DE19900743A1

DE19900743A1 - Neue komplexbildende Proteine

Info

Publication number: DE19900743A1
Application number: DE19900743A
Authority: DE
Inventors: Valerie Jerome; Hans-Harald Sedlacek; Rolf Mueller
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1999-01-12
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2000-07-13
Also published as: EP1144634A2; HK1042520A1; AU2796000A; US6495346B1; KR20010089817A; US20030054409A1; JP2002534121A; WO2000042179A3; WO2000042179A2; CN1340103A; ZA200105427B; CA2359479A1; MXPA01006988A

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf einen Komplex aus nicht vorkommenden, spezifisch komplexbildenden Proteinen, enthaltend folgende Komponenten: a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand, b) mindestens ein Protein, enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist, c) mindestens ein Protein, enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechselwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponentne d) verbunden ist, und d) mindestens einen Effektor. Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung und Herstellung dieser Komplexe sowie Nukleinsäurekonstrukte kodierend für die genannten Proteine und deren Verwendung.

Description

1. Einleitung

Komplexverbindungen zwischen Proteinen sind in der Natur weit verbreitet.

Grundsätzlich können diese Proteine folgenden Gruppen zugeordnet werden:

- Antikörper, welche mit ihrer Antigenbindestelle spezifisch an das korrespondierende Epitop eines Antigens (welches auch ein anderer Antikörper sein kann) binden können
- Proteinkomplexe, wie sie beispielsweise bei der Aktivierung des Gerinnungssystems oder des Komplementsystems vorkommen
- Liganden-Rezeptorinteraktionen der unterschiedlichsten Art, beispielsweise
- - von Antigenen oder deren Epitopen mit dem T-Zell- oder B-Zell-Rezeptor
- - von Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen, Peptidhormonen, Steroidhormonen und Mediatoren mit ihren jeweiligen Rezeptoren
- - von Enzymen wie beispielsweise uPA oder tPA mit ihrem Rezeptor
- - von Virusproteinen mit ihrem zugehörigen zellulären Rezeptor
- Adhäsionen zwischen Adhäsionsmolekülen
- Proteinkomplexe bei der Signalübertragung, der Zellzykluskontrolle und der Transkriptionskontrolle von Genen

Zahlreiche Beispiele hierfür sind in der Literatur zusammengefaßt, so von Hardie et al.; The Protein Kinase Facts Book I and II, Academic Press 1995, Callard et al., The Cytokine Facts Book, Academic Press 1994, Pigott et al., The Adhesion Molecule Facts Book, Academic Press 1994, Barclay et al., The Leukocyte Antigen Facts Book, Academic Press 1994, Watson et al., G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press 1994, Hesketh, The Oncogene Facts Book, Academic Press 1995, Leid et al., Cell 68, 377 (1992), Murre et al., Cell 58, 537 (1989), Bbeneza et al., Cell 61, 49 (1990), Brugge, Curr. Top. Microbiol. Immunolbiol. 123, 1 (1981), Callebaut et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6270 (1992), Nadeau et al., J. Biol. Chem. 268, 1479 (1993), Burbach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8185 (1992), Hoffman et al., Science 252, 954 (1991), Stress-induced Proteins, M. L. Pardue, J. R. Feramisco and S. Lindquist Ed, A. R. Liss, New York (1989), Eukaryotic Transcription Factor, D. S. Lachman, Academic Press (1991), Transoriptional Regulations, Eds. S. McKnight and K. R. Yamamoto, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York (1992).

In einigen Fällen werden die von der Natur vorgegebenen, weitgehend spezifischen Verbindungen zwischen mindestens zwei Proteinen benutzt für die Analyse bzw. Detektion von Proteinen bei der Diagnose von Krankheiten (siehe hierzu EP 0 491 362 B1) und die Bindungspartner solcher Proteine für die Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen. Steht ein Partner der jeweiligen Proteinkomplexe zur Verfügung, kann mit Hilfe dieses Partners die Menge des zweiten oder weiterer Partner, seien es beispielsweise Komplement- oder Gerinnungsfaktoren, Antigene, Rezeptoren oder Signalproteine ermittelt werden. Darüber hinaus werden spezifische Proteinkomplexe benutzt für die Suche nach kleinmolekularen Aktivatoren oder Inhibitoren. Des weiteren werden gereinigte Antikörper oder Liganden für Rezeptoren, wie beispielsweise Cytokine und Peptidhormone, für die Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen Patienten oder Tieren verabreicht.

Bei diesen unterschiedlichen Anwendungsmöglichkeiten für Proteine, die Proteinkomplexe bilden, ist von entscheidender Bedeutung die Spezifität, mit welcher die jeweiligen Proteine eine Komplexbildung eingehen, des weiteren die Verbreitung der jeweiligen Proteine im Organismus. Je geringer die Spezifität ist, um so häufiger werden unspezifische Bindungen eines Partners mit fremden Proteinen auftreten.

Beispielsweise sind unspezifische, d. h. unerwünschte Komplexbildungen mit fremden Proteinpartnern bekanntermaßen das wesentliche Problem der Analytik und Diagnose mit Antikörpern. Unerwünschte Komplexbildungen mit fremden Proteinpartnern können auch in vivo die Ursache für Nebenwirkungen beispielsweise nach Injektion von Antikörpern sein. Des weiteren ist die spezifische ausschließliche Bindung zwischen zwei Proteinen eine wesentliche Voraussetzung für die Herstellung und spezifische Funktionsweise von komplexen Transkriptionsfaktoren, insbesondere von künstlichen Transkriptionsfaktorkomplexen, wie sie in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 beschrieben wurden.

Es besteht somit ein erheblicher Bedarf an neuen, hochspezifisch, nicht mit fremden Partnern reagierenden komplexbildenden Proteinen.

2. Kurzbeschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Komplex aus nicht natürlich vorkommenden, spezifisch komplexbildenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Komponenten im Komplex enthalten sind:

a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand,
b) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist,
c) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimensierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechselwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponente d) verbunden ist, und
d) mindestens einen Effektor.

Entsprechend der Erfindung sind die Komponenten b) und c) dadurch charakterisiert, daß in natürlich vorkommenden Peptiden oder Proteinen gleicher oder unterschiedlicher Art Aminosäuren ausgetauscht oder eingefügt werden, so daß die so mutierten Peptide oder Proteine praktisch nur noch ausschließlich miteinander komplexieren können. Eine Komplexierung so mutierter Peptide oder Proteine mit den entsprechenden nichtmutierten Wildtyp-Proteinen oder -Peptiden unterbleibt hingegen. Auf diese Weise können Homodimere oder Heterodimere aus mutierten Monomeren (mutierte Peptide oder Proteine) gebildet werden.

Die Mutationen in den Bindungsdomänen der gleichen oder verschiedenen Proteine haben daher den Zweck, die Fähigkeit zur Komplexbildung zwischen einem unmutierten Monomeren und einem mutierten Monomeren eines Paares gleicher oder verschiedener Proteine oder Peptide, die im unmutierten Zustand komplexieren würden, zu verhindern. Gleichzeitig verleihen die Mutationen einem solchen Paar von mutierten Proteinen die Fähigkeit, mit hoher Spezifität aneinander zu binden. Die Mutationen treten also paarweise auf, wobei eine Mutation in Komponente b), die andere in Komponente c) vorliegt, und zwar so, daß eine molekulare Interaktion zwischen den jeweiligen Aminosäuren eines solchen Paares möglich ist.

Aminosäuren gemäß der Erfindung eingefügt in natürlich vorkommende Peptide oder Proteine können beispielsweise sein (die paarweise Auflistung soll die molekulare Interaktion im Rahmen eines dimeren Proteinkomplexes andeuten):

Komponente b) oder c)
Komponente c) oder b)
3-18 Cysteine	3-18 Cysteine
3-4 basische Aminosäuren wie	3-24 saure Aminosäuren wie
Histidin,	Asparagin,
Arginin,	Asparaginsäure,
Lysin	Glutamin,
Glutaminsäure@	3-24 hydrophobe Aminosäuren wie	3-24 aromatische Aminosäuren wie
Methionib,	Phenylalnin,
Isoleucin,	Tyrosin,
Leucin,	Tryptophan
Valin	Tryptophan
3-24 aromatische Aminosäuren	3-24 aromatische Aminosäuren

Die Ausgangsproteine für Komponente b) und c) können hierbei gleich oder unterschiedlich sein.

Die Bindungskonstante eines Komplexes zweier erfindungsgemäßer Proteine beträgt mindestens K_M = 10^-7 mol l^-1, bevorzugt mindestens K_M = 10^-8 mol l^-1.

Im Sinne dieser Erfindung werden beispielsweise folgende gleiche oder ungleiche Partner (für die Herstellung von Komponente b) oder c) und mit dem Ziel Heteromere zu binden) bevorzugt in ihrer jeweiligen Bindedomäne mutiert und diese oder das gesamte Protein verwendet:

Komponente b) oder c)
Komponente c) oder b)
Fos	Jun oder Jun B oder Jun D
FRA-1	Jun oder Jun B oder Jun D
FRAU-2	Jun oder Jun B oder Jun D
FOS-B	Jun oder Jun B oder Jun D
OCT-1	Jun oder Jun B oder Jun D
NFKB (p65)	IKB
Ras	RAF
CD4	p56LcK
bcl-2	bad oder bax
cyclin A	cdk1
E2F	DP
CD40	CD40L
Myc	Max
Myc N	Max
Myc L	Max
p105 (Rb1)	AFF-2, E1A
p107 (Rb2)	E7, E2F oder Myc
p130	E7, E2F oder Myc
CBL	Gag
TRP	TRP
Met	Met
Myb	p67 oder p160
VAV	p67 oder p160
APC	α- oder β-Catenin
APC	APC
VD Rezeptor	h-(Retinoid x-Rezeptor)RXR α oder β
T3 Rezeptor	hRXR α oder β
MyoD	E12
E12	Id
E47	Id
hHSP90	Progesteron-Rezeptor
hHSP90	Glucocorticoid-Rezeptor
hHSP90	Mineralocorticoid-Rezeptor
hHSP90	Dioxinrezeptor
Dioxinrezeptor	Arnt
HPS90	FKBP59
HSP90	Cyclosporin-bindendes Protein
HPS90	pp60^V-src
HSP70	HSF1 Heat shock Faktor 1
HSP70	HSF2 Heat shock Faktor 2

Bevorzugt werden sollten solche Proteinpaare, welche natürlicherweise über eine Helix-Loop-Helix/Leucin-Zipper-Bindesequenz verfügen.

