DE19856796A1

DE19856796A1 - Spaltung von chemisch synthetisierten Oligo-/Polynucleotiden an einer vorbestimmten Stelle

Info

Publication number: DE19856796A1
Application number: DE1998156796
Authority: DE
Inventors: Holger Klapproth; Hubert Bernauer
Original assignee: Biochip Technologies GmbH
Current assignee: Biochip Technologies GmbH
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1998-12-09
Publication date: 2000-06-15
Also published as: WO2000034299A1; AU1657800A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligo-/Polynucleotid, das durch die allgemeine Formel A[-X-B]¶n¶ gekennzeichnet ist, wobei n gleich 1 oder ein ganzzahliges Vielfaches von 1 ist, A und B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen, wobei im Falle von n > 1 B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen kann, und X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunabhängig und spezifisch gespalten werden kann/können. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur chemischen Synthese eines vorgenannten Oligo-/Polynucleotids. In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei wie oben definierten Nucleinsäuremolekülen A und B.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligo-/Polynucleotid, das durch die allgemeine Formel A[-X-B]_n gekennzeichnet ist, wobei n gleich 1 oder ein ganzzahliges Vielfaches von 1 ist, A und B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstel len, wobei im Falle von n < 1 B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen kann, und X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunabhängig und spezifisch gespalten werden kann/können. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur chemischen Synthese eines vorgenannten Oligo-/Polynucleotids, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäure moleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben beschrie benen Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nuclein säuremoleküls B eine Elongation des im vorangehenden Schritt erzeugten Moleküls darstellt, und (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (c) und (d). In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Er findung ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei wie oben definierten Nucleinsäure molekülen A und B, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangehen den Schritt erzeugten Moleküls darstellt, (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (c) und (d), und (e) Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B.

Für die chemische DNA-Synthese wird heutzutage im wesentlichen die Amiditchemie angewendet (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552). Bei neueren Ver fahren zur Synthese von DNA auf planaren Oberflächen, wie z. B. zur Herstellung von sogenannten "Arrays", werden zunehmend auch photoreaktivierbare Gruppen verwendet (Ahmad Hasan, et al., Tetrahedron Letters 53 (1997), 4247-4264).

Für verschiedene Anwendungen werden Amidite von Nucleo tidanaloga angeboten oder auch einfachere Verbindungen mit synthesetauglichen Amiditgruppen, welche dazu verwendet wer den, Oligonucleotide mit kopplungsfähigen Gruppen, Haptenen oder beispielsweise mit Fluorochromen zu markieren.

Synthetische Oligonucleotide werden für eine Vielzahl von molekularbiologischen Verfahren verwendet, die zum größten Teil Varianten der Polymerasekettenreaktion (PCR-Technik) dar stellen. Auch für die Hybridisierung auf soliden Oberflächen finden immobilisierte Oligonucleotide Verwendung. Beide Ver fahren beruhen grundlegend auf der spezifischen Hy bridisierung. Die PCR-Reaktion beruht auf der spezifischen Hy bridisierung von mindestens zwei antipolar orientierten Primeroligonucleotiden an Matrizen-DNA in Lösung. Zur An wendung der PCR-Reaktion wird mindestens ein Primerpaar benötigt. Andere Varianten der Methode, z. B. die "nested primer"-PCR, oder die Multiplex-PCR benötigen drei oder mehr Primeroligonucleotide.

In der Regel werden Oligonucleotide an einer Festphase synthe tisiert. Der meist verwendete Standard ist heutzutage CPG-Glas ("controlled pore size glas"), auf das über eine Succin säureesterbindung jeweils eine der vier Basen als Start-Base angedockt ist. Neuerdings werden auch universelle Starter moleküle angeboten. Zu einer Oligonucleotidsynthese benötigt man in einer Syntheseeinheit eine Säule mit CPG, die einen Platz in der Synthesemaschine belegt.

Wie vorstehend erwähnt, ist der Bedarf an chemisch hergestell ten Nucleinsäuremolekülen bereits enorm groß, und ein Ende dieses weiter zunehmenden Bedarfs ist aufgrund der Entwicklung immer neuerer molekularbiologischer Verfahren, die auf der Verwendung von chemisch hergestellten Oligonucleotiden beru hen, nicht abzusehen. Aufgrund dieser großen Nachfrage besteht ein dringender Bedarf, sowohl die Kapazität der Synthese maschinen als auch die Produktionskosten für Unternehmen, die solche Leistungen anbieten, zu senken.

