MXPA01006988A - Proteinas que forman complejo novedosas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un complejo de proteinas que forman complejo especificamente que no ocurren naturalmente, que comprende los siguientes componentes: a) al menos un ligando especifico para una estructura objetivo, b) al menos una proteina que comprende un dominio de dimerizacion mutado, habiendo sido derivado el dominio de dimerizacion mutado por la mutacion de un dominio de dimerizacion que ocurre naturalmente siendo posible para este dominio de dimerizacion mutado interactuar especificamente con el componente c) y el componente b) estando conectado covalentemente al componente a), c) al menos una proteina que comprende un dominio de dimerizacion mutado, habiendo sido derivado el dominio de dimerizacion mutado por la mutacion de un dominio de dimerizacion que ocurre naturalmente, siendo posible para este dominio de dimerizacion mutado interactuar especificamente con el componente b) y el componente c) se enlaza covalentemente al componente d) y d) al menos un efector. Ademas, la invencion se refiere al uso y preparacion de estos complejos y a construcciones de acido nucleico que codifican para las proteinas mencionadas y uso de las mismas.

Description

PROTEÍNAS QUE FORMAN COMPLEJO NOVEDOSAS 1. Introducción Los compuestos complejos entre las proteínas están 5 diseminados en la naturaleza. Fundamentalmente, estas proteínas pueden asignarse a los siguientes grupos: anticuerpos que, con sus sitios de enlace antígeno, pueden enlazarse específicamente al epítope correspondiente 10 de un antígeno (que también puede ser otro anticuerpo) . complejos de proteína, tales como ocurren, por ejemplo, en la activación del sistema de coagulación o del sistema de complemento interacciones del receptor ligando de tipos muy 15 diferentes, por ejemplo, * de antígenos o sus epitopes con el receptor de célula T o célula B * de factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, hormonas peptídicas, hormonas esteroides y 20 mediadores con sus receptores respectivos * de enzimas tales como, por ejemplo, uPA o tPA con su receptor * de proteínas de virus con sus receptores celulares respectivos 25 - adhesiones entre moléculas de adhesión -jrf******'j"- _ , _. ^^ complejos de proteína en transmisión de señales, control del ciclo celular y control de la transcripción de genes Numerosos ejemplos en la presente se resumen en la literatura, es decir por Hardie et al., The Protein Kinase Facts Book I and 11, Academic Press 1995, Callard et al., The Cytokine Facts Book, Academic Press 1994, Pigott et al., The Adhesión Molecule Facts Book, Academic Press 1994, Barclay et al., The Leukocyte Antigen Facts Book, Academic. Press 1994, Watson et al., G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press 1994, Hesketh, The Oncogene Facts Book, Academic Press 1995, Leid et al., Cell 68, 377 (1992), Murre et al., Cell 58, 537 (1989), Bbeneza et al., Cell 61, 49 (1990), Brugge, Curr. Top. Microbiol. Immunolbiol. 123, 1 (1981), Callebaut et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6270 (1992), Nadeau et al., J. Biol. Chem. 268, 1479 (1993), Burbach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8185 (1992), Hoffman et al., Science 252, 954 (1991), Stress-induced Proteins, M.L. Pardue, J.R. Feramisco and S. Lindquist Ed, A.R. Liss, New York (1989), Eukaryotic Transcription Factor, D.S. Lachman, Academic Press (1991), Transcriptional Regulations, Eds. S. McKnight and K.R. Yamamoto, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York (1992) . En algunos casos, los compuestos muy específicos especificados por naturaleza, entre al menos dos proteínas, se utilizan para el análisis o detección de proteínas en el diagnóstico de enfermedades (para esto ver EP 0 491 362 Bl) y los asociados por simbiosis de enlace de tales proteínas se usan para la profilaxis o terapia de trastornos . Si un asociado por simbiosis de los complejos de proteína particulares está disponible, con el auxilio de este asociado por simbiosis la cantidad del segundo o componente adicional, sea, por ejemplo, factores de complemento o coagulación, antígenos, proteínas receptoras o de señalamiento, puede determinarse. Además, los complejos de proteínas específicos se utilizan en la búsqueda de activadores o inhibidores de molécula pequeña. Además, los anticuerpos purificados o ligandos para receptores, tales como, por ejemplo, citocinas y hormonas peptídicas, se administran a pacientes o animales para la profilaxis o terapia de trastornos. En el caso de estas diferentes posibilidades de la aplicación para proteínas que forman complejos de proteína, la especificidad con la cual las proteínas respectivas entran dentro de la formación del complejo y además de la distribución de las proteínas respectivas en el organismo es de importancia crucial. Mientras más baja sea la especificidad, más frecuentemente ocurrirá el enlace no específico de un asociado por simbiosis a proteínas extrañas. Por ejemplo, la formación de complejos no específica, es decir, no deseada, con asociados por simbiosis de proteína extraña es, como es conocido, el problema principal del análisis y diagnóstico al usar anticuerpo. La formación no deseada de complejos con asociados por simbiosis de proteína extraña también puede ser la causa de efectos secundarios in vivo, por ejemplo después de la inyección de anticuerpos. Además, el enlace exclusivo específico entre dos proteínas es un pre-requisito esencial para la producción y función específica de factores de transcripción complejos, en particular de complejos sintéticos de factor de transcripción, tales como han sido descritos en la Solicitud de Patente EP-A 0 805 209. Existe así una considerable necesidad de proteínas que formen complejo altamente específicas, novedosas que no reaccionen con asociados por simbiosis extraños. 2. Breve descripción de la invención La invención se refiere a un complejo formado de proteínas que específicamente forman complejo que no ocurre naturalmente, en donde los siguientes componentes están contenidos en el complejo: a) al menos un ligando específico para una estructura objetivo, b) al menos una proteína que comprende un dominio de dimerización mutado, el dominio de dimerización mutado habiendo sido derivado por la mutación de un dominio de dimerización que ocurre naturalmente, siendo posible para este dominio de dimerización mutado interactuar específicamente con el componente c) y el componente b) siendo enlazada covalentemente al componente a), c) al menos una proteína que comprende un dominio de dimerización mutado, el dominio de dimerización mutado habiendo sido derivado por mutación de un dominio de dimerización que ocurre naturalmente, siendo posible para este dominio de dimerización mutado interactuar específicamente con el componente b) y el componente c) siendo enlazado covalentemente al componente d) , y d) al menos un efector. Conforme a la invención, una característica de los componentes b) y c) es que en los péptidos que ocurren naturalmente o proteínas de idéntico o diferente tipo de aminoácidos se reemplazan o insertan de tal forma que los péptidos o proteínas mutadas en esta forma pueden formar complejo virtualmente sólo exclusivamente entre sí. Una formación de complejos de péptidos o proteínas mutadas en esta forma con las correspondientes proteínas tipo silvestre no mutadas o péptidos sin embargo, no ocurre. En esta forma, pueden formarse homodímeros o heterodímeros de monómeros mutados (péptidos o proteínas mutadas) . Las mutaciones en los dominios de enlace de las proteínas idénticas o diferentes tiene por lo tanto el propósito de prevenir la capacidad de la formación de complejo entre un monómero no mutado y un monómero mutado de un par de proteínas o péptidos idénticos o diferentes que formarían complejo en el estado no mutado. Al mismo tiempo, las mutaciones imparten a dicho par de proteínas mutadas la capacidad para enlazarse entre sí con alta especificidad. Las mutaciones ocurren así en pares, en donde una mutación está presente en el componente b) , la otra en el componente c) , es decir tal que sea posible una interacción molecular entre los aminoácidos respectivos de tal par. Los aminoácidos conforme a la invención insertados dentro de los péptidos o proteínas que ocurren naturalmente pueden ser, por ejemplo (la lista en pares intenta indicar la interacción molecular en el contexto de un complejo de proteína dimérico) : Componente b) o c)i Componente c) o b) 3-18 cisteínas 3-18 cisteínas 3-24 aminoácidos básicos 3-24 aminoácidos ácidos tales tales como como histidina, asparagina, arginina, ácido aspártico, lisina, glutamina, ácido glutámico, 3-24 aminoácidos hidrofóbicos 3-24 aminoácidos aromáticos tales como metionina, fenilalanina, isoleucina, tirosina, leucina, triptofano valina 3-24 aminoácidos aromáticos 3-24 aminoácidos aromáticos Las proteínas iniciales para los componentes b) y c) pueden ser idénticos o diferentes aquí. La constante de enlace de un complejo de dos proteínas conforme a la invención es al menos KM = 10~7 mol 1" 1, preferiblemente al menos KM = 10"8 mol l"1. Dentro del significado de esta invención, los siguientes asociados por simbiosis idénticos o no idénticos (para la producción de componente b) o c) y con la finalidad de enlazar heterodímeros), por ejemplo, se muta preferiblemente en su dominio de enlace respectivo y éstos o la proteína completa se usan: Componente b) o c) Componente c) o b) Fos Jun o Jun B o Jun D FRAU-1 Jun o Jun B o Jun D FRAU-2 Jun o Jun B o Jun D FOS-B Jun o Jun B o Jun D OCT-1 Jun o Jun B o Jun D NFKB(p65) IKB Ras RAF CD4 p56LcK bcl-2 bad o bax Cyclin A cdkl E2F DP CD40 CD40L Myc Max Myc N Max Myc L Max pl05 (Rbl) AFF-2, ElA, pl07 (Rb2) E7, E2F o Myc pl30 E7, E2F o Myc CBL Gag TRP TRP Met Met Myb p67 o pl60 VAV p67 o pl60 APC a- o ß-Catenin APC APC receptor VD h- (receptor Retinoide x)RXR a o ß receptor T3 HRXR a o ß MyoD E12 Componente b) o c¡ Componente c) o b) E12 Id E47 Id HhSP90 Receptor de progesterona HHSP90 Receptor glucocorticoide HHSP90 Receptor corticoide mineral HHSP90 Receptor de Dioxina Receptor de Dioxina Arnt HPS90 FKBP59 HSP90 Proteína que enlaza ciclosporina H PS90 pp60v"src HSP70 factor 1 de choque térmico HSF1 HSP70 factor 2 de choque térmico HSF2 Se prefieren aquéllos pares de proteínas que naturalmente tienen una secuencia de enlace zipper hélice-bucle-hélice/leucina. La invención se refiere adicionalmente a los muy diferentes usos de estas proteínas que forman complejo conforme a la invención, por ejemplo, como complejos de proteína multivalentes para profilaxis y terapia como ligandos multivalentes para vectores para terapia de gen como factores de transcripción sintéticos para control de la expresión de genes y como sistemas de diagnóstico o analíticos. En este contexto, los componentes a) y d) se seleccionan dependiendo del tipo seleccionado de uso. La invención se refiere particularmente a proteínas que forman complejo novedosas, en donde los aminoácidos mencionados han sido insertados dentro de las proteínas que naturalmente forman homodímeros o heterodímeros, tales como estas proteínas (componentes b) y e)) mutados en esta forma, solamente forman complejos consigo mismos (homodímeros) o con el asociado por simbiosis correspondientemente mutado (heterodímeros), pero no más con las proteínas iniciales no mutadas que ocurren naturalmente. Las proteínas que forman complejo novedosas contienen los componentes a) , b) , c) y d) pueden usarse en, por ejemplo, dos modalidades. En la primera modalidad (véase Figura la) , el componente b) es un homo- (o hetero) multímero [componente b) 1-b)n] al cual los componentes c) correspondientes idénticos (o diferentes) en cada caso se enlazan, en cada caso como un monómero y en cada caso enlazados al componente d) . Con esta modalidad, muchos componentes d) (efectores) se enlazan a la estructura objetivo. En la segunda modalidad (véase Figura 2), tanto el componente b) como el componente c) son multímeros, enlazándose solamente uno o unos cuantos componentes d) al componente c) . Aunque con esta modalidad solamente unos cuantos componentes d) (efectores) se enlazan a la estructura .. , . .^ ^. r ....,* . ... ... . ^_j-________^ . ^^ .. Al?.t.L? _fcsa<fts¡¡aais?9sa objetivo, el enlace entre los componentes c) y d) es extremadamente fuerte, lo cual puede incrementar la especificidad del enlace de los componentes c) y d) a la estructura objetivo. 5 La invención se refiere a proteínas que forman complejo novedosas que consisten de los componentes a), b) , c) y d) , y también construcciones de ácido nucleico que codifican para estas proteínas que forman complejo. La invención se refiere igualmente a complejos que consisten de 10 los componentes d) , b) , c) y d) , es decir el componente a) se reemplaza por d) , y construcciones de ácido nucleico que codifican por el mismo. Además, la invención se refiere a un complejo que consiste de los componentes a), b) , c) y a); es decir el 15 componente d) se reemplaza por a) , y construcciones de ácido nucleico que codifican por el mismo. La invención también se refiere además a proteínas que forman complejo que consisten de los componentes a), b) , c) y d) o variantes del mismo descritas anteriormente, que 20 adicionalmente contienen un péptido fusogénico, un péptido de translocación o, entre los componentes c) y d) o a) y b) , una secuencia de desdoblamiento para una proteasa, y construcciones de ácido nucleico que codifican por el mismo. Todas las construcciones de ácido nucleico de este 25 tipo pueden introducirse dentro de bacterias, levaduras o 'r-WWw Wfflü.i - - n- «i__ _____ . . .—-,-. células de mamífero con el auxilio de vectores virales o no virales conocidos por la persona experta en la técnica. Las células de este tipo pueden usarse para la preparación de la proteína conforme a la invención o aún administrarse con el propósito de la profilaxis o terapia de un organismo. Las construcciones de ácido nucleico de este tipo, insertadas dentro de un vector, sin embargo, pueden también administrarse directamente a un organismo con el propósito de profilaxis o terapia. La invención se refiere además a la preparación de uno de los complejos precedentes, en los cuales, una proteína de este complejo se expresa con el auxilio de una construcción de ácido nucleico que codifica para el mismo y una proteína adicional de este complejo, que es diferente de la primera, se expresa con el auxilio de una construcción de ácido nucleico que codifica para el mismo, y las proteínas expresadas se aislan y forman complejo la entre sí. En el caso de complejos que consisten de homodímeros u homooligómeros, la preparación se lleva a cabo sin la expresión de una segunda proteína que es diferente de la primera . 3. Complejos de proteína multivalente para profilaxis y terapia ' - T TjjÉ ll La presente invención se refiere al uso de los complejos de proteína conforme a la invención para la profilaxis o terapia de un trastorno. En este contexto, el componente a) es un ligando para la estructura objetivo. Esta estructura objetivo puede presentarse sobre una membrana celular, en la matriz extracelular o en un tejido o fluido sanguíneo . Conforme a la invención, el componente a) puede ser un ligando para un receptor celular, por ejemplo * Factores de crecimiento como VEGF, PDGF, EGF, TGFa, TGFß, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, neurotrofinas, BMF, bombesina, M-CSF, trombopoyetina, eritropoyetina, SCF, SDGF, oncostatina, PDEGF, endotelina-1 * citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL- 14, IL-15 * interferon a, ß y ? * factores de necrosis tumoral TNFa, -ß, * quimiocinas tales como RANTES, MCAF, MlP-la o -ß, NAP, ß-tromboglobulina * hormonas peptídicas tales como SRH, SIH o STH, MRH o MSH, PRH, PIH o prolactina, GnRH, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH o FSH, TRH o TSH, CRH o ACTH * angiotensina, quininas, histamina, homólogos o análogos de los mismos * hormonas esteroides tales como estrógenos, gestágenos, andrógenos, glucocorticoides, mineralocorticoides , homólogos o análogos de los mismos * vitaminas tales como, por ejemplo, ácido fólico En el contexto de la presente invención, el componente a) también puede ser una molécula de adhesión, una parte de la molécula de adhesión o un análogo de una molécula de adhesión que se enlaza a una molécula de adhesión correspondiente sobre la membrana celular o a otra estructura de enlace específica para una molécula de adhesión sobre la célula objetivo. Las moléculas de adhesión de este tipo capaces de funcionar como el componente a) son, por ejemplo - Lewis X (para GMP-140) S-Lewis X (para ELA -1) . LFA-1 (para ICAM-1 e ICAM-2) MAC-1 (para ICAM-1) VLA-4 (para VCAM-1) - PECAM (para PECAM) Vitronectina (para el receptor de vitronectina) GMP-140 (para Lewis X) S-Lewis X (para ELAM-1) ICAM-1, ICAM-2 (para LFA-1, MAC-1) - VCAM-1 (para VLA-4) Fibronectina (para VLA-4) Laminina (para VLA-6) Fibronectina, laminina (para VLA-1, VLA-2, VLA-3) Fibronectina (para VLA-4) - Fibrinógeno (para GPIIb-IIIa) B7 (para CD28) CD28 (para B7) CD40 (para CD40L) CD40L (para CD40) En el contexto de la presente invención, el componente a) también puede ser una proteína que se enlaza a una proteína asociada por simbiosis y por lo tanto participa en una cadena de reacción biológica, por ejemplo un factor de complemento, un factor de coagulación, un factor del sistema cinin, del sistema de fibrinólisis o un inhibidor enzimático, plasmático o celular o una enzima plasmática o celular. En el contexto de la presente invención, el componente a) también puede ser un receptor para una de las proteínas previamente mencionadas . En el contexto de la presente invención, el componente a) también puede ser la porción extracelular de un receptor Fc ((Dougherty et al., Transfusión Science 1_7, 121 (1996)), al cual un anticuerpo específico para la célula objetivo se enlaza por medio de su porción Fc . En el contexto de la presente invención, el componente a) también puede ser una molécula anticuerpo o la parte que enlaza epítope de una molécula de anticuerpo. Se prefieren anticuerpos humanos. Los anticuerpos monoclonales de murino también pueden emplearse en forma humanizada. La humanización se lleva a cabo en la forma mostrada por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) y Hoogenboo s et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 3_6, 19 (1993)). Los fragmentos de anticuerpo se preparan conforme a la técnica anterior, por ejemplo en la forma descrita por Winter et al., (Nature 349, 293 (1991)), Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 3_6, 19 (1993), Girol, Mol. Immunol . 28, 1379 (1991) o Huston et al. (Ins. Rev. Immunol . 10, 195 (1993). Los fragmentos de anticuerpo recombinante se preparan directamente de hibridomas existentes o se aislan de bibliotecas de fragmentos de anticuerpo de murino o humano con el auxilio de tecnología "exhibición de fago". Estos fragmentos de anticuerpo se emplean después a nivel genético directamente para manipulaciones adicionales (por ejemplo, fusión con otras proteínas). Para la producción de fragmentos de anticuerpo recombinante a partir de hibridomas, la información genética que codifica para los dominios de enlace antígeno (VH, VL) de los anticuerpos se obtiene por aislamiento del ARNm, transcripción inversa del ARN dentro del ADNc y amplificación subsecuente por medio de reacción en cadena de polimerasa y oligonucleotidos complementarios a los extremos 51 o 31 de los fragmentos variables. Los fragmentos VH y VL se clonan después dentro de vectores de expresión bacterianos, por ejemplo en la forma de fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o como fragmentos Fab. Los fragmentos anticuerpo novedosos también pueden aislarse directamente a partir de bibliotecas de anticuerpos (inmunobibliotecas, bibliotecas nativas) de origen de murino o humano por medio de la tecnología de "exhibición de fago". En la "exhibición de fago" de fragmentos de anticuerpo, los dominios de enlace de antígeno se clonan como proteínas fusionadas con la proteína g3P de recubrimiento de bacteriófagos filamentosos ya sea dentro del genoma del fago o dentro de vectores fagémidos en la forma de fragmentos scFv o como fragmentos Fab. Los fagos que enlazan antígeno se seleccionan sobre recipientes de plástico recubiertos con antígeno ("panning"), sobre cuentas paramagnéticas conjugadas con antígeno o enlazando a superficies celulares. Las inmunobibliotecas se preparan por amplificación PCR de los fragmentos de anticuerpo variables de linfocitos B de animales o pacientes inmunizados. Para esto, se usan combinaciones de oligonucleotidos que son específicas para genes de inmunoglobulina de murino o humano o para las familias de genes de inmunoglobulina humanos.

