DE60130100T2

DE60130100T2 - Expressions- und sekretionsvektor für menschliches interferon-alpha und verfahren zur herstellung von interferon-alpha durch anwendung desselben

Info

Publication number: DE60130100T2
Application number: DE60130100T
Authority: DE
Inventors: Se Chang Kwon; Sung Youb Jung; Ki Doo Choi; Cha Soon Kim; Sung Min Bae; Gwan Sun Lee
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd; Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Current assignee: Hammi Holdings Co Ltd Seoul Kr
Priority date: 2000-01-19
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2021-01-20
Also published as: NZ520076A; JP3751883B2; JP2003521925A; CN100436581C; EP1250439A1; CN1418251A; US20040151695A1; AU2890901A; CA2397527A1; AU762053B2; WO2001057217A1; EP1250439A4; US7052867B2; KR100360594B1; ES2290156T3; KR20010073658A; DE60130100D1; WO2001057217A9; EP1250439B1; CA2397527C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Expressionsvektor zur Sekretions-Produktion von humanem Interferon-alpha (hIFNα), welcher ein Polynukleotid, das für eine modifizierte thermostabile Enterotoxin-II-Signalsequenz von E.coli kodiert, und ein an dessen 3'-Ende ligiertes Polynukleotid umfaßt, das für hIFNα kodiert; einen Mikroorganismus, der mit dem Expressionsvektor transformiert ist; und ein Verfahren zum Erzeugen von hIFNα in sekretierter Form, das kein Methionin an seinem N-Terminus im Periplasma der E. coli-Zelle besitzt.
Hintergrund der Erfindung
Isaacs und Lindenmann haben 1957 berichtet, daß, wenn ein Huhn mit dem Influenza-Virus A infiziert wurde, es einen die virale Replikation inhibierenden Faktor produziert, der als Interferon bezeichnet wird (Isaacs, K. und Lindenmann, J. Proc. R. Soc. Lond., B147:258-267, 1957).
Humane Interferone gehören zu den Cytokin-Proteinen, die in vivo die Immunantwort oder die virale Replikation hemmen, und sie können, in Abhängigkeit davon, welcher Zelltyp sie produziert, als Interferon-alpha (IFNα), Interferon-beta (IFNβ) und Interferon-gamma (IFNγ) klassifiziert werden (Kirchner, H. et al., Tex Rep. Biol. Med., 41:89-93, 1981; Stanton, G. J. et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41:84-88, 1981).
Es ist gut bekannt, dass diese Interferone zusammen arbeiten, um synergistische Effekte auf die Manifestation anti-viraler, anti-cancerogener, NK-(Natürlicher Killerzellen) Zellaktivie rungs- und Markzellen-Inhibitions-Aktivitäten auszuüben (Klimpel, et al., J. Immunol., 129:76-78, 1982; Fleischmann, W. R. et al., J. Natl. Cancer Inst., 65:863-966, 1980; Weigent, et al., Infec. Immun., 40:35-38, 1980). Zusätzlich spielen Interferone eine Rolle als regulatorische Faktoren der Expression, Struktur und Funktion von Genen in der Zelle und zeigen einen direkten anti-proliferativen Effekt.
IFNα wird produziert, wenn ein Leukocyt von dem B-Zell Mitogen, Viren oder Krebszellen stimuliert wird. Bislang wurden Gene gefunden, die für über 20 Species von Interferonen kodieren, die jeweils 165 oder 166 Aminosäuren umfassen.
IFNα, das für frühe klinische Versuche eingesetzt wurde, wurde aus „buffy coat"-Leukocyten genommen, die durch das Sendai Virus stimuliert wurden, und seine Reinheit war lediglich weniger als 1% (Cantell, K. and Hirvonen, Tex. Rep. Biol. Med., 35:138-144, 1977).
Es wurde in den 1980er Jahren möglich, große Mengen an biophysikalisch-aktivem IFNα mit rekombinanter Gentechnik zu produzieren (Goedell, D. V. et al., Nature, 287:411-416, 1980). Klinische Tests unter Verwendung des rekombinanten hIFNα haben gezeigt, daß es bei der Behandlung verschiedener solider Krebsarten, insbesondere Blasenkrebs, Nierenkrebs, HIV-bezogenes Kaposi-Sarkoma, etc. wirksam ist (Torti, F. M., J. Clin. Oncol., 6:476-483, 1988; Vugrin, D., et al., Cancer Treat. Rep., 69:817-820, 1985; Rios, A., et al., J. Clin. Oncol., 3:506-512, 1985). Es ist auch wirksam bei der Behandlung von Hepatitis-C-Virus (Davis, G. G., et al., N. Engl. J. Med., 321:1501-1506, 1989), und das Einsatzgebiet als therapeutisches Agens wird von Tag zu Tag größer.
Die Ergebnisse der Klonierung des IFNα-Gens aus Leukocyten hat gezeigt, daß IFNα von einer Gruppe von mindestens 10 verschiedenen Genen kodiert wird. Das deutet darauf hin, daß die DNA-Sequenzen nicht eine Art von Protein erzeugen, sondern daß IFNα als Mischung verschiedener Subtypen mit ähnlichen Strukturen vorliegt. Solche Subtypen werden IFNα-1, -2, -3, usw. genannt (Nature, 290:20-26, 1981).
Unter den verschiedenen Typen von Interferonen hat hIFNα, das aus menschlichen Leukocyten aufgereinigt worden ist, ein Molekulargewicht von 17,500 bis 21,000 und eine sehr hohe native Aktivität von 2 × 10⁸ IU/mg Protein. In vivo ist IFNα ein Protein, das aus 165 Aminosäuren besteht. Es wird IFNα-2a (SEQ ID NO: 1) genannt, wenn die 23. Aminosäure ein Lysin ist, und IFNα-2b (SEQ ID NO: 2), wenn die 23. Aminosäure ein Arginin ist. Anfangs wurde hIFNα mit einem Zellkultur-basierten Verfahren hergestellt. Jedoch ist dieses Verfahren wegen der geringen Ausbeute von 250 μg/L für kommerzielle Zwecke nicht geeignet.
Um dieses Problem zu lösen, wurden rekombinante gentechnische Verfahren entwickelt, um große Mengen an Interferon aus Mikroorganismen zu gewinnen, und werden bis heute verwendet.
