DE19856796A1

DE19856796A1 - Cleavage of chemically synthesized oligo- / polynucleotides at a predetermined location

Info

Publication number: DE19856796A1
Application number: DE1998156796
Authority: DE
Inventors: Holger Klapproth; Hubert Bernauer
Original assignee: Biochip Technologies GmbH
Current assignee: Biochip Technologies GmbH
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1998-12-09
Publication date: 2000-06-15
Also published as: WO2000034299A1; AU1657800A

Abstract

The invention relates to an oligonucleotide/polynucleotide characterized by the general formula A[-X-B]n, where n is 1 or an integer multiple of 1 and A and B represent identical or different nucleic acid molecules. If n > 1 B can represent identical or different nucleic acid molecules and X is a compound whose covalent bond(s) with A and B can be specifically cleaved by a chemical agent independently of the sequence. The invention also relates to a method for the chemical synthesis of an oligonucleotide/polynucleotide of the type described above. A different embodiment of the invention relates to a method for the chemical synthesis of a mixture of the at least two nucleic acid molecules A and B defined above.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligo-/Polynucleotid, das durch die allgemeine Formel A[-X-B]_n gekennzeichnet ist, wobei n gleich 1 oder ein ganzzahliges Vielfaches von 1 ist, A und B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstel len, wobei im Falle von n < 1 B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen kann, und X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunabhängig und spezifisch gespalten werden kann/können. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur chemischen Synthese eines vorgenannten Oligo-/Polynucleotids, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäure moleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben beschrie benen Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nuclein säuremoleküls B eine Elongation des im vorangehenden Schritt erzeugten Moleküls darstellt, und (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (c) und (d). In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Er findung ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei wie oben definierten Nucleinsäure molekülen A und B, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangehen den Schritt erzeugten Moleküls darstellt, (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (c) und (d), und (e) Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B.The present invention relates to an oligo- / polynucleotide which is characterized by the general formula A [-XB] _n , where n is 1 or an integer multiple of 1, A and B are identical or different nucleic acid molecules, in the case of n <1 B may represent the same or different nucleic acid molecules, and X is a compound which and / or whose covalent bonds with A and B can / can be cleaved by an agent in a sequence-independent and specific manner. The invention further relates to a method for the chemical synthesis of an aforementioned oligonucleotide / polynucleotide, which comprises the following steps: (a) synthesis of the nucleic acid molecule A, (b) covalent linkage of a compound X as described above with the nucleic acid molecule A, (c) Synthesis of the nucleic acid molecule B, the synthesis of the nucleic acid molecule B representing an elongation of the molecule generated in the previous step, and (d) optionally repeating steps (c) and (d) one or more times. In a further embodiment, the present invention relates to a process for the chemical synthesis of a mixture of the at least two nucleic acid molecules A and B as defined above, which comprises the following steps: (a) synthesis of the nucleic acid molecule A, (b) covalent linkage of a as above defined compound X with the nucleic acid molecule A, (c) synthesis of the nucleic acid molecule B, the synthesis of the nucleic acid molecule B being an elongation of the molecule generated in the previous step, (d) optionally repeating steps (c) and (d ), and (e) cleavage of the compound X and / or its covalent bonds with the at least two nucleic acid molecules A and B.

Für die chemische DNA-Synthese wird heutzutage im wesentlichen die Amiditchemie angewendet (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552). Bei neueren Ver fahren zur Synthese von DNA auf planaren Oberflächen, wie z. B. zur Herstellung von sogenannten "Arrays", werden zunehmend auch photoreaktivierbare Gruppen verwendet (Ahmad Hasan, et al., Tetrahedron Letters 53 (1997), 4247-4264).For chemical DNA synthesis today is essentially applied the amidite chemistry (Köster and Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stems and Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552). With newer ver drive to the synthesis of DNA on planar surfaces, such as. B. for the production of so-called "arrays" are increasing photo-reactivatable groups are also used (Ahmad Hasan, et al., Tetrahedron Letters 53 (1997), 4247-4264).

Für verschiedene Anwendungen werden Amidite von Nucleo tidanaloga angeboten oder auch einfachere Verbindungen mit synthesetauglichen Amiditgruppen, welche dazu verwendet wer den, Oligonucleotide mit kopplungsfähigen Gruppen, Haptenen oder beispielsweise mit Fluorochromen zu markieren.Amidites from Nucleo tid analogues or simpler connections with Amidite groups suitable for synthesis, which are used for this den, oligonucleotides with couplable groups, haptens or to mark with fluorochromes, for example.

Synthetische Oligonucleotide werden für eine Vielzahl von molekularbiologischen Verfahren verwendet, die zum größten Teil Varianten der Polymerasekettenreaktion (PCR-Technik) dar stellen. Auch für die Hybridisierung auf soliden Oberflächen finden immobilisierte Oligonucleotide Verwendung. Beide Ver fahren beruhen grundlegend auf der spezifischen Hy bridisierung. Die PCR-Reaktion beruht auf der spezifischen Hy bridisierung von mindestens zwei antipolar orientierten Primeroligonucleotiden an Matrizen-DNA in Lösung. Zur An wendung der PCR-Reaktion wird mindestens ein Primerpaar benötigt. Andere Varianten der Methode, z. B. die "nested primer"-PCR, oder die Multiplex-PCR benötigen drei oder mehr Primeroligonucleotide.Synthetic oligonucleotides are used for a variety of molecular biological methods used, the largest Some variants of the polymerase chain reaction (PCR technique) put. Also for hybridization on solid surfaces immobilized oligonucleotides are used. Both ver driving are based on the specific Hy bridization. The PCR reaction is based on the specific Hy bridization of at least two antipolar oriented Primer oligonucleotides on template DNA in solution. To the The PCR reaction uses at least one pair of primers needed. Other variants of the method, e.g. B. the "nested primer "-PCR, or the multiplex-PCR require three or more Primer oligonucleotides.

In der Regel werden Oligonucleotide an einer Festphase synthe tisiert. Der meist verwendete Standard ist heutzutage CPG-Glas ("controlled pore size glas"), auf das über eine Succin säureesterbindung jeweils eine der vier Basen als Start-Base angedockt ist. Neuerdings werden auch universelle Starter moleküle angeboten. Zu einer Oligonucleotidsynthese benötigt man in einer Syntheseeinheit eine Säule mit CPG, die einen Platz in der Synthesemaschine belegt.As a rule, oligonucleotides are synthesized on a solid phase tized. The most used standard today is CPG glass ("controlled pore size glass") on which a succin acid ester bond each one of the four bases as a starting base is docked. Recently, universal starters have also become available molecules offered. Needed for oligonucleotide synthesis one in a synthesis unit a column with CPG, the one Space occupied in the synthesis machine.

