DE19900681A1

DE19900681A1 - Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE19900681A1
Application number: DE19900681A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Demmer; Dietmar Nussbaumer
Original assignee: Sartorius AG
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 1999-01-04
Filing date: 1999-01-04
Publication date: 2000-07-06
Anticipated expiration: 2019-01-05
Also published as: DE19900681B4; US6235892B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen mittels Membranen, durch das eine nachhaltige Reduzierung des Endotoxingehaltes erreicht wird. Das Verfahren ist für kleine und große Volumina geeignet und mit einem geringen zeitlichen und apparativen Aufwand durchführbar. Es kann sowohl im Labor- als auch im technischen Maßstab angewendet werden. DOLLAR A Es wurde gefunden, daß bei der Filtration einer wässrige Nukleinsäure enthaltenden Lösung durch eine schwach basische Anionenaustauschermembran hindurch sowohl Nukleinsäuren als auch Endotoxine an die Membran gebunden werden, und daß bei anschließender Passage einer Neutralsalzlösung hoher Ionenstärke nur die Nukleinsäuren eluiert werden, während zumindest der überwiegende Anteil der Endotoxine an der Membran verhaften bleibt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren mittels Membranen.

Durch die zunehmende Verwendung von Nukleinsäuren in der Tier- und Humanmedizin, wie zum Beispiel der Gentherapie besteht die Notwendigkeit zur Bereitstellung dieser Stoffe in großer Reinheit. Der Begriff "Nukleinsäuren" soll als Sammelbegriff verstanden werden, der mindestens Nukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren (DNS), Ribonukleinsäuren (RNS), antisense DNS, Nukleinsäuren mit modifizierten Basen oder modifizierter Struktur umfaßt. Besonders in den Fällen, wo die Nukleinsäuren in gramnegativen Bakterien wie Escherichia coli amplifiziert werden und bei ihrer Gewinnung Bruchstücke von Bakterienzellwänden nicht vollständig abgetrennt werden, besteht die Möglichkeit der Verschleppung von Endotoxinen bis hin zu formulierten Lösungen. Das Einbringen von Endotoxinen in den Patienten muß vermieden werden, denn am Menschen und Versuchstier verursachen Endotoxine beispielsweise Fieber, Leukopenie, entzündliche Gefäßveränderungen, eine Aktivierung der Blutgerinnung und des Komplement- und Immunsystems.

Aus der EP 0 853 123 A1 ist ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren in wässrigen Lösungen bekannt, bei dem die Nukleinsäure enthaltende und mit Endotoxinen verunreinigte Lösung tangential über Ultrafiltrationsmembranen mit Ausschlußgrenzen von 1 bis 1000 Kilodalton geströmt wird. Dabei sollen die Nukleinsäuremoleküle die Membran auf Grund ihrer Molekülgröße nicht passieren und Substanzen mit einem geringeren Molekulargewicht, wie Endotoxine, durch die Membran hindurchtreten oder/und an der Membran adsorbiert werden. Nachteilig ist der hohe apparative und zeitliche Aufwand, der durch die verhältnismäßig geringen, mit Ultrafiltrationsmembranen erreichbaren Filtrationsgeschwindigkeiten bedingt ist, sowie die Verwendung großer Volumina, wodurch das Verfahren für Laboranwendungen häufig ungeeignet ist. Ungünstig ist weiterhin die rasche Verblockung von Ultrafiltrationsmembranen, die vor allem durch gelöste Proteine hervorgerufen wird.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein einfach durchzuführendes Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen mittels Membranen bereit zu stellen, durch das eine nachhaltige Reduzierung des Endotoxingehaltes erreicht wird. Das Verfahren soll für kleine und große Volumina geeignet sein und mit einem geringen zeitlichen und apparativen Aufwand durchführbar sein.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem eine die Nukleinsäuren enthaltende wässrige Ausgangslösung, die mit Endotoxinen verunreinigt ist, durch mindestens eine Lage einer mikroporösen schwach basischen Anionenaustauschermembran hindurchfiltriert wird, um die Nukleinsäuren an der Anionenaustauschermembran zu binden. Partikel, die größer sind, als die Poren der Anionenaustauschermembran, werden von der Passage durch die Membranen hindurch ausgeschlossen und werden auf der äußeren Oberfläche der Membranlage zurückgehalten. Danach werden die gebundenen Nukleinsäuren mit einer gepufferten Neutralsalzlösung, die eine höhere Ionenstärke als die Ausgangslösung aufweist, von der Anionenaustauschermembran eluiert, wobei eine im wesentlichen endotoxinfreie Nukleinsäure-Lösung erhalten wird. Wahlweise kann dem Elutionsschritt ein Waschschritt mit einem Puffer geringerer Ionenstärke vorangestellt werden, um Verunreinigungen, die sich in der Porenflüssigkeit befinden oder an der Anionenaustauschermembrane schwach gebunden sind, wie zum Beispiel Proteine, abzutrennen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die wässrige Ausgangslösung auf einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 9,5 und eine Ionenstärke von bis zu 0,1 mol/l und der Puffer auf einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 9,5 und eine Ionenstärke im Bereich von 0,5 bis 3 mol/l des Neutralsalzes eingestellt. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der die wässrige Ausgangslösung auf den pH-Wert von etwa 8 und die Ionenstärke auf etwa 0,01 mol/l und der Puffer auf den pH-Wert etwa 5,5 und die Ionenstärke auf etwa 1 bis 2, vorzugsweise auf 0,7 mol/l mit Natriumchloridionen eingestellt werden.