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren die unterschiedlichsten Verwendungen dieser erfindungsgemäßen komplexbildenden Proteine, beispielsweise

- als multivalente Proteinkomplexe für die Prophylaxe und Therapie
- als multivalente Liganden für Vektoren zur Gentherapie
- als künstliche Transkriptionsfaktoren für die Kontrolle der Expression von Genen
- und als diagnostische oder analytische Systeme.

Hierbei werden die Komponenten a) und d) je nach der gewählten Verwendungsart ausgewählt.

Gegenstand der Erfindung sind besonders neue komplexbildende Proteine, dadurch charakterisiert, daß in natürlicherweise Homodimere oder Heterodimere bildenden Proteinen die aufgeführten Aminosäuren eingefügt worden sind, so daß diese derartig mutierten Proteine (Komponenten b) und c) nur noch mit sich selber (Homodimere) oder mit dem entsprechend mutierten Partner (Heterodimere) Komplexe bilden, jedoch nicht mehr mit den natürlicherweise vorkommenden, nicht mutierten Ausgangsproteinen.

Neue komplexbildende Proteine mit den Komponenten a), b), c) und d) können in beispielsweise zwei Ausführungsformen verwendet werden.

In der ersten Ausführungsform (siehe Fig. 1a) stellt die Komponente b) ein Homo- (oder Hetero-)multimer dar [Komponente b)1-b)n], an welche die jeweils korrespondierenden gleichen (oder unterschiedlichen) Komponenten c) jeweils als Monomer und jeweils verbunden mit der Komponente d) binden.

Mit dieser Ausführungsform werden viele Komponenten d) (Effektoren) an die Zielstruktur gebunden.

In der zweiten Ausführungsform (siehe Fig. 2) stellen sowohl die Komponente b) als auch die Komponente c) Multimere dar, wobei an die Komponente c) nur eine oder wenige Komponenten d) gebunden sind. Mit dieser Ausführungsform werden zwar nur wenige Komponenten d) (Effektoren) an die Zielstruktur gebunden, aber die Bindung zwischen den Komponenten c) und d) ist außerordentlich stark, was die Spezifität der Bindung der Komponenten c) und d) an die Zielstruktur erhöhen kann. Gegenstand der Erfindung sind neue, komplexbildende Proteine bestehend aus den Komponenten a), b) c) und d), wie auch Nukleinsäurekonstrukte, welche für diese komplexbildenden Proteine kodieren. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Komplexe bestehend aus den Komponenten d), b), c) und d), d. h. die Komponente a) ist durch d) ersetzt, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.

Desweiteren ist Gegenstand der Erfindung ein Komplex bestehend aus den Komponenten a), b), c) und a); d. h. die Komponente d) ist durch a) ersetzt, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch komplexbildende Proteine bestehend aus den Komponenten a), b), c) und d) oder oben beschriebenen Varianten davon, die zusätzlich ein fusiogenes Peptid, ein Translokationspeptid oder zwischen den Komponenten c) und d) oder a) und b) eine Spaltsequenz für eine Protease enthalten, und dafür kodierende Nukleinsäurekonstrukte.

Alle solchen derartigen Nukleinsäurekonstrukte können in Bakterien, Hefen oder Säugerzellen mit Hilfe von viralen oder nichtviralen, dem Fachmann bekannten Vektoren eingeführt werden.

Derartige Zellen können der Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins dienen oder selbst zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie einem Organismus verabreicht werden.

Derartige Nukleinsäurekonstrukte, eingefügt in einen Vektor, können jedoch auch direkt einem Organismus zum Zwecke der Prophylaxe oder Therapie verabreicht werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung einer der o. g. Komplexe, in dem ein Protein dieses Komplexes mit Hilfe eines dafür kodierenden Nukleinsäurekonstruktes exprimiert wird und eine weiteres Protein dieses Komplexes, welches von ersterem verschieden ist, mit Hilfe eines dafür kodierenden Nukleinsäurekonstrukts exprimiert wird, die exprimierten Proteine isoliert und miteinander komplexiert werden. Im Falle von Komplexen bestehend aus Homodimeren oder Homooligomeren erfolgt die Herstellung ohne die Expression eines zweiten, vom ersten verschiedenen Protein.

3. Multivalente Proteinkomplexe für die Prophylaxe und Therapie

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinkomplexe für die Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung. Hierbei stellt die Komponente a) einen Liganden für eine Zielstruktur dar. Diese Zielstruktur kann auf einer Zellmembran, in der extrazellulären Matrix oder in einer Gewebe- oder Blutflüssigkeit vorhanden sein.

Gemäß der Erfindung kann die Komponente a) darstellen

- einen Liganden für einen zellulären Rezeptor, beispielsweise
- - Wachstumsfaktoren wie VEGF, PDGF, EGF, TGFα, TGFβ, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, Neurotrophine, BMF, Bombesin, M-CSF, Thrombopoietin, Erythropoietin, SCF, SDGF, Oncostatin, PDEGF, Endothelin-1
- - Cytokine wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15
- - Interferon α, β und γ
- - Tumomekrosefaktoren TNFα, -β
- - Chemokine wie RANTES, MCAF, MIP-1α oder -β, NAP, β-Thromboglobulin
- - Peptidhormone wie SRH, SIH oder STH, MRH oder MSH, PRH, PIH oder Prolaktin, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH oder FSH, TRH oder TSH, CRH oder ACTH
- - Angiotensin, Kinine, Histamin, Homologe oder Analoge hiervon
- - Steroidhormone wie Östrogene, Gestagene, Androgene, Glukokortikoide, Mineralokortikoide, Homologe oder Analoge hiervon
- - Vitamine wie z. B. Folsäure

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Adhäsionsmolekül, ein Teil des Adhäsionsmoleküls oder ein Analogon eines Adhäsionsmoleküls sein, welches an ein korrespondierendes zellmembranständiges Adhäsionsmolekül oder an eine andere spezifische Bindestruktur für ein Adhäsionsmolekül auf der Zielzelle bindet.

Derartige als Komponente a) funktionsfähige Adhäsionsmoleküle sind beispielsweise

- Lewis X (für GMP-140)
- S-Lewis X (für ELAM-1).
- LFA-1 (für ICAM-1 und ICAM-2)
- MAC-1 (für (CAM-1)
- VLA-4 (für VCAM-1)
- PECAM (für PECAM)
- Vitronectin (für den Vitronectinrezeptor)
- GMP-140 (für Lewis X)
- S-Lewis X (für ELAM-1)
- ICAM-1, ICAM-2 (für LFA-1, MAC-1)
- VCAM-1 (für VLA-4)
- Fibronectin (für VLA-4)
- Laminin (für VLA-6)
- Fibronectin, Laminin (für VLA-1, VLA-2, VLA-3)
- Fibronectin (für VLA-4)
- Fibrinogen (für GPIIb-IIIa)
- B7 (für CD28)
- CD28 (für B7)
- CD40 (für CD40L)
- CD40L (für CD40)

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Protein sein, welches sich mit einem Partnerprotein verbindet und hierdurch an einer biologischen Reaktionskette teilhat, beispielsweise ein Komplementfaktor, ein Gerinnungsfaktor, ein Faktor des Kininsystems, des Fibrinolysesystems oder ein plasmatischer oder zellulärer Enzyminhibitor oder ein plasmatisches oder zelluläres Enzym.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch einen Rezeptor für einen der zuvor erwähnten Proteine darstellen.

Im Rahmen der vorliegenden Verbindung kann die Komponente a) auch der extrazelluläre Teil eines Fc-Rezeptors sein (Dougherty et al., Transfusion Science 17, 121 (1996)), an welchem ein Antikörper spezifisch für die Zielzelle über seinen Fc-Teil gebunden wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch ein Antikörpermolekül oder den epitopbindenden Teil eines Antikörpermoleküls darstellen. Humane Antikörper sind zu bevorzugen.

Die murinen monoklonalen Antikörper können in humanisierter Form eingesetzt werden. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., (Nature 349, 293 (1991)), Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379 (1991)) oder Huston et al. (Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)) beschriebenen Weise.

Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie aus Bibliotheken muriner bzw. humaner Antikörperfragmente isoliert. Diese Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für weitere Manipulationen (z. B. der Fusion mit anderen Proteinen) eingesetzt.

Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (VH, VL) der Anti körper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3'-Enden der variablen Fragmente gewonnen. Die VH- und VL-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z. B. in Form von Fv-Fragmenten, einzelkettigen Fv-Fragmenten (scFv) oder als Fab-Fragmente kloniert.

Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage-display"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (Immunbibliotheken, native Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden. Beim "phage display" von Antikörperfragmenten werden die antigenbindenden Domänen als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein g3P filamentöser Bakteriophagen entweder in das Phagengenom oder in Phagemid-Vektoren in Form von scFv-Fragmenten oder als Fab-Fragmente kloniert. Antigen-bindende Phagen werden an antigenbeladenen Plastikgefäßen ("panning"), an antigenkonjugierten, paramagnetischen Kügelchen ("beads") oder durch Bindung an Zelloberflächen selektioniert.

Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere oder Patienten. Dazu werden Kombinationen von Oligonukleotiden die spezifisch sind für murine oder humane Immunglobulingene bzw. für die humanen Immunglobulin-Genfamilien verwendet.

Unter Verwendung nichtimmunisierter Spender als Quelle der Immunglobulingene lassen sich naive Bibliotheken herstellen. Alternativ können Immunglobulin- Keimbahngene zur Herstellung semisynthetischer Antikörperrepertoires eingesetzt werden, wobei die Komplementarität-bestimmende Region 3 der variablen Fragmente durch PCR mit Hilfe degenerierter Primer ergänzt wird. Diese sogenannten "single pot"-Bibliotheken haben gegenüber Immunbibliotheken den Vorteil, daß Antikörperfragmente gegen eine Vielzahl von Antigenen aus einer einzigen Bibliothek isoliert werden können.

Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neu Bibliotheken von bereits existierenden Antikörper fragmenten durch zufällige, kodonbasierende oder gezielte Mutagenese, durch "chain shuffiing" einzelner Domänen mit Fragmenten aus nativen Repertoires oder unter Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden. Zusätzlich können murine Antikörperfragmente durch stufenweisen Austausch einer der variablen Domänen gegen ein humanes Repertoire und anschließende Selektion mit dem ursprünglichen Antigen ("guided selection") humanisiert werden. Alternativ erfolgt die Humanisierung muriner Antikörper durch zielgerichteten Austausch der hypervariablen Regionen humaner Antikörper durch die korrespondierenden Regionen des originalen murinen Antikörpers.

