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DE102004046364A1 - Verfahren zur Bestimmung von DNA- Schäden und Vielkammer-Behälter - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von DNA- Schäden und Vielkammer-Behälter Download PDF

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Hartmut De Wall
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Abstract

Bei einem Verfahren zur Bestimmung von DNA-Schäden, wobei Zellen mit Schadstoffen behandelt und lysiert werden und DNA-Bruchstücke der Zellen durch ein physikalisches Trennverfahren ihrer Länge nach aufgetrennt werden, werden Zellen in verschiedene Kammern eines Vielkammerbehälters gegeben und eine Mehrzahl an Schadstoffproben in die verschiedenen Kammern des Vielkammerbehälters gegeben. Anschließend wird die Zytotoxizität gemessen und dann die Wände des Vielkammerbehälters entfernt und das physikalische Trennverfahren für alle Proben zusammen durchgeführt. Der dazu verwendete Vielkammerbehälter zeichnet sich dadurch aus, daß die Wände des Vielkammerbehälters abnehmbar sind und der Vielkammerbehälter mindestens im Bodenbereich eine Beschichtung aufweist. Durch das Verfahren unter Verwendung des beschichteten Vielkammerbehälters lassen sich Proben zur Prüfung auf DNA-Schäden besonders schnell, effektiv und kostengünstig untersuchen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von DNA-Schäden, wobei Zellen mit Schadstoffen behandelt und lysiert werden und DNA-Bruchstücke der Zellen durch ein physikalisches Trennverfahren ihrer Länge nach aufgetrennt werden, wobei Zellen in verschiedene Kammern eines Vielkammerbehälters gegeben werden und eine Mehrzahl von Schadstoffproben in die verschiedenen Kammern des Vielkammerbehälters gegeben werden. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Vielkammerbehälter für biologische, medizinische, pharmazeutische und chemische Untersuchungen, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens.
  • Ein Verfahren zur Bestimmung von DNA-Schäden der eingangs genannten Art ist beispielsweise der so genannte „Comet assay". Dieses Verfahren dient zur Bestimmung von DNA-Schäden (Gen-Schäden) in einzelnen Zellen. Dabei werden die DNA-Schäden als DNA-Strangbrüche detektiert. Es besteht auch die Möglichkeit, die Persistenz der gesetzten Schäden, also die Reparatur der DNA-Schäden, zu bestimmen.
  • Zur Durchführung des herkömmlichen „Comet assay" (auch „Single Cell Gel Electrophoresis" genannt) werden adherent wachsende Zellen in eine Petrischale gegeben und die am Boden des Kulturgefäßes anhaftenden Zellen werden begiftet. Die Zellen werden dann aus dieser Petrischale gelöst (trypsiniert), mit LMP-Agarose gemischt und auf einen mit Agarose vorbeschichteten Objektträger übertragen. Dort werden die Zellen lysiert (Zellwände werden aufgelöst) und die DNA freigelegt. Die DNA-Bruchstücke werden über ein physikalisches Trennverfahren, der Elektrophorese ihrer Länge nach aufgetrennt. Dabei wandern die negativ geladenen DNA-Moleküle entsprechend ihrer Größe auf einem Trägermaterial. Die DNA jeder einzelnen Zelle kann nach Anfärbung unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Die ungeschädigte DNA erscheint als rundlicher Fleck (so genannter Kometenkern oder Kopf). Bei geschädigter DNA entsteht aufgrund zahlreicher kleiner DNA-Fragmente zusätzlich ein mehr oder weniger ausgeprägter Schweif (ein sogenannter Kometenschweif) bei gleichzeitiger Abnahme der Intensität des Kometenkerns. Die Intensität bzw. Helligkeit des Schweifes hängt von der DNA-Wanderung aus dem Kernbereich ab. Der Schweif ist umso länger, je kleiner die gebildeten Fragmente sind. Als quantifizierbares Maß der DNA-Schädigung erfolgt entweder eine Einteilung in Schadstoffklassen oder es wird die Schweifintensität oder ein Produkt aus prozentualem Anteil der DNA im Schweif und der Schweiflänge angegeben (das so genannte Tailmoment).
    •
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Durchführung des Verfahrens bei der Untersuchung von mehreren Proben zu vereinfachen und eine, schnelle Untersuchung mehrerer Proben zu ermöglichen.
  • Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 und mit einem Vielkammer-Behälter mit den Merkmalen des Patentanspruchs 8. Vorteilhafte Weiterentwicklungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.