Das am weitesten verbreitete Verfahren benutzt E. coli, das ein 166 oder 167 Aminosäuren langes IFNα gemäß den Eigenschaften der E. coli-Zelle herstellt. Diese Produkte besitzen einen zusätzlichen Methioninrest am N-Terminus, welcher aufgrund des ATG-Codons am Initiationscodon angehängt wird. Allerdings wurde berichtet, daß der zusätzliche Methioninrest eine schädliche Immunantwort hervorrufen kann, im Falle vom menschlichen Wachstumshormon ( EP Patentoffenlegung Nr. 256,843 ).
Darüber hinaus akkumuliert der größte Teil des exprimierten IFNα im Cytoplasma in Form von unlöslichen Inclusion Bodies und muß durch Rückfaltung während eines Aufreinigungsprozesses in eine aktive Form konvertiert werden. Da ein solcher Rückfaltungsprozess nicht effektiv ist, existiert IFNα teilweise in einer reduzierten Form oder bildet einen intermolekularen Disulfidkopplungskörper oder einen defekten Disulfidkopplungskörper. Es ist schwierig, diese Nebenprodukte zu entfernen, was zu einer deutlich geringeren Ausbeute führt. Insbesondere ist es extrem schwierig, unerwünschte Interferon-Nebenprodukte, wie falsch gefaltete Interferone, zu entfernen.
Kürzlich wurden, um die oben genannten Probleme im Zusammenhang mit der Produktion fremder Proteine in einer mikrobiellen Zelle zu lösen, verschiedene Bemühungen unternommen, eine Methode zu entwickeln, die auf einer effizienten Sekretion einer löslichen Form des Zielproteins basiert, welches kein zusätzliches Methionin am N-Terminus hat.
Mit dieser Methode wird ein gewünschtes Protein in Form eines Fusionsproteins exprimiert, welches ein Signalpeptid an seinem N-Terminus trägt. Wenn das Fusionsprotein die Zellmembran passiert, wird das Signalpeptid durch ein Enzym in E. coli entfernt, und das gewünschte Protein wird in nativer Form sezerniert.
Die Sekretions-Produktions-Methode ist gegenüber der mikrobiellen Produktionsmethode vorteilhaft, da die Aminosäuresequenz und die höhere Struktur des produzierten Proteins normalerweise identisch mit der des Wild-Typ-Proteins ist. Jedoch ist die Ausbeute der Sekretions-Produktions-Methode oft aufgrund der ungenügenden Effizienzen, sowohl des Membrantransports als auch des anschließenden Aufreinigungsprozesses, recht niedrig. Das ist mit der gut bekannten Tatsache im Einklang, daß die Ausbeute eines Säugetier-Proteins, das im Sekretions-Modus in Prokaryoten produziert wird, viel geringer ist als die eines prokaryotischen Proteins, das auf die gleiche Art in einem Prokaryoten produziert wird. Deshalb wurde versucht, eine effizientere Sekretions-Produktions-Methode zu entwickeln. Zum Beispiel offenbart die Koreanisches Patentveröffentlichung No. 93-1387 einen Versuch zur Massenproduktion von IFNα, indem das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase von E. coli benutzt wurde, jedoch war die Ausbeute mit 10⁹ IU/L Kulturmedium (10 μg/L Kulturmedium) sehr gering. Daher gab es ein großes Interesse, eine Methode zu entwickeln, die in der Lage ist, lösliches IFNα ohne zusätzliches Methionin am N-Terminus in großem Maßstab unter Verwendung von Mikroorganismen zu produzieren.
Die gegenwärtigen Erfinder haben früher ein neues Signalpeptid des thermostabilen E. coli Enterotoxin-II ( Koreanische Patentanmeldung Nr. 98-38061 und 99-27418 ) generiert und haben gefunden, daß dieses neue Sekretions-Signalpeptid zur Massenproduktion der nativen Form von IFNα benutzt werden kann. Und zwar haben die gegenwärtigen Erfinder einen Expressionsvektor konstruiert, der ein Gen beinhaltet, das durch die Ligation des IFNα kodierenden Gens anstelle des Enterotoxin-II kodierenden Gens an das modifizierte E. coli Sekretions-Signalpeptid erhalten wurde, und haben eine Sekretions-Produktions-Methode für IFNα mit nativer biologischer Aktivität mithilfe des mikrobiellen Sekretionssystems entwickelt, indem der mit dem besagten Expressionsvektor transformierte Mikroorganismus kultiviert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Expressionsvektor zu liefern, der humanes Interferon-alpha (IFNα) im Wege der Sekretion herstellen kann.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, einen Mikroorganismus bereit zu stellen, der mit dem besagten Vektor transformiert worden ist.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, um eine lösliche Form von hIFNα mit dem besagten Mikroorganismus zu produzieren, der keinen zusätzlichen Methioninrest am Amino-Terminus hat.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die obigen und weitere Aufgaben und Merkmale der gegenwärtigen Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den folgenden beigefügten Zeichnungen ersichtlich, welche jeweils folgendes zeigen:
1: Verfahren zur Herstellung des Vektors pT-IFNα-2a;
2: Verfahren zur Herstellung des Vektors pT14SIα-2a;
3: Verfahren zur Herstellung des Vektors pT14SSIα-2a;
4: Verfahren zur Herstellung des Vektors pT140SSIα-2a-4T22Q;
5a und 5b: die Ergebnisse der SDS-PAGE, die die Expression von IFNα-2a und die Reinheit des exprimierten IFNα-2a aus rekombinanten Zelllinien verifizieren, und das Ergebnis der Western Blot-Analyse, die das Molekulargewicht des exprimierten IFNα-2b verifiziert.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Entsprechend eines Aspektes dieser Erfindung wird ein Expressionsvektor für die Sekretions-Produktion von hIFNα bereitgestellt, der ein Polynukleotid, welches für eine modifizierte thermostabile Enterotoxin-II Signalsequenz kodiert (nachstehend bezeichnet als ,STII-Mutante'), und ein an dessen 3'-Ende ligiertes Polynukleotid umfaßt, das für hIFNα kodiert.
Das Polynukleotid, welches für hIFNα kodiert und für die Konstruktion des Expressionsvektors dieser Erfindung benutzt wird, kann jedes beliebige Polynukleotid sein, welches für zufällige hIFNα-Subtypen kodiert, wie natives IFNα-2a (SEQ ID NO: 1), IFNα-2b (SEQ ID NO: 2), IFNα-1 und IFNα-3, und es kann auch ein rekombinantes Polynukleotid sein, welches eine modifizierte Basensequenz hat, die für einen der obigen IFNα-Subtypen kodiert.
