DE19860801A1

DE19860801A1 - Rekombinanter Wachstumsfaktor mit der biologischen Aktivität eines G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)

Info

Publication number: DE19860801A1
Application number: DE1998160801
Authority: DE
Inventors: Johannes Fischer; Peter Wernet; Gerd Gellissen; Ulrike Weydemann; Volker Jenzelewski; Michael Piontek; Alexander W Strasser
Original assignee: Rhein Biotech GmbH
Current assignee: Dynavax GmbH
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2000-07-06
Also published as: WO2000040727A3; AU2103800A; WO2000040727A2; AR016050A1

Abstract

Die Erfindung stellt Wachstumsfaktoren mit Granulozyten Kolonie-stimulierender Aktivität sowie Nukleinsäuremoleküle, die eine für diesen Wachstumsfaktor kodierende Sequenz umfassen, zur Verfügung. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Proteine oder Nukleinsäuren umfassen, und ihre therapeutische Verwendung. Die Wachstumsfaktoren besitzen Cytokinwirkung in unterschiedlicher Ausprägung und sind in der Lage, die Reifung von Blutzellen zu stimulieren. Daher ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Moleküle insbesondere zum Behandeln von Krankheiten und Verletzungen einzusetzen, die mit einem Mangel an Blutzellen in Zusammenhang stehen, wie z. B. Krebs, Leukämie, schwere Verbrennungen, opportunistische Infektionen und nach Knochenmarktransplantationen.

Description

Die Erfindung betrifft einen Wachstumsfaktor mit Granulozyten Kolonie-stimulierender Aktivität sowie ein Nukleinsäuremolekül, das eine für diesen Wachstumsfaktor kodieren de Sequenz umfaßt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors, pharmazeutische Zusammen setzungen, welche die erfindungsgemäßen Proteine oder Nukleinsäuren umfassen, und ihre therapeutische Verwendung.

Cytokine sind an der Reifung von Blutzellen beteiligt, indem sie die Reifung von Stamm zellen zu voll differenzierten Blutzellen stimulieren. Einer dieser Faktoren, der G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) wird in aktivierten Monozyten, Makrophagen und anderen Zellinien synthetisiert. Das Protein tritt in zwei verschiedenen natürlichen Formen mit einer Größe von 177 und 174 Aminosäuren auf (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986). Beide Proteine sind das Resultat der Expression eines einzigen Gens. Das Gen enthält fünf Exons und vier Intronsequenzen. Am 5'-Ende des zweiten Introns be finden sich zwei 9 Bp voneinander entfernte Spleiß-Donorsequenzen, die ein alternatives Spleißen ermöglichen. Die beiden natürlichen Proteinformen werden durch Translation der durch dieses alternative Spleißen des Primärtranskriptes entstandenen mRNAs er zeugt. Die längere Form unterscheidet sich von der kürzeren durch Einschub von 3 Ami nosäuren (Val-Ser-Glu) zwischen den Positionen 35 und 36. Beide Formen entstehen aus einer um 30 Aminosäuren längeren Vorstufe. Die relative Masse der kürzeren Form wurde mit 18,671 Da bestimmt (Nagata et al., 1986). Sie wird als Hauptsyntheseprodukt beschrieben, das eine zwanzigfach höhere Aktivität in bestimmten biologischen Tests aufweist als das längere Nebenprodukt (Nagata, 1989).

Das natürliche Protein enthält zwei Disulfidbrücken zwischen den Aminosäurepaaren Cys36 und Cys42 sowie Cys64 und Cys74. Der natürliche G-CSF enthält eine O-Glyko sylierung an Thr133. Die Glykosylierung hat keinen Einfluß auf die Aktivität und die Sta bilität des Proteins, wie Untersuchungen mit dem in Bakterien hergestellten Produkt und ein Vergleich mit natürlichen Isolaten belegen. Eine Beeinflussung der biologischen Ak tivität durch Veränderung N-terminaler Sequenzen des Cytokins ist nicht bekannt. Nach Kuga et al. behalten N-terminal um bis zu 11 Aminosäurereste verkürzte G-CSF Molekü le die volle biologische Aktivität, wohingegen z. B. C-terminale Verkürzungen der Grund sequenz die Aktivität herabsetzen bzw. variieren (Kuga et al., 1989).

G-CSF ist in der Lage, die Population neutrophiler Granulozyten in kurzer Zeit in vivo und ex vivo substantiell zu vergrößern. Das Protein ist daher eine Substanz mit vielfälti gen therapeutischen Applikationsmöglichkeiten. So kann G-CSF in der Krebsbehand lung eingesetzt werden, wenn die Zellen des Immunsystems z. B. durch eine Chemothe rapie zerstört wurden. Darüber hinaus kann G-CSF in der Knochenmarktransplantation, bei schwerwiegenden Verbrennungen, bei Leukämie oder bei opportunistischen Infektio nen aufgrund von Immundefizienzen eingesetzt werden (US-Patent 5,399,345). Zudem wird G-CSF zur Mobilisierung von Blutstammzellen aus dem Knochenmark oder einem anderen Stammzellreservoir in das periphere Blut eingesetzt. Mit G-CSF können Zellen der myeloischen Zellreihe zum klinischen Einsatz ex vivo expandiert werden.

Aufgrund der Vielzahl an verschiedenen Anwendungsgebieten für den Wachstumsfaktor G-CSF besteht daher ein Bedürfnis nach Varianten dieses Wachstumsfaktors, die sich durch eine höhere oder geringere biologische Aktivität als der natürliche G-CSF Wachs tumsfaktor auszeichnen, so daß je nach angestrebter Verwendung eine Variante des G- CSF Wachstumsfaktors mit geeigneter Aktivität eingesetzt werden kann. Der Terminus "Variante" bzw. "G-CSF-Variante" soll dabei Aminosäure- und Nukleinsäuremoleküle mit einer gegenüber der jeweiligen ursprünglichen Sequenz, z. B. der Humansequenz, ver änderten Aminosäure- bzw. Nukleinsäureabfolge beschreiben.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, rekombinante Varianten eines Pro teins mit der Aktivität des G-CSF Wachstumsfaktors zur Verfügung zu stellen, wobei jede dieser Varianten eine höhere oder geringere biologische Aktivität aufweisen soll als der natürliche G-CSF Wachstumsfaktor.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch einen rekombinanten Wachstumsfaktor ge löst, der ein Säuger-G-CSF oder ein dazu homologes Protein mit der biologischen Aktivi tät eines G-CSFs ist, und dem die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren des reifen G-CSF Proteins fehlen.