Pueden prepararse bibliotecas nativas usando donadores no inmunizados como la fuente de los genes de inmunoglobulina. Alternativamente, pueden emplearse genes de la línea de germen de inmunoglobulina para la preparación de repertorios de anticuerpos semisintéticos, reemplazándose la región 3 que determina complementariedad de los fragmentos variables por PCR con el auxilio de cebadores degenerados. Estas así llamadas bibliotecas de olla individual tienen la ventaja, comparadas con las inmunobibliotecas que pueden aislarse fragmentos de anticuerpo en contra de un gran número de antígenos a partir de una biblioteca individual. La afinidad de los fragmentos anticuerpo puede incrementarse adicionalmente por medio de la tecnología de exhibición de fago, nuevas bibliotecas de fragmentos de anticuerpo que ya existen preparándose por mutagénesis basada en codón o seleccionada aleatoria por barajado en cadena de los dominios individuales con fragmentos de repertorios nativos o con el auxilio de cepas mutadoras bacterianas y fragmentos de anticuerpo que tengan propiedades mejoradas aislándose por reselección bajo condiciones severas. Además, los fragmentos de anticuerpo de murino pueden humanizarse por reposición en forma de tapa de uno de los dominios variables por un repertorio humano y una selección subsecuente usando el antígeno original (selección guiada) . Alternativamente, la humanización de anticuerpos de murino se lleva a cabo por reposición dirigida al objetivo de las regiones hipervariables de anticuerpos humanos por las regiones correspondientes del anticuerpo de murino original. Conforme a la invención, al menos dos ligandos 5 idénticos o diferentes para la estructura objetivo, por ejemplo sobre la célula objetivo, pueden contenerse en el ligando conforme a la invención (componente a) . Una forma particular de anticuerpos recombinantes biespecíficos o multiespecíficos, son moléculas que enlazan antígeno de 10 cadena sencilla, doble, o múltiple. La preparación de estas moléculas se describió en la Solicitud de Patente DE 19816141.7 (no publicada). En esta solicitud de patente, se hace referencia expresamente, por ejemplo, a la preparación del componente a) . 15 En el contexto de la presente invención, el componente a) también puede ser la proteína de recubrimiento o una parte de la proteína de recubrimiento de virus que se enlazan específicamente a las células seleccionadas por medio de su proteína de recubrimiento. 20 La selección del componente a) depende de la estructura objetivo a la cual la proteína que forma complejo conforme a la invención se enlaza. Ejemplos de éstos son: 25 _a£A___i_______l_______M_a£_______ Ligandos para células de endotelio activadas Dentro del significado de la invención, éstos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, dirigidos en contra de estructuras de membrana de células de endotelio, 5 tales como las que han sido descritas, por ejemplo, por Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64_, 155, (1994), Hughes et al. (Cáncer Res. 4_9, 6214 (1989)) y Maruyama et al. (PNAS- USA 87 , 5744 (1990)). En particular, éstos incluyen anticuerpos en contra de los receptores VEGF. 10 Los ligandos adicionalmente incluyen todos los compuestos activos que se enlazan a estructuras de membrana o receptores de membrana sobre células de endotelio. Estos incluyen, por ejemplo, substancias que, terminalmente, contienen mañosa, además IL-1 o factores de crecimiento o 15 fragmentos de los mismos o sustancias de ellos que se enlazan a los receptores expresados por células de endotelio, tales como, por ejemplo, PDGF, bFGF, VEGF, TGFß (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)). Además, éstos incluyen moléculas de adhesión que se 20 enlazan a células del endotelio activadas y/o proliferantes. Las moléculas de adhesión de este tipo, tales como, por ejemplo, Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4, péptidos de vitronectina o RGD ya han sido descritos (revisiones en Augustin-Voos et al., J. Cell Biol. 1_19, 483 (1992), Pauli et 25 al., Cáncer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cáncer g^¡|g^^¡^ ^ Metast. Rev. 11, 353 (1992)). Los ligandos dentro del significado de esta invención en particular incluyen glicoproteínas de recubrimiento de virus que tienen un tropismo para células 5 del endotelio. Estos virus incluyen, por ejemplo: Filovirus, por ejemplo, * el virus Marburg con su proteína GP (glicoproteína) de recubrimiento y sGP (segunda glicoproteína) 10 * o el virus Ebola en cada caso con su proteína GP de recubrimiento y sG el citomegalovirus particularmente con su proteína gB 15 - el virus de herpes simplex tipo I el virus HIV-1 el virus del sarampión el virus Hantaan alfavirus, tales como virus bosque Semliki 20 - el virus de la fiebre hemorrágica epidémica el virus de la polio enterovirus (tales como, por ejemplo, Echo 9, Echo 12, Coxsackie B3) 25 — ^-m*- ***^* ¡M___í__ Ligandos para macrofagos activados y/o linfocitos activados Los ligandos dentro del significado de la invención incluyen sustancias adicionales que se enlazan específicamente a la superficie de células inmunes. Estos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos en contra de estructuras de membrana o células inmunes, tales como las que han sido descritas, por ejemplo, por Powelson et al. (Biotech. Adv. 11, 725 (1993)). Además, los ligandos también incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de anticuerpo que se enlazan con su porción variable de enlace a antígeno a los receptores Fc-? o Fc-e o Fc-µ de células inmunes (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)). Además, esto incluye el fragmento Fc de la inmunoglobulina monoclonal o policlonal humana. Los fragmentos Fc de este tipo se preparan, por ejemplo, por diseño genético con el auxilio de ADN recombinante o conforme a los métodos de Haupt et al. (Klin. Wschr. 4_7, 270 (1969)), Kranz et al. (Dev. Biol. Standard 4_4, 19 (1979)), Fehr et al. (Adv. Clin. Pharmac. 6, 64 (1974)) o Menninger et al. (Immunochem. 1_3, 633 (1976) ) . Los ligandos adicionalmente incluyen todas las substancias que se enlazan a receptores de membrana sobre la superficie de células inmunes. Estos incluyen citocinas tales como, por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa, GM-CSF, M-CSF, además factores de crecimiento tales como, por ejemplo, EGF, TGF, FGF, IGF o PDGF o fragmentos de los mismos o subsecuencias de ellos que se enlazan a receptores expresados por células inmunes. Estos incluyen adicionalmente moléculas de adhesión y otros ligandos que se enlazan a estructuras de membrana celular, tales como, por ejemplo, al receptor de mañosa 6-fosfato sobre macrófagos en el bazo, hígado, pulmón y otros tejidos. Una selección de estos ligandos y estructuras de membrana se describe claramente en Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) ) . Los ligandos dentro del significado de esta invención, sin embargo, también incluyen glicoproteínas de recubrimiento de aquellos virus que tienen un tropismo para linfocitos y/o macrófagos. Estos virus que infectan macrófagos incluyen, por ej emplo : HIV-1 particularmente aquellas cepas que tienen mutaciones en la región V3 o gpl20, que conducen a un enlace incrementado de macrófagos HIV-2 Virus Hanta, por ejemplo el virus Punmala, - citomegalovirus virus del sincitio respiratorio virus del herpes simplex filovirus . Los virus que infectan linfocitos incluyen, por ej emplo : virus de varicella zoster (VZV) ; VZV infecta particularmente células T virus de herpes 6 (HHV-6); HHV-6 infecta particularmente células T - virus de la rabia; la proteína de recubrimiento del virus de la rabia se enlaza particularmente a células TH2 HIV-1; La glicoproteína gpl20 se enlaza preferiblemente a la molécula CD4 de las células T HTLV-II; HTLV-II infecta particularmente células de B HTLV-1; HTLV-1 infecta particularmente células T - virus de influenza C; los virus de influenza C se enlazan por medio de la proteína fusionada hemaglutinina esterasa (HEF) al ácido N-acetil-9-ß-acetilneuramínico (Neu 5,9 Ac), que preferiblemente ocurre sobre los linfocitos B, en un menor grado o no sobre linfocitos T ^.^¡a^sin?Éiát? virus de influenza C que tienen una mutación en la posición 872 de nucleótido (que codifica la posición 284 del HEF de la secuencia de aminoácido) , por ejemplo una reposición de la treonina por isoleucina. La proteína de superficie HEF que tiene esta mutación tiene una afinidad distintamente más fuerte para el receptor del ácido N-acetil-9-ß-acetilneuramínico que el virus silvestre. Productos de desdoblamiento HEF del virus de influenza C, que contienen la estructura de enlace para el ácido N-acetil-9-O-acetilneuramínico . Esta estructura de enlace se define por la triada catalítica serina 71, histidina 368 ó 369 y ácido aspártico 261 virus Epstein-Barr; EBV infecta particularmente células B virus de herpes simplex-2; HSV-2 infectan particularmente células T virus de sarampión Ligandos para células musculares Estos incluyen, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos en contra de estructuras de membrana de células musculares, en particular de células de músculo liso. Los anticuerpos de este tipo son, por ej emplo - el anticuerpo 10F3 anticuerpos en contra de actina anticuerpos en contra de receptores de angiotensina II anticuerpos en contra de receptores de factores de crecimiento o anticuerpos dirigidos, por ejemplo, contra de receptores de EGF o en contra los receptores de PDGF o en contra los receptores de FGF o anticuerpos en contra de los receptores de endotelina A Los ligandos incluyen adicionalmente todas las substancias activas que enlazan a las estructuras de membrana o receptores de membrana sobre células musculares (revisión en Pusztai et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Harris, Curr. Opin. Biotechnol. 2, 260 (1991)). Por ejemplo, éstos incluyen factores de crecimiento o fragmentos de los mismos o subsecuancias de ellos que se enlazan a receptores expresados por células de músculo liso tales como, por ejemplo PDGF - EGF TGFß TGFa FGF endotelina A Los ligandos dentro del significado de esta invención, sin embargo, también incluyen glicoproteínas del recubrimiento de aquellos virus que tienen un tropismo para células musculares. Estos virus incluyen, por ejemplo, los citomegalovirus .