Entsprechend der Erfindung können mindestens zwei gleiche oder unterschiedliche Liganden für die Zielstruktur, z. B. auf der Zielzelle im erfindungsgemäßen Liganden (Komponente a) enthalten sein. Eine besondere Form von bispezifischen oder multispezifischen, rekombinanten Antikörpern stellen einzelkettige, zweifach- oder mehrfach-antigenbindende Moleküle dar. Die Herstellung dieser Moleküle wurde in der Patentanmeldung DE 198 16 141.7 (nicht veröffentlicht) beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird zur beispielsweisen Herstellung der Komponente a) ausdrücklich Bezug genommen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Komponente a) auch das Hüllprotein oder ein Teil des Hüllproteins von Viren darstellen, welche über ihr Hüllprotein an ausgewählte Zellen spezifisch binden.

Die Wahl der Komponente a) richtet sich nach der Zielstruktur, an welche das erfindungsgemäße komplexbildende Protein bilden soll.

Als Beispiele hierfür gelten:

Liganden für aktivierte Endothelzellen

Hierzu gehören im Sinne der Erfindung Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.

Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose enthalten des weiteren IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGFβ (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)).

Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie bei spielsweise Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4, Vitronectin oder RGD-Peptide wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992)).

Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für Endothelzellen haben. Zu diesen Viren gehören beispielsweise:

- Filoviren, beispielsweise
- - das Marburg-Virus
  mit seinem Hüllprotein GP (glycoprotein) und sGP (second glycoprotein)
- - oder das Ebola-Virus
  jeweils mit seinem Hüllprotein GP und sG
- das Cytomegalovirus
besonders mit seinem gB-Protein
- das Herpes Simplex-Virus Type I
- das HIV-1 Virus
- das Masern-Virus
- das Hantaan-Virus
- Alphaviren, wie Semliki Forest-Virus
- das Virus des epidemischen, haemorrhagischen Fiebers
- das Poliovirus
- Enteroviren (wie z. B. Echo 9, Echo 12, Cocksackie B3)

Liganden für aktivierte Makrophagen und/oder aktivierte Lymphozyten

Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören des weiteren Substanzen, welche an die Oberfläche von Immunzellen spezifisch binden. Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Immunzellen, wie sie beispielsweise von Powelson et al. (Biotech. Adv. 11, 725 (1993)) beschrieben wurden.

Des weiteren gehören zu den Liganden auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihrem antigenbindenden variablen Teil an Fc-γ- oder Fc-ε- oder Fc-µ Rezeptoren von Immunzellen binden (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)).

Des weiteren gehört hierzu das Fc-Fragment von humanem monoklonalem oder polyklonalem Immunglobulin. Derartige Fc-Fragmente werden beispielsweise gentechnisch mit Hilfe rekombinierter DNA oder entsprechend der Methoden von Haupt et al. (Klin. Wschr. 47, 270 (1969)), Kranz et al. (Dev. Biol. Standard 44, 19 (1979)), Fehr et al. (Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974)) oder Menninger et al. (Immunochem. 13, 633 (1976)) hergestellt.

Zu den Liganden gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Immunzellen binden. Hierzu gehören Zytokine wie beispielsweise IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, GM-CSF, M-CSF des weiteren Wachstumsfaktoren wie beispielsweise EGF, TGF, FGF, IGF oder PDGF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Immunzellen binden.

Hierzu gehören des weiteren Adhäsionsmoleküle und andere Liganden, welche an Zellmembranstrukturen, wie beispielsweise an den Mannose 6-Phosphat-Rezeptor auf Makrophagen in Milz, Leber, Lunge und andere Gewebe binden.

Eine Auswahl dieser Liganden und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)) beschrieben.

Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Lymphozyten und/oder Makrophagen haben.

Zu diesen Makrophagen infizierenden Viren gehören beispielsweise:

- HIV-1
besonders solche Stämme mit Mutationen in der V3-Region von gp120, die zu einer erhöhten Bindung an Makrophagen führen
- HIV-2
- Hantaviren, beispielsweise des Punmalavirus
- Cytomegalovirus
- Respiratory Syncytial Virus
- Herpes simplex-Virus
- Filoviren.

Zu den Lymphozyten infizierenden Viren gehören beispielsweise:

- Varizella-Zoster-Virus (VZV);
VZV infiziert besonders T-Zellen
- Herpes Virus 6 (HHV-6);
HHV-6 infiziert besonders T-Zellen
- Rabies-Virus;
das Rabies-Virus Hüllprotein bindet besonders an TH2-Zellen
- HIV-1;
das Glykoprotein gp120 bindet bevorzugt an das CD4 Molekül von T-Zellen
- HTLV-II;
HTLV-II infiziert besonders B-Zellen
- HTLV-I;
HTLV-I infiziert besonders T-Zellen
- Influenza C-Viren;
Influenza-C-Viren binden über das Haemagglutinin-Esterase-Fusions-(HEF)- Protein an N-acetyl-9-β-acetylneuraminsäure (Neu 5,9 Ac), welche bevorzugt auf B-Lymphzyten, weniger oder nicht auf T-Lymphozyten vorkommt
- Influenza C Viren mit Mutation in der Nukleotidposition 872 (die die Position 284 des HEF der Aminosäuresequenz kodiert), beispielsweise ein Austausch des Threonins durch Isoleucin. Das Oberflächenprotein HEF mit dieser Mutation hat eine deutlich stärkere Affinität zum N-acetyl-9-0-acetylneuraminsäure-Rezeptor als das Wildvirus
- HEF Spaltprodukte des Influenza C-Virus, welche die Bindestruktur für N- acetyl-9-β-acetylneuraminsäure enthalten. Diese Bindestruktur ist definiert durch die katalytische Triade Serin-71, Histidin 368 oder -369 und Arsparaginsäure 261
- Epstein-Barr Virus;
EBV infiziert besonders B-Zellen
- Herpes simplex-Virus-2;
HSV-2 infiziert besonders T-Zellen
- Masernvirus

Liganden für Muskelzellen

Hierzu gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Muskelzellen, insbesondere von glatten Muskelzellen. Derartige Antikörper sind beispielsweise

- der Antikörper 10F3
- Antikörper gegen Actin
- Antikörper gegen Angiotensin II-Rezeptoren
- Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren

oder Antikörper gerichtet beispielsweise gegen

- EGF-Rezeptoren
- oder gegen PDGF-Rezeptoren
- oder gegen FGF-Rezeptoren
- oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren.

Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirksubstanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Muskelzellen binden (Übersicht bei Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991)). Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch glatte Muskelzellen binden wie beispielsweise

- PDGF
- EGF
- TGFβ
- TGFα
- FGF
- Endothelin A

Zu den Liganden im Sinne dieser Erfindung gehören jedoch auch Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Muskelzellen haben. Zu diesen Viren gehört beispielsweise das Cytomegalovirus.

Liganden für blutbildende Zellen

Zu den Liganden gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Rezeptoren exprimiert auf gering differenzierten Blutzellen.

Derartige Antikörper sind beispielsweise für folgende Rezeptoren beschrieben worden:

- Stem Cell Factor Receptor
- IL-1-Rezeptor (Type I)
- IL-1-Rezeptor (Type II)
- IL-3-Rezeptor α
- IL-3-Rezeptor β
- IL-6-Rezeptor
- GM-CSF-Rezeptor.

Des weiteren gehören zu den Liganden auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-γ Rezeptoren von Immunzellen binden.

Zu den Liganden gehören des weiteren alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von gering differenzierten Blutzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie SCF, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Blutzellen binden.

Liganden für Synovialzellen und Entzündungszellen

Hierzu gehören monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren variablen Domänen an Membranstrukturen von Synovialzellen oder Entzündungszellen binden. Solche Membranstrukturen sind beispielsweise

- Vimentin
- Fibronectin oder
- Fc-Rezeptoren.

Hierzu gehören auch monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente, die mit ihren konstanten Domänen an Fc-Rezeptor binden.

Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Synovialzellen binden. Beispielsweise gehören hier Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Synovialzellen binden wie bei spielsweise IL-1-RA, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10, IGF, TGFβ.

Des weiteren gehören hierzu Liganden, deren wesentlicher Bestandteil endständige Mannose ist, welche an Mannose-6-Phosphatrezeptoren auf Makrophagen bindet.

Liganden für mit Viren infizierte Zellen

Zu den Liganden gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen die Virusantigene exprimiert auf der Zellmembran von virusinfizierten Zellen.

Derartige Antikörper sind beispielsweise für mit folgenden Viren infizierten Zellen beschrieben worden:

- HBV
- HCV
- HSV
- HPV
- HIV
- EBV
- HTLV.

Liganden für Leberzellen und weitere Gewebezellen

Zu den Liganden gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der Oberfläche von Leberzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren, wie Zytokine, EGF, TGF, FGF oder PDGF, oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch derartige Zellen binden.

Hierzu gehören des weiteren Liganden, welche an Zellmembranstrukturen binden, welche selektiv sind für bestimmte Gewebe. Hierzu zählen beispielsweise:

Diese Liganden und Membranstrukturen sind übersichtlich bei Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)) beschrieben.

Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören jedoch besonders Glykoproteine der Hülle von Viren, die einen Tropismus für ausgewählte Zellen haben, wie beispielsweise für

- Bronchialepithelzellen
- - Respiratory syncytial virus
- Leberzellen
- - Hepatitis C Virus, Hepaptitis B Virus, Hepatitis A Virus
- - Filoviren
  Leberzellen binden z. B. das Marburg-Virus über den Asialoglykoprotein- Rezeptor
- - Hepatitis B-Virus
  Leberzellen binden bevorzugt über den Asialoglykoprotein-Rezeptor an der preS2 und preS1 Domäne von HBV
- - Hepatitis D Virus
- lebersinusoidale Zellen
- - Hepatitis V-Virus
  HBV wird gebunden über Fibronectin.

Liganden für Gliazellen

Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente gerichtet gegen Membranstrukturen von Gliazellen, wie sie beispielsweise von Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 29, 57 (1985)) und McKeever et al. (Neurobiol. 6, 119 (1991)) berichtet wurden. Zu diesen Membranstrukturen gehören des weiteren Neuraladhäsionsmoleküle wie N-CAM, insbesondere dessen Polypeptidkette C.

Hierzu gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Gliazellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Substanzen, die endständig Mannose tragen und an den Mannose-6- Phosphatrezeptor binden, Insulin und Insulin-like growth factor, PDGF und diejenigen Fragmente dieser Wachstumsfaktoren, welche an die zugehörigen Membranrezeptoren binden.

Zu den Liganden im Sinne der Erfindung gehören insbesondere Glykoproteine der Hülle von solchen Viren, die einen Tropismus für Gliazellen haben.