  • Bei dem Verfahren zur Bestimmung von DNA-Schäden, bei dem Zellen mit Schadstoffen behandelt und lysiert werden und DNA-Bruchstücke der Zellen durch ein physikalisches Trennverfahren ihrer Länge nach aufgetrennt werden, wobei Zellen in verschiedene Kammern eines Vielkammer-Behälters gegeben werden und eine Mehrzahl an Schadstoffproben in die verschiedenen Kammern des Vielkammerbehälters gegeben werden, ist es erfindungswesentlich, daß die Wände des Vielkammerbehälters entfernt werden und daß das physikalische Trennverfahren für alle Proben zusammen durchgeführt wird. Es können dadurch parallel eine Vielzahl von Proben untersucht werden und dies kann weitgehend automatisch erfolgen. Der Untersuchungsaufwand wird dadurch erheblich verkleinert und die Zahl der Untersuchungsschritte wird insbesondere durch das Auslassen des Umsetzens der Zellen entscheidend verkürzt. Gegenüber bekannten Techniken kann die Anzahl der untersuchten Proben von etwa 12–24 auf 300–400/Tag und Person gesteigert werden. Das physikalische Trennverfahren, insbesondere die Elektrophorese, wird zusammen und gleichzeitig für alle Proben durchgeführt. Das Verfahren ist insbesondere geeignet für adherente Zellen. Denkbar ist auch ein Einsatz für nicht adherente beziehungsweise in Lösung befindliche Zellen.
  • Insbesondere ist es bevorzugt, daß die Begiftung der Zellen und das Trennverfahren am selben Ort stattfinden. Die Zellen müssen also nicht trypsiniert und transferiert werden. In einer bevorzugten Weiterentwicklung der Erfindung wird die Begiftung der Zellen parallel durchgeführt. Hierfür können Multipipetten oder Roboter verwendet werden, so daß in jede Kammer des Vielkammer-Behälters gleichzeitig eine Testsubstanz oder ein Testsubstanzgemisch gegeben wird. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung erfolgt nach dem Entfernen der Kammerwände die Auflösung der Zellwände. Das heißt, daß der Verfahrensschritt des Lysierens erst nach dem Entfernen der Wände durchgeführt wird. Denkbar ist es auch, diesen Schritt bereits vor dem Entfernen der Wände durchzuführen.
  • In einer besonders günstigen Weiterentwicklung der Erfindung werden die behandelten Zellen nach der physikalischen Trennung der DNA mit einem in mindestens zwei Dimensionen verfahrbaren Mikroskop abgefahren und die ermittelten Bilder werden ausgewertet. Bevorzugt erfolgt dies voll automatisch, so daß dies auch über Nacht erfolgen kann und dadurch etwa 50 Arbeitsstunden eingespart werden können. Das Mikroskop ist dabei bevorzugt mit einem in x-, y- und z-Richtung verstellbaren Kreuztisch ausgestattet, also in 3-Dimensionen verfahrbar, und mit einer Steuerungseinrichtung zum Abfahren der Vielzahl der Proben ausgerüstet und weist eine Software auf, die es ermöglicht, das Mikroskop auf die Kometen schart einzustellen. Das Mikroskopbild wird dann fotografiert und es erfolgt eine automatische Auswertung der Kometen bevorzugt über die Einteilung in Schadstoffklassen, oder über die Schweiflänge oder über das Produkt aus prozentualem Anteil der DNA im Schweif und der Schweiflänge. Weiterhin ist es möglich, diese Ergebnisse auch automatisch grafisch darzustellen.