Das Polynukleotid, das für die modifizierte thermostabile E. coli Enterotoxin-II Signalsequenz dieser Erfindung kodiert, die vor dem 5'-Ende des Polynukleotids ligiert ist, das für hIFNα kodiert und zu dem Zweck der Sekretion-Produktion von hIFNα benutzt wird, kann ein Polynukleotid sein, das für eine Mutante kodiert, die durch Austauschen einer oder mehrerer Aminosäuren der thermostabilen E. coli Enterotoxin-II Signalsequenz, beschrieben in SEQ ID NO: 3, erhalten werden kann, vorzugsweise eine oder mehrere der 4., 20. und 22. Aminosäure davon mit (einer) anderen Aminosäure(n). Beispiele solcher Polynukleotide kodieren für Mutanten, die erhalten wurden durch Austausch von: der 4. Aminosäure mit Threonin ([Thr⁴]STII); der 4. Aminosäure mit Threonin und der 22. Aminosäure mit Glutamin ([Thr⁴, Gln²²]STII); der 4. Aminosäure mit Threonin, der 20. Aminosäure mit Valin und der 22. Aminosäure mit Glutamin ([Thr⁴, Val²⁰, Gln²²]STII); und der 4. Aminosäure mit Threonin und der 20. Aminosäure mit Valin ([Thr⁴, Val²⁰]STII), in der thermostabilen E. coli Enterotoxin-II Signalsequenz (STII), die in SEQ ID NO: 3 beschrieben ist, und bevorzugte Polynukleotidsequenzen sind SEQ ID NO: 4, 5, 6 und 7. Indessen ist bekannt, daß mehrere verschiedene Polynukleotide, die für die Mutanten dieser Erfindung kodieren, aufgrund des degenerierten Codes existieren können, und speziell ein Polynukleotid, das modifiziert worden ist, indem die bevorzugten Codons von E. coli eingebaut wurden, ohne die Aminosäuresequenz zu ändern, kann benutzt werden, um die Expressionsrate von IFNα zu verbessern.
Zusätzlich kann der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung die thermostabile E. coli Enterotoxin II Shine-Dalgarno Sequenz (SD-Sequenz, SEQ ID NO: 8) oder eine Mutante davon umfassen, die vor das 5'-Ende des Polynukleotids ligiert ist, das für die modifizierte thermostabile Enterotoxin II Signalsequenz kodiert. Verglichen mit einem Wildtyp, welcher 7 Basen (TGATTTT) nach GAGG des 5'-Endes der thermostabilen E. coli Enterotoxin II SD-Sequenz hat, die in SEQ ID NO: 8 beschrieben wird, hat die Mutante der SD-Sequenz eine kürzere Sequenz von 6 oder 5 Basen. Die Benutzung dieser Mutante kann die Sekretions-Expressionsrate von IFNα erhöhen. Wenn jedoch die Basensequenz kürzer als 4 Basen wird, nimmt die Expressionsrate stark ab. Ein spezifisches Beispiel für eine bevorzugte Mutante, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden kann, ist die thermostabile E. coli Enterotoxin II SD-Sequenz-Mutante, die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 9 hat.
Der Promoter, der bei der Herstellung des Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung benutzt wurde, kann jeder beliebige sein, der ein heterologes Protein in einem mikrobiellen Wirt exprimieren kann. Besonders lac, Tac und der Arabinosepromoter werden bevorzugt, wenn das heterologe Protein in E. coli exprimiert wird.
Diese Erfindung liefert auch transformierte Mikroorganismen, die erhalten werden können, zum Beispiel durch Transformation von E. coli Stämmen wie E. coli BL21(DE3) (Novagen, USA) oder E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) mit den besagten Vektoren. Beispiele dieser Erfindung liefern solche transformierten Mikroorganismen: E. coli BL21(DE3)/pT140SSIα-2a-4T („HM 10603"), E. coli BL21(DE3)/pT140SSIα-2a-4T22Q („HM 10611"), E. coli BL21(DE3)/pT140SSIα-2b-4T („HM 10703") und E. coli BL21(DE3)/pT140SSIα-2b-4T22Q („HM 10711"). Die oben genannten transformierten Mikroorganismen sind im Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (Adresse: Yurim Bldg., 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-091, Südkorea) am 23. Dezember 1999 unter der Hinterlegungsnummer KCCM-10175, KCCM-10176, KCCM-10177 und KCCM-10178 in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt worden.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird auch ein Verfahren zur Sekretions-Erzeugung von hIFNα ohne zusätzlichen Methioninrest am N-Terminus in das Periplasma von E. coli bereitgestellt, indem die transformierten Mikroorganismen unter geeigneten Kulturbedingungen kultiviert werden, die die gleichen wie konventionelle Kulturbedingungen für transformierte Mikroorganismen sein können.
hIFNα, welches in sekretierter Form durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert worden ist, beinhaltet zufällige hIFNα-Subtypen, wie IFNα-1, IFNα-3 und so weiter, sowie natives IFNα-2a (SEQ ID NO: 1) und hIFNα-2b (SEQ ID NO: 2), bestehend aus 165 Aminosäuren. Zusätzlich kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf die Erzeugung anderer Interferone, wie hIFNβ und hIFNγ, angewendet werden.
Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden 80% oder mehr des IFNα, das durch die erfindungsgemäße E. coli Transformante produziert wurde, mit einer hohen Produktivität von mehr als 1 g/L in das Periplasma sezerniert. Das produzierte IFNα hat dieselbe Amino säuresequenz wie das native IFNα, welches keine zusätzliche Aminosäure am N-Terminus hat, und zeigt die gleiche biologische Aktivität wie das native IFNα.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Veranschaulichung dieser Erfindung angeführt, ohne den Umfang zu beschränken.
Referenzbeispiel: IFNα-2a Gen und Konstruktion eines Vektors, welcher dieses enthält
Ein Gen, das für hIFNα-2a kodiert, wurde mit Hilfe einer PCR hergestellt, bei der humane genomische DNA als Templat und SEQ ID NO: 10 und 11 als Primer verwendet wurden. Der Primer der SEQ ID NO: 10 wurde so konstruiert, daß er eine NdeI-Restriktionsschnittstelle (5'-CATATG-3') stromauf von dem Codon für die erste Aminosäure, dem (Cystein)-Codon des nativen hIFNα, und die Primer SEQ ID NO: 11 enthielt, um eine BamHI-Restriktionsschnittstelle (5'-GGATCC-3') stromab von dem Terminationscodon davon zur Verfügung zu stellen.
Das amplifizierte PCR-Produkt wurde mit NdeI und BamHI geschnitten, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das für hIFNα-2a kodiert. Das DNA-Fragment wurde in die NdeI/BamHI-Schnittstelle des Vektor pET-14b (Novagen, USA) eingesetzt, um den Vektor pT-IFNα-2a zu erhalten.