Zu diesen Viren gehören beispielsweise:

- HIV-1 Subtyp JRF1
- Herpes simplex-Virus I

Liganden für Leukämiezellen

Hierzu gehören Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente mit Spezifität für folgende Antigene geeignet:

Zellen
Membranantigen
AML	CD13
CD14
CD15
CD33
CAMAL
Sialosyl-Le
B-CLL	CD5
CD1c
CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline
T-CLL	CD33
M38
IL-2-Rezeptoren
T-Zell-Rezeptoren
ALL	CALLA
CD19
Non-Hodgkin Lymphoma

Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen binden.

Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cel) 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)). Beispielsweise gehören zu ihnen:

- IFNα bei Non-Hodgkin Lymphomen
- IL-2, besonders bei T-Zell-Leukämien
- FGF bei T-Zell-, monozytären, myeloiden, erythroiden und megarkaryoblastischen Leukämien
- TGFβ bei Leukämien
- Retinoide, z. B. "Retinoic acid" bei akuter promyelozytärer Leukämie.

Liganden für Tumorzellen

Hierzu gehören Antikörper und Fragmente dieser Antikörper, gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt.

Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen:

- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
- von Onkogenen exprimierte Proteine
- Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1
- Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen

Gemäß der Erfindung kann die Komponente d) entweder fehlen oder ist, je nach Art der Erkrankung, welche verhütet oder behandelt werden soll, gemeinsam mit der Komponente a) beispielsweise wie folgt auszuwählen:

a) Therapie von Tumoren

1. a.1) Zielzellen:

- proliferierende Endothelzellen oder
- der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder
- Tumorzellen oder Leukämiezellen

a.2) Effektoren: Inhibitoren der Zellproliferation, zum Beispiel

- das Retinoblastomprotein (pRb = p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine
Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110.
In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert.
- das p53 Protein
Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C terminal verkürzt ist um das Serin 392.
- das p21 (WAF-1)
- das p16 Protein
- andere cdk-Inhibitoren
- das GADD45 Protein
- das Bak Protein
- das Bax Protein

a.3) Effektoren: Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:

- Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1)
- PAI-2
- PAI-3
- Angiostatin und/oder Endostatin
- Interferone (IFNα, IFNβ oder IFNγ)
- Platelet factor 4
- IL-12
- TIMP-1
- TIMP-2
- TIMP-3
- Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente

a.4) Effektoren: zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel

- Perform
- Granzym
- IL-2
- IL-4
- IL-12
- Interferone, wie beispielsweise IFNα, IFNβ oder IFNγ
- TNF, wie TNFα oder TNFβ
- Oncostatin M
- Sphingomyelinase
- Magainin und Magainin-Derivate

a.5) Effektoren: zytostatische oder zytotoxische Antikörper

- Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
- Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T- Zellen erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen

- Des weiteren gehören hierzu gehören Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991)). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene geeignet:

Zellen	Membranantigen
AML	CD13
CD15
CD33
CAMAL
Sialosyl-Le
B-CHL	CD5
CD1c
CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline
T-CLL	CD33
M38
IL-2-Rezeptoren
T-Zell-Rezeptoren
ALL	CALLA
CD19
Non-Hodgkin Lymphoma

- Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der demFachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol 28, 1379 (1991) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit der Komponente b) und/oder Komponente c) erfolgt mit dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik durch Expression eines Genes kodierend für das Fusionsprotein.

a.6) Effektoren: Induktoren von Entzündungen, zum Beispiel

- IL-1
- IL-2
- RANTES (MCP-2)
- monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
- IL-8
- macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -β)
- neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
- IL-3
- IL-5
- human leukemia inhibitory factor (LIF)
- IL-7
- IL-11
- IL-13
- GM-CSF
- G-CSF
- M-CSF
- Cobra venom factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen
- der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
- Spaltprodukte des menschlichen Komplemenffaktors C3, welche funktio nell und strukturell dem CVF ähneln
- bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhi murium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legio nellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebstellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.

2. a.7) Effektoren: Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten.
Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Mullen (Pharmac. Ther. 63, 199 (1994) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist eines der folgenden Enzyme zu verwenden:
- - Herpes Simplex Virus Thymidinkinase
- - Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
- - bakterielle Nitroreduktase
- - bakterielle β-Glucuronidase
- - pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale
- - humane β-Glucuronidase
- - humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreas oder bakterielle Carboxy Peptidase
- - bakterielle β-Laktamase
- - bakterielle Cytosine Deaminase
- - humane Catalase bzw. Peroxidase
- - Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase
- - Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D- aminooxidase
- - Peroxidase, im besonderen humane Gluthation Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase
- - Galaktosidase

b) Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen
- 1. b.1) Zielzellen:
  - - proliferierende Endothelzellen oder
  - - Makrophagen und/oder Lymphozyten oder
  - - Synovialzellen
- 2. b.2) Effektoren zur Therapie von Allergien, zum Beispiel
  - - IFNβ
  - - IFNγ
  - - IL-10
  - - Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
  - - lösliche IL-4-Rezeptoren
  - - IL-12
  - - TGFβ
- 3. b.3) Effektoren zur Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel
  - - IL-10
  - - TGFβ
  - - lösliche IL-1-Rezeptoren
  - - lösliche IL-2-Rezeptoren
  - - IL-1-Rezeptorantagonisten
  - - lösliche IL-6-Rezeptoren
  - - immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene VH- und VL- Fragmente.
    Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1-Rezeptor oder IL-4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1, CD28 oder CD40
- 4. b.4) Effektoren für die Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel
  - - TGFβ
  - - IFNα
  - - IFNβ
  - - IFNγ
  - - IL-12
  - - lösliche IL-4-Rezeptoren
  - - lösliche IL-6-Rezeptoren
  - - immunsuppressive Antikörper oder dessen V_H und V_L-enthaltende Fragmente
- 5. b.5) Effektoren für die Therapie von zellmediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel
  - - IL-6
  - - IL-9
  - - IL-10
  - - IL-13
  - - TNFα oder TNFβ
  - - IL-13
  - - einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen V_H- und N_L-enthaltende Fragmente
- 6. b.6) Effektoren: Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika Beispiele für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt a.7) aufgeführt.
- 7. b.7) Effektoren für die Therapie der Arthritis
  Im Sinne der Erfindung werden Effektoren ausgewählt, die die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmen und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördern.
  Hierzu gehören zum Beispiel
  - - IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA);
    IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, β
  - - löslicher IL-1-Rezeptor;
    löslicher IL-1-Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
  - - IL-6
    IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten
  - - löslicher TNF-Rezeptor
    löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.
  - - IL-4
    IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP
  - - IL-10
    IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNF∝ und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
  - - Insulin-like growth factor (IGF-1)
    IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
  - - TGFβ, im speziellen TGFβ1 und TGFβ2
    TGFβ stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
  - - Superoxiddismutase
  - - TIMP, im speziellen TIMP-1, TIMP-2 oder TIMP-3
c) Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes
- 1. c.1) Zielzellen:
  - - proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder
  - - Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen
- 2. c.2) Effektoren für die Therapie der Anämie, zum Beispiel
  - - Erythropoietin
- 3. c.3) Effektoren für die Therapie der Leukopenie, zum Beispiel
  - - G-CSF
  - - GM-CSF
  - - M-CSF
- 4. c.4) Effektoren für die Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel
  - - IL-3
  - - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
  - - IL-11
  - - Thrombopoietin
d) Therapie von Schäden des Nervensystems
- 1. d.1) Zielzellen:
  - - Gliazellen oder
  - - proliferierende Endothelzellen
- 2. d.2) Effektoren: neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
  - - FGF
  - - Nerve growth factor (NGF)
    Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
  - - Neurotrophin-3 (NT-3)
  - - Neurotrophin-4 (NT-4)
  - - Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
- 3. d.3) Effektoren: Enzyme, zum Beispiel
  - - Tyrosinhydroxylase
  - - Dopadecarboxylase
- 4. d.4) Effektoren: Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel
  - - TGFβ
  - - lösliche TNF-Rezeptoren
  - - TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα
  - - IL-10
    IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4
  - - lösliche IL-1-Rezeptoren
  - - IL-1-Rezeptor I
  - - IL-1-Rezeptor II
  - - lösliche IL-1-Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
  - - IL-1-Rezeptor-Antagonist
  - - lösliche IL-6-Rezeptoren
e) Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
- 1. e.1) Zielzellen:
  - - Endothelzellen oder
  - - proliferierende Endothelzellen oder
  - - somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskel zellen oder
  - - Makrophagen
- 2. e.2) Zielstrukturen: Proteine des Blutgerinnungssystems wie beispielsweise
  - - Thrombin
  - - Fibrin
- 3. e.3) Effektoren für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiel
  - - Tissue Plasminogen Activator (tPA)
  - - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
  - - Hybride von tPA und uPA
  - - Protein C
  - - Hirudin
  - - Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1S-Inhibitor, α1-Antitrypsin oder Antithrombin III
  - - Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
- 4. e.4) Effektoren für die Förderung der Gerinnung, zum Beispiel
  - - F VIII
  - - F IX
  - - von Willebrand factor
  - - F XIII
  - - PAI-1
  - - PAI-2
  - - Tissue Factor and Fragmente hiervon
- 5. e.5) Effektoren: Angiogenesefaktoren, zum Beispiel
  - - VEGF
  - - FGF
  - - Tie-1
  - - Tie-2
- 6. e.6) Effektoren für die Blutdrucksenkung, zum Beispiel
  - - Kallikrein
  - - Endothelzell "nitric oxide synthase"
- 7. Effektoren für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel
  - - ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder
  - - ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (Abschnitt a.7) aufgeführt
- 8. e.8) Effektoren: weitere Blutplasmaproteine, zum Beispiel
  - - C1-Inaktivator
  - - Serum Cholinesterase
  - - Transferrin
  - - 1-Antritrypsin
f) Impfungen
- 1. f.1) Zielzellen:
  - - Muskelzellen oder
  - - Makrophagen und/oder Lymphozyten
- 2. f.2) Effektoren für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen
  Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt.
  Als Effektor ist ein vom Infektionserreger gebildetes Protein, Glykoprotein oder Lipoprotein, auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d. h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T- Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
  Bevorzugt im Sinne der Erfindung werden Neutralisationsantigene folgender Erreger eingesetzt:
  - - Influenza A-Virus
  - - HIV
  - - Tollwut-Virus
  - - HSV (Herpes Simplex Virus)
  - - RSV (Respiratory Syncytial Virus)
  - - Parainfluenza-Virus
  - - Rotavirus
  - - VZV (Varizella Zoster Virus)
  - - CMV (Cytomegalo-Virus)
  - - Masern-Virus
  - - HPV (Humanes Papillomvirus)
  - - HBV (Hepatitis B-Virus)
  - - HCV (Hepatitis C-Virus)
  - - HDV (Hepatitis D Virus)
  - - HEV (Hepatitis E-Virus)
  - - HAV (Hepatitis A-Virus)
  - - Vibrio Cholera-Antigen
  - - Borrelia Burgdorferi
  - - Helicobacter pylori
  - - Malaria-Antigen
  - - Zu Effektoren im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch ein Antüdiotyp- Antikörper oder seine Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementary determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
    Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
    Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.
- 3. f.3) Effektoren: Tumorantigene
  - - Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992)) übersichtlich dargestellt.
    Weitere Beispiele stellen folgende Antigene bzw. für Antiidiotypantikörper korrespondierend mit folgenden Antigenen dar:
  - - Sialyl Lewis
  - - Peptide auf Tumoren, welche von T Zellen erkannt werden
  - - von Onkogenen exprimierte Proteine
  - - Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
  - - Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
  - - Antigene auf Heat Shock Proteinen
g) die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen
- 1. g.1) Zielzelle:
  - - Leberzelle
  - - Lymphozyt und/oder Makrophage
  - - Epithelzelle
  - - Endothelzelle
- 2. g.2) Effektoren beispielsweise
  - - ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkun gen aufweist.
  - - ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.
- 3. g.3) Effektoren: antivirale Proteine
  - - antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen bei spielsweise IFNα, IFNβ, IFN-γ, TNFβ, TNFα, IL-1 oder TGFβ
  - - Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen V_H und V_L enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene V_H und V_L Fragmente herstellt wie bereits beschrieben.
    Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
    anti HBV
    anti HCV
    anti HSV
    anti HPV
    anti HIV
    anti EBV
    anti HTLV
    Anti Coxackie Virus
    anti Hantaan Virus
  - - ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
    RBP9-27
    RBP1-8U
    RBP1-8D
    Pseudogene von RBP1-8
- 4. g.4) Effektoren: antibakterielle Proteine
  Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen
  Meningokokken C oder B
  E. coli
  Borrelia
  Pseudomonas
  Helicobacter pylori
  Staphylococcus aureus
h) Kombination gleicher oder unterschiedlicher Effektoren
Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind zwei unterschiedliche Komponenten d), welche zumindest eine additive Wirkung aufweisen, über die Komponenten b) und c) miteinander zu komplexieren.
Im Sinne der Erfindung sind bevorzugte Kombinationen von Effektoren beispielsweise für
- 1. h.1) die Therapie von Tumoren
  - - gleiche oder unterschiedliche, zytostatische, apoptotische, zytotoxische und/oder entzündungserregende Proteine oder
  - - gleiche oder unterschiedliche Enzyme für die Spaltung der Vorstufe eines Zytostatikums
- 2. h.2) die Therapie von Autoimmunerkrankungen
  - - unterschiedliche Cytokine oder Rezeptoren mit synergistischer Wirkung zur Hemmung der zellulären und/oder humoralen Immunreaktion oder
  - - unterschiedliche oder gleiche TIMPs
- 3. h.3) die Therapie von mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes unterschiedliche, hierarchisch aufeinanderfolgende Cytokine, wie beispielsweise IL-1, IL-3, IL-6 oder GM-CSF und Erythropoietin, G-CSF oder Thrombopoietin
- 4. h.4) die Therapie von Nervenzellschäden
  - - ein neuronaler Wachstumsfaktor und ein Cytokin oder der Inhibitor eines Cytokins
- 5. h.5) die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
  - - ein Antithrombotikum und ein Fibrinolytikum (z. B. tPA oder uPA) oder
  - - ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein und ein Antithrombotikum oder ein Fibrinolytikum
  - - mehrere unterschiedliche, synergistisch wirkende Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise F VIII und vWF oder F VIII und F IX
- 6. h.6) Impfungen
  - - ein Antigen und ein immunstimulierendes Cytolin, wie beispielsweise IL-1α, IL-1β, IL-2, GM-CSF, IL-3 oder IL-4 Rezeptor
  - - unterschiedliche Antigene eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger oder
  - - unterschiedliche Antigene eines Tumortyps oder unterschiedlicher Tumortypen
- 7. h.7) Therapie von viralen Infektionserkrankungen
  - - ein antivirales Protein und ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein
  - - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene eines Virus oder mehrere Viren
- 8. h.8) Therapie von bakteriellen Infektionserkrankungen
  - - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene und/oder Toxine eines Keimes