Zur Erhöhung der Filtrationssicherheit und der Reinigungskapazität können mehr als eine Lage der Membran verwendet werden, beispielsweise in Form eines Stapels wie in U.S. Patent 5,618,418 beschrieben oder eines Wickels wie in DE-OS 197 11 083 beschrieben. Die Membranen können aber auch in Form ein- oder mehrlagiger plissierter Membranfilterkerzen eingesetzt werden, wie sie beispielsweise bei der Sterilfiltration gebräuchlich sind.

Als Anionenaustauschermembran kommen mikroporöse Membranen in Frage, die schwach basische Austauschergruppen besitzen. Diese können primäre, sekundäre oder tertiäre Amine darstellen, die entweder einzeln oder in Kombination miteinander an der Membrane fixiert sind. Bevorzugt sind solche Anionenaustauschermembranen, die überwiegend oder ausschließlich tertiäre aliphatische Amine als Austauschergruppen besitzen, wobei mindestens eine der Alkylgruppen 2-5 Kohlenstoffatome aufweist und bei 3 und mehr Kohlenstoffatomen verzweigt oder unverzweigt sein kann. Besonders bevorzugt ist ein tertiäres Amin, das zwei Ethylgruppen aufweist. Bevorzugt werden Membranen im Porengrößenbereich zwischen 0,01 bis 30 µm, besonders bevorzugt im Bereich zwischen 0,1 bis 8 µm. Die erfindungsgemäß eingesetzten Membranen sind somit nicht zu verwechseln mit Anionenaustauschermembranen, wie sie beispielweise in der Elektrodialyse eingesetzt werden und deren Porendimensionen unterhalb des angegebenen Bereiches liegen. Derartige Anionenaustauschermembranen sind beispielsweise nach Verfahren erhältlich, die in den EP-B1 0 538 315 und EP- B1 0 527 992 beschrieben sind. Als Membranpolymere werden solche bevorzugt, die eine besonders niedrige unspezifische Adsorption aufweisen, wie beispielsweise Cellulose. Es kommen jedoch auch andere gebräuchliche Membranmaterialien in Frage wie beispielsweise die Polyamide, Polysulfone oder Polyvinylidenfluoride.