Ligandos para células hematogénicas Los ligandos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos en contra de receptores expresados sobre células sanguíneas pobremente diferenciadas. Los anticuerpos de este tipo han sido descritos, por ejemplo, para los siguientes receptores: receptor del factor de célula del tallo receptor IL-1 (tipo I) receptor IL-1 (tipo II) - receptor IL-3 a receptor IL-3 ß receptor IL-6 receptor GM-CSF. Además, los ligandos también incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de anticuerpos, los cuales, con sus dominios constantes, se enlazan a receptores Fc-? de las células inmunes. Los ligandos incluyen adicionalmente todas las sustancias que se enlazan a estructuras de membrana o receptores de membrana sobre la superficie de células sanguíneas pobremente diferenciadas. Por ejemplo, éstos incluyen factores de crecimiento, tales como SCF, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF o fragmentos de los mismos o subsecuencias de ellos que se enlazan a receptores expresados por células sanguíneas .

Ligandos para células sinoviales y células inflamatorias Estos incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de anticuerpos que se enlazan con sus dominios variables a estructuras de membrana de células sinoviales o células inflamatorias. Tales estructuras de membrana son, por ejemplo, vimentina - fibronectina o receptores Fc . Estos también incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos de anticuerpos que se enlazan con sus dominios constantes al receptor Fc . Estos incluyen adicionalmente todos los compuestos activos que se enlazan a las estructuras de membrana o receptores de membranas sobre células sinoviales. Por ejemplo, incluidas aquí están las citocinas o factores de crecimiento o fragmentos de los mismos o subsecuencias de ellos que se enlazan a células sinoviales expresadas o los -¿—J iAllit-l-- receptores, tales como, por ejemplo, IL-l-RA, TNFa, IL-4, IL- 6, IL-10, IGF, TGFß. Además, éstos incluyen ligandos cuyo constituyente esencial es mañosa terminal que se enlaza a los receptores de manosa-6-fosfato sobre macrófagos.

Ligandos para células infectadas con virus Los ligandos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos en contra de los antígenos de virus expresados sobre la membrana celular de las células infectadas con virus. Los anticuerpos de este tipo se han descrito, por ejemplo, para células infectadas con los siguientes virus: HBV - HCV HSV HPV HIV EBV - HTLV.

Ligandos para células del hígado y células adicionales de tejido Los ligandos incluyen todas las substancias que enlazan a las estructuras de membrana o los receptores de membrana sobre la superficie de las células de hígado. Por ejemplo, éstos incluyen factores de crecimiento, tales como citocinas, EGF, TGF, FGF o PDGF, o fragmentos de las mismas o subsecuencias de ellas que se enlazan a receptores expresados por células de este tipo. Estos incluyen adicionalmente ligandos que se enlazan a estructuras de membrana celular que son selectivos para algunos tejidos. Estos incluyen, por ej emplo : Estructura de Ligando Células de tejido Membrana Receptor de Asialoorosomucoide Células de Hígado asialoglicoproteína Neoglicoproteína Galactosa Receptor de Transferrina Hígado, otras transferrina células de tejido Receptor de Insulina Hígado, otras insulina células de tejido Receptor de mañosa- Mañosa Macrófagos en Bazo, 6-fosfato hígado, pulmón, otros tejidos Receptores Fc-? Inmunoglobulina G Sistema reticuloendotelial, otros tejidos Estos ligandos y las estructuras de membrana se describen claramente en Perales et al. (Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) ) . Los ligandos dentro del significado de la invención, sin embargo, incluyen particularmente glicoproteínas de recubrimiento de virus que tienen un tropismo para células seleccionadas, tales como, por ejemplo, para células del epitelio bronquial * virus del sincitio respiratorio células de hígado * virus de hepatitis C, virus de hepatitis B, virus de hepatitis A * Filovirus Las células de hígado enlazan, por ejemplo, el virus Marburg por medio del receptor asialoglicoproteína * virus hepatitis B Las células de hígado se enlazan preferiblemente por medio del receptor asialoglicoproteína a los dominios preS2 y preSl de HBV * virus de hepatitis D - Células sinusoidales de hígado * virus de hepatitis V HBV se une por medio de fibronectina.

Ligandos para células glia Estos incluyen anticuerpos o fragmentos de ,»«-», anticuerpos dirigidos en contra de estructuras de membrana de células glia, tal como han sido reportados, por ejemplo, por Mirsky et al. (Cell and Tissue Res. 240, 723 (1985)), Coakham et al. (Prog. Exp. Tumor Res. 2_9, 57 (1985)) y McKeever et al. (Neurobiol. 6 , 119 (1991)). Estas estructuras de membrana incluyen además moléculas de adhesión neural tales como N-CAM, en particular su cadena polipeptídica C. Estos incluyen adicionalmente todos los compuestos activos que se enlazan a las estructuras de membrana o los receptores de membrana sobre células glia. Por ejemplo, éstos incluyen substancias que llevan mañosa terminalmente y se enlazan al receptor de manosa-6-fosfato, insulina y factor de crecimiento similar a insulina, PDGF y aquellos fragmentos de estos factores de crecimiento que se enlazan a los receptores de membrana asociados. Los ligandos dentro del significado de la invención en particular incluyen glicoproteínas de recubrimientos de aquellos virus que tienen un tropismo para células glia. Estos virus incluyen, por ejemplo: - HIV-1 subtipo JRF1 virus de herpes simplex I Ligandos para células de leucemia Estos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo dirigidos en contra de estructuras de membrana de células de leucemia. Un gran número de anticuerpos monoclonales de este tipo ya han sido descritos para procedimientos de diagnóstico y terapéuticos (revisiones en en Kristensen, Danish Medical Bulletin _4_1, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 3_8, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 .(1988), Freedman et al., Cáncer Invest. 9, 69 (1991)). Dependiendo del tipo de leucemia, los ligandos adecuados son, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de fragmentos de anticuerpos que enlazan antígeno de los mismos que tienen especificidad para los siguientes antígenos: Células Antígeno de Membrana AML CD13 CD14 CD15 CD33 CAMAL Sialosyl-Le B-CLL CD5 CDlc CD23 Idiotipos e isotipos de las inmunoglobulinas de membrana T-CLL CD33 M38 receptores IL-2 receptores de célula T ALL CALLA CD19 linfoma No-Hodgkin Los ligandos adicionalmente incluyen todos los compuestos activos que se enlazan a las estructuras de membrana o a los receptores de membrana de células de leucemia. Por ejemplo, éstos incluyen factores de crecimiento o fragmentos de los mismos y subsecuencias de ellos que se enlazan a los receptores expresados por células de leucemia. Los factores de crecimiento de este tipo ya han sido descritos (revisiones en Coss et al., Cell 64, 271 (1991); Aulitzky et al., Grugs 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cáncer Res. 1, 3 (1995); Van Kooten et al., Leuk. Lymph . 12, 27 (1993)). Por ejemplo, incluyen: IFNa en linfomas no-Hodgkin IL-2, particularmente en leucemias de células T FGF en célula T, leucemias monolíticas, mieloides, eritroides y megacarioblásticas . TGFß en leucemias retinoides, por ejemplo ácido retinoico en leucemia promielocítica aguda.