  • In einer anderen Weiterentwicklung der Erfindung wird in das Verfahren auch ein Toxizitätstest integriert. Bevorzugt erfolgt der Toxizitätstest an denselben Zellen, an denen auch die Gen-Schädigung gemessen wird. Zur Toxizitätsuntersuchung wird bevorzugt der FDA-Assay eingesetzt. In Anlehnung an den Fluoresceindiacetat-Toxizitätstest (FDA-Test) nach Rotman und Papermaster (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 55, 131–141) kann die Vitalität der Zellen nach Giftbehandlung in dem Vielkammer-Behälter vor der Zelllyse gemessen werden. Bei diesem Test sind geschädigte Zellen in ihrer Fähigkeit, FDA zum fluoreszierenden Fluorescein abzubauen, reduziert. Die Fluoreszenzintensität wird mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät gemessen. Anschließend werden die Kammerwände abgenommen und die Zellen lysiert und die notwendigen Schritte für die Elektrophorese durchgeführt. Durch die hohe Sensitivität des FDA-Tests ist für das Verfahren eine geringe Anzahl an Zellen ausreichend, um zu einer statistisch abgesicherten Toxizitätsaussage zu kommen. Zur besseren Durchführung der Fluoreszenzmessung sind die Seitenwände schwarz ausgebildet.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Vielkammer-Behälters für biologische, medizinische, pharmazeutische und chemische Untersuchungen, insbesondere zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens, wobei sich dieser Vielkammer-Behälter dadurch auszeichnet, daß er mindestens im Bodenbereich eine Beschichtung aufweist und die Wände des Vielkammer-Behälters abnehmbar sind. Der Vielkammer-Behälter ist insbesondere zur gleichzeitigen Untersuchung einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben geeignet. In den einzelnen Kammern können zunächst Voruntersuchungen wie Zytotoxizitätsuntersuchungen durchgeführt werden und nach Abnahme der Wände bleiben die behandelten Zellen auf der Beschichtung haften und können gleichzeitig und automatisch weiter bearbeitet werden, insbesondere mit einem physikalischen Trennverfahren, insbesondere der Elektrophorese. Der Boden des Vielkammer-Behälters, insbesondere jeder Bodenbereich jeder Kammer ist bevorzugt planar ausgebildet, um die weiteren Untersuchungen zu vereinfachen. Mit der Beschichtung wird bevorzugt weiterhin erreicht, daß eine gute Zellhaftung mit kugeliger Zellform erreicht wird. Aufgrund der Beschichtung ist ein Trypsinieren nicht mehr notwendig und die Zellen brauchen nicht transferiert werden.
  • Um die Wände des Vielkammer-Behälters abnehmbar zu gestalten, werden diese bevorzugt mit Hilfe einer Klebeverbindung oder Haftverbindung auf dem Boden des Vielkammer-Behälters befestigt. Diese Form der Befestigung bildet eine Art Sollbruchstelle. In einer anderen Weiterentwicklung sind die Wände mechanisch über eine Sollbruchstelle mit einer Steckverbindung oder einer lösbaren Rastverbindung auf dem Boden befestigt.
  • Der Vielkammer-Behälter kann in unterschiedlichen Größen ausgebildet sein. Bevorzugt ist die Ausbildung eines Vielkammer-Behälters mit 96 Kammern. In anderen Ausgestaltungen weist ein solcher Vielkammer-Behälter acht Kammern auf. Auch andere Größen sind problemlos herstellbar, zum Beispiel 6, 12, 24, 48, 192 oder nahezu beliebige andere Größen. Die Wände des Vielkammer-Behälters sind zur reinen Gentoxizitätsuntersuchung transparent und zur Miterfassung der Zytotoxizität bevorzugt nicht reflektierend, insbesondere schwarz ausgebildet. Auf diese Weise läßt sich in den Kammern des Vielkammer-Behälters auch ein Fluoreszenztest durchführen.
  • In einer anderen bevorzugten Weiterentwicklung der Erfindung ist der Vielkammer-Behälter im Bodenbereich mit einem Trägermaterial zur Durchführung eines physikalischen Trennverfahrens, insbesondere einer Elektrophorese, belegt. Auch dadurch können die in den Vielkammer-Behälter eingebrachten Zelln nach Begiftung in dem Vielkammer-Behälter verbleiben und nach Abnahme der Seitenwände lysiert werden. An diesen Proben kann das physikalische Trennverfahren dann direkt durchgeführt werden. Das Trägermaterial weist bevorzugt eine Mischung aus Gelatine und Agarose auf. Diese Beschichtung gewährleistet, dass die kugelige Zellform erhalten bleibt, die Zellen sich nicht ausbreiten und nicht trypsiniert werden müssen. Bevorzugt ist der größere Anteil der Mischung Gelatine. Das Mischungsverhältnis von Agarose zu Gelatine beträgt bevorzugt 1:10 bis 1:2, insbesondere 1:5 bis 1:3 und besonders bevorzugt 1:3,3.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausbildung der Erfindung ist unterhalb des Trägermaterials eine Grundschicht, insbesondere Agarose, vorgesehen. Diese dient unter anderem der besseren Anheftung der zuvor genannten Trägerschicht. Die Agarose in der Grundschicht trägt auch zur besseren Durchführung der Elektrophorese bei. Es können verschiedene Agarosearten in verschiedenen Konzentrationen verwendet werden. Alternativ kann die Grundbeschichtung auch derart ausgebildet sein, daß der Boden des Vielkammer-Behälters aufgerauht ist und auf diese Weise eine bessere Anheftung des Trägermaterials erreicht wird.