Wie vorstehend erwähnt, ist der Bedarf an chemisch hergestell ten Nucleinsäuremolekülen bereits enorm groß, und ein Ende dieses weiter zunehmenden Bedarfs ist aufgrund der Entwicklung immer neuerer molekularbiologischer Verfahren, die auf der Verwendung von chemisch hergestellten Oligonucleotiden beru hen, nicht abzusehen. Aufgrund dieser großen Nachfrage besteht ein dringender Bedarf, sowohl die Kapazität der Synthese maschinen als auch die Produktionskosten für Unternehmen, die solche Leistungen anbieten, zu senken.As mentioned above, the need for chemically manufactured is nucleic acid molecules are already huge, and an end this further increasing need is due to the development more and more recent molecular biological processes, which on the Use of chemically produced oligonucleotides is based hen not predicting. Because of this great demand there is an urgent need, both the capacity of synthesis machines as well as the production costs for companies that offer such services to lower.

Neben der PCR-Technik existieren eine Reihe weiterer moleku larbiologischer Techniken, die ebenfalls auf der Verwendung von zwei Oligonucleotiden beruhen, und, ähnlich wie im Fall der PCR-Technik, ist es auch bei diesen Verfahren von großer Wichtigkeit, daß die beiden Oligonucleotide in einem be stimmten molaren Verhältnis zueinander eingesetzt werden. Im Falle der PCR-Technik und in Fällen, in denen z. B. doppel strängige Oligonucleotide eingesetzt werden, ist das ge wünschte molare Verhältnis in der Regel 1 : 1. Ist der Einsatz von zwei Oligonucleotiden erforderlich, wird herkömmlicher weise nach der Synthese der beiden Oligonucleotide, gegebenen falls nach verschiedenen Behandlungsschritten, die Konzentra tion der Oligonucleotide bestimmt, um diese danach im Experi ment in einem bestimmten molaren Verhältnis zueinander ein zusetzen. Da der Einsatz von Oligonucleotiden in molaren Verhältnissen, die vom gewünschten Wert mehr oder weniger stark abweichen, zu unerwünschten Nebenreaktionen führen kann, die einen erheblichen negativen Einfluß auf die Quantität und Qualität eines Versuchsergebnisses haben können, ist der Fach mann in der Regel sehr bemüht, die Konzentrationen der Nucleinsäuren so exakt wie möglich zu bestimmen. Üblicherweise wird die Bestimmung der Konzentration einer Nucleinsäure pho tometrisch durchgeführt. Obwohl diese Methode prinzipiell Er gebnisse von ausreichender Genauigkeit liefern kann, existieren eine Reihe von Faktoren, die diese Genauigkeit be einträchtigen können. So können z. B. Verunreinigungen in der nucleinsäurehaltigen Lösung, aber auch zu hohe Nucleinsäure konzentrationen zu falschen Meßergebnissen führen, die wiederum zu falschen Konzentrationsberechnungen und schließlich zum Einsatz der Oligonucleotide in falschen mo laren Verhältnissen führen. Somit besteht neben dem oben genannten Bedarf von wirtschaftlicher Seite ein weiterer Be darf von wissenschaftlicher Seite, nämlich der Bedarf für eine Möglichkeit, Oligonucleotide in einem bestimmten molaren Verhältnis zueinander in einem Experiment einsetzen zu können, bei dem (ein) bestimmte(s) molares/molare Verhältnis(se) von zwei oder mehreren Nucleinsäuremolekülen wichtiger ist als die exakten absoluten Molaritäten.In addition to the PCR technique, there are a number of other molecules larbiological techniques that are also based on use are based on two oligonucleotides, and, similar to the case the PCR technique, it is also of great importance in these methods Importance that the two oligonucleotides in one be agreed molar ratio to each other. in the Case of the PCR technique and in cases where e.g. B. double stranded oligonucleotides are used, that is ge desired molar ratio usually 1: 1. Is the use required by two oligonucleotides is becoming more conventional given after the synthesis of the two oligonucleotides if after different treatment steps, the concentra tion of the oligonucleotides determined to this in the Experi ment in a certain molar ratio to each other clog. Because the use of oligonucleotides in molar Ratios of the desired value more or less deviate significantly, can lead to undesirable side reactions, which have a significant negative impact on quantity and The quality of a test result is the subject As a rule, one tries very hard to determine the concentrations of the Determine nucleic acids as precisely as possible. Usually is the determination of the concentration of a nucleic acid pho carried out tometrically. Although this method is principally Er can provide results of sufficient accuracy, There are a number of factors that affect this accuracy can impair. So z. B. impurities in the solution containing nucleic acid, but also too high nucleic acid concentrations lead to incorrect measurement results again wrong concentration calculations and finally to use the oligonucleotides in wrong mo lead conditions. So there is next to the above from the economic point of view another Be may from the scientific side, namely the need for a Possibility of oligonucleotides in a particular molar To be able to use relationships in an experiment at the determined molar / molar ratio (s) of two or more nucleic acid molecules is more important than that exact absolute molarities.

Das dieser Erfindung zugrunde liegende technische Problem war dementsprechend, Möglichkeiten bereitzustellen, die die oben erwähnten Bedürfnisse befriedigen.The technical problem underlying this invention was accordingly, to provide opportunities that the above satisfy the needs mentioned.

Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.This technical problem is solved by the provision of the the characterized embodiments solved.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligo- /Polynucleotid, das durch die allgemeine Formel A[-X-B]_n ge kennzeichnet ist, wobei n gleich 1 oder ein ganzzahliges Viel faches von 1 ist, A und B gleiche oder verschiedene Nuclein säuremoleküle darstellen, wobei im Falle von n < 1 B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen kann, und X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunabhängig und spezifisch gespalten werden kann/können.Thus, the present invention relates to an oligo- / polynucleotide which is characterized by the general formula A [-XB] _n , where n is 1 or an integer multiple of 1, A and B are identical or different nucleic acid molecules, where in the case of n <1 B can represent identical or different nucleic acid molecules, and X is a compound which and / or whose covalent bonds with A and B can / can be cleaved by an agent in a sequence-independent and specific manner.

Der Begriff "Oligo-/Polynucleotid" umfaßt im Sinne der vor liegenden Erfindung sowohl Nucleinsäuremoleküle mit einer Länge von ungefähr 50 bis zu 100 oder mehr Nucleotiden als auch Oligonucleotide, die eine Länge zwischen 10 oder weniger Nucleotiden und ungefähr 50 Nucleotiden aufweisen. Des weiteren umfaßt der Begriff "Oligo-/Polynucleotid" insbesondere Ribo-, Desoxyribo- und Peptidnucleinsäuremole küle.The term "oligo- / polynucleotide" includes in the sense of the lying invention both nucleic acid molecules with a Length from about 50 to 100 or more nucleotides than also oligonucleotides that are between 10 or less in length Nucleotides and approximately 50 nucleotides. Of further includes the term "oligo- / polynucleotide" especially ribo, deoxyribo and peptide nucleic acid moles cool.

Der Begriff "Verbindung X" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl einzelne Atome als auch Moleküle und Makro moleküle, die aus mehreren, kovalent verknüpften Atomen beste hen.The term "compound X" for the purposes of the present Invention both single atoms as well as molecules and macro molecules that consist of several, covalently linked atoms hen.

