Temperatur konsistent ist. Der größte Anstieg der Temperatur beträgt ungefähr 100 mK und er wird sehr folgerichtig in dem Wachstumskegel der Zelle beobachtet (Fig. 2B und 2D).

Fluoreszenzmessungen

Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Fluoreszenz mikroskop durchgeführt, welches mit einer Hg/Xenon-Lampe ausgerüstet war, wobei ein Ultraviolett-Anregungsfilter und ein Emissionsfilter verwendet wurden. Eu(TTA)₃ wird bei 360 nm angeregt und emittiert bei 614 nm.

Ergebnisse

Wahl der fluoreszierenden Verbindung: Es war notwendig, das gesamte Wasser in dem Lösungsmittel und Polymer zu ent fernen, bevor die Deckgläschen beschichtet wurden. Unglück licherweise beeinträchtigt Wasser nachteilig die Stabilität der Fluorophor/Polymermischung, und viele der häufig ver wendeten Reagenzien, um das Lösungsmittel zu dehydratisie ren, beeinträchtigen ebenfalls nachteilig die Fluorophore. Ein Schlüssel war, einen Fluorophor zu verwenden, welcher ohne nachteilige Wirkungen mit Dehydratisierungsreagenzien behandelt werden konnte. Es stellte sich heraus, daß einer der möglichen Fluorophore (Eu-FOD) größere Änderungen in den Eigenschaften durchmachen würde, wenn wir ihn auf die Deckgläschen brannten. Eu(TTA)₃ wies dieses Problem nicht auf und wurde daher als ein guter Fluorophor ausgewählt.

Wahl des Polymers: Die Fluorophore, welche untersucht wurden, ändern ihre Fluoreszenz als Reaktion auf die Tempe ratur. Jedoch könnte ihre Fluoreszenz ebenso für bestimmte Proteine, Kohlenhydrate, pH oder ionische Änderungen emp findlich sein. So wird der Fluorophor in ein Polymer einge bettet, das verwendet wird, um die Deckgläschen zu beschichten. Polystyrol war unsere erste Wahl für ein Trä gerpolymer. Es ist stabil gegenüber vielen verschiedenen Behandlungen, es ist nicht toxisch, es kann als ein Substrat für wachsende Zellen verwendet werden. Unglückli cherweise waren die Reaktionseigenschaften von EuTTA auf die Temperatur in dem Polystyrol schwach. Es scheint, als ob die Benzolringe in dem Polystyrol nachteilig mit den Gruppen in dem EuTTA wechselwirkten, was zu einem Verlust an Aktivität führte. Andererseits ist PMMA ein nichtaroma tischer Fluorophor. Von diesem Polymer war bekannt, daß es für UV-Wellenlängen empfindlich ist, welche verwendet wer den, um EuTTA anzuregen. Tatsächlich wird UV-Licht oft ver wendet, um PMMA zu ätzen. Jedoch wurde nach einem Variieren der Konzentrationen von PMMA : EuTTAQ : Lösungs mittel : Dehydratisierungsmittel eine Mischung von EuTTA : PMMA bestimmt, welche auf Deckgläschen sehr stabil ist. Diese Mischung kann ohne nachteilige Wirkungen auf die mechani sche Stabilität in eine Wasserumgebung eingetaucht werden; ihr Fluoreszenzsignal ist für wenigstens eine Stunde wäh rend einer UV-Anregung stabil; Wasser beeinflußt das Fluo reszenzsignal nicht nachteilig; und ihre Fluoreszenz ändert sich um 2,5% bei jedem Grad Änderung in Grad Celsius. Wei terhin ist das Rauschen sehr niedrig (ungefähr 100 : 1), was die Auflösung von Änderungen um 0,01°C erlaubt. Eine gra phische Darstellung der Änderung bei der Fluoreszenzinten sität mit der Temperatur ist in Fig. 1 dargestellt. In Tabelle 1 wird die Eu(TTA)₃/PMMA-Mischung mit Proben von anderen Fluorophor/Polymerpaaren im Hinblick auf ihre maxi male logarithmische Steigung/°C verglichen.

Tabelle 1

Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll nicht durch die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt werden. Tatsächlich werden den Fachleuten ver schiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu jenen, welche hierin beschrieben sind, aus der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren klar werden. Sol che Modifikationen sollen in den Umfang der angefügten Ansprüche fallen.

Man sollte weiterhin verstehen, daß alle Basengrößen oder Aminosäuregrößen und alle Molekulargewichts- oder Molekularmassenwerte, welche für Nukleinsäuren oder Poly peptide angegeben werden, ungefähre Werte sind und zur Beschreibung dienen.

Verschiedene Veröffentlichungen werden hierin zitiert, auf deren Offenbarung hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Claims

1. Ein Verfahren zur Feststellung der Temperatur einer Zelle umfassend:

(a) Anordnen einer Zelle auf einer Stoffwechselsonde, wel che ein festes Substrat umfaßt, das einen temperatur empfindlichen Fluorophor eingebettet in ein Polymer enthält, wobei diese, wenn der Fluorophor mit dem geeigneten ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Licht angeregt wird, ein nachweisbares Fluoreszenzsig nal emittiert und wobei, wenn eine lebende Zelle auf der Stoffwechselsonde angeordnet wird, das Fluoreszenz signal durch die Stoffwechselgeschwindigkeit der Zelle hervorgerufen wird;
(b) Anregen des Fluorophors mit dem geeigneten ultraviolet ten, sichtbaren oder infraroten Licht; und
(c) Nachweisen des Fluoreszenzsignals, wobei die Intensität des nachgewiesenen Fluoreszenzsignals ein Anzeichen für die Temperatur der Zelle ist.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein nichtaromatisches synthetisches Polymer ist.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Fluorophor, während er in ein Polymer eingebettet ist, benachbart zu einer wäßrigen Lösung für wenigstens eine Stunde bei Anregung mit ultraviolettem Licht bei 37 Grad Celsius, pH 7,5 ein stabiles Fluoreszenzsignal emittieren kann.

4. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Polymer Poly(methylmethacrylat) ist.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Fluorophor Eu(TTA)₃ ist.

6. Ein Verfahren zum Feststellen der Stoffwechselaktivität einer Zelle, welches ein Feststellen der Temperatur der Zelle durch das Verfahren nach Anspruch 1 und ein Kor relieren der Temperatur mit ihrer Stoffwechselaktivität umfaßt.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.

8. Ein Verfahren zum Feststellen des Vorliegens eines ano malen Metabolismus in einer Zelle, die von gesundem Gewebe umgeben ist, welches ein Feststellen der Tempe ratur der Zelle durch das Verfahren nach Anspruch 1 umfaßt, wobei ein Unterschied in der Temperatur der Zelle in Bezug auf eine Kontrollzelle ein Anzeichen dafür ist, daß die Zelle einen anomalen Metabolismus durchmacht.

9. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das lebende Gewebe aus einer Tumorbiopsie erhalten wird.

10. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei der anomale Meta bolismus der Zelle ein Anzeichen für eine ultraviolette Schädigung, eine Kachexie oder eine Apoptosis ist.