Ligandos para células de tumor Estas incluyen anticuerpos y fragmentos de estos anticuerpos dirigidos en contra de estructuras de membrana sobre células de tumor. Los anticuerpos de este tipo se han descrito claramente, por ejemplo, por Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992)). Ejemplos adicionales son anticuerpos en contra de: sialil-Lewis péptidos sobre tumores, que se reconocen por células T proteínas expresadas por oncogenes - gangliosidas tales como GD3, GD2, GM2 , 9-0-acetil GD3, fucosil GM1 antígenos de grupos sanguíneos y sus precursores antígenos sobre la mucina de epitelio polimórfico antígenos sobre proteínas de choque térmico. Conforme a la invención, el componente d) puede estar ya sea ausente o, dependiendo de la naturaleza del trastorno 'que se previene o trata, seleccionarse junto con el componente a), por ejemplo, como sigue: a) Terapia de tumores a.l) células objetivo: - células de endotelio proliferante o - células de estroma y células de músculo adyacente a la célula de endotelio o - células de tumor o células de leucemia a.2) Efectores: inhibidores de proliferación celular, por ejemplo La proteína retinoblastoma (pRb=pllO) o las proteínas pl07 y pl30 relacionadas. La proteína retinoblastoma (pRb/pllO) y las proteínas pl07 y pl30 relacionadas se inactivan por fosforilación. Preferiblemente, los genes a usarse de estos inhibidores del ciclo celular son aquellos que tienen mutaciones para los sitios de inactivación de las proteínas expresadas sin que estas sean disminuidas en su función con eso. Ejemplos de estas mutaciones se han descrito para pllO. La secuencia de ADN para la proteína pl07 o la proteína pl30 se mutan análogamente. La proteína p53 La proteína p53 se inactiva en la célula por enlace a proteínas específicas, tales como, por ejemplo, MDM2, o por oligomerización de la p53 por medio de la serina C-terminal desfosforilada . Preferiblemente una secuencia de ADN para una proteína p53 se usa así la cual se trunca en el término C por la serina 392. p21 (WAF 1) la proteína plß otros inhibidores cdk la proteína GADD45 - la proteína de Bak la proteína de Bax a.3) Efectores: Factores que inducen la coagulación e inhibidores de angiogénesis, por ejemplo: inh?bidor-1 del activador de plasminógeno (PAI-1) - PAI-2 PAI-3 angiostatina y/o endostatina interferones (IFNa, IFNB o IFN?) factor 4 de plaqueta - IL-12 TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 factor inhibitorio de leucemia (LIF) - factor de tejido (TF) y sus fragmentos activos de coagulación . a.4) Efectores: proteínas citostáticas y citotóxicas, por ejemplo perforina - granzima IL-2 IL-4 IL-12 interferones, tales como, por ejemplo, IFNa, IFNß o IFN? TNF, tales como TNFa o TNFß oncostatina M esfingomielinasa magainina y derivados de magainina a.5) Efectores: anticuerpos citostáticos o citotóxicos Los anticuerpos citostáticos o citotóxicos incluyen aquellos dirigidos en contra de estructuras de membrana de células de endotelio tales como los que han sido descritas por ejemplo, por Burrows et al. (Pharmac. Ther. 6_4, 155 (1994)), Hughes et al., (Cáncer Res. 49, 6214 (1989)) y Maruyama et al., (PNAS USA 8_7, 5744 (1990)). En particular, éstos incluyen anticuerpos en contra de los receptores VEGF. Además, éstos incluyen anticuerpos citostáticos o citotóxicos dirigidos en contra de estructuras de membrana sobre células de tumor. Los anticuerpos de este tipo se han descrito claramente, por ejemplo, por Sedlacek et al.

(Contrib. to Oncol. 3_2, Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 4_3, - Kargen Verlag, Munich (1992)).

Ejemplos adicionales son anticuerpos en contra de sialil-Lewis; en contra de péptidos sobre tumores, que son reconocidos por células T; proteínas en contra de proteínas expresadas de oncogenes; en contra de gangliosidos tales como GD3, GD2, GM2, 9-0-acetil GD3, fucosil GM1; en contra de antígenos de grupos sanguíneos y sus precursores; en contra de antígenos sobre la musina de epitelio polimórfico, en contra de antígenos sobre proteínas de choque térmico Además, éstos incluyen anticuerpos dirigidos en contra de estructuras de membrana de células de leucemia. Un gran número de anticuerpos monoclonales de este tipo ya han sido descritos para procedimientos de diagnóstico y terapéuticos (revisiones en Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. , 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cáncer Invest. 9, 69 (1991)) . Dependiendo del tipo de leucemia, los ligandos adecuados son, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo que enlazan antígeno de los mismos dirigidos en contra de los siguientes antígenos de membrana: Células Antígeno de membrana AML CD13 CD15 CD33 CAMAL Sialosil-Le B-CLL CD5 CDlc CD23 Idiotipos e isotipos de las inmunoglobulinas de membrana T-CLL CD33 M38 Receptores IL-2 Receptores de células T ALL CALLA CD19 Linfoma no-Hondkin La humanización de anticuerpos de murino, y la preparación y optimización de los genes para Fab y rec. Los fragmentos Fv se llevan a cabo conforme a la técnica conocida por la persona experta en la técnica (Winter et al., Nature 349, 293 (1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. I munol . 28, 1379 (1991) o Huston et al., Intern. Rev. lmmunol . _10, 195 (1993)). La fusión de los fragmentos rec. Fv con el componente b) y/o componentes c) se lleva a cabo usando la técnica anterior conocida por la persona experta en la técnica por expresión ^^^gjj¡^3£^ de un gen que codifica para la proteína fusionada, a.6) Efectores: inductores de inflamación, por ejemplo IL-1 IL-2 RANTES (MCP-2) monocito quimiotáctico y factor activador (MCAF) IL-8 proteína-1 inflamatoria de macrófago (MlP-la, ß) proteína-2 activadora de neutrófilo (NAP-2) - IL-3 IL-5 factor inhibitorio de leucemia humana (LIF) IL-7 IL-11 - IL-13 GM-CSF G-CSF M-CSF factor de veneno de cobra (CVF) o subsecuencias de CVF que corresponden funcionalmente al factor de complemento humano C3b, es decir que puede enlazarse al factor B de complemento y, después del desdoblamiento por el factor D, son una convertasa C3 el factor C3 de complemento humano o su sebsecuencia C3b ^^jjm^^j productos de desdoblamiento del factor C3 de complemento humano, que son funcionalmente y estructuralmente similares a CVF proteínas bacterianas que activan el complemento o causan la inflamación, tales como, por ejemplo, porinas de Salmonella typhimurium, factores de aglutinación de Staphylococcus aureus, modulinas, particularmente de bacterias gram negativas, proteína de membrana externa principal de Legionellae o Haemophilus influenza tipo B o de Klebsiellae o moléculas M de Estreptococos del grupo G. a.7) Efectores: enzimas para la activación de precursores de citostáticos, por ejemplo para enzimas, que desdoblan sustancias preliminares inactivas (profármaco) en citostáticos activos (fármacos) . Sustancias de este tipo y los profármacos asociados y fármacos en cada caso han sido ya claramente descritos por Deonarain et al. (Br. J. Cáncer 70, 786 (1994)), Mullen (Pharmac. Ther. 63, 199 (1994) y Harris et al. (Gene Ther. 1 , 170 (1994)). Por ejemplo, puede usarse una de las siguientes enzimas : timidincinasa del virus de herpes simplex timidincinasa del virus varicella zoster nitroreductasa bacteriana ß-glucuronidasa bacteriana - ß-glucuronidasa vegetal de Sécale cereale ß-glucuronidasa humana carboxipeptidasa humana (CB) por ejemplo CB-A de la célula de mastocito, CB-B de la carboxipeptidasa de páncreas o bacteriana - ß-lactamasa bacteriana citosindeaminasa bacteriana catalasa o peroxidasa humana fosfatasa, en particular fosfatasa alcalina humana, fosfatasa de próstata acida humana o fosfatasa del tipo 5 acida oxidasa, en particular lisiloxidasa humana o D-aminooxidasa acida humana peroxidasa, en particular glutationperoxidasa humana, eosinofiloperoxidasa humana o peroxidasa de glándula tiroides humana galactosidasa b) Terapia de trastornos autoinmunes e inflamaciones b.l) Células Objetivo: - células de endotelio proliferante o macrófagos y/o linfocitos o células sinoviales b.2) Efectores para la terapia de alergias, por ejemplo IFNß - IFN? IL-10 anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en contra IL-4 receptores IL-4 solubles - IL-12 TGFß b.3) Efectores para prevenir el rechazo de órganos trasplantados, por ejemplo IL-10 - TGFß receptores IL-1 solubles receptores IL-2 solubles antagonistas del receptor IL-1 receptores IL-6 solubles - anticuerpos inmunosupresores o VH y VL que contienen fragmentos de los mismos o fragmentos VH y VL de los mismos conectados por medio de un enlazante. Los anticuerpos inmunosupresores son, por ejemplo, anticuerpos específicos para el receptor de célula T o su complejo CD3, en contra de CD4 o CD8, además en contra del receptor IL-2, receptor IL-1 o receptor IL-4 o en contra de las moléculas de adhesión CD2, LFA-1, CD28 o CD40. b.4) Efectores para la terapia de trastornos autoinmunes mediados por anticuerpos, por ejemplo - TGFß IFNa IFNß IFN? IL-12 - receptores IL-4 solubles receptores 1-6 solubles anticuerpos inmunosupresores o sus fragmentos que contienen VH y VL b.5) Efectores para la terapia de trastornos autoinmunes mediados por células, por ejemplo IL-6 IL-9 IL-10 IL-13 - TNFa o TNFß IL-13 un anticuerpo inmunosupresor o sus fragmentos que contienen VH y VL b.6) Efectores: Inhibidores de la proliferación celular, proteínas citostáticas o citotóxicas y enzimas para la activación de precursores de citostáticos Ejemplos de proteínas de este tipo han sido mencionados ya en la sección a.7) . b.7) Efectores para la terapia de artritis Dentro del significado de la invención, se seleccionan efectores que inhiben directa o indirectamente la inflamación, por ejemplo, en la articulación, o promueven la reconstitución de la matriz extracelular (cartílago, tejido conectivo) en la articulación. Estos incluyen, por ejemplo antagonista del receptor IL-1 (IL-l-RA); IL-l-RA inhibe el enlace de IL-la, ß receptor IL-1 soluble; El receptor IL-1 soluble enlaza e inactiva IL-1 - IL-6 IL-6 incrementa la secreción de TIMP y superóxidos y disminuye la secreción de IL-1 y TNFa por células sinoviales y condrocitos receptor TNF soluble - el receptor TNF soluble enlaza e inactiva TNF. IL-4 IL-4 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa y MMP IL-10 IL-10 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa y MMP e incrementa la secreción de TIMP factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1) IGF-1 estimula la síntesis de matriz extracelular TGFß, especialmente TGFßl y TGFß2 TGFß estimula la síntesis de matriz extracelular. »-&* *» dismutasa superóxido TIMP, especialmente TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-3, c) Terapia para formación deficiente de células de la sangre c.l) Células objetivo: células inmaduras proliferantes del sistema hematogénico o células del estroma adyacentes a las células hematogénicas . c.2) Efectores para la terapia de anemia, por ejemplo eritropoyetina c.3) Efectores para la terapia de leucopenia, por ejemplo G-CSF - GM-CSF M-CSF c.4) Efectores para la terapia de trombocitopenia, por ej emp1o IL-3 - factor inhibitorio de leucemia (LIF) IL-11 trombopoyetina d) Terapia para daño del sistema nervioso d.l) Células objetivo: células glia o células de endotelio proliferantes d.2) Efectores: factores de crecimiento neuronal, por ejemplo FGF - factor de crecimiento del nervio (NGF) factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) neurotrofin-3 (NT-3) neurotrofin-4 (NT-4) factor neurotrófico ciliar (CNTF) d.3) Efectores: enzimas, por ejemplo tirosin hidroxilasa dopa decarboxilasa d.4) Efectores: citocinas y sus inhibidores que inhiben o neutralizan la acción neurotóxica de TNFa, por ejemplo - TGFSß receptores TNF solubles receptores TNF que neutralizan TNFa IL-10 IL-10 inhibe la formación de IFN?, TNFa, IL-2 e IL-4 receptores IL-1 solubles receptor I IL-1 receptor II IL-1 receptores IL-1 solubles que neutralizan la actividad de IL-1 antagonista de receptor IL-1 receptores IL-6 solubles e) Terapia de trastornos de coagulación de la sangre y sistema de circulación sanguíneo e.l) Células objetivo: células de endotelio o células de endotelio proliferantes o células somáticas en la vecindad de células de endotelio y células de músculo liso o macrófagos e.2) Estructuras objetivo: proteínas del sistema de coagulación sanguínea tales como, por ejemplo trombina - fibrina e.3) Efectores para inhibir la coagulación o para promover la fibrinolisis, por ejemplo activador de plasminógeno de tejido (tPA) activador de plásminógeno tipo urocinasa (uPA) - híbridos de tPA y uPA proteína C hirudina inhibidores de serina proteinasa (serpinas), tales como, por ejemplo, inhibidores C-1S, al-antitripsina o antitrombina III inhibidor de ruta del factor de tejido (TFPI) e.4) Efectores para promover coagulación, por ejemplo F VIII F IX - factor de von Willebrand F XIII PAI-1 PAI-2 factor de tejido y fragmentos del mismo e.5) Efectores: factores de angiogénesis, por ejemplo VEGF FGF T?e-1 Tie-2 e.ß) Efectores para disminuir la presión sanguínea, por ej emplo calicreina óxido nítrico sintasa de célula de endotelio e.7) Efectores por inhibir la proliferación de células del músculo liso después de heridas de la capa de endotelio, por ej emplo un antiproliferativo, proteína citostática o citotóxica o una enzima para el desdoblamiento de precursores de citostáticos en citostáticos como ya se mencionaron anteriormente (la sección a.7) e.8) Efectores: proteínas de plasma sanguíneo adicionales, por ejemplo, inactivador Cl - colinesterasa de suero transferrina 1-antitripsina f) Vacunaciones f.l) Células objetivo: células de músculo o macrófagos y/o linfocitos f.2) Efectores para la profilaxis de trastornos infecciosos Las posibilidades para preparar vacunas eficaces en una forma convencional son restringidas. El efector que va a ser seleccionado es una proteína, glicoproteína o lipoproteína formada a partir del patógeno infeccioso, que conduce a la neutralización y/o a la eliminación del patógeno al disparar una reacción inmune, es decir por enlace de anticuerpo y/o por medio de los linfocitos T citotóxicos. Los así llamados antígenos de neutralización de este tipo ya han sido usados como antígenos para vacuna (véase revisión en Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992) ) . Preferiblemente, dentro del significado de la invención se emplean antígenos de neutralización de los siguientes patógenos: virus de influenza A HIV - virus de la rabia HSV (virus de herpes simplex) RSV (virus del sincitio respiratorio) virus de parainfluenza rotavirus - VZV (virus de varicela zoster) CMV (citomegalovirus) virus del sarampión HPV (virus de papiloma humano) HBV (virus de hepatitis B) - HCV (virus de hepatitis C) HDV (virus de hepatitis D) HEV (virus de hepatitis E) HAV (virus de hepatitis A) Antígeno de Vibrio cholera - Borrelia burgdorferi Helicobacter pylori antígeno de malaria Los efectores dentro del significado de la invención, sin embargo, también incluyen un anticuerpo antiidiotipo o sus fragmentos que enlazan antígeno cuyas estructuras que enlazan antígeno (las regiones que determinan complementaridad) son copias de la estructura de proteína o carbohidrato del antígeno de neutralización del patógeno infeccioso . Los anticuerpos antiidiotipo de este tipo pueden reemplazar particularmente antígenos de carbohidratos en patógenos bacterianos infecciosos . Los anticuerpos antiidiotípicos de este tipo y sus productos de desdoblamiento se han descrito claramente por Hawkins et al. (J. Immunother. 14_, 273 (1993)) y Westerink and Apicella (Springer Seminars m Immunopathol . 1_5, 227 (1993) ) . f.3) Efectores: antígenos de tumor Estos incluyen antígenos sobre células de tumor. Los antígenos de este tipo han sido claramente descritos, por ejemplo, por Sedlacek et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) y Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, Munich (1992) ) . Ejemplos adicionales son los antígenos siguientes o, para anticuerpos antiidiotipo, corresponde a los siguientes antígenos: sialil-Lewis péptidos sobre tumores, que se reconocen por células T - proteínas expresadas por oncogenes antígenos de grupos sanguíneos y sus precursores antígenos sobre la mucina de epitelio polimórfico antígenos sobre proteínas de choque térmico g) la terapia de enfermedades infecciosas crónicas g.l) Célula objetivo: célula de hígado linfocito y/o macrófago célula de epitelio - célula de endotelio g.2) Efectores, por ejemplo una proteína que tiene acciones citostáticas, apoptóticas o citotóxicas una enzima que desdobla un precursor de una sustancia antiviral o citotóxica dentro de la sustancia activa . g.3) Efectores: proteínas antivirales citocinas y factores de crecimiento antiviralmente activos. Estos incluyen, por ejemplo IFNa, IFNß, IFN?, TNFß, TNFa, IL-1 o TGFß anticuerpos de una especificidad que inactiva el virus respectivo o produce sus fragmentos que contiene VH y VL o sus fragmentos VH y VL conectados por medio de un enlazante como ya se describió. Anticuerpos en contra de antígeno de virus son, por e emplo : anti-HBV anti-HCV anti-HSV anti-HPV anti-HIV anti-EBV anti-HTLV antivirus-Coxsackie antivirus Hantaan una proteína que enlaza Rev. Estas proteínas se enlazan al Rev ARN e inhiben etapas postranscripcionales dependientes de Rev de expresión del gen de retrovirus. Ejemplos de proteínas que enlazan Rev son: RBP9-27 RBP1-8U RBP1-8D pseudogenes de RBPl-8 g.4) Efectores: proteínas antibacterianas Las proteínas antibacterians incluyen, por ejemplo, anticuerpos que neutralizan toxinas bacterianas o bacteria opsonize. Por ejemplo, éstas incluyen anticuerpos en contra de Meningococci C o B E. coli Borrelia Pseudomonas Helicobacter pylori Staphilococcus aureus h) Combinación de efectores idénticos o diferentes Dentro del significado de la invención, dos diferentes componentes d) son preferidos, que tienen al menos una acción aditiva, para formar complejo entre sí por medio de los componentes b) y e). Dentro del significado de la invención, se prefieren combinaciones de efectores, por ejemplo, para h.l) la terapia de tumores proteínas idénticas o diferentes, citostáticas, apoptóticas, citotóxicas y/o que estimulan la inflamación o enzimas idénticas o diferentes para el desdoblamiento del precursor de un citostático h.2) la terapia de enfermedades autoinmunes diferentes citocinas o receptores que tienen la acción sinergística para inhibir la reacción inmune celular y/o humoral o TIMPs diferentes o idénticas h.3) la terapia para formación defectuosa de células de la sangre diferentes, citocinas jerárquicamente consecutivas, tales como, por ejemplo, IL-1, IL-3, IL-6 o GM-CSF y eritropoyetina, G-CSF o trombopoyetina h.4) la terapia para daño de células nerviosas un factor de crecimiento neuronal y una citosina o el inhibidor de una citosina h.5) la terapia para trastornos de la coagulación de la sangre y sistema de circulación sanguíneo un antitrombótico y un fibrinolítico (Por ejemplo, tPA o uPA) o una proteína citostática, apoptótica o citotóxica y un antitrombótico o un fibrinolítico varios factores de coagulación de la sangre que actúan sinergísticamente, diferentes por ejemplo F-VIII y vWF o F VIII y F IX h.6) vacunaciones - un antígeno y una citocina inmunoestimulate, tal como, por ejemplo, receptor IL-la, IL-ß, IL-2, GM-CSF, IL-3 o IL-4 diferentes antígenos de un patógeno infeccioso o diferentes patógenos infecciosos o - diferentes antígenos de un tipo de tumor o diferentes tipos de tumor h.7) terapia de enfermedades infecciosas virales una proteína antiviral y una proteína citostática, apoptótica o citotóxica - anticuerpos en contra de diferentes antígenos de superficie de un virus o diversos virus h.8) terapia de enfermedades infecciosas bacterianas los anticuerpos en contra de los antígenos de la superficie diferentes y/o toxinas de un microorganismo 4. Ligando multifunción para vectores virales y no virales para terapia de gen Los ligandos multifuncionales ya han sido descritos en detalle en la solicitud de patente EP-A 0 846 772. Se hace referencia expresamente a esta solicitud de patente. En el caso de uso como un ligando multifuncional, un componente a) se selecciona el cual se dirige en contra de una estructura objetivo celular. Ejemplos de ligandos (componente a) específicos para estructuras objetivos celulares ya han sido mencionados en la sección 3) . En un ligando multifuncional, el efector (componente d) se selecciona de tal forma que se enlaza a un vector viral o a un vector no viral. Efectores de este tipo son, por ejemplo: - un receptor celular para un virus, tal como, por ejemplo, para AdV, AAV, un lentivirus, un RTV, virus vaccinia, HSV, virus de influenza, HJV un anticuerpo recombinante específico para una proteína de virus, para un vector no viral o para un ácido nucleico, tal como, por ejemplo, un IgG, F(ab)2, Fab, rec.