Der Begriff "sequenzunabhängig" bedeutet im Sinne der vorlie genden Erfindung, daß das Agens zur Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit den Nucleinsäure molekülen A und B nicht zuvor ein bestimmtes Sequenzmotiv, d. h. eine bestimmte Abfolge von Nucleotidbausteinen, erkennen muß, das sich innerhalb des Oligo-/Polynucleotids z. B. in un mittelbarem Anschluß vor und nach der Verbindung X oder auch in einem bestimmten Abstand von der Verbindung X entfernt be findet. Ist beispielsweise für die Spaltung die Erkennung ausschließlich der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B notwendig, so ist diese Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung sequenzunabhängig. Wäre jedoch die Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B Teil eines Sequenzmotivs, das notwendigerweise zur Spaltung erkannt werden muß, so würde eine solche Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als sequenzunabhängig gelten. Restriktionsendonucleasen sowohl des Typs II (Spaltung des Nucleinsäuremoleküls erfolgt innerhalb der Erkennungsse quenz) als auch des Typs I oder III (Spaltung des Nuclein säuremoleküls erfolgt außerhalb der Erkennungssequenz) erfül len deshalb z. B. nicht die erfindungsgemäßen Kriterien der Se quenzunabhängigkeit.The term "sequence-independent" means in the sense of the present The present invention that the agent for cleaving the compound X and / or their covalent bonds with the nucleic acid molecules A and B do not previously have a specific sequence motif, d. H. recognize a certain sequence of nucleotide building blocks must within the oligo- / polynucleotide z. B. in un indirect connection before and after connection X or also be at a certain distance from the connection X. finds. For example, is the detection for the split exclusively the compound X and / or its covalent Bonds with A and B are necessary, so this split is in the For the purposes of the present invention, sequence-independent. Would however, the compound X and / or its covalent bonds A and B part of a sequence motif, which is necessarily for Cleavage must be recognized, such a split would For the purposes of the present invention, not as sequence-independent be valid. Restriction endonucleases of both type II (cleavage of the nucleic acid molecule takes place within the recognition zone quenz) as well as type I or III (cleavage of the nuclein acid molecule takes place outside the recognition sequence) len therefore z. B. not the inventive criteria of Se cross-independence.

Der Begriff "spezifisch" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß mittels des Agens nur die Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen mit den Nucleinsäuremolekülen A und B gespalten wird, ohne daß es zu einer Spaltung einer oder mehrerer der Bindung(en) kommt, die die Nucleoside der Nucleinsäuremoleküle A und B verknüpft/verknüpfen und/oder Bestandteil der Nucleoside selbst ist/sind. Handelt es sich beispielsweise bei der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B um die einzige(n) Phosphodiester bindung(en), die durch eine Endonuclease gespalten wird/werden, so würde eine solche Spaltung im Sinne der vor liegenden Erfindung als spezifisch bezeichnet werden. Bindun gen, die nicht durch Nucleasen gespalten werden können, sind z. B. Phosphorothioat-, Methylphosphonat- oder Peptidbindungen. Handelt es sich hingegen bei der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B um eine oder mehrere Phos phodiesterbindungen, und wird das Oligo-/Polynucleotid mit einer unspezifisch spaltenden Endonuclease behandelt, so wird diese Behandlung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als spezifische Spaltung betrachtet, sofern zwei oder mehrere der Nucleoside des Nucleinsäuremoleküls A und/oder B ebenfalls über (eine) Phosphodiesterbindung(en) miteinander verknüpft sind und diese auch durch die verwendete Endonuclease gespal ten wird/werden. Eine chemische Modifikation des Oligo- /Polynucleotids und eine anschließende chemische Spaltung, wie sie z. B. bei der Sequenzierungsmethode nach Maxam & Gilbert eingesetzt wird, würde, um ein weiteres Beispiel zu geben, un ter den Begriff "spezifische Spaltung" fallen, wenn durch eine solche Behandlung nur die Verbindung X und/oder deren kova lente Bindungen mit A und B gespalten werden würde. Würde eine solche Behandlung nicht nur zur Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B, sondern auch zur Spaltung von einer oder mehreren weiteren Bindungen in den Nucleinsäuremolekülen A und/oder B führen, so wäre dies keine spezifische Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung.The term "specific" means in the sense of the present Invention that by means of the agent only the compound X and / or whose covalent bonds with the nucleic acid molecules A and B is split without causing a split or several of the bond (s) that the nucleosides of the Nucleic acid molecules A and B linked / link and / or Part of the nucleosides themselves is / are. Is it for example in the case of compound X and / or its covalent one Bonds with A and B around the only phosphodiester binding (s) cleaved by an endonuclease if / will, such a split in the sense of the lying invention can be referred to as specific. Bindun gene that cannot be cleaved by nucleases e.g. B. phosphorothioate, methylphosphonate or peptide bonds. However, it is the connection X and / or their covalent bonds with A and B around one or more Phos phodiester bonds, and the oligo- / polynucleotide with an unspecific cleaving endonuclease is treated this treatment in the sense of the present invention not as specific split considered, provided two or more of the Nucleosides of the nucleic acid molecule A and / or B also linked together via (a) phosphodiester bond (s) and are also split by the endonuclease used will / will. A chemical modification of the oligo / Polynucleotide and subsequent chemical cleavage, such as they z. B. in the sequencing method according to Maxam & Gilbert would be used, to give another example, un ter the term "specific cleavage" fall when by a such treatment only the compound X and / or its kova lent bonds with A and B would be split. Would one such treatment not only to cleave compound X and / or their covalent bonds with A and B, but also for cleaving one or more further bonds in the Lead nucleic acid molecules A and / or B, this would not be specific cleavage in the sense of the present invention.