4. Multifunktioneller Ligand für virale und nichtvirale Vektoren zur Gentherapie

Multifunktionelle Liganden wurden bereits in der Patentanmeldung EP-A 0 846 772 ausführlich beschrieben. Auf diese Patentanmeldung wird ausdrücklich Bezug genommen.

Bei Verwendung als multifunktioneller Ligand ist eine Komponente a) auszuwählen, welche gegen eine zelluläre Zielstruktur gerichtet ist. Beispiele für Liganden (Komponente a) spezifisch für zelluläre Zielstrukturen sind im Abschnitt 3) bereits aufgeführt worden.

In einem multifunktionellen Liganden ist der Effektor (Komponente d) so auszuwählen, daß er an einen viralen Vektor oder an einen nichtviralen Vektor bindet. Derartige Effektoren sind beispielsweise:

- ein zellulärer Rezeptor für ein Virus, wie beispielsweise für AdV, AAV, ein Lentivirus, ein RTV, Vacciniavirus, HSV, Influenzavirus, HJV
- ein rekombinanter Antikörper spezifisch für ein Virusprotein, für einen nichtviralen Vektor oder für eine Nukieinsäure, wie beispielsweise ein IgG, F(ab)2, Fab, rec. Fv, Diabody oder einzelkettiges, doppelantigenbindendes Protein
- ein Peptid mit einer reaktiven Gruppe zur Konjugation an ein Virusprotein
- ein Peptid mit Bindeaffinität zu einer definierten Nukleinsäuresequenz

Bevorzugterweise stellt die Komponente d) ein ganzes Antikörpermolekül oder ein Epitop-bindendes Fragment eines humanen Antikörpers dar.

Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) und Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Antikörperfragmente und rekombinante Fv-Fragmente werden entsprechend dem Stand der Technik, und wie bereits beschrieben, hergestellt.

Ob ein bivalentes oder ein monovalentes Fragment Verwendung findet, ist von der Wahl der Antikörperspezifität und des Genkonstruktes abhängig. Wenn der gewählte Antikörper die Fusionsaktivität des Hüllproteins eines viralen Genkonstruktes beeinträchtigt (wie z. B. von Ubol et al. (J. Virol. 69 1990 (1995)) beschrieben), so ist ein monovalentes Antikörperfragment zu bevorzugen.

Die Spezifität des Antikörpers richtet sich nach der Art des verwendeten Genkonstruktes.

- Ist das Genkonstrukt ein nackte RNA oder eine nackte DNA alleine oder im Komplex mit einem nichtviralen Träger, so ist eine der erfindungsgemäßen Ausführungsformen dieser Erfindung, daß die Spezifität des Antikörpers gerichtet ist gegen solche Epitope, welche in die DNA eingeführt wurden.

Derartige Epitope können erzeugt werden durch Bindung von xenogenen Substanzen an die DNA. Beispiele hierfür sind

- Kreuzvernetzungen der DNA durch Cisplatin
- Alkylierung am N⁷ von Guanin durch Alkylantien wie Nitrogen-Mustard, Melphalan, Chlorambucil
- Interkalation in die Doppelhelix der DNA von Anthracyclinen wie Doxorubicin, Daunomycin

Monoklonale Antikörper gegen derartige neu eingeführte Epitope auf der DNA sind beispielsweise:

- Antikörper gegen methylierte DNA
- Antikörper gegen 0⁶-ethyl deoxyguanosin (nach Behandlung der DNA mit Ethylnitrosoharnstoff)
- Antikörper gegen N⁷-ethylguanin
- Antikörper gegen N⁵-methyl-N5 formyl-2,5,6 triamino 4-hydroxy pyrimidine
- Antikörper gegen O⁶-methyl-2'-deoxyguanosin
O⁶-ethyl-2'-deoxyguanosin
O⁶-n-butyl-2'-deoxyguanosin
O⁶-isopropyl-2'-deoxyguanosin
O⁴-methyl-2'-deoxythymidin
O⁴-ethyl-2'-deoxythymidin
- Antikörper gegen Melphalan Adukte mit DNA
- Antikörper gegen Anthracycline

Neue Epitope in die DNA entstehen jedoch auch durch Methylierung der DNA im Rahmen des DNA-Stoffwechsels.

Von einer Reihe von E. coli Stämmen ist bekannt, daß sie die DNA der in sie eingeführten Plasmide am N⁶ des Adenins methylieren (Winnacker, From Genes to Clones, page 18/19, VCH Publisher, Weinheim (1987)). Bakterien besitzen das Enzym DNA-Adenin-Methylase, das während der Replikation spezifisch Adenine an der N⁶-Position methyliert (Hattman et al., J Mol. Biol. 126, 367 (1978)).

Ein besonderer Gegenstand dieser Erfindung ist somit die Verwendung vom monoklonalen Antikörpern gegen methylierte DNA - im besonderen gegen methyliertes N⁶ des Adenins - im erfindungsgemäßen Ligandensystem.

- Ist das Genkonstrukt in Komplex mit einem nichtviralen Träger, so ist eine weitere besondere Ausführungsform dieser Erfindung, daß die Spezifität des Antikörpers gerichtet ist gegen ein Epitop auf dem Träger.
Zu diesen Trägem gehören kationische Polymere, Peptide, Proteine, Polyamine oder kationische Lipide wie beispielsweise kationische Lipide und Phospholipide. Beispiele für Antikörper gegen derartige Träger sind
- - Antikörper gegen Spermidin, Spermin oder Putrescin
- - Antikörper gegen Polylysin
- - Antikörper gegen Albumin
- - Antikörper gegen Phospholipid
- - Antikörper gegen Polyethylenimin
- Ist das Genkonstrukt ein Virus, so ist die Spezifität des Antikörpers gerichtet gegen ein oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Epitope auf den Hüllproteinen des Virus. Da der Linker im verwendeten Ligandensystem bevorzugterweise ein fusiogenes Peptid oder Protein darstellt, können auch Antikörper verwendet werden, welche durch Bindung an das Hüllprotein die Zelladhäsion und/oder die fusiogene Aktivität des Virus beeinträchtigen.