Unter "homologen Proteinen" sind solche Proteine zu verstehen, die eine Homologie von mindestens 60% zu einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäu resequenzen besitzen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Homologie 70 oder 80%, besonders bevorzugt 90 oder 95%. Am stärksten bevorzugt ist eine Homo logie von 98 oder 99%. Die Homologie wird dabei berechnet wie in Pearson und Lip man, 1988, dargestellt.

Der in der vorliegenden Erfindung beschriebene Wachstumsfaktor weist einen gegen über dem natürlichen G-CSF-Protein um zwei Aminosäuren verkürzten N-Terminus auf und besitzt vollkommen unerwartet eine deutlich höhere biologische Aktivität als der na türliche G-CSF-Wachstumsfaktor. Der Begriff "biologische Aktivität" des G-CSF Wachs tumsfaktors bezieht sich dabei auf die Fähigkeit, die Proliferation von Blutstammzellen zu stimulieren (Kuga et al., 1989). Diese können durch die Stimulation mit G-CSF und ande ren Faktoren zu Granulozyten expandiert und differenziert werden. Diese Differenzierung korreliert mit der Synthese des an der Zelloberfläche von myeloischen Vorläuferzellen lokalisierten CD34-Proteins. Daher eignet sich der Nachweis des CD34 Proteins als Maßstab für die Proliferationsfähigkeit der stimulierten Zellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Wachstumsfaktor ein reifer humaner, um die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren verkürzter Wachstums faktor.

Wie oben erwähnt, umfaßt der natürliche humane G-CSF Wachstumsfaktor zwei leicht unterschiedliche Aminosäuresequenzen. Dieser Unterschied ist für die erfindungsgemä ße, N-terminal verkürzte Ausführungsform ebenfalls beobachtet worden. Dabei hat die kürzere Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors in ihrer reifen Form 172 Aminosäuren, die längere Form enthält eine Insertion von drei Aminosäuren zwischen den Positionen 33 und 34. Für die Numerierung wird dabei die Aminosäure +3 des reifen Proteins als neue Aminosäure +1 zugrundegelegt. Beide Moleküle, sowohl das 172 als auch das 175 Aminosäuren umfassende Molekül, weisen einen identischen N-Terminus mit der N-terminalen Sequenz Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser auf, im Gegensatz zum N-Terminus der natürlichen Sequenz, die Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser lautet. Die Aminosäuresequenz kann dabei im Vergleich zu den natürlichen Proteinen weiter verändert werden, z. B. ein N-terminales Methionin enthalten; erfindungsgemäß fehlen jedoch stets die beiden Aminosäuren Thr/Pro am N-Terminus.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße rekombi nante Wachstumsfaktor ein N-terminales Methionin. Abhängig vom ausgewählten Wirtsorganismus, in dem der Wachstumsfaktor exprimiert wird, können spezifische Pro teasen das N-terminale Methionin, welches durch Translation des Initiationskodons ent steht, bei allen oder einem Teil der exprimierten Moleküle abspalten. Durch Einführung eines weiteren für Methionin kodierenden Codons in 3'-Position vom Initiationscodon kann jedoch ein reifes Protein erhalten werden, das auch nach der Prozessierung des N- Terminus ein N-terminales Methionin enthält.

Weiterhin umfaßt der rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungs form die in SEQ ID NR:1 ("174 (-2 AS) Variante"), SEQ ID NR: 2 ("177 (-2 AS) Variante"), SEQ ID NR:3 ("Met-174 (-2 AS) Variante") oder SEQ ID NR:4 ("Met-177 (-2 AS) Varian te") dargestellte Aminosäuresequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz. Die abgelei tete Sequenz unterscheidet sich durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäu reaustausch in einer oder mehreren Positionen von einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 gezeigten Sequenzen. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sich die abgeleitete Sequenz in 1 bis 5 Aminosäureresten von einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR: 4 gezeigten Sequenzen durch eine der erwähnten Mutationen unterscheidet; überaus be vorzugt ist es, wenn sich eine abgeleitete Sequenz in lediglich einem Aminosäurerest von einer der vorstehenden Sequenzen unterscheidet. Zur Modulation der Aktivität wird das Protein bevorzugt am C-Terminus verkürzt.

Die im folgenden verwendete Numerierung der Aminosäuren bezieht sich auf die in SEQ ID NR:1 dargestellte Sequenz und unterscheidet sich folglich um jeweils 2 Aminosäure positionen von der bekannten natürlichen Sequenz des humanen G-CSFs. Dabei ist jedoch grundsätzlich immer auch die um 3 Aminosäuren längere Spleiß-Variante (siehe SEQ ID Nr. 2) von SEQ ID Nr. 1 von der Erfindung mit umfaßt, ohne daß die Position des jeweiligen Aminosäurerestes oder der jeweiligen Region in der Sequenz für die Spleiß- Variante explizit noch einmal erwähnt wird.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen rekombinanten Wachstumsfaktors sind Wachstumsfaktoren, in denen ein oder mehrere der Histidinreste an den Positionen 41, 77, 154 und 168 durch eine andere natürliche Aminosäure, be vorzugt Glutamin (Gln), ersetzt sind. Des weiteren kann der erfindungsgemäße rekombi nante Wachstumsfaktor in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein oder mehrere Mutationen im Bereich der Aminosäuren 48 bis 54 tragen. Wie bereits in US-Patent 5,399,345 gezeigt, reduzieren Mutationen in diesen Aminosäu reresten die Aktivität des resultierenden Proteins. So führen die Kombinationen der ak tivitätssteigernden Mutationen unmittelbar am N-Terminus und der aktivitätsreduzieren den Mutationen in den oben angegebenen Positionen zu zahlreiche Varianten des G- CSF Wachstumsfaktors mit einer Vielzahl an unterschiedlichen biologischen Aktivitäten.

Darüber hinaus ist der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungsform posttranslational modifiziert. Eine solche posttranslationa le Modifikation umfaßt besonders bevorzugt die Abspaltung eines N-terminalen Methio nins und/oder die Glykosylierung des Wachstumsfaktors und weitere mögliche andere Modifikationen.

Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für einen wie oben beschriebenen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF kodieren. Dabei umfaßt ein solches Nukleinsäuremolekül Nukleinsäuresequenzen, die für ein Protein mit einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:4 dargestellten Aminosäuresequenzen kodieren und schließt insbesondere eine der in SEQ ID NR: 5 bis SEQ ID NR: 8 dargestellten Nuklein säuresequenzen ein, sowie Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleinsäureaustausch von einer dieser Nukleinsäuresequenzen ableiten und für ein Protein mit der biologi schen Aktivität eines G-CSF kodieren. Des weiteren sind ebenfalls Nukleinsäuresequen zen umfaßt, die mit einer zu den oben aufgezählten Sequenzen komplementären Se quenz hybridisieren können. Diese Varianten der Nukleinsäuremoleküle, die für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodieren, sollen unter Bedingungen moderater Stringenz, bevorzugt aber unter stringenten Bedingungen (siehe Maniatis et al., 1989) mit einer zu den in SEQ ID NR:5 bis SEQ ID NR:8 dargestellten Sequenzen komplemen tären Sequenz hybridisieren können. Unter moderater Stringenz ist z. B. eine Hybridisie rung bei 42°C in 50% Formamid und anschließenden wenig stringenten Waschschritten zu verstehen, wobei die Waschschritte bei einer Temperatur von weniger als 12°C bis 20°C unter der errechneten T_m des zu untersuchenden Hybridmoleküls durchgeführt werden. Stringente Bedingungen bedeuten eine Hybridisierung in 5 × SSC bei 65°C. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin jede zu den vorgenannten Sequenzen komple mentäre Sequenz, deren Gegenstrang für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSF's kodiert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül weiterhin für eine funktionelle Leader-Sequenz. Sekretorische Proteine werden aus einer Vorstufe prozessiert, die eine N-terminale Leader-Sequenz für den Import eines Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat enthält. Derar tige Leader-Sequenzen können aus Prä-Sequenzen oder Prä-Pro-Sequenzen bestehen.

Prä-Sequenzen dirigieren ein Translationsprodukt in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) und werden beim Eintritt in das ER proteolytisch entfernt. Bei Prä-Pro- Sequenzen erfolgt eine zweistufige Reifung des Proteins. Nach dem Eintritt in das ER wird wie im ersten Typus die Prä-Sequenz entfernt. Das verbleibende Pro-Protein erfährt im Golgi-Apparat der Zelle eine zusätzliche proteolytische Reifung, bei der die noch vor handene Pro-Sequenz mit Hilfe einer dibasischen Endopeptidase abgespalten wird. Mit Hilfe von Leader-Sequenzen, die diesen beiden Grundtypen entsprechen, können he terologe Proteine aus Wirtszellen sezerniert werden.

Ein besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung enthält als funktionel le Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des hyperglykämischen Crustaceen-Hormons (CHH) aus Carcinus maenas oder ein Derivat derselben. So konnte von Weydemann und Kollegen bereits gezeigt werden, daß die Fusion dieser Prä-Pro-Sequenz mit der für Hirudin kodierenden Sequenz zu einer effizienten Sezemierung des reifen Hirudinpro teins mir korrekt prozessiertem N-Terminus führt (Weydemann et al., 1995). Die Fusion der für die CHH-Leader-Sequenz kodierenden DNA mit einer der in den SEQ ID NR: 5 bsi 8 dargestellten Nukleinsäuresequenzen wird daher ebenfalls zur korrekten Abspal tung der CHH-Prä-Pro-Sequenz führen.

In einer überaus bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Nuklein säuremolekül als Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des Mating Factors α (MFα1) aus Hefe. Eine zur Expression in Hefewirtszellen etablierte Konstruktion kodiert für ein Fusionsprotein, welches die Präpro-Sequenz des Pheromons MFα1 enthält (Brake et al., 1984). Aminosäuren in der Umgebung der neu entstandenen Fusionsstelle können da bei die Position der Prozessierungstelle und damit die N-terminale Sequenz des durch Proteolyse entstandenen reifen Proteins beeinflussen. Von Bedeutung ist hierbei insbe sondere das Vorhandensein von Pro-Resten (Zurek et al., 1996).

Ein weiteres besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß es die natürliche MFα1 Sequenz in funktioneller Verbindung mit der für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierenden natürlichen Sequenz, einschließlich der Co dons für die beiden N-terminalen Aminosäuren von G-CSF, umfaßt. Dabei wird durch Verwendung der natürlichen MFα1-Sequenz ein primäres Translationsprodukt erzeugt, das aufgrund seiner Aminosäuresequenz im Bereich der Fusionsstelle zwischen MFα-1 Leader-Sequenz und der für den rekombinanten Wachstumsfaktor kodierenden Se quenz von einer Protease zwischen Aminosäure +2 und +3 der nicht verkürzten Ami nosäuresequenz des Wachstumsfaktor gespalten wird. Die Prozessierung des Translati onsproduktes führt entsprechend zu einer Verkürzung des N-Terminus um zwei Ami nosäuren. Der Vorteil der Nutzung eines geeigneten Sekretions-Leaders besteht damit neben der Einschleusung des Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat in der Generierung eines definierten N-Terminus in dem ausgewählten Organismus.

Ein solches bevorzugtes Nukleinsäuremolekül kodiert z.B für die hier in NR:1 oder SEQ ID NR:2 dargestellte Aminosäuresequenz. In weiteren Ausführungsformen umfaßt sie die in SEQ ID NR:9 ("natürlicher Leader + 174 × 3 Variante (incl. 6 Nu)") oder SEQ ID NR:10 ("natürlicher Leader + 177 × 3 Variante (incl. 6 Nu)") dargestellte Aminosäuresequenz oder eine sich davon durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch ableitende Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSFs kodiert. Weiterhin kann ein solches Nukleinsäure molekül eine Sequenz enthalten, die mit einer der zu den oben aufgeführten Nukleinsäu resequenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann bzw. zu einer der oben ge nannten Sequenzen komplementär ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine in der 3'-Region modifizierte MFα1 Se quenz und weiterhin die für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierende Sequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:5 oder SEQ ID NR:6 oder eine davon abgelei tete Sequenz bevorzugt ist. Um eine proteolytische Spaltung unmittelbar am C-Terminus des MFα-1-Peptids zu erzielen, muß die Aminosäuresequenz des MFα1 Leaders in der Nähe der Prozessierungsstelle verändert werden. Veränderungen dieser Art sind in frü heren MFαI/G-CSF Fusionen beschrieben (z. B. U.S. Patent 5,055,555). Dahingegen führt die Verwendung der unveränderten MFα1 Leader Sequenz wie oben beschrieben zur proteolytischen Spaltung zwischen den Aminosäuren +2 und +3 der Sequenz des vollständigen reifen Proteins, d. h. vor Position +1 eines erfindungsgemäßen Proteins.