Bei Filtration einer wässrigen Lösung durch eine schwach basische Anionenaustauschermembran hindurch werden sowohl Nukleinsäuren als auch Endotoxine an die Membran gebunden. Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei anschließender Passage einer Neutralsalzlösung hoher Ionenstärke nur die Nukleinsäuren eluiert werden, während zumindest der überwiegende Anteil der Endotoxine an der Membrane haften bleibt. Dieser Effekt tritt nicht auf bei Verwendung stark basischer Anionenaustauschermembranen, wie zum Beispiel vom Typ SARTOBIND^TMQ (Sartorius AG). Die stark basischen Anionenaustauschermembranen binden zwar ebenfalls beide Substanzklassen, bei nachfolgender Passage einer Neutralsalzlösung hoher Ionenstärke werden aber neben den Nukleinsäuren auch die Endotoxine eluiert, so daß eine Reinigung von Nukleinsäuren mittels dieser Membranen nicht möglich ist. Andere poröse Membranen, die über keinerlei Austauschergruppen verfügen, kommen für eine Reinigung von Nukleinsäuren ebenfalls nicht in Frage. So adsorbiert beispielsweise eine Polypropylenmembran beide Substanzklassen, diese Adsorption ist aber irreversibel, so daß eine selektive Elution der einen oder anderen Substanzklasse nicht möglich ist.

Die Anionenaustauschermembranen im Mikrofiltrationsbereich weisen eine hohe Durchflußgeschwindigkeit auf, wodurch die Filtrationszeit gering gehalten werden kann. Die Verwendung der Anionenaustauschermembranen ermöglicht sowohl die Filtration kleiner Volumina, wie in den Ausführungsbeispielen gezeigt wird, als auch die Filtration großer Volumina, in denen die Nukleinsäuren in äußerst geringer Konzentration enthalten sind, denn die Nukleinsäuremoleküle werden bei der Filtration durch die Membran an diese gebunden und können anschließend mit relativ kleinen Flüssigkeitsvolumina von der Membran eluiert werden, wodurch ein Konzentrationseffekt um mehrere Größenordnungen erreicht wird. Stehen lediglich Mikromengen an Nukleinsäuren zur Verfügung, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, mit schwach basischen Anionenaustauschermembranen ausgerüstete Zentrifugenröhrchen als Trennvorrichtung zu verwenden. Eine derartige Vorrichtung wird beispielsweise unter der Bezeichnung Centribind® D vertrieben (Sartorius AG).

Unter Bindung der Nukleinsäuren an die Anionenaustauschermembranen soll eine reversible Bindung verstanden werden, die vermutlich vorwiegend über einen ionischen Mechanismus erfolgen dürfte. Die Bindung erfolgt dabei sowohl an der äußeren Oberfläche der Membran als auch an der inneren Oberfläche der Membranporen. Die Erfindung soll nun anhand der Beispiele näher erläutert werden.

In den Beispielen wird Endotoxin der Fa. Pyroquant, Charge 11717 eingesetzt und die quantitative Bestimmung erfolgt mit dem Limulus Amoebo-Lysat Test (LAL-Test) von Pyrogent, Ch. 2196, Empfindlichkeit 6 pg/ml.

Als Membranen werden schwach basische Anionenaustauschermembranen Sartobind®D und stark basische Anionaustauschermembranen Sartobind®Q der Sartorius AG, sowie eine Polypropylenmembran (PP) der nominellen Porenweite von 0,2 µm der Fa. AKZO Nobel AG, Bezeichnung 2EPPHF, Chargenbezeichnung 0884, verwendet.

Beispiel 1

Je 3 Membranen mit 25 mm Durchmesser der schwach basischen Anionaustauschermembran, der stark basischen Anionaustauschermembran und der Polypropylenmembran wurden jeweils in einen Edelstahlfilterhalter als Membranstapel eingelegt und mit 20 ml Wasser für Injektionszwecke (api) durchspült. Anschließend wurden 5 ml einer Ausgangslösung von 100 µg Desoxiribonukleinsäure (DNS) des Plasmids pSE 420 (Bestellnummer: E7772, der Fa. SIGMA Deisenhofen) und 3 µg/ml Endotoxin in einem Puffer der Zusammensetzung 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA (TE-Puffer) durch die Membranen hindurchfiltriert und ein Filtrat erhalten. Danach wurden 20 ml TE Puffer filtriert, um nicht gebundene Verunreinigungen aus den Membranen heraus zu waschen. Dann wurden 4 ml einer Lösung von 2 M NaCl in TE- Puffer filtriert, um ein Eluat zu erhalten.