Antikörper gegen Hüllproteine von Viren, die als Vektoren Verwendung finden können, sind beispielsweise Antikörper gegen das

- murine Leukämie Virus
- HIV-Virus
- Adenovirus
- Herpes Simplex Virus
- Cytomegalovirus
- Minute Vrus of mice
- adenoassoziiertes Virus
- Sindbis-Virus
- Vaccinia Virus

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Komponente d) den zellexternen Teil eines Fc-Rezeptors dar. An diesen Fc-Rezeptor bindet über sein Fc-Teil einer der bereits erwähnten Antikörper, welcher mit seinem antigenbindenden Teil direkt oder indirekt an das Genkonstrukt bindet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Komponente d) eine kationische Struktureinheit, wie beispielsweise eine kationische Aminosäure, ein kationisches Peptid oder Protein oder ein biogenes Amin dar, welche mit dem Genkonstrukt komplexieren können.

Zu diesen kationischen Struktureinheiten gehören beispielsweise:

- Lysin oder Polylysin
- Arginin oder Polyarginin
- Histidin oder Polyhistidin
- Peptide enthaltend mindestens 1 Lysin, 1 Arginin und/oder 1 Histidin
- Polyamine wie beispielsweise Cadaverin, Spermidin, Spermin, Agmatin oder Putrescin

In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform stellt die Komponente d) den Rezeptor für das Hüllprotein des das Transgen beherbergenden Virus dar.

Derartige Rezeptoren sind beispielsweise für folgende Viren beschrieben worden:

- HIV
- - das CD4-Molekül (löslich oder nativ)
- - Galactosylceramid
- - Rezeptoren für Chemokine
- HBV
- - der IL-6 Rezeptor
- - Annexin oder Apolipoprotein
- HTLV
- - der IL-2 Rezeptor (die β- wie auch die γ-Kette)
- Masern Virus
- - das CD46 Molekül
- Friend Leukemia Virus
- - der Erythropoietin Rezeptor
- Varizella Zoster
- - das Fo-Fragment von humanem Immunglobulin G
- Sendai Virus
- - das Glycophorin
- Influenza C-Virus
- - die N-acetyl-9-acetamido-9-deoxy-neuraminsäure
- - die 9-0-acetyl-N-acetylneuraminsäure
- Foot and Mouth Disease Virus
- - das integrin αVβ3
- EBV
- - der Complement Rezeptor 2 (CD21)
- Herpes simplex Virus
- - der 275-kDa Mannose-6-Phosphat-Rezeptor oder der 46-kDa Mannose-6- Phosphat-Rezeptor
- adenovirales Virus
- - der CAR (Cocksackie-Adenovirus-Rezeptor)

5. Einfügung eines fusiogenen Peptids oder eines Translokalisationspeptids

Bei multivalenten Proteinkomplexen, bei denen der Effektor (Komponente d) intrazellulär einzudringen hat, um prophylaktisch oder therapeutisch zu wirken oder die als multifunktionelle Liganden einen Vektor in das Zytoplasma einer Zelle einführen sollen, ist dem Effektor ein fusiogenes Peptid anzufügen. Dieses fusiogene Peptid kann zwischen der Komponente c) und d) eingefügt oder der Komponente d) angefügt werden. Zu den fusiogenen Peptiden gehören beispielsweise:

- Peptide enthaltend die Translokationsdomäne (Domäne II) des Exotoxins A von Pseudomonas

- Peptide enthaltend das Peptid
- Peptide enthaltend das Peptid
- Peptide enthaltend das Peptid
des Fusionsproteins des Masern-Virus
- Peptide enthaltend das Peptid
des HA2 Proteins von Influenza A
- Peptide enthalten das Peptid
oder das Peptid

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden desweiteren Proteine von Viren verwendet, welche fusiogene Eigenschaften haben. Eine Reihe von Viren besitzt fusiogene und/oder translozierende Hüllproteine, so beispielsweise Paramyxoviren, Retroviren und Herpesviren. Hierzu gehören beispielsweise das TAT-Protein von HIV oder dessen translokalisierende Aminosäuresequenz oder das VP22-Protein von HSV.

Eine Reihe von Viren besitzen des weiteren Glykoproteine, die verantwortlich sind sowohl für die Virusanheftung als auch nachfolgend für die Zellmembranfusion (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)).

Derartige Proteine werden beispielsweise von Alpha-, Rhabdo- und Orthomyxoviren gebildet.

Virale fusiogene Proteine im Sinne der Erfindung wurden übersichtlich beschrieben von Hughson (Curr. Biol. 5, 265 (1995)), Hoekstra (J. Bioenergetics Biomembranes 22, 675 (1990)), und White (Ann. Rev. Physiol. 52, 675 (1990)).

Fusiogene Proteine im Sinne dieser Erfindung sind beispielsweise:

- das Haemagglutinin von Influenza A- oder B-Viren, insbesondere die HA2-Kom ponente
- das M2-Protein von Influenza A-Viren
alleine oder in Kombination mit dem Haemagglutinin von Influenza eingesetzt oder mit Mutanten von Neuraminidase von Influenza A, denen die Enzymaktivität fehlt, die jedoch Haemagglutination bewirken.
- Peptidanaloga des Influenza-Virus Haemagglutinins
- das HEF-Protein des Influenza C Virus
Die Fusionsaktivität des HEF-Proteins wird aktiviert durch Spaltung des HEFo in die Untereinheiten HEF1 und HEF2.
- das Transmembranglykoprotein von Filoviren, wie beispielsweise
- - des Marburg-Virus
- - des Ebola-Virus
- das Transmembranglykoprotein des Tollwutvirus
- das Transmembranglykoprotein (G) des Vesicular Stomatitis-Virus
- das Fusionsprotein des HIV-Virus, insbesondere die gp41-Komponente und fusiogene Komponenten hiervon
- das Fusionsprotein des Sendai-Virus, insbesondere die aminoterminalen 33 Ami nosäuren der F1-Komponente
- das Transmembranglykoprotein des Semliki Forest-Virus, insbesondere die E1- Komponente
- das Transmembranglykoprotein des Tickborn Enzephalitis-Virus
- das Fusionsprotein des menschlichen respiratorischen syncytialen Virus (RSV) (im besonderen die gp37-Komponente)
- das Fusionsprotein (S-Protein) des Hepatitis B-Virus
- das Fusionsprotein des Masern-Virus
- das Fusionsprotein des Newcastle Disease Virus
- das Fusionsprotein des Visna-Virus
- das Fusionsprotein vom murinen Leukämie-Virus (im besonderen p15E)
- das Fusionsprotein vom HTL-Virus (im besonderen das gp21)
- das Fusionsprotein des Simian Immunodeficiency Virus (SIV)

Virale fusiogene Proteine werden entweder durch Lösung der Hüllproteine aus einer Virusanreicherung mit Hilfe von Detergentien (wie beispielsweise β-D- octylglucopyranosid) und Abtrennung durch Zentrifugation (Übersicht bei Mannio et al., BioTechniques 6, 682 (1988)) gewonnen oder aber mit Hilfe von dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Methoden.

6. Einfügung von Proteasespaltsequenzen

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multifunktionelle Proteinkomplexe, welche zwischen der Komponente a) und b) oder zwischen der Komponente c) und d) eine Peptidsequenz besitzen, welche für Proteasen spaltbar ist. Durch diese Proteasen kann der Effektor von dem Liganden (Komponente a) oder von dem Liganden und den mutierten Proteinen [Komponente a), b) und c)] abgespalten werden und beispielsweise am Ort der Anreicherung der multivalenten Proteinkomplexe in freier Form seine Wirkung entfalten.

Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Spaltsequenzen, welche durch Proteasen, die in Tumoren oder von Tumorzellen oder von Entzündungszellen gebildet werden, gespalten werden.

Beispiele von Spaltsequenzen für die Enzyme

- Plasminogenaktivator
- prostataspezifisches Antigen
- Cathepsin
- Stromelysin
- Collagenase und
- Plasminogen

sind in der Patentanmeldung EP-A 0 859 058 aufgeführt, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multivalente Proteinkomplexe mit Spaltsequenzen, welche von Proteasen, die von Viren gebildet werden, gespalten werden.

Beispiele von Spaltsequenzen für Enzyme von Retroviren, Polioviren, Influenzaviren, Epstein-Barr Viren, Herpes Simplex Viren, Hepatitisviren, Pockenviren, Cytomegalieviren und Denque Viren sind in der deutschen Patentanmeldung DE 198 50 987.1 (nicht veröffentlicht) aufgeführt, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren multivalente Proteinkomplexe mit Spaltsequenzen, welche von Proteasen, die in der Zelle freigesetzt werden können, gespalten werden.

Beispiele von derartigen Proteasen sind beispielsweise Caspasen, wie Caspasen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9.

Die zugehörigen Spaltsequenzen sind in der Patentanmeldung DE 198 50 987.1 (nicht veröffentlicht) aufgeführt, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.

7. Künstliche Transkriptionsfaktoren für die Kontrolle der Expression von Genen

In der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 sind aktivatorresponsive Promotoren beschrieben worden. Auf diese Erfindung wird in dieser Erfindung ausdrücklich Bezug genommen. Diese aktivatorresponsiven Promotoren werden durch einen künstlichen Transkriptionsfaktor aktiviert, welcher im Prinzip aus zwei Aktivatorsubeinheiten besteht: die Subeinheit A und die Subeinheit B. Beide Subeinheiten enthalten Bindeproteine (A, B). In der EP-A 0 805 209 wurden Bindeproteine (A, B) ausgewählt, welche natürlicherweise den Komplex AB bilden, so daß die Subeinheit A sich mit der Subeinheit B zu einem funktionsfähigen Transkriptionsfaktorkomplex verbindet. Gegenstand der Erfindung sind nunmehr künstliche Transkriptionsfaktoren für aktivatorresponsive Promotoren, bei denen die Bindeproteine A+B mutierte Bindeproteine darstellen.

In der einfachsten Form besteht dieser künstliche Transkriptionfaktorkomplex aus folgenden Komponenten:
Komponente a) mindestens einem Liganden für einen Reaktionspartner = Aktivierungsdomäne
Komponente b) ein Bindeprotein derartig mutiert, daß es sich ausschließlich mit der Komponente c) verbindet
Komponente c) ein Bindeprotein derartig mutiert, daß es sich ausschließlich mit der Komponente b) verbindet
Komponente d) mindestens einen Effektor = eine DNA-Bindedomäne

Gegenstand der Erfindung sind des weiteren Nukleinsäurekonstrukte, welche für einen Transkriptionsfaktorkomplex entsprechend dieser Erfindung kodiert. Die Expression dieses Nukleinsäurekontruktes steht hierbei unter der Kontrolle von Promotoren wie in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209 aufgeführt, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.