Außerdem umfaßt die vorliegende Erfindung einen Vektor, der ein wie oben beschriebe nes Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon sowie einen damit funktionell ver bundenen Promotor und ein mit der Nukleinsäure funktionell verbundenes Terminati onssignal umfaßt.

Ein solcher Vektor enthält in einer bevorzugten Ausführungsform einen Promotor und ein Terminationssignal, die jeweils für eine vorgesehene Wirtszelle spezifisch sind. Dabei bedeutet spezifisch, daß der Promotor und das Terminationssignal aus dem für die Ex pression verwendeten Wirtsorganismus stammen. Ein beispielhafter Expressionsvektor für Hefe, wie der in der vorliegenden Erfindung genutzte, umfaßt eine Expressionskas sette mit den folgenden funktionellen Elementen in der angegebenen Reihenfolge:

- FMD-Promotor
- heterologe kodierende Sequenz
- MOX-Terminator

Die einzelnen Elemente eines solchen bevorzugten Vektors sind in der Literatur gut be schrieben, z. B. in Gellissen und Melber, 1996; Hollenberg und Gellissen, 1997.

Darüber hinaus enthält ein solcher Vektor Selektionssequenzen und eine HARS (Hansenula autonomously replicating sequence) für eine Propagierung und Selektion in einem geeigneten Hefewirt, einen bakteriellen Replikationsursprung und ein für ein Bak terium geeignetes Selektionsgen für die Vermehrung und Selektion z. B. in einem E.coli Wirt (Gellissen und Hollenberg, 1997; Hollenberg und Gellissen, 1997). Ein Expressions vektor für die erfindungsgemäße Produktion von G-CSF wurde mit Hilfe von allgemein bekannten Methoden und Verfahren hergestellt, z. B. wie in den laufend aktualisierten Protokollen zur Molekularbiologie beschrieben (Ausubel et al., 1987). Die folgenden Komponenten wurden genutzt: Eine Gensequenz, die für die Aminosäuresequenz des reifen G-CSF kodiert, wurde auf Grundlage der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986) synthetisiert und an ein geeignetes DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für die Prä-Pro-Sequenz des Hefepheromons MFα1 fusioniert. Erfindungsgemäß wurde bewußt ein Element mit unveränderter Aminosäuresequenz eingesetzt (Brake et al., 1984). Die Nutzung eines derartigen Elementes resultiert in ei ner Prozessierung zwischen Position +2 und +3 und damit in der N-terminalen Verkür zung der G-CSF Sequenz um zwei Aminosäuren (siehe dazu Beispiel 5). Die fusionierte DNA-Sequenz wurde als EcoRI/BamHI Fragment in den Hansenula polymorpha Ex pressionsvektor pFPMT121 integriert. In diesem Vektor dient ein FMD-Promotor Element zur Kontrolle der Fremdgenexpression. Der Vektor pFPMT121 und abgeleitete Varianten sind in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben (u. a. Gellissen und Hollenberg, 1997). Die DNA-Sequenzen für die erzeugte MFαI/G-CSF Fusion und der erzeugte Ex pressionsvektor für die Produktion von G-CSF in Hansenula polymorpha sind in den Abb. 1 und 2 wiedergegeben (Abb. 1 zeigt die in SEQ ID NR. 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz in Verbindung mit dem Initiationscodon "ATG" sowie die entspre chende Aminosäuresequenz).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der oben beschriebene Vektor ein RNA-Vektor. Auf diese Weise können verschiedene Virus- Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, für die Transfektion von Säugerzellen genutzt werden. DNA-Vektoren sind jedoch ebenfalls umfaßt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Wirtszellen, die einen der oben beschriebe nen Vektoren enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine prokaryotische Wirtszelle. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sie eine Wirtszelle der Gattung Escherichia oder Bacillus ist. Eine solche Wirtszelle ist z. B. E.coli oder B. subtilis.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle. Dabei ist die Wirtszelle bevorzugt eine Säugerzelle, z. B. CHO, HeLa, WISH, COS oder NIH-Zellen, eine Hefezelle oder Pilzzelle. Unter den verschiedenen mikrobiel len Expressionssystemen bieten Hefearten verschiedene Vorteile für industrielle Appli kationen. Sie sind in der Lage, rekombinante Produkte effizient zu sezernieren und ei nem generellen eukaryotischen Muster entsprechend zu prozessieren und modifizieren.

Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, die eine methylothrophe Hefezelle ist. Die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha wurde als Expressionssystem für heterologe Proteine entwickelt (Roggenkamp et al., 1986; EP 0 173 378), wobei sich dieser Organis mus insbesondere für die Herstellung pharmazeutischer Produkte eignet (Gellissen und Melber, 1996). Die Komponenten des Expressionssystems sind Gegenstand verschie dener Publikationen und Patentanmeldungen. So ist zum Beispiel die Anwendung des FMD-Promotors (Formiatdehydrogenase-Promotor) als Kontrollelement für heterologe Genexpression in EP 0 299 108 niedergelegt. Ein Plasmid mit einem solchen Kontrollele ment dient in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als Ex pressionsvektor für die Produktion von G-CSF. Nach Aufnahme einer heterologen DNA wird diese stabil in das Hefegenom integriert. Als fakultativ methylotrophe Hefe ist diese Spezies in der Lage, Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen; andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Glyzerin und Glukose. Bei Zugabe von Metha nol oder bei der Zugabe von Glyzerin oder Glukose in definierten Konzentrationen wer den Schlüsselenzyme des Methanolstoffwechsels in hohen Konzentrationen produziert. Die Produktionskontrolle erfolgt auf transkriptioneller Ebene. Um die Sekretion eines heterologen Produktes zu ermöglichen, können unterschiedliche Elemente genutzt wer den. So kann z. B. durch Fusion einer vom Hefepheromon MFα1 abgeleiteten Leader- Sequenz und der DNA-Sequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, ein Translati onsprodukt erhalten werden, das nach Einschleusen in den sekretorischen Apparat in prozessierter Form ins Zellmedium sezerniert wird (Brake et al. 1984).