Das Filtrat und das Eluat wurden reihenweise im Verhältnis 1 : 10 mit TE-Puffer verdünnt und mit dem LAL-Test auf Anwesenheit von Endotoxin geprüft.

Mit einem UV-Spektrophotometer wurde bei einer Wellenlänge von 260 nm (Absorptionsmaximum der DNS) die Konzentration der DNS im Filtrat und im Eluat ermittelt. Die aufgegebene Menge DNS wurde dabei als 100% gesetzt. Es wurden die in der Tabelle 1 angegebenen Werte erhalten, die Mittelwerte aus mindestens zwei Versuchen darstellen.

Tabelle 1

Bilanz der Bindung und Elution von DNA und Endotoxin

Beispiel 2

3 Membranen mit 25 mm Durchmesser der schwach basischen Anionaustauschermembran wurden in einen Edelstahlfilterhalter als Membranstapel eingelegt und mit 20 ml Wasser für Injektionszwecke (api) durchspült. Anschließend wurden 3 ml einer Ausgangslösung von 100 µg DNS des Plasmids pSE420 (Bestellnummer: E 7772 der Fa. SIGMA Deisenhofen) und von 3 µg/ml Endotoxin in einem Puffer der Zusammensetzung 10 mM Tris- HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA (TE-Puffer) durch die Membranen hindurchfiltriert und ein Filtrat erhalten. Danach wurden 20 ml TE Puffer filtriert, um nicht gebundene Verunreinigungen aus den Membranen heraus zu waschen. Dann wurden 4 ml einer Lösung von 2 M NaCl in 1 M Natriumacetat-Puffer vom pH 5,5 filtriert, um ein Eluat zu erhalten (Versuch 1, Tabelle 2).

Bei einem parallelen Versuch (Versuch 2, Tabelle 2) wurde mit einer Lösung von 2 M NaCl in 10 mM Natriumacetat-Puffer vom pH 5,5 eluiert. Die Filtrate und Eluate wurden reihenweise im Verhältnis 1 : 10 mit TE-Puffer verdünnt und mit dem LAL-Test auf Anwesenheit von Endotoxin geprüft.

Die Absorption der Filtrate bei der Wellenlänge 260 nm wurden in einem UV- Spektrophotometer ermittelt. Bei dieser Wellenlänge liegt ein Absorptionsmaximum der DNS. Die aufgegebene Menge DNS wurde zu 100% gesetzt.

Es wurden die in der Tabelle 2 angegebenen Werte erhalten, die Mittelwerte aus mindestens zwei Versuchen darstellen.

Tabelle 2

Bilanz der Bindung und Elution von DNA und Endotoxin

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren mittels Membranen, dadurch gekennzeichnet, daß
eine die Nukleinsäuren enthaltende wässrige Ausgangslösung durch mindestens eine Lage einer mikroporösen schwach basischen Anionenaustauschermembran hindurchfiltriert wird, um die Nukleinsäuren an der Anionenaustauschermembran zu binden und
die gebundenen Nukleinsäuren mit einer gepufferten Neutralsalzlösung, die eine höhere Ionenstärke als die Ausgangslösung aufweist, von der Anionenaustauschermembran eluiert werden, wobei eine im wesentlichen endotoxinfreie Nukleinsäure-Lösung erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die wässrige Ausgangslösung auf einen pH-Wert von 5 bis 9,5 und eine Ionenstärke von bis zu 0,1 mol/l und
der Puffer für die Elution auf einen pH-Wert von 5 bis 9,5 und eine Ionenstärke von 0,5 bis 3 mol/l des Neutralsalzes eingestellt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die wässrige Ausgangslösung vorzugsweise auf den pH-Wert 8 und die Ionenstärke 0,01 mol/l und
der Puffer für die Elution vorzugsweise auf den pH-Wert 5,5 und die Ionenstärke 1 bis 2 mol/l mit Natriumchloridionen eingestellt werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Ausgangslösung durch eine Anionenaustauschermembran filtriert wird, die vorzugsweise als schwach basische Austauschergruppe primäre, sekundäre oder tertiäre Amine enthält.