Die Oligo-/Polynucleotide der vorliegenden Erfindung erlauben es vorteilhafterweise, Gemische herzustellen, die zwei oder mehrere Oligo- und/oder Polynucleotide in (einem) bestimmten Verhältnis(sen) enthalten. Enthält das erfindungsgemäße Poly nucleotid beispielsweise 1 Nucleinsäuremolekül A und 1 Nucleinsäuremolekül B, so erhält man nach Spaltung der Ver bindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B ein Gemisch, das das Nucleinsäuremolekül A und B exakt oder im we sentlichen im Verhältnis 1 : 1 enthält. Enthält das er findungsgemäße Polynucleotid z. B. 2, 3 oder 4 Kopien des Nucleinsäuremoleküls B, so lassen sich Gemische herstellen, die die Nucleinsäuremoleküle A und B exakt oder im wesentli chen im Verhältnis 1 : 2, 1 : 3 oder 1 : 4 enthalten. Es ist zu er warten, daß je nach Wahl der Oligo-/Polynucleotidsequenz und/oder der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B und des entsprechenden Agens, möglicherweise nicht jedes Oligo-/Polynucleotid oder gegebenenfalls nicht jede Ver bindung X und/oder deren kovalente Bindungen innerhalb eines Oligo-/Polynucleotids mittels des Agens gespalten wird, so daß das erzielte Verhältnis vom theoretisch erwarteten Wert ge ringfügig abweichen kann. Solche möglicherweise auftretenden geringfügigen Abweichungen von dem theoretisch erwarteten Verhältnis verleihen den entsprechenden Nucleinsäuregemischen nichtsdestotrotz die erfindungsgemäßen vorteilhaften Eigen schaften, wodurch solche Gemische ebenfalls von der vorliegen den Erfindung umfaßt sind.The oligo- / polynucleotides of the present invention allow it is advantageous to produce mixtures which two or determine several oligo- and / or polynucleotides in (one) Ratio (s) included. Contains the poly according to the invention nucleotide for example 1 nucleic acid molecule A and 1 Nucleic acid molecule B, so after cleavage of the ver bond X and / or their covalent bonds with A and B. Mixture that the nucleic acid molecule A and B exactly or in the we contains significant in a ratio of 1: 1. Does he contain that? inventive polynucleotide z. B. 2, 3 or 4 copies of the Nucleic acid molecule B, mixtures can be prepared which the nucleic acid molecules A and B exactly or in essence Chen in a ratio of 1: 2, 1: 3 or 1: 4. It is too wait for the choice of oligo- / polynucleotide sequence and / or the compound X and / or its covalent bonds with A and B and the corresponding agent, possibly not every oligo- / polynucleotide or possibly not every ver bond X and / or their covalent bonds within a Oligo- / polynucleotide is cleaved by means of the agent so that the achieved ratio of the theoretically expected value ge can vary slightly. Such may occur slight deviations from the theoretically expected Ratio give the corresponding nucleic acid mixtures nevertheless, the advantageous properties according to the invention shafts, whereby such mixtures are also present the invention are included.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Oligo-/Polynucleotid durch die allgemeine Formel 3'-A[-X-B]_n-5' oder 5'-A[-X-B]_n-3' gekennzeichnet.In a preferred embodiment, the oligo- / polynucleotide according to the invention is characterized by the general formula 3'-A [-XB] _n -5 'or 5'-A [-XB] _n -3'.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Oligo-/Polynucleotid ist 1 ≦ n < 100. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist 1 ≦ n < 50, und am meisten bevorzugt ist 1 ≦ n < 10.In a further preferred embodiment of the oligo- / polynucleotide according to the invention is 1 ≦ n <100. In one particularly preferred embodiment is 1 ≦ n <50, and am most preferably 1 ≦ n <10.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Er findung ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Oligo- /Polynucleotids wie oben beschrieben, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elonga tion des im vorangegangenen Schritt erzeugten Moleküls dar stellt, und (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wieder holung der Schritte (b) und (c), wobei die Nucleinsäuresyn these nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchge führt wird (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552).In a further embodiment, the present Er relates a process for the chemical synthesis of an oligo / Polynucleotides as described above, the following steps comprises: (a) synthesis of nucleic acid molecule A, (b) covalent Linking a connection X as defined above with the Nucleic acid molecule A, (c) synthesis of the nucleic acid molecule B, the synthesis of the nucleic acid molecule B being an elonga tion of the molecule generated in the previous step represents, and (d) optionally one or more times again repetition of steps (b) and (c), wherein the nucleic acid syn thesis by conventional methods known to those skilled in the art (Köster and Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1973, 10: 859-860; Stems and Pfleiderer, tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552).

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei.wie oben definierten Nucleinsäuremolekülen A und B, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäure moleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangegangenen Schritt erzeugten Moleküls darstellt, (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederhol ung der Schritte (b) und (c), und (e) Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B, wobei darunter selbstverständ lich auch Ausführungsformen fallen, in denen nach Wie derholung der Schritte (b) und (c) die Bindung(en) in B-X-B gespalten werden können, und wobei die Nucleinsäuresynthese nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt wird (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552).The present invention further relates to a method for chemical synthesis of a mixture of the at least two Nucleic acid molecules A and B defined above, the following Steps Includes: (a) Synthesis of Nucleic Acid Molecule A, (b) covalent linkage of a compound X as defined above with the nucleic acid molecule A, (c) synthesis of the nucleic acid molecule B, wherein the synthesis of the nucleic acid molecule B a Elongation of the molecule created in the previous step represents (d) repetition, if necessary, one or more times steps (b) and (c), and (e) cleavage of the compound X and / or their covalent bonds with the at least two Nucleic acid molecules A and B, of course Lich also fall into embodiments in which according to how repeating steps (b) and (c) the bond (s) in B-X-B can be cleaved, and doing nucleic acid synthesis carried out by customary methods known to those skilled in the art (Köster and Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stems and Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31: 2549-2552 (1990)).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Oligo-/Polynucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B gekoppelt an einer Festphase synthetisiert.In a preferred embodiment of the invention The oligo- / polynucleotide or at least two nucleic acid molecules A and B coupled to a solid phase synthesized.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, die Synthesekosten dadurch zu reduzieren, daß die Kosten für das Festphasenmaterial halbiert bzw. noch weiter reduziert werden, da zwei oder mehr Oligo- und/oder Polynucleotide ge koppelt an einer Festphase synthetisiert werden, und nicht für jedes Oligo- und/oder Polynucleotid separat Festphasenmaterial bereitgestellt werden muß. Die Kopplung an die Festphase erfolgt vorteilhafterweise nach konventionellen Verfahren. Weiterhin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu, Zusammensetzungen herzustellen, die nur Nucleinsäure moleküle enthalten, die aus der vollständigen gewünschten Se quenz bestehen und nicht mit Molekülen verunreinigt sind, die aufgrund eines frühzeitigen Abbruchs der Synthese nicht die vollständige gewünschte Sequenz aufweisen. Wird beispielsweise für ein Nucleinsäuremolekül A eine Sequenz gewählt, die kom plementär zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls B ist, und ist das zu synthetisierende Oligo-/Polynucleotid so an die Synthesematrix gekoppelt, daß es bei Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B nicht von der Synthesematrix abgespalten wird, so erhält man nach der Syn these des Oligo-/Polynucleotids und Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B ein an die Synthesematrix gekoppeltes Nucleinsäuremolekül A und ein in Lösung vorhandenes Nucleinsäuremolekül B, das aufgrund der Komplementarität der Sequenzen an das Nucleinsäuremolekül A hybridisieren kann. Über einen Temperaturgradient lassen sich nun "affinitätschromatographisch" alle Nucleinsäuremoleküle B abtrennen, die nicht die vollständige gewünschte Sequenz auf weisen, da diese abhängig von der Anzahl der hybridisierenden Nucleotide, die im Vergleich zu der vollständigen Sequenz fehlen, ab einer entsprechend hohen Temperatur nicht mehr in der Lage sind, mit dem Nucleinsäuremolekül A zu hybridisieren, und bei entsprechend hoher Temperatur nur noch in ihrer Se quenz vollständige Nucleinsäuremoleküle B hybridisieren. Auf diese Weise aufgereinigte in ihrer Sequenz vollständige Nucleinsäuremoleküle B lassen sich schließlich z. B. durch kur zes Erhitzen auf 100°C isolieren.The method according to the invention advantageously allows to reduce the synthesis costs in that the costs for the solid phase material halved or reduced even further be because two or more oligo- and / or polynucleotides ge couples to a solid phase, and not for each oligo- and / or polynucleotide separately solid phase material must be provided. The coupling to the solid phase is advantageously carried out by conventional methods. Furthermore, the method according to the invention is also suitable to make compositions containing only nucleic acid contain molecules that result from the complete desired Se exist and are not contaminated with molecules that due to early termination of the synthesis, not the have the complete desired sequence. For example selected a sequence for a nucleic acid molecule A, the com is complementary to the sequence of a nucleic acid molecule B, and is the oligo- / polynucleotide to be synthesized so Synthesis matrix coupled that when cleaving compound X and / or their covalent bonds with A and B not of the If the synthesis matrix is split off, the syn thesis of the oligo- / polynucleotide and cleavage of compound X and / or their covalent bonds with A and B to the Synthesis matrix coupled nucleic acid molecule A and an in Solution existing nucleic acid molecule B, which due to the Complementarity of the sequences to the nucleic acid molecule A can hybridize. About a temperature gradient now "affinity chromatography" all nucleic acid molecules B sever that does not have the full desired sequence point, since these depend on the number of hybridizing Nucleotides compared to the full sequence missing, from a correspondingly high temperature no longer in are able to hybridize with nucleic acid molecule A, and at a correspondingly high temperature only in their Se complete nucleic acid molecules B hybridize. On this way complete in sequence Nucleic acid molecules B can finally z. B. by kur Isolate heating to 100 ° C.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das er findungsgemäße Verfahren nach dem letzten Schritt eine Abspal tung des Oligo-/Polynucleotids oder des Nucleinsäuremoleküls A von der Festphase (Synthesematrix).In a particularly preferred embodiment, it comprises Process according to the invention after the last step tion of the oligo- / polynucleotide or the nucleic acid molecule A from the solid phase (synthesis matrix).

Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben es dem Fachmann also vorteilhafterweise, mittels einer Synthese zwei oder mehrere Oligo- und/oder Polynucleotide herzustellen. Neben den oben diskutierten Vorteilen, weisen die erfindungsgemäßen Verfahren eine Reihe weiterer vorteilhafter Eigenschaften auf. Zu diesen Eigenschaften zählt u. a., daß die Synthesekapazität von Nucleinsäure-Synthesemaschinen deutlich erhöht werden kann. Ist das Ziel der Synthese beispielsweise ein Gemisch von zwei Oligonucleotiden, so können bei Durchführung des er findungsgemäßen Verfahrens die zwei Oligonucleotide wie im Falle der Synthese eines einzelnen Oligonucleotids auf einer Synthesematrix synthetisiert werden. Außerdem findet nur eine Programmierung des Geräts statt. Wird eine Nucleinsäure-Syn thesemaschine nun mit einer maximal möglichen Anzahl von Syn theseeinheiten bestückt, so wird durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der Reduktion der notwendigen Ar beitsschritte die Synthesekapazität der Synthesemaschine deut lich erhöht.The methods according to the invention therefore allow the person skilled in the art to do so advantageously, two or more by means of a synthesis To produce oligonucleotides and / or polynucleotides. Besides the above The advantages according to the invention have the advantages discussed a number of other advantageous properties. To this Properties counts u. a. that the synthesis capacity of Nucleic acid synthesis machines can be increased significantly. For example, the goal of the synthesis is a mixture of two Oligonucleotides, so when performing the he inventive method the two oligonucleotides as in Case of synthesis of a single oligonucleotide on one Synthesis matrix can be synthesized. In addition, only one finds Programming the device instead. If a nucleic acid syn thesis machine now with a maximum possible number of syn these units, so the invention Procedure due to the reduction of the necessary Ar steps indicate the synthesis capacity of the synthesis machine Lich increased.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Fest phase eine planare Oberfläche oder "controlled pore size glas" (CPG).In a particularly preferred embodiment, the fixed phase a planar surface or "controlled pore size glass" (CPG).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Oligo-/Polynucleotid bzw. ein oder mehrere der mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B mit einer kopplungsfähigen Gruppe, einem Hapten, einem Chromophor, einem oder mehreren Fluorophoren, einem oder mehreren Chelatoren, einer enzymatisch modifizierbaren Gruppe oder einem Paar von modifizierenden Gruppen markiert.In a further preferred embodiment of the present The invention is the oligo- / polynucleotide or one or more of the at least two nucleic acid molecules A and B with one coupling group, a hapten, a chromophore, a or more fluorophores, one or more chelators, an enzymatically modifiable group or a pair of modifying groups marked.

Ein Paar von modifizierenden Gruppen kann z. B. ein Fluorophor und ein Quenchermolekül umfassen, oder ein Paar von Fluoropho ren, die in der Lage sind, Fluoreszenz-Resonanz-Energietrans fer (FRET) durchzuführen. Chelatoren können verwendet werden, um verschiedene Metalle und Übergangsmetalle wie z. B. fluo reszierendes Europium oder Ruthenium zu binden und damit das Emissionsspektrum einer Fluoreszenzanregung zugunsten einer vorteilhafteren Filterkombination zu verschieben.A pair of modifying groups can e.g. B. a fluorophore and comprise a quencher molecule, or a pair of fluoropho ren, which are able to transfer fluorescence resonance energy fer (FRET). Chelators can be used to various metals and transition metals such. B. fluo binding resident europium or ruthenium and thus the Emission spectrum of a fluorescence excitation in favor of one to move more advantageous filter combination.

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des Oligo- /Polynucleotids oder des Verfahrens der vorliegenden Erfindung weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 2 und 40 Nucleotiden auf.In an additional preferred embodiment of the oligo / Polynucleotide or the method of the present invention the at least two nucleic acid molecules A and B have one Length between 2 and 40 nucleotides.

Stellt es sich heraus, daß z. B. bestimmte Di-, Tri- oder Tet ramere eine besondere z. B. therapeutische oder prophylaktische Wirkung besitzen, so lassen sich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens solche Nucleinsäuremoleküle enthaltende Lösungen einfach und kostengünstig herstellen.It turns out that, for. B. certain di, tri or tet ramere a special z. B. therapeutic or prophylactic Have effect, can be by means of the invention Solutions containing such nucleic acid molecules easy and inexpensive to manufacture.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwi schen 10 und 30 Nucleotiden auf.In a particularly preferred embodiment, the at least two nucleic acid molecules A and B are between two between 10 and 30 nucleotides.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 13 und 25 Nucleotiden auf. In another particularly preferred embodiment the at least two nucleic acid molecules A and B have a length between 13 and 25 nucleotides.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das Oligo-/Polynucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B einzelsträngig.In a further preferred embodiment of the present Invention are the oligo- / polynucleotide or at least two nucleic acid molecules A and B single-stranded.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR).In another preferred embodiment of the present Invention are the at least two nucleic acid molecules A and B Primer for a polymerase chain reaction (PCR).

Die vorliegende Erfindung erlaubt es natürlich auch, Oligo nucleotide für Techniken herzustellen, die Varianten der PCR darstellen. Solche Techniken wie beispielsweise die sogenannte "Ligase Chain Reaction" (LCR) sind dem Fachmann bekannt (Lee, Biologicals 3 (1996), 197-199; Barany, PCR Methods Appl. 1 (1991), 5-16).The present invention naturally also allows oligo to produce nucleotides for techniques that use variants of PCR represent. Techniques such as the so-called "Ligase Chain Reaction" (LCR) are known to the person skilled in the art (Lee, Biologicals 3 (1996), 197-199; Barany, PCR Methods Appl. 1 (1991) 5-16).