Als Wirtszellen bevorzugte methylotrophe Hefezellen sind ausgewählt aus Hansenula, Candida, Pichia und Torulopis. Der Terminus "Hansenula" soll so verstanden werden, daß er alle Spezies einschließt, die die gleiche oder eine ähnliche taxonomische Einord nung mit einer methylotrophen Hansenula Hefe teilen. Dies schließt die Organismen Hansenula polymorpha, Hansenula angusta, Hansenula capsulata, Hansenula saturnus und Hansenula wingei ein, ohne auf sie beschränkt zu sein.

Weitere bevorzugte Wirtszellen, die nicht zu den methylothrophen Hefen gezählt wer den, sind aus Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis und Schizosaccharomy ces pombe ausgewählt. Zur Expression besagter G-CSF-Molekülen bestens geeignet sind ferner Insektenzellen. Filamentöse Pilzzellen sind ebenfalls bevorzugte Wirtszellen, wobei Aspergillus niger, Aspergillus oryzae und Neurospora crassa besonders bevorzugt sind.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinan ten Wachstumsfaktors G-CSF, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsge mäße Wirtszelle wie oben beschrieben unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird und der Wachstumsfaktor G-CSF entweder aus dem Medium oder aus der Zelle gewonnen wird. Die dafür geeigneten Verfahren, die dem Zellaufschluß und der Reinigung dienen, sind dem Fachmann bekannt.

Gemäß der Erfindung wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF zur Mobilisierung von peripheren Blutstammzellen verwendet. Dabei ist unter "Mobilisierung von periphe ren Blutstammzellen" eine Steigerung des Blutvorläuferzellspiegels im peripherem Blut zu verstehen.

Des weiteren wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF erfindungsgemäß zur Förderung der Proliferation von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen eingesetzt.

Darüber hinaus ist die Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektio nen und nach Knochenmarkstransplantationen von der vorliegenden Erfindung mit um faßt.

Das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül, das für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodiert bzw. ein oben beschriebener Vektor, der ein solches Nuklein säuremolekül enthält, wird zur in vitro-Transfektion von Blutstammzellen und/oder Vor läuferzellen verwendet.

Ein solches Nukleinsäuremolekül wird gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektio nen und nach Knochenmarktransplantationen eingesetzt.

Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF wie oben beschrieben umfaßt und auf eine weitere pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül oder mindestens einen der Vektoren wie oben dargestellt enthält.

Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen dazu dienen, die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung vollständiger zu beschreiben und zu erläutern. Damit wird die Absicht verfolgt, Hansenula polymorpha als beispielhaften Organismus des Genus Hansenula und anderer methylotropher Hefen darzustellen. Darüber hinaus soll auch die Auswahl der genutzten genetischen Komponenten und DNA-Sequenzen der Erläuterung des Grundprinzips der Erfindung dienen. In diesem Sinne werden die aufgeführten Beispiele als nicht-beschränkend aufgefaßt.

Abbildungen

Abb. 1 zeigt die Gensequenz für die MFα1/G-CSF Fusion und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz.

Abb. 2 zeigt den Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF entsprechend der vor liegenden Erfindung.

Abb. 3 zeigt einen Southern Blot der genomischen DNA des rekombinanten Stammes Hansenula polymorpha 27-1, der mit dem Vektor pFPMTaG-CSF transformiert worden war. Die DNA wurde mit XhoI/HindIII geschnitten, in definierten Verdünnungen elektro phoretisch getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einer markierten FMD-Pro motor Sonde hybridisiert. Das Hybridisationsmuster besteht aus einem Signal bei 1,2 Kb für die genuine Sequenz und einem Signal bei 1,88 Kb für die heterologe Fusion. An hand der Signalstärke läßt sich eine Kopienzahl von 40 Kopien abschätzen.
Spur 1 Größenstandard, Spur 2 Plasmid DNA, Spur 3 nicht-transformierter Ausgangs stamm RB11, Spuren 4-7 Stamm 27-1 (Verdünnungen 1 : 40; 1 : 20, 1 : 10 und unver dünnt).

Abb. 4 zeigt die SDS-elektrophoretische Charakterisierung (15%ige Gele). Die beiden stark gefärbten Banden wurden immunologisch als G-CSF Moleküle identifiziert. Beide Proteine weisen einen identischen N-Terminus auf.

Abb. 5 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Nabelschnurblutzellen nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten.

Abb. 6 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Blutzellen eines an einem Myelom erkrankten Patienten nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten.

Beispiel 1 Herstellung eines Hefe-Expressionsvektors Konstruktion eines H. polymorpha-Expressionsvektors für die Sekretion von G-CSF:

Ein DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für das reife G-CSF wurde entspre chend der publizierten Sequenz synthetisiert (Abb. 1, Nukleotid 256 ff). Ein EcoRI/HindIII Fragment mit der kodierenden Sequenz für die MFα1-Leadersequenz wurde zusammen mit dem G-CSF-Fragment in einen mit EcoRI/BamHI geöffneten M13mp18 Vektor ligiert. Das neu enstandene ligierte Fragment enthält eine MFα1-Leader/O-SCF Fusion als EcoRI/BamHI Fragment. Durch Mutagenese wurde die Fusionsstelle zwischen Leader und reifem G-CSF dahingehend verändert, daß die ursprüngliche Leader-Sequenz ein schließlich der Lys-Arg-Prozessierungstelle rekonstituiert wurde. An diese Prozessie rungsstelle schließt sich die Sequenz des reifen G-CSF ohne N-terminales Methionin an. Die mutagenisierte Fusionssequenz wurde als EcoRI/BamHI-Fragment in den mit diesen Restriktionsenzymen geöffneten Hansenula polymorpha Expressionsvektor pFPMT121 inseriert. Die inserierte Sequenz für MFα1/G-CSF ist in Abb. 1 und der entstandene Ex pressionsvektor pFPMTaG-CSF ist in der Abb. 2 wiedergegeben.

Beispiel 2 Transformation von Hansenula polymorpha

Der oben beschriebene Vektor diente zur Transformation des Hansenula polymorpha Stammes RB11, der eine Defizienz in der Orotidin 5'-Phosphat-Dehydrogenase (uraW) aufweist. Kompetente Zellen dieses Stammes wurden nach etablierten Methoden her gestellt (Dohmen et al., 1991, Yeast 7 : 691): 10 ml Hefemedium (YPD; Gemisch aus He feextrakt, Pepton und Glucose) wurden mit Zellen inokuliert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Diese Kultur wurde anschließend zur Beimpfung von 200 ml des beschriebe nen Mediums benutzt. Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 0,6 bis 1 bei OD₆₀₀ kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation sedimentiert, bei Raumtemperatur mit 100 ml einer Lösung A gewaschen (1 M Sorbitol, 10 mM Bicine pH 8,35, 3% (w/v) Ethy lenglycol) und in 4 ml dieser Lösung resuspendiert. 11 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) wur de zugegeben und die kompetenten Zellen in 200 µl Aliquots aufgeteilt. Sie wurden ent weder sofort genutzt oder bis zur Nutzung bei -70°C gelagert.