Fv, diacuerpo o cadena sencilla, proteína que enlaza doble antígeno un péptido que tiene un grupo reactivo para conjugación con una proteína de virus - un péptido que tiene afinidad de enlace para una secuencia de ácido nucleico definida Preferiblemente, el componente d) es una molécula de anticuerpo completa o un fragmentos que enlaza epítope de un anticuerpo humano Los anticuerpos monoclonales de murino se emplean preferiblemente en forma humanizada. La humanización se lleva a cabo en la forma presentada por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) y Hoogenboom et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Los fragmentos de anticuerpo y los fragmentos de Fv recombinantes se preparan conforme a la técnica anterior, y como ya se describió. Ya sea que se use un fragmento bivalente o uno monovalente, es dependiente de la selección de la especificidad de anticuerpo y de la construcción del gen. Si el anticuerpo seleccionado afecta adversamente la actividad de fusión de la proteína de recubrimiento de una construcción del gen viral (como se describe, por ejemplo, por Ubol et al.

(J. Virol. 69 1990 (1995)), se prefiere un fragmento de anticuerpo monovalente. La especificidad del anticuerpo depende del tipo de construcción del gen usado. Si la construcción del gen es un ARN desnudo o un ADN desnudo por sí mismo o como un complejo con un portador no viral, una de las modalidades conforme a la invención de esta invención es que esta especificidad del anticuerpo se dirige en contra de aquellos epítopes que han sido introducidos dentro del ADN. Epítopes de este tipo pueden producirse por enlace de sustancias genogénicas al ADN. Ejemplos de éstos son * reticulamientos del ADN por cisplatina * alquilación sobre el N7 de guanina por agentes alquilantes tales como nitrógeno mostaza, melfalano, clorambucilo * intercalación dentro de la doble hélice de ADN de antraciclinas tales como doxorubicina, daunomicina Anticuerpos monoclonales en contra de epítopes recientemente introducidos sobre el ADN de este tipo son, por ej emplo : anticuerpos en contra de ADN metilado - anticuerpos en contra de Od-etil desoxiguanosina (después del tratamiento del ADN con etilnitrosourea) anticuerpos en contra de N -etilguanina anticuerpos en contra de N5-metil-N5-formil-2 , 5, 6-triamino-4-hidroxipirimidina - anticuerpos en contra de 06-metil-2'- desoxiguanosina 0 -etil-2 ' -desoxiguanosina 0 -n-butil-2 ' -desoxiguanosina 0 -isopropil-2 ' -desoxiguanosina 0 -metil-2 ' -desoxitimidina 0 -etil-2 ' -desoxitimidina anticuerpos en contra de aductos de melfalano con ADN anticuerpos en contra de antraciclinas También resultan nuevos epítopes en el ADN, sin embargo, debido a la metilación del ADN durante el curso del metabolismo de ADN. Se sabe de un número de cepas de E. coli que metilan el ADN de los plásmidos introducidos dentro de ellos sobre el N6 de adenina (Winnacker, From Genes to Clones, page 18/19, VCH Publisher, Weinheim (1987)). Las bacterias tienen la enzima ADN-adenina metilasa, que específicamente metila adenina sobre la posición N5 durante la replicación (Hattman et al., J. Mol. Biol. 126, 367 (1978)). Esta invención se refiere así particularmente al uso de los anticuerpos monoclonales en contra de ADN metilado - en particular en contra del N6 metilado de adenina - en el sistema ligando conforme a la invención. Si la construcción del gen es un complejo con un portador no viral, una modalidad particular adicional de esta invención es que la especificidad del anticuerpo se dirige en contra de un epítope sobre el portador. Estos portadores incluyen polímeros catiónicos, péptidos, proteínas, poliamidas o lípidos catiónicos, tales como, por ejemplo, lípidos catiónicos y fosfolípidos.