Die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B können im Sinne der vorliegenden Erfindung jedoch auch zwei in ihrer Se quenz komplementäre Nucleinsäuremoleküle sein. Nach Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B kann eine Hybridisierung der komplementären Nucleinsäure moleküle z. B. durch kurzes Erhitzen und langsames Abkühlen der die Nucleinsäuremoleküle enthaltenden Lösung erzielt werden. Da die Nucleinsäuremoleküle z. B. im Verhältnis 1 : 1 vorliegen, erlaubt es die vorliegende Erfindung, doppelsträngige Nuclein säuremoleküle herzustellen, die im wesentlichen nicht durch einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle verunreinigt sind. Auf diese Weise hergestellte doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle können vorteilhafterweise z. B. als Linker eingesetzt werden, die an die Enden von DNA- oder RNA-Fragmenten ligiert werden können und somit diese Fragmente mit Restriktionsendonuclease- Schnittstellen z. B. zu Clonierungszwecken versehen. Die er findungsgemäß hergestellten doppelsträngigen Nucleinsäure moleküle können auch in sogenannten "Electrophoretic Mobility Shift Assays" (EMSAs) eingesetzt werden. Durch entsprechende Wahl der Sequenzen und entsprechender Anzahl von Nucleinsäure molekülen B ist es mittels der erfindungsgemäßen Verfahren natürlich auch möglich, Gemische von verschiedenen doppel strängigen Nucleinsäuremolekülen herzustellen.The at least two nucleic acid molecules A and B can in According to the present invention, however, two in their Se be complementary nucleic acid molecules. After division the compound X and / or their covalent bonds with A and B can hybridize the complementary nucleic acid molecules z. B. by briefly heating and slowly cooling the the solution containing nucleic acid molecules can be achieved. Since the nucleic acid molecules e.g. B. are present in a ratio of 1: 1, the present invention allows double-stranded nuclein to produce acid molecules that are essentially not single-stranded nucleic acid molecules are contaminated. On double-stranded nucleic acid molecules produced in this way can advantageously z. B. can be used as a linker, which are ligated to the ends of DNA or RNA fragments can and thus these fragments with restriction endonuclease Interfaces e.g. B. provided for cloning purposes. Which he double-stranded nucleic acid produced according to the invention Molecules can also be used in so-called "electrophoretic mobility Shift Assays "(EMSAs) can be used Choice of sequences and corresponding number of nucleic acids it is molecular B by means of the method according to the invention of course also possible, mixtures of different double to produce stranded nucleic acid molecules.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung X ein 5'-O-(o-Nitrophenyl)alk oxycarbonylnucleosid, ein Dicarbonsäure-di-cis-diolester oder eine thermisch spaltbare Verbindung.In another preferred embodiment of the present Invention is the compound X a 5'-O- (o-nitrophenyl) alk oxycarbonyl nucleoside, a dicarboxylic acid di-cis diol ester or a thermally fissile connection.

Thermisch spaltbare Verbindungen, die vorteilhafterweise im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind beispielsweise solche, die durch eine thermisch induzierte Cycloreversion des Typs (4+2) nach Diels-Alder gespalten wer den können.Thermally fissile compounds, which advantageously in Processes according to the invention can be used for example, those induced by a thermally Cycloreversion of type (4 + 2) according to Diels-Alder who split that can.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Oligo-/Polynucleotids oder des er findungsgemäßen Verfahrens ist die Verbindung X 5'- oder 3'-O- [2,2'-Di-(2-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl]-thymidin, Succinyl- 2,3-dihydroxytetrafuran oder Di-1,2-Hydroxycyclopentansuccin säurediester.In a particularly preferred embodiment of the oligo- / polynucleotide or he according to the invention The process according to the invention is the compound X 5'- or 3'-O- [2,2'-di- (2-nitrophenyl) ethoxycarbonyl] thymidine, succinyl- 2,3-dihydroxytetrafuran or di-1,2-hydroxycyclopentane succin acid diester.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Verfahrens ist das Agens ein chemisches und/oder physikalisches Agens.In a further preferred embodiment of the The method according to the invention is a chemical and / or physical agent.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das chemi sche Agens eine Säure oder Base.In a particularly preferred embodiment, the chemi an acid or base.

Idealerweise wird/werden für die Durchführung des er findungsgemäßen Verfahrens die Verbindung(en) X und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B so gewählt, daß die Behandlung des Polynucleotids zur Abtrennung von der Festphase nach der Synthese oder zur Abspaltung der zum Schutz der Basen vorhandenen chemischen Gruppen auch zu einer Spaltung der Ver bindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B führt. Somit kann A auch über X an die Matrix gebunden sein. Eine übliche Behandlung zur Abspaltung der Schutzgruppen von chemisch synthetisierten Nucleinsäuremolekülen ist die mehr stündige Inkubation bei ca. 55°C in einer konzentrierten Ammoniaklösung. Wird/werden nun während der Synthese des Polynucleotids eine oder mehrere Verbindung(en) X inkorporiert, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch Alkalibehandlung gespalten wird/werden, so erhält man in einem Arbeitsschritt ein Gemisch von einsatzbereiten Nuc leinsäuremolekülen.Ideally, he / she will be responsible for carrying out the inventive method the compound (s) X and / or their covalent bonds with A and B chosen so that the treatment of the polynucleotide for separation from the solid phase after the Synthesis or cleavage to protect the bases existing chemical groups also lead to a cleavage of ver bond X and / or their covalent bonds with A and B. leads. A can thus also be bound to the matrix via X. A common treatment to deprotect chemically synthesized nucleic acid molecules is the more hourly incubation at about 55 ° C in a concentrated Ammonia solution. Will / will now during the synthesis of the Polynucleotide one or more compound (s) X incorporated, and / or their covalent bonds with A and B is / are split by alkali treatment, one obtains a mixture of ready-to-use nuc linseed acid molecules.

In einer zusätzlichen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B thermisch und/oder photoinduziert.In an additional particularly preferred embodiment is the cleavage of compound X and / or its covalent Bonds with the at least two nucleic acid molecules A and B thermally and / or photo-induced.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Spaltung der Verbindung X und/oder deren ko valenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäure molekülen A und B eine Eliminierungsreaktion, eine intramolekulare Umlagerungsreaktion, eine hydrolytische Reak tion, die Umkehrung einer Additionsreaktion oder eine Cyclo reversion.In another preferred embodiment of the present Invention is the cleavage of compound X and / or its ko valent bonds with the at least two nucleic acids molecules A and B an elimination reaction, a intramolecular rearrangement reaction, a hydrolytic reac tion, the reversal of an addition reaction or a cyclo reversion.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Spal tung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B eine β-Eliminierungsreaktion, eine Umkehrung einer Mi chaelis-Addition, eine Woodward-Hoffmann-Reaktion oder eine Diels-Alder-Reaktion.In a particularly preferred embodiment, the gap device of the compound X and / or its covalent bonds A and B a β-elimination reaction, a reversal of a Mi chaelis addition, a Woodward-Hoffmann reaction or one Diels-Alder reaction.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Oligo-/Polynucleotids oder Verfahrens erzeugt die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B eine 5'- und 3'-OH-Gruppe oder eine 5'-Phosphatgruppe und eine 3'-OH-Gruppe in den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B.In a further preferred embodiment of the oligo- / polynucleotide or method according to the invention the cleavage of compound X and / or its covalent Bonds with the at least two nucleic acid molecules A and B is a 5'- and 3'-OH group or a 5'-phosphate group and a 3'-OH group in the at least two nucleic acid molecules A and B.