Für die Transformation wurden 10 µg der Plasmid DNA (pFPMTaG-CSF) und 100 µl kaltes 0,1 M CaCl₂ zu gefrorenen Zellaliquots gegeben. Nach schnellem Auftauen wurde 1 ml einer Lösung B zugegeben (40% (w/v) PEG 3000, 200 mM Bicine pH 8,35) und die Transformationsansätze bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Zel len in 1 ml einer Lösung C (150 mM NaCl in 10 mM Bicine pH 8,35) gewaschen und in 200 µl resuspendiert. Diese Suspension wurde auf Selektivnährböden (Agar in YNB- Glucose (yeast nitrogen base) ausplattiert. Die Ausstriche wurden bei 37°C für 3 bis 5 Tage inkubiert.

Beispiel 3 Erzeugung mitotisch stabiler Stämme

Kolonien der Transfomationsausstriche wurden zur Inokulation von 3 ml YNB-Glukose benutzt und bei 37°C kultiviert. Ein 50 µl Aliquot der ausgewachsenen Kultur wurde zur Inokulation weiterer 3 ml YNB genutzt. Dieser Vorgang wurde für ca. 60 Wachstumsge nerationen wiederholt. Während dieser Passagierung wurde die Plasmid-DNA in das Genom der Hefe integriert. Anschließend wurden 3 ml des nicht-selektiven Mediums (YPD) beimpft und bei 37°C inkubiert.

Beispiel 4 Herstellung von rekombinanten Stämmen der Art Hansenula polymorpha mit der Fähig keit, G-CSF zu sezernieren, und Identifizierung rekombinanter Stämme, die G-CSF se zemieren

Die Herstellung von rekombinanten, G-CSF produzierenden Hefestämmen der Art Han senula polymorpha erfolgte nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode durch Trans formation des Wirtsstammes RB11 mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid pFPMTaG-CSF. Mitotisch stabile Stämme wurden wie beschrieben durch Passagieren in selektivem Medium erzeugt. Die generierten Transformanden wurden im 3 ml Maßstab vergleichend kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in einem Medium, dem Glyzerin in einer Konzentration von 1,5% (w/v) zugesetzt war. Der Verbrauch des Glyzerins durch die wachsende Kultur resultierte in Derepressionsbedingungen für den Promotor. Unter die sen Bedingungen läßt sich die Expression des unter der Kontrolle des FMD-Promotors stehenden Fremdgens nach zwei bis drei Tagen nachweisen. Dabei wurden die Zellen nach zweitägiger Kultur in diesem Medium bei 37°C abzentrifugiert und der Überstand auf das Vorhandensein von G-CSF untersucht. Der Nachweis erfolgte durch einen direk ten ELISA, bei dem ein käuflich erhältliches Anti-G-CSF-Serum aus Ziegenblut verwen det wurde. Der ELISA erfolgte in Polystyrolmikrotiterplatten (F96 Maxisorp, Nung-Immuno Plate) nach etablierten Methoden. Der Nachweis erfolgte über die an einen biotinylierten Zweitantikörper im Laufe der Nachweisschritte gebundene Peroxidaseaktivität. Das En zym katalysiert bei Zugabe eines Substrates eine grüne Farbentwicklung, die bei 405 nm photometrisch gemessen werden kann. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich mit kalibrierten G-CSF Mengenstandards. Durch diesen vergleichenden quantitativen Nachweis des G-CSF in den Kulturüberständen konnten Kandidaten mit überdurch schnittlichen Produktionseigenschaften identifiziert werden.

Beispiel 5 Bestimmung der Kopienzahl in ausgewählten Stämmen

Die Kopienzahl der integrierten heterologen DNA wurde durch Southern Blot Hybridisie rung bestimmt. Dazu wurde die genomische DNA ausgesuchter Hefestämme mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI geschnitten, nach elektrophoretischer Trennung auf Nitrozellulosefilter übertragen und mit einer markierten FMD-Promotor Sonde hybri disiert. Die Wahl der Restriktionsenzyme und die Festlegung der Hybridisierungssonde in der angegebenen Weise resultiert in zwei Hybridisierungssignalen für das genuine FMD-Gen und die heterologe Fusion. Durch Vergleich der Signalstärken dieser zwei Si gnale kann die Kopienzahl der rekombinanten DNA festgelegt werden. Die Kopienzahl der beiden als Beispiele dienenden Stämme mit den Seriennummern 12-3 und 27-1 wurde mit jeweils 40 bestimmt (siehe Abb. 3).

Beispiel 6 Kultivierung

Die Kultivierung der G-CSF-sezemierenden Hansenula-Stämme erfolgte im 21 Ansatz verfahren in einem synthetischen Medium, supplementiert mit Glyzerin als Kohlenstoff quelle. Die Fermentation erfolgte bei pH 5,5 - 3,2.

Beispiel 7 Isolierung des sezernierten G-CSF

Die Isolierung des sezernierten G-CSF erfolgte mit Hilfe der nachfolgenden Aufreini gungsschritte. Der Fermentationsüberstand wurde durch Zentrifugation der Suspension und anschließende Sterilfiltration gewonnen. Daraufhin erfolgte eine Konzentrierung und Entsalzung durch Querstromfiltration mit Hilfe einer 10 kDa Polyethersulfonmembran bei 4-8°C. Das so gewonnene Material wurde 1 : 1 mit einem Puffer A verdünnt (20 mM HOAc/KOH pH 5,2, 0,5 mM EDTA, 02% (w/v) Tween 20), mit KOH auf pH 5,2 eingestellt und auf einen mit diesem Puffer äquilibrierten Kationenaustauscher gegeben (Merck Fractogel EMD-SO^3- 650 M; 1 × 7 cm). Die aufgetragene Proteinmenge war 4,5 mg nach Bradford, die Leitfähigkeit 2,1 mS/cm. Die Elution des gebundenen Proteinmaterials er folgte mit Hilfe eines Salzgradienten mit 10% bis 100% Anteil eines Puffers B (Puffer B entspricht Puffer A mit 0,5 M NaCl). Die Produktfraktionen wurden mit Hilfe eines 10 kDa Filters aufkonzentriert und durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Sephadex G 75 Matrix eluiert. Der G-CSF befand sich unter diesen Bedingungen im Ausschlußvolumen. Das so gewonnene Präparat lag in einer Konzentration von 50 µg/ml vor. Eine elektro phoretische Analyse mit Hilfe von 15%igen SDS-PAGE Gelen nach Laemmli belegte das Vorhandensein der zwei bereits beschriebenen G-CSF Moleküle von 18 und 20 kDa.