  • In einer weiteren Weiterbildung der Erfindung ist oberhalb der Trägerschicht eine weitere Schicht vorgesehen. Diese dient der Verbesserung der Anheftungsbedingungen der Zellen und ist besonders wichtig zur Durchführung des Toxizitätsnachweises. Bevorzugt weist diese Zellenhaftschicht Poly-Lysin auf. Insbesondere wird hierfür Poly-D-Lysin oder auch Poly-L-Lysin, insbesondere in einer Konzentration von etwa 50 μg/ml, verwendet. Es kann auch Fibronectin, insbesondere in Konzentrationen von 0,05 bis 0,01 mg/ml, Kollagen, insbesondere in Konzentrationen von 0,1 % bis 0,5 % (W/V) oder ein dünner Film eines fetalen Kälberserums eingesetzt werden. Die genannten Zusätze können auch Calcium und Magnesiumionen enthalten. Die Beschichtung des Vielkammer-Behälters erfolgt vor der Durchführung des Verfahrens. Die Beschichtung mit LMP-Agarose erfolgt nach der Demontage der Vielkammer-Behälter. Nach dem Abnehmen der Wände verbleiben dann an den Stellen, an denen vorher die Wände waren, Streifen, die nur LMP-Agarose aufweisen. Da die anderen Schichten jedoch fehlen, kann die DNA einer Probe nicht in die Nachbarprobe wandern.
    •
  • Nachfolgend wird die Durchführung des Gesamtverfahrens anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels erläutert.
  • Bevorzugte Vorschrift zur Durchführung des kombinierten Zytotoxizitäts/Gentoxizitätsexperimentes (FDA-Bestimmung/comet-assay) für adherente Zellen
    • – Zellen in das MCW aussäen (Endkonzentration: abhängig von der Kammergröße)
    • – 15 Minuten bis 2 Stunden mit dem Schadstoff (im serumfreien Medium) in verschiedenen Konzentrationen inkubieren
    • – Schadstoff abnehmen
    • – Für 5–10 min. 50 μl FDA-Lösung: 60 μl Stammlösung (50 mg FDA in 10 ml Aceton) in 10 ml PBS-Puffer/Kammer im Dunkeln inkubieren
    • – im Fluoreszenzplattenlesegerät gemessen (Anregung: 485 nm, Emission: 520 nm)
    • – Demontage der Wände des MCWs. Alle nachfolgenden Schritte bei gedämpften Licht durchführen
    • – Eintauchen (dippen) der demontierten MCW-Platte in gelöste, 37 °C warmer LMP-Agarose (0,25 g LMP-Agarose in 50 ml PBS-Puffer)
    • – Bei 3 °C Agaroseschicht für 3–5 min abkühlen lassen
    • – für 1 h in frisch hergestellter Lyselösung (Zusammensetzung siehe unten) bei 0 °C inkubieren
    • – MCW-Platte in horizontale Elektrophoresekammer geben und für 40 min. im eiskalten alkalischen Elektrophoresepuffer (Zusammensetzung siehe unten) belassen (alternativ kann auch der neutrale Comet assay zur Bestimmung von Doppelstrangbrüchen durchgeführt werden).
    • – für 20 min. bei 25 V und 300 mA Elektrophorese durchführen
    • – MCW-Platte aus der Elektrophoresekammer nehmen und für 5 min. in Neutralisationspuffer (48,5 g/l Tris, mit rauchender HCL auf pH 7,5 einstellen) geben; Vorgang 2 × wiederholen
    • – kurz mit bidestilliertem Wasser spülen
    • – MCW-Platte trocknen (bei 20 °C)
    • – die Proben z.B. mit Ethidiumbromidlösung (2 μg/ml) anfärben
    • – MCW mit einem Deckglas (in der Größe der MCW-Platte) bedecken und nach 15 min. die Kometen im Fluoreszenzmikroskop (Anregungsstelle 515–560 nm, Barrierefilter 590 nm) vollautomatisch auswerten.
    • – Färbung kann durch Verwenden einer Antifadelösung über einen längeren Zeitraum konserviert werden.
  • Lösungen:
  • LMP-Agarose:
    • 0,250 g LMP Agarose (Sea Plaque GTG Agarose)
    • 50 ml PBS-Puffer
    • lösen durch Aufkochen in der Mikrowelle,
    • bei 37 °C auf das MCW auftragen
  • Lyselösung:
  • Stammlösung:
    • 2,5 M NaCl
    • 100 mM EDTA (Titriplex III)
    • 10 mM Tris
    • Salze mit 8 g/l NaOH 1ösen und pH auf 10 einstellen
    • 1 % Na-Laurylsarkosinat (10 g)
    • mit Aqua bidest auf 890 ml auffüllen
  • Gebrauchslösung:
    • 1 ml Triton X-100
    • 10 ml DMSO
    • 89 ml Lysestammlösung
  • Elektrophoresepuffer:
  • Stammlösungen:
    • a) 10 mol/l NaOH (in bidest. Wasser)
    • b) 0,2 mol/l EDTA (in bidest. Wasser), auf pH 10 einstellen
  • Gebrauchslösung:
    • 30 ml a) + 5 ml b), auf 1 l bidest Wasser auffüllen, pH Wert sollte >13 sein.