Ejemplos de anticuerpos en contra de portadores de este tipo son * anticuerpos en contra de espermidina, espermina o putresina * anticuerpos en contra de polilisina * anticuerpos en contra de albúmina * anticuerpos en contra de fosfolípido * anticuerpos en contra de polietilenimina Si la construcción del gen es un virus, la especificidad del anticuerpo se dirige en contra de uno o más epítopes idénticos o diferentes sobre la proteína de recubrimiento del virus. Puesto que el enlazante en el sistema ligando usado es preferiblemente un péptido fusogénico o proteína, también pueden usarse anticuerpos que afecten adversamente la adhesión celular y/o la actividad fusiogénica del virus al enlazarse a la proteína de recubrimiento . Los anticuerpos - en contra de las proteínas de recubrimiento de los virus que pueden usarse como vectores son, por ejemplo, anticuerpos en contra de * virus de leucemia de murmo * virus HIV * adenovirus * virus de herpes simplex * citomegalovirus * virus diminuto de ratones * virus adenoasociado * virus Sindbis * virus vaccinia En una modalidad adicionalmente preferida de la invención, el componente d) es la porción celular de un receptor Fc . Un de los anticuerpos ya mencionados, que se enlaza directamente o indirectamente a la construcción del gen con su porción que enlaza antígeno, se enlaza a este receptor Fc por medio de su porción Fc . En una modalidad adicionalmente preferida, el componente d) es una unidad estructural catiónica tal como, por ejemplo, un aminoácido catiónico, un péptido o proteína catiónica o una amina biogénica, que puede formar complejo con la construcción del gen. Estas unidades estructurales catiónicas incluyen, por ejemplo: - lisina o polilisina - arginina o poliarginina - histidina o polihistidina - péptidos que comprenden al menos una lisina, una arginina y/o una histidina - poliaminas tales como, por ejemplo, cadaverina, espermidina, espermina, agmatina o putrescina. En una modalidad adicionalmente preferida, el componente d) es el receptor para la proteína de recubrimiento del virus que alberga el transgen. Los receptores de este tipo han sido descritos, por ejemplo, para los siguientes virus: - HIV * la molécula CD4 (soluble o nativa) * galactosilceramida * receptores para quimiocinas - HBV * el receptor IL-6 * anexina o apolipoproteína - HTLV * el receptor IL-2 (la cadena ß y la ?) - virus del sarampión * la molécula CD46 - virus de leucemia amiga * el receptor de eritropoyetina - varicela zoster * el fragmento Fc de inmunoglobulina G - Virus Sendai * glicoforina - Virus de influenza C * ácido N-acetil-9-acetamida-9-desoxineura- mínico * ácido 9-0-acetil-N-acetilneuramínico - Virus de enfermedad de pie y boca * integrina aVß3 - EBV * receptor 2 de complemento (CD21) - Virus de herpes simplex * el receptor de manosa-6-fosfato de 275 kDa o el receptor de manosa-6-fosfato de 46 kDa - Virus adenoviral * CAR (receptor de adenovirus coxsackie) 5. Inserción de un péptido fusogénico o de un péptido de translocalización . En el caso de complejos de proteína multivalentes en los cuales el efector (componente d) tiene que penetrar intracelularmente para actuar profilácticamente o terapéuticamente o el cual, como un ligando multifuncional, es para insertar un vector dentro del citoplasma de una célula, debe unirse un péptido fusogénico al efector. Este péptido fusogénico puede insertarse entre los componentes c) y d) o unirse al componente d) . Los péptidos fusogénicos incluyen, por ejemplo: - péptidos que comprenden el dominio de translocación (dominio II) de la exotoxina A de Pseudomonas. péptidos que comprenden el péptido GLFEALLELLESLWELLLEA (SEC DE IDENT. NO.: 1) péptidos que comprenden el péptido AALAEA[LAEA]4LAAAAGC (SEC DE IDENT. NO.: 2) péptidos que comprenden el péptido FAGV-VLAGAALGVAAAAQI (SEC DE IDENT. NO.: 3) de la proteína fusionada del virus de sarampión. péptidos que comprenden el péptido GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG (SEC DE IDENT. NO.: 4) de la proteína HA2 de influenza A péptidos que comprenden el péptido GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (SEC DE IDENT. NO.: 5) o el péptido GLFGAIAGFIE ¡SEC DE IDENT. NO. : 6) ALFGAIAGFIE ;SEC DE IDENT. NO. : 7) LFLGAIAGFIE ¡SEC DE IDENT. NO. : 8) LLLGAIAGFIE ;SEC DE IDENT. NO. : 9) LILGAIAGFIE (SEC DE IDENT. NO. : 10) GIFGAIAGFIE (SEC DE IDENT. NO . : 11) GLLGAIAGFIE (SEC DE IDENT. NO . : 12) GLFAAIAGFIE (SEC DE IDENT. NO. : 13) GLFEAIAGFIE ¡SEC DE IDENT. NO. : 14) GLFGAMAGFIE 'SEC DE IDENT. NO. : 15) GLFGAIAGLIE; (SEC DE IDENT. NO.: 16) GLFGAIAGFIV; (SEC DE IDENT. NO.: 17) GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG (SEC DE IDENT. NO.: 18) o GLLEALAELLEGGWEGLLEG (SEC DE IDENT. NO.: 19). En el contexto de la presente invención se usan adicionalmente proteínas de virus que tengan propiedades fusogénicas . Un número de virus tienen proteínas de recubrimiento fusogénicas y/o translocantes, por ejemplo para paramixovirus, retrovirus y virus de herpes. Estos incluyen, por ejemplo, la proteína TAT de HIV su secuencia de aminoácidos translocalizantes o la proteína VP22 de HSV. Un número de virus tienen adicionalmente glicoproteínas que son responsables de la unión del virus y subsecuentemente de la fusión de la membrana celular (Gaudin et al., J. Gen. Viro. 76, 1541 (1995)). Las proteínas de este tipo se forman, por ejemplo, de alfa-, rabdo- y ortomixovirus. Las proteínas fusogénicas virales dentro del significado de la invención se han descrito claramente por Hughson (Curr. Biol. 5, 265(1995)), Hoekstra (J.

Bioenergetics Biomembranes 22_ 675 (1990)), y White (Ann. Rev.

Physiol. 5_2, 675 (1990) ) . Las proteínas fusogénicas dentro del significado de esta invención son, por ejemplo: - la hemaglutinina de los virus de influenza A o B, en particular el componente HA2. - la proteína M2 de los virus de influenza A empleados por sí mismos o en combinación con la hemaglutinina del virus influenza o con mutantes de neuraminidasa de influenza A, que carecen de actividad enzimática, pero que realizan hemaglutinación. - análogos péptidicos de la hemaglutinina del virus influenza [lacuna] 6. Inserción de secuencias de desdoblamiento por proteasas. La invención se refiere adicionalmente a complejos de proteína multifuncionales que, entre los componentes a) y b) o entre los componentes c) y d) , tienen una secuencia péptidica que es capaz de desdoblarse por proteasa. Por medio de estas proteasas, el efector puede desdoblarse del ligando (componente a) o del ligando y las proteínas mutadas [componente a), b) y e)] y, por ejemplo, pueden presentar su acción en forma libre en el sitio de la concentración de los complejos de proteína multivalente. La invención se refiere en particular a secuencias de desdoblamiento que se desdoblan por proteasas que se forman en tumores o por células de tumor o por células inflamatorias. Ejemplos de secuencias de desdoblamiento para las enzimas - activador de plasminógeno - antígeno específico para próstata - catepsina - estromelicina - colagenasa y - plasminógeno se enlistan en la solicitud de patente EP-A 0 859 058, a la cual se hace referencia expresamente. La invención se refiere adicionalmente a complejos de proteína multivalente que tienen secuencias de desdoblamiento que se desdoblan por proteasas que se forman por virus. Ejemplos de secuencias de desdoblamiento para enzimas de retrovirus, virus de polio, virus de influenza, virus de Epstein-Barr, virus de herpes simplex, virus de hepatitis, virus de viruela, citomegalovirus y virus del dengue se enlistan en la solicitud de patente Alemana DE 198 50987.1 (no publicada) a la cual se hace referencia expresamente . La invención se refiere adicionalmente a complejos de proteína multivalente que tienen secuencias de desdoblamiento que se desdoblan por proteasas que pueden liberarse en la célula. Ejemplos de proteasas de este tipo son, por ejemplo, caspasas tales como caspasas 1,2,3,4,5,6,7,8 y 9.

Las secuencias de desdoblamiento asociadas se enlistan en la solicitud de patente DE 198 50987.1 (no publicada), a la cual se hace referencia expresamente. 7. Factores de transcripción sintéticos para controlar la expresión de genes. Se han descrito promotores responsivos activadores descritos en la solicitud de patente EP-A 0 805 209. En esta invención, se hace referencia expresamente a esta invención. Estos promotores responsivos a activador son activados por un factor de transcripción sintético, que en principio consiste de dos subunidades de activador, las subunidad A y la subunidad B. Ambas subunidades contienen proteínas de enlace (A, B) . En la EP-A 0 805 209, se seleccionaron proteínas de enlace (A, B) que forman naturalmente el complejo AB, de tal forma que la subunidad A se une a la subunidad B para dar un complejo de factor de transcripción funcional. La invención se refiere ahora a factores de transcripción sintéticos para promotores responsivos a activador, en los cuales las proteínas de enlace A+B son proteínas de enlace mutadas. En la forma más simple, este complejo de factor de transcripción sintético consiste de los siguientes componentes : Componente a) al menos un ligando para un asociado de reacción = dominio de activación.

Componente b) una proteína de enlace mutada tal que se enlaza exclusivamente al componente c) . Componente c) una proteína de enlace mutada tal 5 que se enlaza exclusivamente al componente b) . Componente d) al menos un efector = un dominio de enlace ADN. La invención se refiere adicionalmente a 0 construcciones de ácido nucleico que codifican para un complejo de factor de transcripción conforme a esta invención. La expresión de esta construcción de ácido nucleico está en ésta bajo el control de promotores tales como los enlistados en la solicitud de patente EP-A 0 805 209, a la cual se hace referencia expresamente. 8. Sistemas analíticos y de diagnóstico novedosos. La invención se refiere a proteínas que forman complejo novedosas para sistemas analíticos o de diagnóstico para el análisis cualitativo o cuantitativo o diagnóstico de un reactante . En tales sistemas de diagnóstico el componente a) es al menos un ligando que entra dentro de un enlace específico con el reactante al ser analizado. Este ligando está directa o indirectamente enlazado por al menos una í ¡¡tíi¡m£^^^^^ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^&¡2£££^— proteína de enlace mutada [componentes b)l-b)n], tal que resulta el componente ab . Además al menos una proteína de enlace mutada [componente c)l-c)n], que puede dimerizarse con el componente b) por medio de al menos dos sitios de enlace se enlaza al menos a un efector (componente c) , en donde éste efector es una sustancia que emite señales (analito) . El componente cd resulta de la combinación del componente b) con el componente c) . El componente ab se enlaza por medio de a) al reactante. Por medio de la formación de complejo del componente ab con el componente be, la cantidad de reactante al cual el componente ab se enlaza por medio del componente a) puede determinarse. Este sistema de diagnóstico puede, por ejemplo, usarse en las dos modalidades mostradas (véase Figuras 1 y 2) : En la primera modalidad (véase Figura 1), el componente b) es un homo- (o hetero) multímero [componente b) 1-b)n], al cual se enlazan muchos idénticos (o diferentes) componentes c) , en cada caso como monómeros y en cada caso enlazados al componente d) . Usando esta modalidad, muchos componentes que emiten señales [analitosv componente d) ] se enlazan al reactante al ser analizados, lo cual incrementa la sensibilidad del sistema.