8. Neue analytische und diagnostische Systeme

Gegenstand der Erfindung sind neue komplexbildende Proteine für analytische oder diagnostische Systeme zur qualitativen oder quantitativen Analyse oder Diagnose eines Reaktionspartners.

In solchen diagnostischen Systemen stelle die Komponente a) mindestens einen Liganden dar, welche eine spezifische Bindung mit dem zu analysierenden Reaktionspartner eingeht. Dieser Ligand ist direkt oder indirekt verbunden mit mindestens einem mutierten Bindeprotein [Komponenten b)1-)n], so daß sich die Komponente ab ergibt. Des weiteren ist mindestens ein mutiertes Bindeprotein [Komponente c)1-)n], welches mit der Komponente b) über mindestens zwei Bindestellen dimerisieren kann, verbunden mit mindestens einem Effektor (Komponente c), wobei dieser Effektor eine signalgebende Substanz (Analyten) darstellt. Aus der Verbindung der Komponete b) mit der Komponente c) ergibt sich die Komponente cd.

Die Komponente ab bindet über a) an den Reaktionspartner. Durch Komplexbildung der Komponente ab mit der Komponente bc läßt sich die Menge des Reaktionspartners, an welchen die Komponenten ab über Komponente a) gebunden ist, ermitteln.

Dieses diagnostische System kann beispielsweise in den zwei aufgeführten Ausführungsformen (siehe Fig. 1 und 2) verwendet werden:
In der ersten Ausführungsform (siehe Fig. 1) stellt die Komponente b) ein Homo- (oder Hetero-)multimer dar [Komponente b)1-)n], an welche viele gleiche (oder unterschiedliche) Komponenten c) jeweils als Monomer und jeweils verbunden mit der Komponente d) binden.

Mit dieser Ausführungsform werden viele signalgebende Komponenten [Analyten, Komponente d)] an den zu analysierenden Reaktionspartner gebunden, was die Empfindlichkeit des Systems steigert.

In der zweiten Ausführungsform (siehe Fig. 2) stellen sowohl die Komponente b) als auch die Komponente c) Multimere dar, wobei an die Komponente c) nur eine oder wenige Komponenten d) gebunden sind. Mit dieser Ausführungsform werden zwar nur wenige Komponenten d) an den zu analysierenden Reaktionspartner gebunden, aber die Bindung zwischen den Komponenten c) und d) ist außerordentlich stark, was die Spezifität des Nachweises von dem zu analysierenden Reaktionspartners erhöhen kann.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Komponente c) [c₁-cn] mit mindestens einer weiteren Komponente b [b₁-bn] gebunden, an welche mindestens eine weitere Komponente cd dimerisieren kann. Ein Beispiel hierfür ist in Fig. 1b dargestellt.

Diese besondere Ausführungsform steigert die Empfindlichkeit des Testsystems beträchtlich.

Mit Hilfe dieses erfindungsgemäßen analytischen oder diagnostischen Systems kann ein Reaktionspartner in oder auf einer festen Phase, in einer Flüssigkeit, beispielsweise in einer Körperflüssigkeit, auf Zellen und in Geweben bestimmt werden.

Gemäß der Erfindung kann die Komponente a) darstellen:

- eine Nukleotidsequenz. Bei Wahl einer Nukleotidsequenz ist diese endständig so zu derivatisieren [beispielsweise entsprechend WO95/02422 oder durch Einfügung einer Bindesequenz für ein Nukleotidbindeprotein (wie beispielsweise für LexA, Gal4 oder für einen Transkriptionsfaktor) oder für einen Antikörper], daß an sie direkt oder indirekt über ein Nukleotidbindeprotein oder über einen antigenbindenden Teil eines Antikörpers die Komponente b) gekoppelt werden kann.
- einen Liganden für einen zellulären Rezeptor
- ein Virushüllprotein
- einen zellulären Rezeptor für ein Virushüllprotein
- einen zellulären Rezeptor für einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, ein Chemokin, ein Peptidhormon, einen Mediator oder ein Steroid
- ein Protein, welches sich mit einem Partnerprotein verbindet und hierdurch an einer biologischen Reaktionskette teilhat, beispielsweise ein Komplementfaktor, ein Gerinnungsfaktor, ein Faktor des Kininsystems, des Fibrinolysesystems oder ein plasmatischer oder zellulärer Enzyminhibitor oder ein plasmatisches oder zelluläres Enzym
- den extrazellulären Teil eines Fo-Rezeptors, an welchem ein Antikörper spezifisch für eine Zielzelle über seinen Fo-Teil gebunden wird
- ein Antikörpermolekül oder der epitopbindende Teil eines murinen oder humanen Antikörpermoleküls.

Rekombinante Antikörperfragmente werden hergestellt wie bereits in Abschnitt 3) aufgeführt.

In einem analytischen oder diagnostischen System gemäß der Erfindung kann die signalgebende Komponente, der Analyt (Komponente d) beispielsweise darstellen ein fluoreszierendes Molekül, ein Molekül, welches eine Chemolumineszenzreaktion auslöst, ein Enzym, wie beispielsweise eine Phosphatase oder Peroxydase zur Spaltung eines zu messenden Substrates, ein Isotop oder ein Metall.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen analytischen und diagnostischen Systems wird ein zu bestimmender Reaktionspartner vermischt mit einem Überschuß der Komponente ab. Der nicht an den zu bestimmenden Reaktionspartner gebundene Anteil von Komponente ab wird beispielsweise durch Waschen entfernt. Nachfolgend wird die an den Reaktionspartner gebundene Komponente ab mit einem Überschuß von Komponente cd versetzt, der nicht an die Komponente ab gebundene Anteil der Komponente bc beispielsweise durch Waschen entfernt und die an den Reaktionspartner über die Komponente ab und c) gebundene Komponente d) bestimmt.

Beispiele zur Verdeutlichung des Erfindungsgegenstandes Herstellung und Prüfung einer Aktivator-responsiven Promotoreinheit

Es wurde eine Aktivator responsive Promotereinheit hergestellt, bei welcher sich eine Aktivatorsubeinheit A mit einer Aktivatorsubeinheit B (siehe Fig. 3) verbindet. Dis Verbindung erfolgt über mutiertes c jun und mutiertes c-fos (siehe Fig. 4). Der Komplex ist ein Transkriptionsfaktor, welcher einen Aktivator-responsiven Promoter aktiviert.

Diese erfindungsgemäße Aktivator responsive Promotereinheit besteht aus folgenden unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:
Aktivatorsubeinheit A:

- der Promoter des Cyclin A Gens (Nukleinsäuren -214 bis +100; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995))
- dem nuklearen Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T, Aminosäuren 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
- der sauren Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (VP16, Aminosäuren 411 bis 455; Triezenberg et al., Genes Dev. 2, 718 (1988))
- der cDNA für den leucine Zipper Teil des c-jun Proteins (Aminosäuren 276 bis 312; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in dem die Aminosäuren 283, 288 und 302 mutiert sind (m-jun).

Beschreibung der Mutationen (Fig. 2)

Aminosäure 283 K → E
Aminosäure 288 K → E
Aminosäure 302 R → E
Aktivatorsubeinheit B:

- der Promoter des Tyrosinase Gens (2X die Enhancer Sequenz, Nukleinsäuren -2014 bis -1820 und der Kernpromotor Nukleinsäuren -209 bis +51; Shibata et al., J. Biol: Chem. 267, 20584 (1992))
- dem nuklearen Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T, Aminosäuren 126-132; PKKKRKV (SEQ ID NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
- der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4 Proteins (Aminosäuren 1 bis 147, Chasman und Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1990))
- der cDNA für den leucine Zipper Teil des c fos Proteins (Aminosäuren 160 bis 196; Mark et al., Nature 373, 257 (1995)) in dem die Aminosäuren 167, 172 und 181 mutierten sind (m-fos).

Beschreibung der Mutationen (Fig. 2)

Aminosäure 167 E → K
Aminosäure 172 E → K
Aminosäure 181 E → K
Dimerisierung von mutiertem c-fos mit mutiertem c-jun

Die Expressionsprodukte der Aktivatorsubeinheiten A und B dimerisieren durch Bindung des mutierten o-fos leucine Zipper an den mutierten o-jun leucine Zipper.

Die Dimerisierung der Aktivatorsubeinheiten A und B, d. h. die Bindung des mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c-jun leucine Zipper, wurde wie folgt geprüft:
Die Proteine wurden in einem "in vitro translation" System (TNT T7 quick coupled transcription/translation system, Promega, Madison, WI) mit oder ohne (S³⁵)- Methionin synthetisiert. Nachfolgend wurden die synthetisierten Proteine (m-jun- VP16 und m-fos-Gal4) im Verhältnis 1 : 1 vermischt und die Komplexe gelelektrophoretisch getrennt und nach Immunpräzipitation mit einem Antikörper anti- GAL4 analysiert.

Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

- Das Protein m-jun-VP16 kann sich mit dem Protein m-fos-GAL4 verbinden.
- Das Protein m-jun-VP16 kann sich nicht mit dem Protein wt fos-GAL4 und das Protein wt-jun-VP16 kann sich nicht mit dem Protein m-fosGAL4 verbinden (siehe Tabelle 1).

Das dimere Protein stellt einen chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator responsiven Promotor 10x (Gal4-SV40) dar.

Aktivator-responsiver Promotor und das Effektorsystem

Der Aktivator-responsive Promotor hat folgende Zusammensetzung:

- 10x die Bindesequenz für Gal4-Bindeprotein mit der Nukleotidsequenz 5'- CGGAGTACTGTCCTCCG-3' (Webster et al., Cell 52, 169 (1988); SEQ ID NO.: 21)
- der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (Ed). DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory))
- die cDNA für das Reportergen Luciferase (Luc) (Nordeen, BioTechniques 6, 454 (1988))

Die Reihenfolge der Nukleotidsequenzen und deren Aktivierungseinheiten ist in Fig. 5 dargestellt.

Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in den pGL3 Plasmidvektor (Promega; Madison, USA) einkloniert, die direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in vivo Applikation genutzt werden.

Die Funktionsweise der gesamten Aktivator-responsiven Promotoreinheit ist wie folgt:
Der Promotor Cyclin A reguliert zellzyklusspezifisch die Transkription der kombinierten cDNAs für die Ak 04354 00070 552 001000280000000200012000285910424300040 0002019900743 00004 04235tivierungsdomäne von VP16 und den mutierten leucine Zipper von c-jun (Aktivierungsuntereinheit A) (Fig. 3).