Beispiel 8 Bestimmung der biologischen Aktivität des rekombinanten G-CSF aus Hansenula poly morpha

Das rekombinante Produkt wurde in einem CD34-Synthesetest nach Sutherland et al. (Sutherland et al., 1994) durchflußzytometrisch in Vorläuferzellpräparaten auf seine bio logische Aktivität im Vergleich mit einem in Bakterien hergestellten G-CSF-Isolat (Filgrastim) getestet. Als Testzellen dienten Zellen aus potentiell zur autolog bzw. allogen zur Knochenmarktransplantation vorgesehenen Vorläuferzellpräparaten. Eingesetzt wurden Nabelschnurblutzellen aus Plazentarestblut bzw. mononukleäre Zellen aus auto logen Stammzellapheresaten von zytotoxisch mobilisierten Myelompatienten (jeweils drei verschiedene Chargen). Die Zellproben wurden bei unterschiedlichen G-CSF Konzen trationen 30 Minuten inkubiert, mit monoklonalen fluoreszierenden Antikörpern markiert, fixiert und durchflußzytometrisch analysiert. Dabei wurden G-CSF Konzentrationen ein gesetzt, die der Serumkonzentration bei der klinischen Anwendung entsprechen (Fischer et al., 1994). Nach Inkubation mit rekombinantem G-CSF aus Hansenula polymorpha wiesen Zellen aus Nabelschnurblut eine sechsfach höhere Syntheserate an CD34 Prote in auf als der Kontroll-G-CSF aus E.coli (Filgrastim, Amgen Corporation, Thousand Oaks, CA). Bei Zellen aus Apheresaten von Myelompatienten wurde eine 8,2-fach höhe re Aktivität gegenüber dem E.coli Isolat gefunden. In Vorversuchen wurde demgegen über kein Unterschied zwischen dem E.coli Isolat und einem rekombinanten glykosylier ten Produkt aus Hamsterzellen (Lenograstim, Rhône-Poulenc Rorer; Frankreich) nach gewiesen.

Beispiel 9 Charakterisierung des sezernierten G-CSF

Die in Beispiel 3 identifizierten Stämme wurden im 2 l Maßstab nach dem bereits be schriebenen Verfahren fermentiert und das sezernierte Produkt wurde nach verschiede nen Methoden charakterisiert. Die apparente relative Masse wurde durch SDS-PAGE nach Schäger und von Jagow mit 19,5 kDa bestimmt. In der SDS-PAGE nach Laemmli traten zwei monomere Formen von 18 und 20 kDa auf, darüber hinaus multimere For men (siehe Abb. 4). Die 18 kDa Form bildete in der vergleichenden SDS-PAGE eine Bande auf derselben Höhe wie G-SCF aus E.coli. Die 18 und die 20 kDa Form der SDS- PAGE Auftrennung nach Laemmli und die 19,5 kDa Form der SDS-PAGE nach Schäg ger und von Jagow wurden mit Hilfe präparativer Gele aufgetrennt, auf PVDF Membra nen transferiert und N-terminal ansequenziert. Für alle Isolate wurde übereinstimmend der folgende N-Terminus bestimmt:

Referenzsequenz (natürliche Sequenz): TPLGP ASSLP QSFLL KCLEQ VRKIQ GD Nachgewiesene
Sequenzen: LGP ASSLP QSFLL K?LEQ VRKIQ GD

Das sezernierte Produkt liegt nicht in monomerer, sondern in multimerer Form vor. Durch ausschlußchromatographische Verfahren konnte bestimmt werden, daß die relati ve Masse des nativen Produktes größer als 75 kDa ist. Das größere Produkt ist nicht N- glykosyliert. Eine O-Glycosylierung konnte durch PAS Färbung (periodic acid Schiff rea gent-Färbung) von SDS-Polyacrylamidgelen sowie durch Glycoblotting nicht detektiert werden.

Zitierte Literatur

Ausubel F. M. et al. (eds) Current protocols in molecular biology. Wiley & Sons, New York 1987
Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81 : 4642-4646
Dohmen J. et al., Yeast, 1991, 7 : 691
Fischer J. et al., Blood, 1994, 84 : 23a
Gellissen et al., Biotech Adv., 1992, 10 : 179-189
Gellissen G. und Hollenberg C. P., Gene, 1997, 190 : 87-97
Gellissen und Melber, Drug Res., 1996, 46 : 943-948
Hollenberg C. P. und Gellissen G., Gurr. Opin. Biotechnol., 1997, 8 : 554-560
Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, 159 : 103-111
Laemmli U., Nature, 1970, 227 : 680-685
Maniatis T., Sambrook J. und Fritsch E. F., 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Aufl., C. S. H. Laboratory Press
Nagata S. et al., Nature, 1986, 319 : 415-418
Nagata S., BioEssays, 1989, 10 : 113-117
Pearson W. R. und Lipman D. J., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 2444-2448
Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., 1986, 202 : 302-308
Schägger H. und von Jagow G., Anal. Biochem., 1987, 166 : 368-379
Souza L. M. et al., Nature, 1986, 323 : 61-65
Sutherland D. R. et al. Exp. Hematol., 1994, 22 : 1003-1010
Weydemann U. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, 44 : 377-385
Zurek C. et al., Proc. Biochem., 1996, 31 : 679-689

Claims

1. Rekombinanter Wachstumsfaktor, der ein Säuger-G-CSF (Granulozyten Kolo nie-stimulierender Wachstumsfaktor) oder ein dazu homologes Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSF ist, dadurch gekennzeichnet, daß die er sten beiden N-terminalen Aminosäuren des reifen G-CSF Proteins fehlen.

2. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein humaner Wachstumsfaktor ist.

3. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, da durch gekennzeichnet, daß er ein N-terminales Methionin enthält.

4. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der folgen den Gruppe ausgewählt ist:

a) SEQ ID NR:1 ("174 (-2 AS) Variante"),
b) SEQ ID NR:2 ("177 (-2 AS) Variante"),
c) SEQ ID NR:3 ("Met-174 (-2 AS) Variante"), und
d) SEQ ID NR:4 ("Met-177 (-2 AS) Variante"),

oder eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz ist.

5. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich die abgeleitete Sequenz durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch einer oder mehrerer Aminosäuren von der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 angegebenen Sequenz un terscheidet.

6. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 4 und/oder 5, dadurch ge kennzeichnet, daß einer oder mehrere der Histidinreste an den Positionen 41, 77, 154 und 168 durch eine andere natürliche Aminosäure ersetzt sind.

7. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehrere der Histidinreste an den Positionen 41, 77, 154 und 168 durch Glutamin ersetzt sind.

8. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach mindestens einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Aminosäurereste im Be reich der Aminosäuren 48 bis 54 ausgetauscht sind.

9. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er posttranslational modifiziert ist.

10. Rekombinanter Wachstumsfaktor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die posttranslationale Modifikation die Abspaltung eines N-terminalen Methionins und/oder die Glycosylierung des Wachstumsfaktors umfaßt.

11. Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine für einen re kombinanten Wachstumsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodierende Sequenz umfaßt und ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:1 dar gestellten Sequenz kodiert,
b) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:2 dar gestellten Sequenz kodiert,
c) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:3 dar gestellten Sequenz kodiert,
d) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der in SEQ ID NR:4 dar gestellten Sequenz kodiert,
e) der in SEQ ID NR:5 ("174 × 3 (-6 Nu) Variante") dargestellten Nukleinsäure sequenz,
f) der in SEQ ID NR:6 ("177 × 3 (-6 Nu) Variante") dargestellten Nukleinsäure sequenz,
g) der in SEQ ID NR:7 ("AUG-174 × 3 (-6 Nu) Variante ") dargestellten Nuklein säuresequenz,
h) der in SEQ ID NR:8 ("AUG-177 × 3 (-6 Nu) Variante ") dargestellten Nuklein säuresequenz,
i) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleotidaustausch von einer der in a) bis h) beanspruch ten Nukleinsäuresequenzen abgeleiteten Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSFs kodiert,
j) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer zu den in a) bis i) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann,

sowie einer zu einer der unter a) bis k) genannten Sequenzen komplementären Sequenz.

12. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin für eine funktionelle Leader-Sequenz kodiert.

13. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des hyperglykämischen Crustaceen- Hormons (CHH) aus Carcinus maenas oder ein Derivat derselben ist.

14. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des Mating Factors α (MFα1) aus Hefe oder ein Derivat derselben ist.

15. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die MFα1 Leader-Sequenz mit der natürlichen MFα1 Sequenz in funktioneller Verbindung mit einer für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierenden Sequenz einschließlich der Codons für die beiden N-terminalen Aminosäuresequenzen von G-CSF umfaßt.

16. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäuresequenz umfaßt, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

a) einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein gemäß SEQ ID NR:1 oder SEQ ID NR:2 und für eine damit funktionell verbundene MFα1 Leader- Sequenz kodiert,
b) SEQ ID NR:9 ("natürlicher Leader + 174 × 3 Variante (incl. 6 Nu)"),
c) SEQ ID NR:10 ("natürlicher Leader + 177 × 3 Variante (incl. 6 Nu)"),
d) einer durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleotidaustausch von einer der in (i), (ii) oder (iii) beanspruchten Nukleinsäuresequenzen abgelei teten Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G- CSFs kodiert,
e) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer zu den in (i) bis (iv) beanspruchten komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann,

sowie ein zu einer der in (i) bis (v) genannten Sequenzen komplementären Se quenz.

17. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat der MFα1 Leader-Sequenz eine in der 3'-Region modifizierte MFα1 Sequenz ist und die für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierende Sequenz die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:S oder SEQ ID NR:6 oder eine davon abgeleitete Sequenz ist.

18. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Nukleinsäuremolekül nach min destens einem der Ansprüche 10 bis 17 oder ein Fragment davon, einen damit funktionell verbundenen Promotor sowie ein mit der Nukleinsäure funktionell verbundenes Terminationssignal umfaßt.

19. Vektor nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor und das Terminationssignal ein für eine vorgesehene Wirtszelle spezifischer Pro motor und spezifisches Terminationssignal sind.

20. Vektor nach Anspruch 18 und/oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Vektor oder ein RNA-Vektor ist.

21. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Vektor nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 20 enthält.

22. Wirtszelle nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine pro karyotische Wirtszelle ist.

23. Wirtszelle nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Wirtszel le der Gattung Escherichia oder Bacillus ist.

24. Wirtszelle nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle E.coli oder B. subtilis ist.

25. Wirtszelle nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine eu karyotische Wirtszelle ist.

26. Wirtszelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säuger zelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Pilzzelle ist.

27. Wirtszelle nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine methy lothrophe Hefezelle ist.

28. Wirtszelle nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Hansenula, Candida, Pichia und Torulopis.

29. Wirtszelle nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Hansenula polymorpha, Hansenula angusta, Hansenula capsu lata, Hansenula saturnus und Hansenula wingei.

30. Wirtszelle nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis und Schi zosaccharomyces pombe.

31. Wirtszelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine filamen töse Pilzzelle ist.

32. Wirtszelle nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus Zellen von Aspergillus niger, Aspergillus oryzae und Neurospora cras sa.

33. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF, da durch gekennzeichnet, daß eine Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 21 bis 32 unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird und der Wachstumsfaktor G-CSF entweder aus dem Medium oder aus der Zelle gewonnen wird.

34. Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Mobilisieren von peripheren Blutstammzel len.

35. Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Fördern der Proliferation von Blutstammzel len und/oder Vorläuferzellen.

36. Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektionen und nach Knochenmarkstrans plantationen.

37. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach mindestens einem der Ansprü che 11 bis 17 oder eines Vektors nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 20 zur in vitro-Transfektion von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen.

38. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach mindestens einem der Ansprü che 11 bis 16 oder eines Vektors nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 19 zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportu nistischen Infektionen und nach Knochenmarktransplantationen.

39. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens einen rekombi nanten Wachstumsfaktor G-CSF nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

40. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Nukleinsäu remolekül nach einem der Ansprüche 11 bis 17 oder mindestens einen Vektor nach einem der Ansprüche 18 bis 20.