1 zeigt das obige Verfahren zur Konstruktion des Vektors pT-IFNα-2a.
Vergleichsbeispiel 1: Konstruktion eines Vektors, der die Enterotoxin-Signalsequenz und IFNα-2a-Gene enthält
Um das E. coli Enterotoxin II Signalsequenzgen herzustellen, wurden ein Paar von komplementären Oligonukleotiden SEQ ID NO: 12 und 13, basierend auf der zuvor bekannten Nukleotidsequenz des E. coli Enterotoxin II Signalpeptids, erstellt und mit einem DNA-Synthesizer (Modell 380B, Applied Biosystems, USA) synthetisiert. Die oben genannten Oligonukleotide wurden so erstellt, daß sie eine BspHI-Restriktionsschnittstelle (komplementäre Schnittstellen zu einer NdeI-Restriktionsschnittstelle) stromauf von dem Initiationscodon von E. coli Enterotoxin II und eine MluI-Restriktionsschnittstelle bereitstellten, die durch eine stille Änderung am anderen Ende eingeführt wird. Beide Oligonukleotide wurden bei 95°C angelagert, um ein stumpf endendes DNA-Fragment mit der Nukleotidsequenz zu erhalten, die für die E. coli Enterotoxin II Signalsequenz kodiert. Das oben genannte DNA-Fragment wurde in die SmaI-Restriktionsschnittstelle des Vektors pUC19 (BioLabs, USA) inseriert, um den Vektor pUC19ST zu erhalten.
Zusätzlich wurde der Vektor pT-IFNα-2a, der das IFNα-2a-Gen enthält und der im Referenzbeispiel erhalten wurde, einer PCR mit den Primer der SEQ ID NO: 14 und 15 unterzogen, um das Enterotoxinsignalpeptid an das IFNα-2a-Gen zu ligieren. Der Primer der SEQ ID NO: 14 wurde so geplant, daß er dem 5'-Ende des IFNα-2a-Gens entsprach, und der Primer der SEQ ID NO: 15 so, daß er eine BamHI-Restriktionsschnittstelle (5'-GGATCC-3') stromab von dem Terminationscodon davon bereitstellte. Das DNA-Fragment, welches das Polynukleotid enthält, das für natives IFNα-2a kodierte, wurde mittels PCR mit den oben genannten Polynukleotidprimern amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit MluI und BamHI geschnitten, um ein IFNα-2a-DNA-Fragment mit MluI/BamHI-Enden zu erhalten.
Zwischenzeitlich wurde der Vektor pUC19ST, der das Enterotoxin-Signalpeptid enthielt, mit Mini geschnitten und dann mit BamHI verdaut, um ein Vektorfragment mit MluI/BamHI-Enden zu erhalten. Das Vektorfragment wurde an das IFNα-2a-DNA-Fragment ligiert, um den Vektor pUC19SIFNα-2a zu konstruieren.
Der Vektor pUC19SIFNα-2a wurde mit BspHI und BamHI geschnitten, um ein DNA-Fragment zu erhalten (564 bp). Dieses DNA-Fragment wurde in dem NcoI/BamHI-Abschnitt des Vektors pET-14b (Novagen, USA) inseriert, um den Vektor pT14SIα-2a zu erhalten. 2 zeigt das oben genannte Verfahren zur Konstruktion des Vektors pT14SIα-2a auf.
Nachfolgend wurde der E. coli Stamm BL21(DE3) mit 70 mM Calciumchloridlösung behandelt, um kompetente E. coli Zellen herzustellen, und danach wurde der Vektor pT14Iα-2a in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) zugegeben. Ein E. coli-Transformant, der IFNα-2a exprimiert, wurde mittels eines herkömmlichen Verfahrens, welches die Sensitivität des transformierten Vektors gegenüber Antibiotika ausnutzt, ausgewählt und E. coli HM 10600 genannt.
Zusätzlich wurde der Vektor pT14SIα-2a einer PCR unter Verwendung der Primer der SEQ ID NO: 16 und 17 unterzogen, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das durch die Ligati on der Shine-Dalgarno Sequenz des Enterotoxins, des Enterotoxin-Signalpeptids und des IFNα-2a-Gens, in dieser Reihenfolge, erhalten wurde, und dann wurde das DNA-Fragment mit XbaI und BamHI geschnitten, um ein Insert zu erhalten.
Dieses Insert wurde in den XbaI/BamHI-Abschnitt des Vektors pET-14b (Novagen, USA) ligiert, um Vektor pT14SSIα-2a zu konstruieren. 3 zeigt das obige Verfahren zur Konstruktion von Vektor pT13SSIα-2a. E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) wurde mit Vektor pT14SSIα-2a transformiert, um einen Transformanten zu erhalten, der E. coli HM 10601 genannt wurde.
Vergleichsbeispiel 2: Konstruktion eines Vektors, der die Enterotoxin-Signalsequenz und IFNα-2b-Gene enthält
Das 23. Lysin-Codon des IFNα-2a-Gens in Vektor pT14SSIα-2 wurde durch ein Arginin-Codon mit Hilfe der ortspezifischen Mutagenese ersetzt (Papworth, C. et al., Stratagies, 9, 3, 1996), um einen Expressionsvektor, der das IFNα-2b-Gen enthält, zu konstruieren. Vektor pT14SSIα-2a wurde mit den synthetischen Oligonukleotiden SEQ ID NO: 19 und 20 hybridisiert, die das ausgetauschte Codon enthalten, um ein Hybridmolekül zu bilden, und die DNA-Amplifikation wurde unter Verwendung von pfu (Stratagene, USA) und vier Nukleotidtriphosphaten (ATP, GTP, TTP, CTP) durchgeführt, welche die besagten Oligonukleotide in der 5'-3'-Richtung verlängern.
Interferon α-2b-Sequenz
Das amplifizierte DNA-Fragement wurde wiedergewonnen, und ein Restriktionsenzym DpnI wurde zugefügt, um nicht-umgewandelte Plasmide komplett zu entfernen.
E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid transformiert. Die Basensequenz der DNA, welche von den transformierten Kolonien zurückgewonnen wurde, wurde bestimmt, und somit wurde das Plasmid pT14SSIα-2b erhalten, welches ein Gen von IFNα-2a mit Arginin anstelle der 23. Aminosäure Lysin beinhaltet.