Die in dieser Anmeldung zitierten Publikationen sind hiermit per Referenz in die Anmeldung inkorporiert.The publications cited in this application are hereby incorporated into the application by reference.

Die Figuren zeigen:The figures show:

Fig. 1 Schematische Darstellung der internen Spaltungsreak tion in einem Oligonucleotid an einer vorbestimmten Stelle durch Einbau einer labilen Amiditverbindung während der Synthese, und nachfolgende Spal tungsreaktion:
M = Synthesematrix, O = labile Gruppe, - = Sequenz. Fig. 1 Schematic representation of the internal Spaltungsreak tion in an oligonucleotide at a predetermined position by incorporating a labile Amiditverbindung during synthesis and processing subsequent reaction Spal:
M = synthesis matrix, O = labile group, - = sequence.

Fig. 2 Plasmidclonierung und Linkeradaptor.
A: Plasmidende links (HindIII, schwarzer Balken),
B: Adaptor (HindIII, hellgrauer Balken, EcoRI),
C: zu ligierendes Fragment (EcoRI, dunkelgrauer Balken, AatII),
D: Plasmidende rechts (AatII, schwarzer Balken) Fig. 2 plasmid cloning and linker adapter.
A: plasmid end on the left (Hind III, black bar),
B: adapter (HindIII, light gray bar, EcoRI),
C: fragment to be ligated (EcoRI, dark gray bar, AatII),
D: plasmid end on the right (AatII, black bar)

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

example 1

Für eine Clonierungsreaktion wird ein doppelsträngiges Adap tormolekül benötigt, das in einer eigentlich inkompatiblen Li gationsreaktion eine geeignete Verbindung schafft zwischen einem Plasmid und einem zu ligierenden Fragment. Dies wird durch Inkorporation einer neuen Restriktionsschnittstelle mit geeignetem Überhang bewerkstelligt.For a cloning reaction, a double-stranded adap tormolecule needed in an actually incompatible Li reaction creates a suitable connection between a plasmid and a fragment to be ligated. this will by incorporating a new restriction interface with suitable overhang accomplished.

Üblicherweise würden nun zwei Oligonucleotide bei dem Synthe sedienstleister bestellt, die
Usually, two oligonucleotides would now be ordered from the synthesis service provider

1. are partially complementary to each other, furthermore
2. are partially complementary with matching single strands overhangs, on the one hand at one plasmid end (A: B),
3. on the other hand at the left end of the fragment to be ligated (B: C).

Das Syntheselabor würde für je einen Strang der Einzelstrang- DNA zwei Synthesen durchführen, und der Forscher müßte dann zur Herstellung des Adaptors die beiden einzelsträngigen DNAs in exakt dem gleichen Verhältnis mischen und diese dann für die Clonierung vorbereiten.The synthesis laboratory would DNA perform two syntheses, and the researcher would then have to to produce the adapter, the two single-stranded DNAs mix in exactly the same ratio and then mix them for prepare the cloning.

Im vorliegenden Falle wurden die beiden einzelsträngigen DNAs jedoch in einer Synthese hintereinandergeschaltet und zeit gleich in der gleichen Synthesesäule synthetisiert, indem die beiden Sequenzen bei der Synthese durch den Einbau eines Di- Diol-Succinsäureesteramidits miteinander verbunden wurden.In the present case, the two single-stranded DNAs however, connected in series in a synthesis and time synthesized in the same synthesis column by the two sequences in the synthesis by incorporating a di- Diol succinic acid ester amidites were linked together.

Bei der Ammoniumabspaltung der Schutzgruppen nach der Synthese spalten sich die beiden einzelsträngigen Oligos voneinander ab und können sich dann aneinanderlagern. Das richtige stöchio metrische Verhältnis (1 : 1) wurde durch das Syntheseverfahren bereits eingestellt. Das Adaptormolekül konnte so fertig zur Ligation direkt ausgeliefert werden. When the protecting groups are split off after synthesis the two single-stranded oligos separate and can then stack up. The right stoichio metric ratio (1: 1) was determined by the synthetic method already set. The adapter molecule was thus ready for Ligation can be delivered directly.

Ligation buffer

1 µl Ligationspuffer (T4-DNA-Ligase, BioLabs)
1 µl Ligase (1 U)
1 µl Plasmid pNEB193 (50 ng)
1 µl Fragment pAO1-15 (150 ng)
1 µl Adaptoroligonucleotid (10 ng)
5 µl H₂ 1 µl ligation buffer (T4 DNA ligase, BioLabs)
1 µl ligase (1 U)
1 µl plasmid pNEB193 (50 ng)
1 µl fragment pAO1-15 (150 ng)
1 µl adapter oligonucleotide (10 ng)
5 µl H ₂

O
10 µlO
10 µl

GesamtansatzOverall approach

Die Ligationsreaktion erfolgte 5 h bei 16°C. Der Ligationsan satz wurde mit Ethanol gefällt und mit 70% Ethanol an schließend gewaschen, getrocknet und nach Standardprotokoll in kompetente DH10α-E. coli Zellen transformiert und auf Ampicil linplatten (50 µg/ml, Amp) plattiert. Zwanzig Transformanten wurden ausgewählt und in LB-Medium (50 µg/ml Ampicillin) ange zogen.The ligation reaction took place at 16 ° C. for 5 h. The ligationsan Set was precipitated with ethanol and with 70% ethanol finally washed, dried and in accordance with the standard protocol competent DH10α-E. coli cells transformed on Ampicil lin plates (50 µg / ml, Amp) plated. Twenty transformants were selected and placed in LB medium (50 µg / ml ampicillin) pulled.

Die Analyse der Transformanten erfolgte nach der Plasmid präparation-Alkali-Methode: A rapid alkaline extraction method für the isolation of plasmid DNA, Birnboim, HC., Methods Enzymol. 1983; 100: 243-55 mittels Restriktionsanalyse (EcoRI- AatII).The transformants were analyzed after the plasmid Preparation Alkali Method: A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA, Birnboim, HC., Methods Enzymol. 1983; 100: 243-55 by means of restriction analysis (EcoRI- AatII).