  • Rezeptur zur Beschichtung des MCWs
  • Die Beschichtungsdicke sollte insgesamt bei ca. 50 μm liegen
  • 1. Beschichtung:
    • – 3 g Seakem Agarose LE in 200 ml PBS Puffer (nach Dulbecco) geben
    • – kurz aufkochen und auf 60 °C abkühlen
    • – Aufkoch- und Abkühlungsprozedur 3 × wiederholen
    • – bei 100 °C Oberfläche beschichten (dippen) und langsam trocknen lassen
  • 2.Beschichtung:
    • – 5 g Gelatine in 500 ml bidest. Wasser bei 60 °C lösen
    • – 3,3 Teile Gelatinelösung mit 1 Teil fertig hergestellter Agaroselösung mischen und auf 100 °C erhitzen.
    • - bei 100 °C auf 1. Coatingschicht auftragen (dippen) und langsam trocknen lassen
  • 3. Beschichtung:
    • – 50 μg/ml Poly-L-Lysin in Aqua bidest. auf die 2. Coatingschicht auftragen
    • – 30 min im Brutschrank bei 37 °C inkubieren
    • – mit PBS-Puffer (nach Dulbecco) spülen

Claims (18)

  1. Verfahren zur Bestimmung von DNA-Schäden, wobei Zellen mit Schadstoffen behandelt und lysiert werden und DNA-Bruchstücke der Zellen durch ein physikalisches Trennverfahren ihrer Länge nach aufgetrennt werden, wobei Zellen in verschiedene Kammern eines Vielkammerbehälters gegeben werden und eine Mehrzahl an Schadstoffproben in die verschiedenen Kammern des Vielkammerbehälters gegeben werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des Vielkammerbehälters entfernt werden und dass das physikalische Trennverfahren für alle Proben zusammen durchgeführt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Begiftung der Zellen und das Trennverfahren am selben Ort durchgeführt werden.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des Vielkammer-Behälters demontierbar sind und nach dem Entfernen der Kammerwände die Lyse der Zellen durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten Zellen mit einem in mindestens zwei Dimensionen verfahrbaren Mikroskop abgefahren werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem verfahrbaren Mikroskop Bilder der Proben erstellt und automatisch ausgewertet werden.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in das Verfahren ein Toxizitätstests integriert wird.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an derselben Zellprobe, an denen die Gen-Schädigung gemessen wird, ein Toxizitätstest durchgeführt wird.
  8. Vielkammer-Behälter für biologische, medizinische, pharmazeutische und chemische Untersuchungen, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des Vielkammer-Behälters abnehmbar sind, dass der Vielkammer-Behälter mindestens im Bodenbereich eine Beschichtung aufweist.
  9. Vielkammer-Behälter nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des Vielkammer-Behälters eine Sollbruchstelle aufweisen.
  10. Vielkammer-Behälter nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des Vielkammer-Behälters mit einer Klebeverbindung oder einer Haftverbindung auf dem Boden des Vielkammer-Behälters befestigt sind.
  11. Vielkammer-Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Vielkammer-Behälter 96 Kammern aufweist.
  12. Vielkammer-Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Vielkammer-Behälter 8 Kammern aufweist.
  13. Vielkammer-Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände nicht reflektieren, insbesondere schwarz ausgebildet sind.
  14. Vielkammer-Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Vielkammer-Behälter im Bodenbereich mit einem Trägermaterial zur Durchführung eines physikalischen Trennverfahrens, insbesondere einer Elektrophorese, belegt ist.
  15. Vielkammer-Behälter nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial Gelatine und/oder Agarose aufweist.
  16. Vielkammer-Behälter nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass unterhalb des Trägermaterials eine Grundschicht, insbesondere Agarose, vorgesehen ist.
  17. Vielkammer-Behälter nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass oberhalb des Trägermaterials eine Schicht zur Zellanhaftung vorgesehen ist.
  18. Vielkammer-Behälter nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellenhaftschicht Poly-Lysin aufweist.
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