En la segunda modalidad (véase Figura 2) el componente b) y el componente c) son multímeros, enlazándose solamente uno o unos cuantos componentes d) al componente c) . Con esta modalidad, aunque solamente unos cuantos componentes d) se enlazan al reactante al ser analizado, el enlace entre los componentes c) y d) es extremadamente fuerte, lo cual puede incrementar la especificidad de la detección de reactante al ser analizado. En una modalidad particular adicional de la invención, los componentes c) [ci-cn] se enlazan al menos un componente adicional b [b?~bn] , al cual puede dimerizar al menos un componente cd adicional. Un ejemplo de esto se muestra en la Figura lb. Esta modalidad particular incrementa las sensibilidad del sistema de prueba considerablemente. Con el auxilio de este sistema analítico de diagnóstico conforme a la invención, puede determinarse un reactante en o sobre una fase sólida, en un fluido por ejemplo en un fluido corporal, sobre células y en tejidos. Conforme a la invención, el componente a) puede ser : una secuencia de nucleótido. Si una secuencia de nucleótidos se selecciona, ésta será derivatizada terminalmente [por ejemplo conforme a WO95/02422 o por inserción de una secuencia de enlace por una ^•__!_. proteína de enlace a nucleótido (tal como, por ejemplo, para LexA, Gal4 o para un factor de transcripción) o para un anticuerpo tal que el componente b) pueda acoplarse directa o indirectamente por medio de un proteína que enlaza nucleótidos o por medio de una porción de enlace a antígeno de un anticuerpo, un ligando para un receptor celular una proteína de recubrimiento de virus - un receptor celular para una proteína de recubrimiento de virus . un receptor celular para un factor de crecimiento, una citosina, una quimiocina, una hormona peptídica, un mediador o un esteroide. - una proteína que se enlaza a una proteína asociada y con esos toma parte en una cadena de reacción biológica, por ejemplo un factor de complemento, un factor de coagulación, un factor del sistema cinina o del sistema de fibrinolisis o un inhibidor enzimático plasmático o celular o una enzima plasmática o celular. la porción extracelular de un receptor Fc, al cual se enlaza un anticuerpo específico para una célula objetivo por medio de su porción Fc . - una molécula de anticuerpo o la porción que enlaza epítope de una molécula de anticuerpo de murino o humano . Los fragmentos de anticuerpos recombinantes se preparan como ya se mencionó en la sección 3) . En un sistema analítico o de diagnóstico conforme a la invención, el componente que emite señales, el analito (componente d) , por ejemplo, puede ser una molécula fluorescente, una molécula que causa una reacción quimioluminicente, una enzima, tal como, por ejemplo, una fosfatasa o peroxidasa para el desdoblamiento de un sustrato que va a ser medido, un isótopo o un metal. Con el auxilio del sistema analítico y de diagnóstico conforme a la invención, un reactante al ser determinado se mezcla con un exceso del componente. La fracción del componente ab no enlazado al reactante para determinarse se elimina, por ejemplo, por lavado. Subsecuentemente, el componente enlazado al reactante se trata con un exceso de componente cd, la fracción del componente be no enlazado al componente ab se elimina, por ejemplo por lavado, y el componente d) enlazado al reactante por medio de los componentes ab y c) se determina.

Ejemplos para clarificar el objeto de la invención. Preparación y prueba de una unidad de promotor resposivo a activador.

Se preparó una unidad de promotor responsivo activador en la cual una subunidad A activadora se enlaza a una subunidad B de activador (véase Figura 3) . La combinación se lleva a cabo por medio de c-jn mutada y c-fos mutada (véase Figura 4) . El complejo es un factor de transcripción que activa un promotor responsivo activador. Esta unidad de promotor responsivo activador conforme a la invención consiste, hacia el extremo 3' en sucesión, de las siguientes secuencias de nucleótidos diferentes: Subunidad A de activador: el promotor del gen ciclina A (ácidos nucleicos-214 a + 100; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995)). la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (SV40 grande T, aminoácidos 126-132; PKKKRKV (SEC. DE IDENT. NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991) ) . el dominio de transactivación ácido (TAD) de HSV-1 VP16 (VP16, aminoácidos 411 a 455; Triezenberg et al., Genes Dev. 2, 718 (1988)). el ADNc para la parte de zipper de leucina de la proteína c-jun (aminoácidos 276 a 312; Mark et al., Nature 373, 257 -(1995)) en la cual los aminoácidos 283, 288, y 302 se mutan ( -jun) .

Descripción de las mutaciones (Figura 2): Aminoácidos 283 K - E Aminoácidos 288 K ? E Aminoácidos 302 R —>• E Subunidad B de activador: el promotor del gen tirocinasa (2X la secuencia de mejorador, ácidos nucleicos -2014 a -1820 y los ácidos nucleicos promotores nucleares -209 a +51; Shibata et al., J. Biol: Chem. 267, 20584 (1992)). - la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (SV40 grande T, aminoácidos 126-132; PKKKRKV (SEC. DE IDENT. NO.: 20), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991) ) . el ADNc para el dominio que enlaza ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147, Chasman und Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1990)). el ADNc para la parte de zipper de leucina de la proteína c-fos (aminoácidos 160 a 196; Mark et al., Nature 373, 257 (1995) ) en la cual los aminoácidos 167, 172 y 181 se mutan (m-fos) .

Descripción de las mutaciones (Figura 2) : Aminoácidos 167 E —» K Aminoácidos 172 E -» K Aminoácidos 181 E ? K Dimerización de c-fos mutada con c-jun mutada. Los productos de expresión de las subunidades A y B de activador se dimerizan por enlace del zipper de leucina de c-fos mutada al zipper de leucina de c-jun mutada. La dimerización de las subunidades A y B de activador, es decir el enlace del zipper de leucina c-fos mutada al zipper de leucina c-jun mutada se probó como sigue: Las proteínas se sintetizaron en un sistema de traducción in vitro (sistema de transcripción/traducción de acoplado rápido TNT T7, Promega, Madison, Wl) con o sin metionina- ( S35) . Subsecuentemente, las proteínas sintetizadas (m-jun-VP16 y m-fos-Gal4) se mezclaron en la proporción de 1:1 y el complejo se separó por electroforesis en gel y, después de inmunoprecipitación, se analizó con un anticuerpo anti-GAL4. Se obtuvieron los siguientes resultados: la proteína m-jun VP16 puede enlazarse a la proteína m-fos-GAL4. la proteína m-jun-VP16 no puede enlazarse a la proteína wt-fos-GAL4 y la proteína wt-jun-VP16 no puede enlazarse a la proteína m-fosGAL4 (véase Tabla 1) . La proteína dimérica es un factor de transcripción quimérico para el promotor responsivo a activador 10x(Gal4-SV40) .

El promotor resposivo activador y el sistema efector . El promotor resposivo activador tiene la siguiente composición : - lOx la secuencia de enlace para la proteína de enlace Gal4 que tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3' (Webster et al., Cell 52, 169 (1988); SEC. DE IDENT. NO.: 21). el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Tooze (Ed) . DNA Tumor Viruses (Col Spring Harbor, New York, Col Spring Harbor Laboratory) ) . el ADNc para el gen reportero luciferasa (Luc) (Nordeen, BioTechniques 6, 454 (1988)). El orden de las secuencias de nucleótidos y sus unidades de activación se muestra en la Figura 5. La construcción de nucleótidos preparada en esta forma se clona dentro del vector plásmido pGL3 (Promega; Madison, USA) el cual se emplea directamente o en sistemas de dispersión coloidal para una aplicación in vivo. El funcionamiento de la unidad de promotor responsivo activador completo es como sigue: El promotor ciclina A regula, en una forma específica del ciclo celular, la transcripción de los ADNcs combinados para el dominio de activación de VP16 y el zipper de lucina mutado de c-jun (subunidad A de activación) ( Figura 3) . El promotor tirocinasa restringue la transcripción de los ADNcs para el dominio de enlaces Gal4, el NLS de SV40 y el zipper de leucina mutada de c-fos sobre células de melanoma (subunidad B de activación) (Figura 3). La proteína dimérica es un factor de transcripción quimérico para el promotor responsivo activador (secuencia de ADN para el dominio de enlace Gal4 /promotor SV40) y para la transcripción del gen efector (= gen reportero = gen luciferasa) (Figura 5).

La preparación de la construcción. El enlace de los constituyentes individuales de la construcción e inserción dentro de un plásmido (pGL3, Promega, Madison Wi USA) (Figura 6) se lleva a cabo por medio de sitios de restricción adecuados que se incluyen sobre los términos de los diversos elementos por medio de amplificación PCR. El enlace se lleva a cabo con el auxilio de enzimas que son específicas para los sitios de restricción y conocidas por la persona experta en la técnica y ADN ligasas. Estas enzimas pueden obtenerse comercialmente. Usando los plásmidos descritos, las células de tumor mantenidas en cultivo (MeWo: células de melanoma humano, PC3 : células de próstata humana) se transfectan usando el método DOTAP conocido por la persona experta en la técnica (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y la cantidad de luciferasa producida de las células se mide (Herber et al., Oncogene 9, 1295 (1994); Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) y Jeróme et al., Hum. Gen. Ther., in print (1998) ) . Para comprobar la especificidad del ciclo celular, las células de tumor se sincronizan en G0/G1 durante 48 horas por retiro de metionina. La incorporación de BrdU muestra que las células MeWo y PC3 pueden sincronizarse después del retiro de metionina (Jeróme et al., Hum. Gen. Ther., in press (1998) ) .

Resultados Se obtienen los siguientes resultados: en las células transfectadas, puede determinarse un distinto incremento en la luciferasa en comparación con las células de tumor no transfectadas (Tablas 2 y 3) . Proliferantes MeWo (ADN>2S) forman distintamente más luciferasa que las células de tumor (ADN=2S) sincronizadas en G0/G1 y que las células PC3 proliferantes (Tablas 2 y 3) . Las subunidades A y B de activador, que contienen zipper de leucina mutada, -no pueden enlazarse a las c-fos y c-jun endógenas (Tabla 2) . Las subunidades A y B de activador, que contienen zipper de leucina mutada, son más activas que el sistema con CD4 y LCK (Tabla 2) descrito en detalle en la solicitud de patente EP-A 0 805 209, debido al fuerte enlace del zipper de leucina c-fos mutado al zipper de leucina c-jun mutado. Así, la unidad del promotor responsivo activador conduce a una expresión dependiente del ciclo celular, específico de la célula del gen luciferasa (Tabla 4).

Resultados Adicionales con el sistema Fos/jun. La actividad de proteína que forma complejo novedosa en xenotransplantes de melanoma y carsinoma de pulmón . Los xenotransplantes de melanoma se incorporaron dentro de ratones desnudos por inyección intradérmica de 106 células de MeWo. Se incorporaron xenotransplantes de carcinoma de pulmón dentro de ratones desnudos por inyección subcutánea de 2.107 células de H322 (H3 22, carcinoma broncoalveolar, humano ATCC No. CRL 5806) . Cuando los xenotransplantes alcanzaron un tamaño de 4 mm, se coinyectaron intratumoralmente con la siguiente combinación de plásmido en una solución portadora de 5% de glucosa, 0.01% de Tritón X100.

Combinación de plásmido: 6 ng del vector pRL-SV40 (Promega Incorporated) + 30 µg del vector promotor pGL3 (Promega Incorporated) . 6 ng del vector pRL-SV40 (Promega Incorporated) + 15 µg de 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 µg del Tyr-m- fos-CycA-VP16. 6 ng del vector pRL-SV40 (Promega Incorporated) + 15 µg de 10 x BS Gal4-SV40-luc + 15 µg de Tyr-m- fos-CycA-VP16-m-jun. Todos estos plásmidos se aislaron usando el endolibre QIAGEN plasmid Maxi Kit (QIAGEN Inc.). El vector pRL-SV40 se usó como un control interno para estandarizar los resultados de los diversos xenotransplantes . 24 horas después de la inyección se sacrificaron los ratones, los tumores se disectaron y se molieron mecánicamente, y se midió la actividad de luciferasa en el lisado con el auxilio del sistema de prueba del gen reportero luciferasa dual (Promega Incorporated) . Los resultados se indicaron como la proporción de la actividad de luciferasa luciérnaga a la actividad pRL-SV40 y traducido a la concentración de proteína.

Resultados (ver Tabla 5) : 1. En ambos tipos de xenotransplantes, los xenotransplantes de melanoma y el de carcinoma de pulmón, el promotor expresado constitutivamente SV40 (construcción de promotor pGL3) conduce a la detección de la actividad de luciferasa luciérnaga. 2. En ambos tipos de xenotransplante, no se encontró actividad de luciferasa luciérnaga después de la inyección de 15 µg de lOxBS Gal4-SV40-luc + 15 µg de Tyr-m- fos-CycA-VP16. 3. La actividad de luciferasa luciérnaga se encontró solamente en xenotransplantes de melanoma después de la inyección de 15 µg de lOxBS Gal4-SV40-luc + 15 µg de Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun . Esto muestra que el sistema fos-jun realiza una expresión selectiva de la actividad de luciferasa en el xenotransplante de melanona. La expresión de un gen efector, que se controla por el sistema fos/jun, tiene un efecto biológico. Para el análisis de la capacidad del sistema fos/jun para causar una acción biológica, el gen reportero luciferasa se reemplazó por Bax ADNc (Oltvai et al., 1993) . Para ser capaces de analizar las células transfectadas, las células se cotransfectaron con CMV-luc. Una gran cantidad de luciferasa se expresó constitutivamente, lo cual es fácilmente medible usando una prueba de luciferasa, de manera que el porcentaje de las células transfectadas sobrevivientes puede calcularse.