Der Promotor Tyrosinase beschränkt die Transkription der kombinierten cDNAs für die Gal4-Bindungsdomäne, das NLS von SV40 und den mutierten leucine Zipper von c-fos auf Melanomzellen (Aktivierungsuntereinheit B) (Fig. 3).

Das dimere Protein stellt einen chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator responsiven Promotor (DNA-Sequenz für die Gal4-Bindedomäne/SV40 Promotor) und für die Transkription des Effektorgenes (= Reportergen = Luciferasegen) dar (Fig. 5).

Die Herstellung des Konstruktes

Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes und die Einfügung in ein Plasmid (pGL3, Promega, Madison Wi USA) (Fig. 6) erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen Enzyme und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben.

Mit den beschriebenen Plasmiden werden in Kultur gehaltene Tumorzellen (MeWo: Humanmelanom Zellen, PC3: Humanprostata Zellen) mit dem Fachmann bekannter Methode DOTAP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) transfiziert und die Menge an Luciferase produziert von den Zellen gemessen (Herber et al., Oncogene 9, 1295 (1994); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) und Jérôme et al., Hum. Gen. Ther., im Druck (1998)).

Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden die Tumorzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in Go/G1 synchronisiert. BrdU-Einbau zeigt, daß sich MeWo und PC3 Zellen nach Methionientzug synchronisieren lassen (Jérôme et al., Hum. Gen. Ther., in press (1998)).

Ergebnisse

Folgende Ergebnisse werden erzielt: in transfizierten MeWo und PC3 Zellen kann eine deutliche Zunahme der Luciferase im Vergleich mit nichttransfizierte Tumorzellen ermittelt werden (Tabellen 2 und 3).

Proliferierende MeWo (DNA<25) bilden deutlich mehr Luciferase als in GO/G1 synchronisierte Tumorzellen (DNA = 25) und als proliferierende PC3 Zellen (Tabellen 2 und 3).

Die Aktivatorsubeinheiten A und B, die mutierte leucine Zipper enthalten, können nicht mit den endogenen c-fos und c-jun binden (Tabelle 2).

Die Aktivatorsubeinheiten A und B, die mutierten leucine Zipper enthalten, sind durch die starke Bindung von dem mutierten c-fos leucine Zipper an den mutierten c-jun leucine Zipper wirksamer als das System mit CD4 und LCK (Tabelle 2). Im Detail beschrieben in der Patentanmeldung EP-A 0 805 209.

Somit führt die beschriebene Aktivator responsive Promotoreinheit zu einer zellspezifischen, zellzyklusabhängigen Expression des Gens Luciferase (Tabelle 4).

Figurenlegende

Fig. 1:
(a) Schematische Darstellung der neuen komplexbildenden Proteine, Möglichkeit 1
(b) Variante der Möglichkeit 1

Fig. 2: Schematische Darstellung der neuen komplexbildenden Proteine, Möglichkeit 2.

Fig. 3: Aktivatorresponsive Promotoreinheiten A und B gemäß den Beispielen.

Fig. 4: Mutationen von c-jun und c-fos gemäß den Beispielen.

Fig. 5: Der Aktivator responsive Promotor und das Effektorgen.

Fig. 6: Nukleinsäurekonstrukte zur Expression der erfindungsgemäßen komplexbildenden Proteine.

Tabelle 1

Protein-Protein-Interaktion nach Immunprecipitation

Tabelle 2

Luciferase Aktivitäten in MeWo Zellen

Tabelle 3

Luciferase Aktivitäten in PC3 Zellen

Tabelle 4

Zellspezifische, zellzyklusabhängige Expression des Luciferasegens

Claims

1. Komplex aus nicht natürlich vorkommenden, spezifisch komplexbildenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Komponenten im Komplex enthalten sind:

a) mindestens ein für eine Zielstruktur spezifischer Ligand,
b) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente c) wechselwirken kann und die Komponente b) kovalent mit der Komponente a) verbunden ist,
c) mindestens ein Protein enthaltend eine mutierte Dimerisierungsdomäne, wobei die mutierte Dimerisierungsdomäne durch Mutierung von einer natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomäne abgeleitet worden ist, diese mutierte Dimerisierungsdomäne spezifisch mit Komponente b) wechselwirken kann und die Komponente c) kovalent mit der Komponente d) verbunden ist, und
d) mindestens einen Effektor.

2. Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente a) ersetzt ist durch die Komponente d).

3. Komplex gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente d) ersetzt ist durch die Komponente a).

4. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich ein fusiogenes Peptid oder ein Translokalisationspeptid enthält.

5. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er zwischen den Komponenten c) und d) oder a) und b) eine Spaltsequenz für eine Protease enthält.

6. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand (Komponente a) ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, TNF, ein Chemokin, ein Peptidhormon, ein Mediator, ein Steroidhormon, ein Vitamin, einen Komplementfaktor, einen Gerinnungsfaktor, einen Faktor des Kininsystems oder des Fibrinolysesystems, ein plasmatisches oder zelluläres Enzym, einen plasmatischen oder zellulären Enzyminhibitor, eine Virushüllprotein, einen zellulären Rezeptor für einen der zuvor aufgeführten Proteine und Wirkstoffe, einen Antikörper, ein Antikörperspaltprodukte wie F(ab)₂, ein einzelkettiges Fv, ein einzelkettiges, doppelantigenbindendes Molekül, ein Fc-Fragment, ein DNA-Bindeprotein, die DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors und die Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors.

7. Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten b) und c) von natürlich sich miteinander verbindenden Proteinen abgeleitet werden.

8. Komplex gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich sich miteinander verbindenden Proteine ausgewählt werden aus einer Gruppe von natürlichen Dimerisierungspartnern enthaltend:
Fos Jun oder Jun B oder Jun D FRAU-1 Jun oder Jun B oder Jun D FRAU-2 Jun oder Jun B oder Jun D FOS-B Jun oder Jun B oder Jun D OCT-1 Jun oder Jun B oder Jun D NFKB (p65) IKB Ras RAF CD4 p56LcK bcl-2 bad oder bax Cyclin A cdk1 E2F DP CD40 CD40L Myc Max Myc N Max Myc L Max p105 (Rb1) AFF-2, E1A p107 (Rb2) E7, E2F oder Myc p130 E7, E2F oder Myc CBL Gag TRP TRP Met Met Myb p67 oder p160 VAV p67 oder p160 APC α- oder β-Catenin APC APC VD Rezeptor h-(Retinoid x-Rezeptor)RXR α oder β T3 Rezeptor HRXR α oder β MyoD E12 E12 Id E47 Id HHSP90 Progesteron-Rezeptor HHSP90 Glucocorticoid-Rezeptor HHSP90 Mineralocorticoid-Rezeptor HHSP90 Dioxinrezeptor Dioxinrezeptor Arnt HPS90 FKBP59 HSP90 Cyclosporin-bindendes Protein HPS90 Pp60^V-src HSP70 HSF1 Heat shock Faktor 1 HSP70 HSF2 Heat shock Faktor 2

9. Komplex gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich sich miteinander verbindenden Proteine, der Helix-Loop-Helix/Leucin-Zipper Familie angehören.

10. Komplex gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutationen der Dimerisierungsdomänen der Komponenten b) und c) erfolgt sind durch Einführung von

- 3-18 Cysteinen in die jeweils zugrundeliegenden natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen;
- 3-24 basischen Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3-24 sauren Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen;
- 3-24 hydrophoben Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3-24 aromatischen Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen; und/oder
- 3-24 aromatischen Aminosäuren in jeweils eine der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen und von 3-24 aromatischen Aminosäuren in jeweils die andere der zugrundeliegenden, natürlich vorkommenden Dimerisierungsdomänen.

11. Komplex nach Anspruch 10, bei welchen die Komponenten b) und c) die mutierten Bindedomänen von c-fos und o-jun darstellen, wobei folgende Mutationen vorliegen:
c-fos Aminosäure 167E → K
172E → K
181E → K
c-jun Aminosäure 283K
→ E
288 K → E
302K → E.

12. Komplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch charakterisiert, daß die Komponente d) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Inhibitoren der Zellproliferation, Apoptose induzierende Proteine, zytostatische oder zytotoxische Proteine, Gerinnung induzierende Faktoren, Angiogenese induzierende Faktoren, Angiogenese hemmende Faktoren, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Interleukine, Interferone, Komplementfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse induzierende Proteine, Peptidhormone, Mediatoren, bakterielle Proteine, Rezeptoren (für Wachstumsfaktoren, Cytokine, Chemokine, Interleukine, Interferone, Komplementfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse induzierende Proteine, Peptidhormone, Steroidhormone, Mediatoren oder Virushüllproteine), virale Antigene, parasitäre Antigene, Tumorantigene, Autoantigene, Gewebsantigene, Adhäsionsmoleküle, Antikörper oder Antikörperspaltprodukte wie F(ab)₂, Fab, einzelkettiges Fv, einzelkettige doppelantigenbindende Proteine, Enzyme zur Umsetzung einer signalgebenden Komponente, Enzyme zur Überführung einer Vorstufe einer Wirksubstanz in eine Wirksubstanz, Fluoreszenzfarbstoffe, Isotope, metallbindende Proteine, eine DNA-Bindedomäne.

13. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes, Schäden des Nervensystems, Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems, Tumoren, viralen- und bakteriellen Infektionen und zur Herstellung eines Impfstoffes.

14. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Komplexierung mit einem viralen oder nicht viralen Vektor und zur zielzellspezifischen Einführung dieses Vektors in die Zelle eines Organismus oder einer Zellkultur.

15. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für den Nachweis eines Reaktionspartners in vitro oder in vivo.

16. Nukleinsäurekonstrukt kodierend für ein Protein nach Anspruch 1 bis 12.

17. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 16, kodierend für die Aktivatorsubeinheiten einer Aktivator-responsiven Promotoreinheit.

18. Wirtszelle enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß den Ansprüchen 16 oder 17.

19. Wirtszelle gemäß Anspruch 18 ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend ein Bakterium, eine Hefe und eine Säugerzelle.

20. Verwendung einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 18 und 19 zur Herstellung der Komplexe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.

21. Herstellung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein Protein des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit Hilfe eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 16 oder 17 exprimiert wird,
b) ein weiteres, von dem unter (a) beschriebenen Protein verschiedenes Protein des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit Hilfe eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 16 oder 17 exprimiert wird,
c) die Proteine aus Schritt (a) und (b) isoliert und
d) miteinander komplexiert werden.