Nachfolgend wurde E. coli BL21(DE3) mit dem modifizierten Vektor pT14SSIα-2b transformiert, um einen Transformanten zu erhalten, der E. coli HM10701 genannt wurde, indem dieselbe Methode, wie im Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, verwendet wurde. Indem die N-terminale Aminosäuresequenz des durch Kultivierung des Transformanten produzierten Proteins analysiert wurde, wurde bestätigt, daß IFNα-2b mit der nativen Aminosäuresequenz davon exprimiert wurde.
Beispiel 1: Konstruktion eines Vektors, der eine Enterotoxin-Signalpeptidmutante enthält
(1) Konstruktion eines Vektors, der [Thr⁴]STII enthält
Um einen spezifischen Aminosäurerest des Enterotoxin-Signalsequenzpeptids zu modifizieren, wurde ein Vektor, enthaltend ein Polynukleotid, das für eine mutante Enterotoxin-Signalsequenz kodiert, mittels ortsgerichteter Mutagenese folgendermaßen hergestellt.
Als erstes wurde Vektor pT14SSIα-2a, der im Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde, mit den Oligonukleotiden SEQ ID NO: 22 und 23 einer PCR unterzogen, um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten, wobei die 4. Aminosäure der Enterotoxin-Signalsequenz mit einem Threonin (Thr) ausgetauscht ist, indem das Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese, wie im Vergleichsbeispiel 2 beschrieben, angewendet wurde.
Dann wurde E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) mit dem modifizierten Plasmid transformiert. Die Basensequenz der wiedergewonnenen DNA aus den transformierten Kolonien wurde bestimmt, und somit wurde ein Plasmid erhalten, welches ein Gen enthielt, das für das Enterotoxin-Signalsequenzpeptid mit Threonin in der 4. Aminosäureposition kodiert. Das so erhal tene Plasmid wurde mit XbaI und MluI geschnitten und dann in dem XbaI/MluI-Abschnitt des Vektor pT14SSIα-2a inseriert, um den Vektor pT14SSIα-2a-4T zu erhalten.
Nachfolgend wurde E. coli B121(DE3) (Stratagene, USA) mit Vektor pT14SSIα-2a-4T transformiert, um einen E. coli Transformanten zu bekommen, der E. coli HM 10602 genannt wurde.
Vektor pT14SSIα-2a-4T wurde mittels pT14SSIα-2b, konstruiert, und dann in E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) transformiert, um einen E. coli Transformanten zu erhalten, der E. coli HM 10702 genannt wurde, indem dieselbe Methode benutzt wurde, wie oben beschrieben.
(2) Konstruktion eines Vektors, der [Thr⁴, Gln²²]STII enthält
Vektor pT14SSIα-2a-4T, der in Schritt (1) erhalten wurde, wurde einer PCR mit den Oligonukleotiden von SEQ ID NO: 25 und 26 unterzogen, die so konstruiert waren, daß ein Gln-Codon für die 22. Aminosäure des Enterotoxin-Signalpeptids ersetzt wurde, welches Thr in der 4. Position hat, entsprechend dem ortsgerichteten Mutageneseverfahren aus Schritt (1), um ein modifiziertes Plasmid zu erhalten.
Dann wurde E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) mit dem modifizierten Plasmid transformiert. Die Basensequenz der zurückgewonnenen DNA aus den transformierten Kolonien wurde bestimmt, und somit wurde das Plasmid pT14SSIα-2a-4T22Q erhalten, welches ein Gen mit Thr und Gln in der 4. bzw. 22. Aminosäureposition der Enterotoxin-Signalsequenz beinhaltete. Anschließend wurde E. coli BL21(DE3) (Stratagene, USA) mit dem Vektor pT14SSIα-2a-4T22Q mit der gleichen Methode, wie in Schritt (1) beschrieben, transformiert, um einen Transformanten zu erhalten, der E. coli HM 10604 genannt wurde.
Um die Shine-Dalgarno-Sequenz der modifizierten Enterotoxin-Signalsequenz in SEQ ID NO: 9 zu modifizieren, wurden die Vektoren pT14SSIα-2a-4T und pT14SSIα-2a-4T22Q dem ortsgerichteten Mutageneseverfahren unterzogen, welches in Schritt (2) beschrieben wurde, wobei die Oligonukleotide von SEQ ID NO: 27 und 28 benutzt wurden, um das gewünschte modifizierte Plasmid zu erhalten.
E. coli XL-1 blue (Novagen, USA) wurde mit dem modifizierten Plasmid transformiert. Die Basensequenz der von den transformierten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurde bestimmt, und somit wurden die Plasmide pT14OSSIα-2a-4T und pT14OSSIα-2a-4T22Q erhalten, die die modifizierte Shine-Dalgarno-Sequenz der Enterotoxin-Signalsequenz haben. 4 stellt das obige Verfahren zur Konstruktion von Vektor pT14OSSIα-2a-4T22Q dar.
E. coli BL21(DE3) wurde mit den Vektoren pT14OSSIα-2a-4T bzw. pT14OSSIα-2a-4T22Q transformiert, um einen Transformanten, bezeichnet als E. coli HM 10603 bzw. HM 10611, zu erhalten, die am 23. Dezember 1999 unter der Hinterlegungsnummer KCCM-10175 bzw. KCCM-10176 in der Korean Culture Collection of Microorganisms (KCCM) hinterlegt wurden.
Zusätzlich wurden die Vektoren pT14OSSIα-2b-4T und pT14OSSIα-2b-4T22Q mit dem gleichen Verfahren wie oben bei Vektor pT14SSIα-2b hergestellt, welche dazu verwendet wurden, E. coli BL21(DE3) zu transformieren, um die Transformanten, bezeichnet als E. coli HM 10703 bzw. HM 10711 zu erhalten. Die E. coli Transformanten HM 10703 und HM 10711 wurden am 23. Dezember 1999 mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10177 bzw. KCCM-10178 in der KCCM hinterlegt.
(3) Konstruktion eines Vektors, der [Thr⁴, Val²⁰, Gln²²)STII enthält
Um ferner das Val-Codon für die 20. Aminosäure des Enterotoxin-Signalsequenzpeptids, das Thr und Gin in der 4. und 22. Aminosäureposition hat, zu substituieren, wurden die Vektoren pT14OSSIα-2a-4T22Q und pT14OSSIα-2b-4T22Q, hergestellt in Schritt (2), einer PCR unterzogen, bei der Oligonukleotide von SEQ ID NO: 29 und 30 verwendet wurden, mit dem ortsgerichteten Mutageneseverfahren, welches in Schritt (2) beschrieben wurde, um die gewünschten modifizierten Plasmide zu erhalten, die als pT14OSSIα-2a-4T20V22Q und pT14OSSIα-2b-4T20V22Q bezeichnet wurden.