Las líneas de células MeWo (melanoma humano) y H322 (carcinoma de pulmón broncoalveolar) se transfectaron, como se describe por el fabricante, con lipofectina (Gibco BRL Inc.) o DOTAP (Boehringer Mannheim Inc.). Las células se cotransfectaron con los siguientes plásmidos: pCDNA3 (Invitrogen Inc.; control): 1 ng de CMV-luc + 1 µg de Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 µg de pCDNA3 CMV-bax (Bax ADNc, clonado en pCDNA3) : 1 ng de CMV-luc + 1 µg de Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 µg de CMV-bax pBax (control) : 1 ng de CMV-luc + 1 µg de Tyr-m-fos-CycA-VP16 + 1 µg de pBax lOxBS Gal4-SV40-bax: 1 ng de CMV-luc + 1 µg de Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun + 1 µg de lOxBS Gal4-SV40-bax Los valores de luciferasa medidos en el caso de la cotransfección con pCDNA3 y pBax (plásmidos control que no expresaron Bax ADNc) se supusieron ser 100% de sobrevivencia de las células transfectadas. 48 horas después de la transfección, las células se recolectaron y se midió la actividad de luciferasa.

Resultados (ver Tabla 6) 1. Si el Bax ADNc se controló por el promotor CMV constitutivo, el porcentaje de las células transfectadas sobrevivientes en ambos tipos de células disminuyó, a 9-10% en MeWo y en 32-36% en las células H322. >_Bt^aa?M 2. Si el Bax ADNc se controló por el promotor lOxBS Gal4-SV40, el porcentaje de las células transfectadas sobrevivientes fue 100% si las células MeWo se cotransfectaron con el plásmido control (Tyr-m-fos-CycA-VPlß) y disminuyó a 36% si Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-j un se usó. En las células H 322, en ambos casos el porcentaje de las células transfectadas sobrevivientes fue 100%. Estos resultados muestran que la activación del sistema fos-jun en melanomas es suficiente para causar un efecto biológico (destrucción celular) que no se encuentra en células sin melanoma. La expresión selectiva del sistema fos-jun en melanomas después de la transferencia del adenovirus. Los casetes de transcripción Tyr-m-fos-CycA-VPlß, Tyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun y el lOxBS Gal4-SV40-luc se clonaron en un adenovirus suprimido de E1/E3 humano (serotipo 5) por medio de recombinación bacteriana, como se describe por He et al. , (1998) . Las células MeWo y H322 se coinfectaron durante 6 horas ya sea con AdTyr-m-fos-CycA-VP16+Adl0xBS Gal4-SV40-luc o con AdTyr-m-fos-CycA-VP16-m-jun+Adl0xBS Gal4 -SV40-luc, y la actividad- de luciferasa se midió 48 horas después de la infección. Se compararon las actividades en ambas líneas de células con los resultados que se obtuvieron con AdSV40-luc (adenovirus suprimido de E1/E3 humano (serotipo 5) usando un promotor SV40 (-138/+45), D.M. Nettelbeck, datos no publicados ) . Resultados (véase Tabla 7): En ambas líneas de células, la coinfección con el adenovirus control (AdTyr-m-fos-CycA-VP16) conduce a una débil expresión de la actividad de luciferasa, mientras que una alta actividad, que fue 70 veces AdSV40-luc, se encontró solamente en células MeWo después de la infección con AdTyr-m-fos-CycA-VP16m-jun . La expresión selectiva del sistema fos-jun en melanomas se mantiene después de la transferencia del sistema fos-jun a un vector adenovirus. Títulos de las Figuras: Figura 1: (a) representación esquemática de las proteínas que forman complejo novedosas, posibilidad 1. (b) variante de la posibilidad 1 Figura 2 : Representación esquemática de las proteínas que forman complejo novedosas, posibilidad 2. Figura 3: Unidades A y B del promotor responsivo a activador conforme a los ejemplos. Figura 4: Mutaciones de c-jun y c-fos conforme a los ej emplos . Figura 5: El promotor responsivo activador y el gen efector .

Figura 6: Construcciones de ácido nucleico para la expresión de las proteínas que forman complejo conforme a la invención .

Tabla 1 Interacción proteína-proteína después de inmunoprecipitación Tabla 2 Actividades de luciferasa en células MeWo Tabla 3 Actividades de luciferasa en células PC3 Tabla 4 Expresión dependiente del ciclo celular, específico para célula del gel luciferasa Tabla 5 Actividades de luciferasa en xenotransplantes de melanoma y carcinoma de pulmón Para desviación estándar n=5 Tabla 6 Porcentaje de células transfectadas sobrevivientes en células MeWo y H322. Todas las células se cotransfectaron usando 1 ng de CMV-luc como un marcador de las células transfectadas.

Tabla 7 Expresión de gen selectiva en melanomas después de transferencia de adenovirus

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un complejo de proteínas que forman complejo específicamente que no ocurre naturalmente, en donde los siguientes componentes están contenidos en el complejo: a) al menos un ligando específico para una estructura objetivo b) al menos una proteína que comprende un dominio de dimerización mutado, habiendo sido derivado el dominio de dimerización mutado por mutación de un dominio de dimerización que ocurre naturalmente, siendo posible para este dominio de dimerización mutado interactuar específicamente con el componente c) y el componente b) siendo unido covalentemente al componente a), c) al menos una proteína que comprende un dominio de dimerización mutado, habiendo sido derivado el dominio de dimerización mutado por mutación de un dominio de dimerización que ocurre naturalmente, siendo posible para este dominio de dimerización mutado interactuar específicamente con el componente b) y el componente c) siendo unido covalentemente al componente d) , y d) al menos un efector.

2. El complejo como se reclama en la reivindicación 1, en donde el componente a) se reemplaza por el componente d) .

3. El complejo como se reclama en la reivindicación 1, en donde el componente d) se reemplaza por el componente a) .

4. El complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 3, que contiene adicionalmente un péptido fusogénico o un péptido de translocalización .

5. El complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene una secuencia de desdoblamiento para una proteasa entre los componentes c) y d) o a) y b) .

6. El complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ligando (componente a) ) se selecciona de un grupo que comprende un factor de crecimiento, una citocina, TNF, una quimiocina, una hormona peptídica, un mediador, una hormona esteroide, una vitamina, un factor de complemento, un factor de coagulación, un factor del sistema cinina o del sistema de fibrinólisis, una enzima plasmática o celular, un inhibidor enzimático plasmático o celular, una proteína de recubrimiento de virus, un receptor de célula para una de las proteínas y compuestos activos mencionados de antemano, un anticuerpo, un producto de desdoblamiento de anticuerpo tal como F(ab)2, Fv de cadena sencilla, una molécula que enlaza doble antígeno, de cadena sencilla, un fragmento de Fc, una proteína que enlaza ADN, el dominio que enlaza ADN dé un factor de transcripción y el dominio de activación de un factor de transcripción.

7. El complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los componentes d) y c) se derivan de proteínas que se combinan naturalmente entre sí.

8. El complejo como se reclama en la reivindicación 7, caracterizado porque las proteínas que se combinan naturalmente entre sí se seleccionan de un grupo de asociados de dimerización naturales que comprenden: Fos Jun o Jun B o Jun D FRAU-1 Jun o Jun B o Jun D FRAU-2 Jun o Jun B o Jun D FOS-B Jun o Jun B o Jun D OCT-1 Jun o Jun B o Jun D NFKB (p65) IKB Ras RAF CD4 p56LcK bcl-2 bad o bax Cyclin A cdkl E2F DP CD40 CD40L Myc Max Myc N Max Myc L Max pl05 (Rbl) AFF-2, ElA pl07 (Rb2) E7, E2F o Myc pl30 E7, E2F o Myc CBL Gag TRP TRP Met Met Myb p67 o plßO VAV p67 o plßO APC a- o ß-Catenina APC APC Receptor VD h- (retinoide x-receptor ) RXR a o ß receptor T3 HRXR a o ß MyoD E12 E12 Id E47 Id HHSP90 receptor de progesterona HHSP90 receptor de glucocorticoide HHSP90 receptor de mineralocorticoide HHSP90 receptor de dioxina Receptor de dioxina Arnt HPS90 FKBP59 HSP90 Proteína que enlaza Ciclosporina HPS90 Pp60v"src HSP70 factor 1 de choque térmico HSFl HSP70 factor 2 de choque térmico HSF2

9. El complejo como se reclama en la reivindicación 8, en donde porque las proteínas que se combinan naturalmente entre sí pertenecen a la familia de hélice-búcle-hélice/zipper leucina.

10. El complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 7 a 9, en donde las mutaciones de los dominios de dimerización de los componentes b) y c) se llevan a cabo por la introducción de - 3-18 cisteínas en los dominios de dimerización que ocurren naturalmente subyacentes en cada caso; 3-24 aminoácidos básicos en uno de los dominios de dimerización que ocurren naturalmente subyacentes en cada caso y de 3-24 aminoácidos ácidos en el otro de los dominios de dimerización que ocurren naturalmente subyacente en cada caso; 3-24 aminoácidos hidrofóbicos en uno de los dominios de dimerización que ocurren naturalmente subyacentes en cada caso y de 3-24 aminoácidos aromáticos en el otro de los dominios de dimerización que ocurren naturalmente subyacentes en cada caso; y/o 3-24 aminoácidos aromáticos en uno de los dominios de dimerización que ocurren naturalmente subyacentes en cada caso y de 3-24 aminoácidos aromáticos en el otro de los dominios de dimerización que ocurren naturalmente subyacentes en cada caso.

11. El complejo como se reclama en la reivindicación 10, en el cual los componentes b) y c) son los dominios de enlace mutados de c-fos y c-jun, estando presentes las siguientes mutaciones: c-fos aminoácido 167E?K 172E?K 181E?K c-jun aminoácido 283K?E 288K?E 302K?E

12. El complejo como se reclama en una de las reivindicaciones precedentes, en donde el componente d) se selecciona del grupo que comprende inhibidores de proliferación celular, proteínas que inducen apoptosis, proteínas citoestáticas o citotóxicas, factores que inducen coagulación, factores que inducen angiogénesis, factores que inhiben angiogénesis, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, interleucinas, interferones, factores de complemento, factores de coagulación, proteínas que inducen fibrinolisis, hormonas peptídicas, mediadores, proteínas bacterianas, receptores (para factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, interleucinas, interferones, factores de complemento, factores de coagulación, proteínas que inducen fibrinolisis, hormonas peptídicas, hormonas esteroide, mediadores o proteínas de recubrimiento de virus) , antígenos virales, antígenos parasitarios, antígenos de tumor, autoantígenos, antígenos de tejido, moléculas de adhesión, anticuerpos o productos de desdoblamiento de anticuerpos, tales como F(ab)2, Fab, Fv de cadena sencilla, proteínas que enlazan doble antígeno de cadena sencilla, enzimas para hacer reaccionar un componente que emite señales, enzimas para convertir un precursor de una sustancia activa en una sustancia activa, tintes fluorescentes, isótopos, proteínas que enlazan metal, un dominio que enlaza ADN.

13. El uso de un complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 12, para la producción de un terapéutico para el tratamiento de inflamación, enfermedades autoinmunes, formación defectuosa de células de la sangre, daño al sistema nervioso, trastornos de la coagulación de la sangre y sistema de circulación sanguíneo, tumores, infecciones bacterianas y virales y para la producción de una vacuna .

14. El uso de un complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 12, para formar complejo con un vector viral o no viral y para la introducción específica a la célula objetivo de este vector dentro de la célula de un organismo o un cultivo de células.

15. El uso de un complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 12, para la detección de un reactante in vitro o in vivo.

16. La construcción de ácido nucleico que codifica para una proteína como se reclama en las reivindicaciones 1 a 12.

17. La construcción de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 16, que codifica para las subunidades de activador de una unidad de promotor responsivo a activador.

18. La célula huésped que comprende una construcción de ácido nucleico como se reclama en la reivindicación 16 ó 17. 5

19. La célula huésped como se reclama en la reivindicación 18, seleccionada de un grupo que comprende una bacteria, una levadura y una célula de mamífero.

20. El uso de una célula huésped como se reclama en una de las reivindicaciones 18 y 19 para la preparación de 10 los complejos como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 12.

21. La preparación de un complejo como se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde (a) una proteína del complejo como se reclama en 15 una de las reivindicaciones 1 a 12, se expresa con el auxilio de una construcción de ácido nucleico como se reclama en una de las reivindicaciones 16 y 17, (b) una proteína adicional, que es diferente de la proteína descrita bajo (a), del complejo como se reclama en 20 una de las reivindicaciones 1 a 12 se expresa con el auxilio de una construcción de ácido nucleico como se reclama en una de las reivindicaciones 16 y 17. (c) las proteínas de las etapas (a) y (b) se aislan y 25 (d) forman complejo entre sí. «_£_1i_-