Example 2

Für eine generelle PCR-Strategie zum Nachweis und zur Diffe renzierung verschiedener Lactobacillenspezies wie z. B. Lacto bacillus fermentum, L. fructivorans, L. brevis und/oder L. cremoris in Sauerteig wurden im stöchiometrischen Verhältnis (1 : 1) ein Primer-Paar zum Nachweis der 16S RNA auf einem DNA- Array eingesetzt.
41f-Primer: GCTCAGATTGAACGCTGGCG
1066R-Primer: ACATTTCACAACACGAGCTGFor a general PCR strategy for the detection and differentiation of different lactobacilli species such. B. Lacto bacillus fermentum, L. fructivorans, L. brevis and / or L. cremoris in sourdough were used in a stoichiometric ratio (1: 1) a pair of primers to detect the 16S RNA on a DNA array.
41f primer: GCTCAGATTGAACGCTGGCG
1066R primer: ACATTTCACAACACGAGCTG

Mit diesem Primerpaar aus hochkonservierten Sequenzen ist es möglich, die divergierenden Sequenzen aus vielen verschiedenen Bakterienspezies, die zwischen den Primersequenzen liegen, zu amplifizieren und in einem Hybridisierungsexperiment voneinan der zu trennen, wobei die entstehenden Signale einer be stimmten Bakterienspezies zugeordnet werden können.It is with this primer pair of highly conserved sequences possible the divergent sequences from many different Bacterial species that lie between the primer sequences amplify and in a hybridization experiment of each other the separate, the resulting signals of a be agreed bacterial species can be assigned.

Die entsprechenden Primersequenzen wurden in einer Oligo nucleotid-Synthese in einer Sequenzfolge am Stück synthe tisiert. Die einzelnen Sequenzabschnitte wurden durch den Ein bau von Trityl-di-cis-diol-dicarbonsäureamidite miteinander verbunden. Bei der Ammoniumabspaltung der Schutzgruppen nach der Synthese spalteten sich die zwei verschiedenen einzel strängigen Oligos voneinander ab und können direkt in der PCR- Reaktion Verwendung finden. Das Primerpaar konnte in einer Synthese hergestellt und direkt im PCR-Experiment eingesetzt werden. Die entstehenden Fragmente wurden zum Hybridisie rungsexperiment mit FITC-dUTP intern markiert.The corresponding primer sequences were in an oligo nucleotide synthesis in a sequence following the piece synthe tized. The individual sections of the sequence were construction of trityl-di-cis-diol-dicarboxylic acid amidites with each other connected. When the protecting groups are split off with ammonium The synthesis of the two different ones split stranded oligos and can be directly in the PCR Reaction use. The primer pair could be in one Synthesis produced and used directly in the PCR experiment will. The resulting fragments became a hybridisie experiment marked with FITC-dUTP internally.

Claims

1. Oligo / polynucleotide, characterized by the general formula:
A [-XB] _n ,
in which:

1. n is 1, or an integer multiple of 1;
2. A and B represent the same or different nucleic acid molecules, where in the case of n <1 B can represent the same or different nucleic acid molecules; and
3. X is a compound which and / or whose covalent bonds with A and B can / can be cleaved in a sequence-independent and specific manner by an agent.

2. oligo- / polynucleotide according to claim 1, characterized by the general formula
3'-A [-XB] _n -5 '
or
5'-A [-XB] _n -3 '.

3. A method for the chemical synthesis of an oligo- / polynucleotide according to claim 1 or 2, comprising the steps:

a) synthesis of the nucleic acid molecule A;
b) covalent linkage of a compound X, as defined in claim 1, with the nucleic acid molecule A;
c) synthesis of the nucleic acid molecule B, the synthesis of the nucleic acid molecule B representing an elongation of the molecule generated in step (b); and
d) repeating steps (b) and (c) one or more times if necessary.

4. A method for the chemical synthesis of a mixture of the at least two nucleic acid molecules A and B as defined in claim 1 or 2, comprising the steps:

a) synthesis of the nucleic acid molecule A;
b) covalent linkage of a compound X as defined in claim 1 with the nucleic acid molecule A;
c) synthesis of the nucleic acid molecule B, the synthesis of the nucleic acid molecule B representing an elongation of the molecule generated in step (b);
d) optionally repeating steps (b) and (c) one or more times; and
e) cleavage of the compound X and / or its covalent bonds with the at least two nucleic acid molecules A and B.

5. The method according to claim 3 or 4, wherein the oligo- / poly nucleotide or the at least two nucleic acid molecules A and B coupled to a solid phase.

6. The method according to claim 5, which according to step (d) or (e) cleavage of the oligo- / polynucleotide or of the nuc Linseed molecule A comprises the solid phase.

7. The method according to claim 5 or 6, wherein the solid phase planar surface or "controlled pore size glass" (CPG) is.

6. oligo- / polynucleotide according to claim 1 or 2, or Method according to one of claims 3 to 7, wherein the Oligo- / polynucleotide or one or more of the at least two nucleic acid molecules A and 8 with one coupling group, a hapten, a chromophore, one or more fluorophore (s), one or more Chelator (s), an enzymatically modifiable group or a pair of modifying groups is marked.

9. oligo- / polynucleotide according to claim 1, 2 or 8, or Method according to one of claims 3 to 8, wherein the at least two nucleic acid molecules A and B a length have between 2 and 40 nucleotides.

10. The oligo- / polynucleotide or method of claim 9, wherein the at least two nucleic acid molecules A and B one Have a length between 10 and 30 nucleotides.

11. oligo- / polynucleotide or method according to claim 10, wherein the at least two nucleic acid molecules A and B have a length between 13 and 25 nucleotides.

12. Oligo / polynucleotide according to one of claims 1, 2 or 8 to 11, or method according to any one of claims 3 to 11, wherein the oligo- / polynucleotide or the at least two Nucleic acid molecules A and B are single-stranded.

13. oligo- / polynucleotide according to one of claims 1, 2 or 8 to 12, or method according to one of claims 3 to 12, wherein the at least two nucleic acid molecules A and B Are primers for a polymerase chain reaction (PCR).

14. Oligo- / polynucleotide according to one of claims 1, 2 or 8 to 13, or method according to any one of claims 3 to 13, wherein the compound X is a 5'-O- (o-nitrophenyl) alkoxy carbonyl nucleoside, a dicarboxylic acid di-cis diol ester or is a thermally fissile connection.

15. The oligo- / polynucleotide or method of claim 14 where for the compound X 5'- or 3'-O- [2,2'-di- (2-nitrophe nyl) ethoxycarbonyl] thymidine, succinyl-2,3-dihydroxytetra furan or di-1,2-hydroxycyclopentanesuccinic acid diester is.

16. Oligo- / polynucleotide according to one of claims 1, 2 or 8 to 15, or method according to any one of claims 3 to 15, wherein the agent is a chemical and / or physical Agent is.

17. The oligo / polynucleotide or method of claim 16 where where the chemical agent is an acid or base.

18. Oligo- / polynucleotide or method according to claim 16 or 17, wherein the cleavage of compound X and / or their ko valent bonds with the at least two nucleic acids Molecules A and B is thermally and / or photo-induced.

19. Oligo- / polynucleotide according to one of claims 1, 2 or 8 to 18, or method according to any one of claims 3 to 18, wherein the cleavage of compound X and / or its kova lent bonds with the at least two nucleic acids molecules A and B an elimination reaction, one in tramolecular rearrangement reaction, a hydrolytic Reaction, the reversal of an addition reaction or a Is cycloreversion.

20. oligo- / polynucleotide according to one of claims 1, 2 or 8 to 19, or method according to any one of claims 3 to 19, wherein the cleavage of compound X and / or its kova lent bonds with the at least two nucleic acids Molecules A and B represent a 5'- and 3'-OH group or a 5'- Phosphate group and a 3'-OH group in the at least generated two nucleic acid molecules A and B.