E. coli XL-1 blue wurde mit den modifizierten Plasmiden transformiert. Die Basensequenzen der von den transformierten Kolonien wiedergewonnen DNA wurde bestimmt, und somit wurden die Plasmide pT14OSSIα-2a-4T20V22Q und pT14OSSIα-2b-4T20V22Q erhalten, die ein Gen enthielten, das ein Thr, Val und Gln-Codon anstelle des 4. Asp, 20. Asp und 22. Tyr Codons hatte. E. coli BL21(DE3) wurde mit den Plasmiden transformiert, um die Transformanten, bezeichnet als E. coli HM 10612 und HM 10712, zu erhalten.
Beispiel 2: Herstellung einer thermostabilen Enterotoxin-II-Shine-Dalgarno-Sequenzmutante
Um die Anzahl der Basen zwischen der ribosomalen Bindestelle und dem Initiationscodon ATG der modifizierten thermostabilen E. coli Enterotoxin-II-Signalsequenz innerhalb der thermostabilen Enterotoxin-II-Shine-Dalgarno-Sequenz des oben hergestellten Expressionsvektors zu reduzieren, wurde ein modifiziertes Plasmid mit dem ortsgerichteten Mutageneseverfahren des Vergleichsbeispiels 2 konstruiert.
Und zwar wurde, um die Zahl der Basen zwischen der ribosomalen Bindestelle GAGG und dem Initiationskodon ATG von 7 auf 5 zu reduzieren, der Vektor pT14OSSIα-2a-4T22Q, der in Beispiel 1 (2) hergestellt wurde, dem ortsgerichteten Mutageneseverfahren des Vergleichsbeispiels 2 mit den Oligonukleotiden von SEQ ID NO: 31 und 32 unterzogen, um ein modifiziertes Plasmid, bezeichnet als pT14NSSIα-2a-4T22Q, zu erhalten. Zusätzlich wurde, um die Anzahl der Basen zwischen der ribosomalen Bindestelle GAGG und dem Initiationscodon ATG auf 4 zu reduzieren, der Vektor pT14NSSIα-2a-4T22Q dem ortsgerichteten Mutageneseverfahren des Vergleichsbeispiels 2 mit den Oligonukleotiden von SEQ ID NO: 33 und 34 unterzogen, um ein modifiziertes Plasmid, bezeichnet als pT14MSSIα-2a-4T22Q, zu erhalten.
E. coli XL-1 blue wurde mit den modifizierten Plasmiden transformiert. Die Basensequenzen der aus den transformierten Kolonien wiedergewonnenen DNA wurden bestimmt, und so wurden die IFNα Expressionsplasmide pT14NSSIα-2a-4T22Q bzw. pT14MSSIα-2a-4T22Q erhalten, die 5 bzw. 4 Basen zwischen der ribosomalen Bindungsstelle GAGG und dem Initiationscodon ATG enthielten. E. coli BL21 (DE3) wurde mit den Expressionsplasmiden transformiert, um Transformanten, bezeichnet als HM 10613 und HM 10614, zu erhalten.
Beispiel 3: Vergleich der Expressionsmengen von IFNα-2
Die Transformanten, die in den obigen Vergleichsbeispielen und Beispielen hergestellt wurden, wurden in LB-Medium gezüchtet und dann in Anwesenheit von IPTG für 3 Stunden inkubiert. Jede der Kulturen wurde bei 6.000 upm für 20 Minuten zentrifugiert, um die bakteriellen Zellen zu fällen und der Niederschlag wurde mit der osmotischen Schockmethode (Nossal, G. N., J. Biol. Chem., 241:3055, 1966) folgendermaßen behandelt.

Der Niederschlag wurde in 1/10 Volumen isotonischer Lösung suspendiert (20% Saccharose, 10 mM Tris-Cl-Puffer, enthaltend 1 mM EDTA, pH 7,0). Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen und dann zentrifugiert, um die bakteriellen Zellen einzusammeln. Die Zellen wurden in D.W. bei 4°C resuspendiert, um die vorhandenen Proteine in dem Periplasma der Zellen zu extrahieren, und zentrifugiert, um einen Überstand als periplasmatische Lösung zu erhalten. Der IFNα-2-Level in der periplasmatischen Lösung wurde entsprechend der ELISA-Methode (Kato, K. et al., J. Immunol., 116, 1554, 1976) mit Antikörpern gegen IFNα-2 (R&D, USA) getestet, welche als IFNα-2a-Menge, die pro 11 Kultur produziert wurde, bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Tabelle I: Vergleich der Expressionsmenge von IFNα-2

Transformant	Beispiel	Expressions-Vektor	Modifizierter Aminosäurerest in STII	IFNα-2-Level im Periplasma
HM 10600	Vergleichs-Beispiel 1	PT14SIα-2a		82 ± 40
HM 10601	Vergleichs-Beispiel 1	PT14SSIα-2a		325 ± 75
HM 10701	Vergleichs-Beispiel 2	PT14SSIα-2b		288 ± 90
HM 10602	Beispiel 1(1)	pT14SSIα-2a-4T	Thr⁴	550 ± 120
HM 10603	Beispiel 1(2)	pT14OSSIα-2a- 4T	Thr⁴	1,020 ± 135
HM 10604	Beispiel 1(2)	PT14SSIα-2a-4T22Q	Thr⁴, Gln²²	680 ± 105
HM 10611	Beispiel 1(2)	pT140SSIα-2a 4T22Q	Thr⁴, Gln²²	1,220 ± 120
HM 10612	Beispiel 1(3)	pT140SSIα-2a-4T20V22Q	Thr⁴, Val²⁰, Gln²²	1,130 ± 180
HM 10613	Beispiel 2	pT14NSSIα-2a 4T22Q	Thr⁴, Gln²²	750 ± 144
HM 10614	Beispiel 2	2T14MSSIα-2a-4T22Q	Thr⁴, Gln	420 ± 100
HM 10702	Beispiel 1(1)	pT14SSIα-2b-4T	Thr⁴	370 ± 90
HM 10703	Beispiel 1(2)	pT140SSIα-2b-4T	Thr⁴	735 ± 117
HM 10711	Beispiel 1(2)	pT140SSIα-2b-4T22Q	Thr⁴, Gln²²	1,070 ± 150
HM 10712	Beispiel 1(3)	pT140SSIα-2b-4T20V22Q	Zhr⁴, Val²⁰, Gln²²	820 ± 160
* IFNα mg/100 O.D_600nm/1 l Kulturlösung

Beispiel 4: Nachbehandlung und Aufreinigung
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 3 wurde der Transformant E. coli HM 10611, der in Beispiel 1 (2) erstellt wurde, in LB-Medium kultiviert, und die Kultur wurde bei 6.000 upm für 20 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu ernten. Die periplasmatische Lösung der Zellen wurde mit der osmotischen Schockmethode hergestellt.
Die periplasmatische Lösung wurde auf pH 5,0 bis 5,5 eingestellt, an einer S-Sepharosesäule (Pharmacia Inc., Schweden) adsorbiert, die auf pH 5,3 prä-equilibriert war, und dann wurde die Säule mit 25 mM NaCl gewaschen. IFNα-2 wurde durch nachfolgende Zugabe von Essigsäurepufferlösungen, die 50 mM, 100 mM, 200 mM bzw. 1 M NaCl enthielten, eluiert, und die Fraktionen, enthaltend IFNα-2, wurden gesammelt und vereint.
Die vereinten Fraktionen wurden einer Blue Sepharose-Säulenchromatographie (Pharmacia Inc., Schweden) unterzogen und durch die Zugabe von Pufferlösungen, die mehr als 2 M NaCl enthielten, eluiert, um eine aktive Fraktion zu erhalten.
Die aktive Fraktion wurde mit Puffer dialysiert, und schließlich einer Harzsäulenfraktionierung unterzogen, bei der eine DEAE-Anionenaustauscher-Harzsäule bei pH 5,8 verwendet wurde, um IFNα-2a mit einer Reinheit von mehr als 99% zu erzielen. Zusätzlich wurde IFNα-2b aus dem Transformanten E.coli HM 10711 aufgereinigt, indem das obige Verfahren wiederholt wurde.
Jede der aufgereinigten IFNα-2a- und IFNα-2b-Fraktionen wurde einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen, um die Reinheit und annähernde IFNα-Konzentration zu bestimmen, und wurde dann einer konventionellen ELISA-Methode wie in Beispiel 3 unterzogen, um die exakte IFNα-Konzentration in der periplasmatischen Lösung zu bestimmen. Ferner wurde mit N-terminaler Aminosäuresequenzanalyse bestätigt, daß IFNα-2a und IFNα-2b die nativen Typen ohne zusätzliches Methionin waren.
Beispiel 5: Bestimmung des IFNα-2a-Molekulargewichts, welches von rekombinanten Zellinien produziert wurde.
Die Expression und Molekulargewichte von IFNα-2a und IFNα-2b, welche aus rekombinanten Zellinien produziert wurden, wurden mit SDS-PAGE und Western blotting bestimmt.
Zuerst wurde die periplasmatische Fraktion des Transformanten E.coli HM 10611, hergestellt in Beispiel 4, und das daraus erhaltene aufgereinigte IFNα-2a einer SDS-PAGE unterzogen, wobei ein kommerzielles IFNα-2a-Produkt (3 × 10⁶ IU/ml) als Kontrolle entsprechend der konventionellen Methode benutzt wurde. 5a gibt das SDS-PAGE-Ergebnis wieder, in dem Spur 1 die IFNα-2a-Kontrolle zeigt; Spur 2 die periplasmatische Fraktion des E.coli-Transformanten HM 10611; und Spur 3 das gereinigte IFNα-2a. Wie in 5a zu sehen ist, hatte das aufgereinigte IFNα-2a das gleiche Molekulargewicht wie das des nativen IFNα-2a und war in der periplasmatischen Fraktion des Transformanten E.coli HM 10611 in einem hohen Level vorhanden.
Des weiteren wurden die periplasmatische Fraktion des Transformanten E.coli HM 10711, eine gereinigte Fraktion, die durch Durchführung einer S-Sepharose-Säulen-Chromatographie an der periplasmatischen Lösung erhalten wurde, und das schließlich gereinigte IFNα-2b einer SDS-PAGE entsprechend der konventionellen Methode unterzogen.
Ein Nitrozellulosefilter (Bio-Rad Lab, USA) wurde mit einer Pufferlösung zum Blotten (170 mM Glycin, 25 mM Tris HCl [pH 8], 20 % Methanol) angefeuchtet und die auf dem Gel separierten Proteine wurden auf den Nitrozellulosefilter über eine Zeit von 3 Stunden mit einem Blotting-Bausatz transferiert. Der Filter wurde für 1 Stunde in 1 % Casein aufbewahrt und dreimal mit PBS, welches 0,05 % Tween 20 beinhaltete, gewaschen. Der Filter wurde in eine Kaninchen-Anti-IFNα-Antikörper-Lösung (Chemicon, #AB1434, USA), die mit PBS verdünnt war, gegeben, und für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach der Reaktion wurde der Filter 3 mal mit einer PEST-Lösung gewaschen, um nicht reagierten Antikörper zu entfernen. Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Bio-Rad Lab., USA), der mit PBS verdünnt wurde, wurde dazugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Filter wurde mit PEST gewaschen und eine Peroxidase-Substrat-Kitlösung (Bio-Rad Lab., USA) wurde dazugegeben, um eine Farbreaktion hervorzurufen. Die Ergebnisse des obigen Western-Blottings sind in 5b gezeigt, wobei Spur 1 die periplasmatische Fraktion des Transformanten E.coli HM 10711 darstellt; Spur 2 die durch S-Sepharose-Säulen-Chromatographie aufgereinigte Fraktion darstellt; und Spur 3 das endgültig gereinigte IFNα-2ab darstellt.
Als Ergebnis des Beispiels wird bestätigt, daß eine große Menge von löslichem IFNα in den rekombinanten E.coli-Stämmen der vorliegenden Erfindung exprimiert wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionsvektor zur Sekretions-Produktion von humanem Interferon-alpha (hIFNα), umfassend: ein Polynukleotid, das für eine modifizierte thermostabile Enterotoxin-II-Signalsequenz kodiert; und ein Polynukleotid, das für hIFNα kodiert, ligiert an das 3'-Ende davon, wobei die modifizierte thermostabile Enterotoxin-II-Signalsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. Asparagins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin; einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. Asparagins und des 22. Tyrosins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin bzw. Glutamin; einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. und 20. Asparagins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin bzw. Valin, und einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. Asparagins, des 20. Asparagins und des 22. Tyrosins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin, Valin bzw. Glutamin.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid, das für hIFNα kodiert für IFNα-2a der SEQ ID NO: 1 oder IFNα-2b der SEQ ID NO: 2 kodiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, der weiterhin die thermostabile Enterotoxin-II-Shine-Dalgarno-Sequenz von E. coli (SD Sequenz, SEQ ID NO: 8) oder eine Mutante davon umfaßt, ligiert vorne an das 5'-Ende des Polynukleotids, das für die modifizierte thermostabile Enterotoxin-II-Signalsequenz kodiert, wobei die Mutante die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 9 hat.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: pT14SSIα-2a-4T, der basierend auf Plasmid pT14SSIα-2a konstruiert ist, wie in 3 gezeigt, wobei der 4. Aminosäurerest der Enterotoxin-II-Signalsequenz, die durch pT14SSIα-2a kodiert wird, durch Threonin ersetzt ist; pT14OSSIα-2a-4T, der in E. coli HM 10603 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10175 enthalten ist; pT14SSIα-2a-4T22Q, der basierend auf Plasmid pT14SSIα-2a konstruiert ist, wie in 3 gezeigt, wobei der 4. und 22. Aminosäurerest der Enterotoxin II-Signalsequenz, die durch pT14SSIα-2a kodiert wird, durch Threonin bzw. Glutamin ersetzt wird; pT14OSSIα-2a-4T22Q, der in E. coli HM 10611 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10176 enthalten ist; pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, der basierend auf Plasmid pT14OSSIα-2a-4T22Q konstruiert ist, enthalten in E. coli HM 10611 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10176, wobei der 20. Aminosäurerest der Enterotoxin-II-Signalsequenz, die durch pT14OSSIα-2a-4T22Q kodiert wird, durch Valin ersetzt ist; pT14NSSIα-2a-4T22Q, der basierend auf Plasmid pT14OSSIα-2a-4T22Q konstruiert ist, enthalten in E. coli HM 10611 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10176, wobei die Anzahl an Basen zwischen der Ribosomen-Bindungsstelle GAGG und dem Initiations-Codon ATG von 7 auf 5 reduziert worden ist durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung der Oligonukleotide von SEQ ID NO: 31 und 32; pT14MSSIα-2a-4T22Q, der basierend auf Plasmid pT14OSSIα-2a-4T22Q konstruiert ist, enthalten in E. coli HM 10611 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10176, wobei die Anzahl an Basen zwischen der Ribosomen-Bindungsstelle GAGG und dem Initiationscodon ATG von 7 auf 4 verringert worden ist durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung der Oligonukleotide von SEQ ID NO: 33 und 34; pT14SSIα-2b-4T, der basierend auf Plasmid pT14SSIα-2a konstruiert ist, wie in 3 gezeigt, wobei der 23. Aminosäurerest von IFNα-2a, kodiert durch pT14SSIα-2a, durch Arginin ersetzt worden ist; pT14OSSIα-2b-4T, der in E. coli HM 10703 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10177 enthalten ist; pT14OSSIα-2b-4T22Q, der in E. coli HM 10711 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10178 enthalten ist; und pT14OSSIα-2b-4T20V22Q, der basierend auf Plasmid pT14OSSIα-2b-4T22Q konstruiert ist, enthalten in E. coli HM 10711 unter der Hinterlegungs-Nr. KCCM-10178, wobei der 20. Aminosäurerest der Enterotoxin-II Signalsequenz, die durch pT14OSSIα-2b-4T22Q kodiert ist, durch Valin ersetzt ist.
Mikroorganismus, transformiert mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1-4.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, der E. coli ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 6, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus E. coli BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T (HM 10602), E. coli BL21 (DE3)/pT14OSSIα-2a-4T (HM 10603; Hinterlegungs-Nr. KCCM-10175), E. coli BL21 (DE3)/pT14SSSIα-2a-4T22Q (HM 10604); E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q (HM 10611; Hinterlegungs-Nr: KCCM-10176), E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q (HM 10612); E. coli BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q (HM 10613), E. coli BL21 (DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q (HM 10614), E. coli BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T (HM 10702), E. coli BL21(DE3) pT14OSSIα-2b-4T (HM 10703; Hinterlegungs-Nr. KCCM-10177), E. coli BL21 (DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q (HM 10711; Hinterlegungs-Nr. KCCM-10178) und E. coli BL21 (DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q (HM 10712).
Verfahren zum Erzeugen von hIFNα in sekretierter Form ohne zusätzlichen Methioninrest angehängt am N-Terminus, umfassend die Schritte: Transformieren eines Mikroorganismus mit einem Expressionsvektor zur Sekretions-Erzeugung von hIFNα, umfassend ein Polynukleotid, das für eine modifizierte thermostabile Enterotoxin-II-Signalsequenz kodiert, und ein Polynukleotid, das für hIFNα kodiert, ligiert an das 3'-Ende davon; und Kultivieren des transformierten Mikroorganismus, wobei die modifizierte thermostabile Enterotoxin-II-Signalsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. Asparagins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin; einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. Asparagins und 22. Tyrosins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin bzw. Glutamin; einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. und 20. Asparagins der Aminosäursequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin und Valin, und einem Polypeptid, erhalten durch Ersetzen des 4. Asparagins, des 20. Asparagins und des 22. Tyrosins der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 durch Threonin, Valin bzw. Glutamin.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polynukleotid, das für hIFNα kodiert, für IFNα-2a von SEQ ID NO: 1 oder IFNα-2b von SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verfahren nach Anspruch 8, das weiterhin die thermostabile Enterotoxin-II-SD-Sequenz von E. coli (SEQ ID NO: 8) oder eine Mutante davon umfaßt, ligiert vorne an das 5'-Ende des Polynukleotids, das für die modifizierte thermostabile Enterotoxin-II-Signalsequenz kodiert, wobei die Mutante die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 9 hat.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Expressionsvektor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Plasmiden pT14SSIα-2a-4T, pT14OSSIα-2a-4T, pT14SSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T22Q, pT14OSSIα-2a-4T20V22Q, pT14NSSIα-2a-4T22Q, pT14MSSIα-2a-4T22Q, pT14SSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T, pT14OSSIα-2b-4T22Q und pT14OSSIα-2b-4T20V22Q, die jeweils in Anspruch 4 definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der transformierte Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus E. coli BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T (HM 10602), E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T (HM 10603; Hinterlegungs-Nr. KCCM-10175), E. coli BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q (HM 10604), E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q (HM 10611; Hinterlegungs-Nr. KCCM-10176), E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q (HM 10612), E. coli BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q (HM 10613), E. coli BL2I(DE3/pE14MSSIα-2a-4T22Q (HM 10614), E. coli BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T (HM 10702), E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T (HM 10703; Hinterlegungs-Nr. KCCM-10177), E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q (HM 10711; Hinterlegungs-Nr. KCCM-10178) und E. coli BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q (HM 10712).