Neben der PCR-Technik existieren eine Reihe weiterer moleku larbiologischer Techniken, die ebenfalls auf der Verwendung von zwei Oligonucleotiden beruhen, und, ähnlich wie im Fall der PCR-Technik, ist es auch bei diesen Verfahren von großer Wichtigkeit, daß die beiden Oligonucleotide in einem be stimmten molaren Verhältnis zueinander eingesetzt werden. Im Falle der PCR-Technik und in Fällen, in denen z. B. doppel strängige Oligonucleotide eingesetzt werden, ist das ge wünschte molare Verhältnis in der Regel 1 : 1. Ist der Einsatz von zwei Oligonucleotiden erforderlich, wird herkömmlicher weise nach der Synthese der beiden Oligonucleotide, gegebenen falls nach verschiedenen Behandlungsschritten, die Konzentra tion der Oligonucleotide bestimmt, um diese danach im Experi ment in einem bestimmten molaren Verhältnis zueinander ein zusetzen. Da der Einsatz von Oligonucleotiden in molaren Verhältnissen, die vom gewünschten Wert mehr oder weniger stark abweichen, zu unerwünschten Nebenreaktionen führen kann, die einen erheblichen negativen Einfluß auf die Quantität und Qualität eines Versuchsergebnisses haben können, ist der Fach mann in der Regel sehr bemüht, die Konzentrationen der Nucleinsäuren so exakt wie möglich zu bestimmen. Üblicherweise wird die Bestimmung der Konzentration einer Nucleinsäure pho tometrisch durchgeführt. Obwohl diese Methode prinzipiell Er gebnisse von ausreichender Genauigkeit liefern kann, existieren eine Reihe von Faktoren, die diese Genauigkeit be einträchtigen können. So können z. B. Verunreinigungen in der nucleinsäurehaltigen Lösung, aber auch zu hohe Nucleinsäure konzentrationen zu falschen Meßergebnissen führen, die wiederum zu falschen Konzentrationsberechnungen und schließlich zum Einsatz der Oligonucleotide in falschen mo laren Verhältnissen führen. Somit besteht neben dem oben genannten Bedarf von wirtschaftlicher Seite ein weiterer Be darf von wissenschaftlicher Seite, nämlich der Bedarf für eine Möglichkeit, Oligonucleotide in einem bestimmten molaren Verhältnis zueinander in einem Experiment einsetzen zu können, bei dem (ein) bestimmte(s) molares/molare Verhältnis(se) von zwei oder mehreren Nucleinsäuremolekülen wichtiger ist als die exakten absoluten Molaritäten.

Das dieser Erfindung zugrunde liegende technische Problem war dementsprechend, Möglichkeiten bereitzustellen, die die oben erwähnten Bedürfnisse befriedigen.

Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligo- /Polynucleotid, das durch die allgemeine Formel A[-X-B]_n ge kennzeichnet ist, wobei n gleich 1 oder ein ganzzahliges Viel faches von 1 ist, A und B gleiche oder verschiedene Nuclein säuremoleküle darstellen, wobei im Falle von n < 1 B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle darstellen kann, und X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunabhängig und spezifisch gespalten werden kann/können.

Der Begriff "Oligo-/Polynucleotid" umfaßt im Sinne der vor liegenden Erfindung sowohl Nucleinsäuremoleküle mit einer Länge von ungefähr 50 bis zu 100 oder mehr Nucleotiden als auch Oligonucleotide, die eine Länge zwischen 10 oder weniger Nucleotiden und ungefähr 50 Nucleotiden aufweisen. Des weiteren umfaßt der Begriff "Oligo-/Polynucleotid" insbesondere Ribo-, Desoxyribo- und Peptidnucleinsäuremole küle.

Der Begriff "Verbindung X" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl einzelne Atome als auch Moleküle und Makro moleküle, die aus mehreren, kovalent verknüpften Atomen beste hen.

Der Begriff "sequenzunabhängig" bedeutet im Sinne der vorlie genden Erfindung, daß das Agens zur Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit den Nucleinsäure molekülen A und B nicht zuvor ein bestimmtes Sequenzmotiv, d. h. eine bestimmte Abfolge von Nucleotidbausteinen, erkennen muß, das sich innerhalb des Oligo-/Polynucleotids z. B. in un mittelbarem Anschluß vor und nach der Verbindung X oder auch in einem bestimmten Abstand von der Verbindung X entfernt be findet. Ist beispielsweise für die Spaltung die Erkennung ausschließlich der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B notwendig, so ist diese Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung sequenzunabhängig. Wäre jedoch die Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B Teil eines Sequenzmotivs, das notwendigerweise zur Spaltung erkannt werden muß, so würde eine solche Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als sequenzunabhängig gelten. Restriktionsendonucleasen sowohl des Typs II (Spaltung des Nucleinsäuremoleküls erfolgt innerhalb der Erkennungsse quenz) als auch des Typs I oder III (Spaltung des Nuclein säuremoleküls erfolgt außerhalb der Erkennungssequenz) erfül len deshalb z. B. nicht die erfindungsgemäßen Kriterien der Se quenzunabhängigkeit.

Der Begriff "spezifisch" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß mittels des Agens nur die Verbindung X und/oder deren kovalente Bindungen mit den Nucleinsäuremolekülen A und B gespalten wird, ohne daß es zu einer Spaltung einer oder mehrerer der Bindung(en) kommt, die die Nucleoside der Nucleinsäuremoleküle A und B verknüpft/verknüpfen und/oder Bestandteil der Nucleoside selbst ist/sind. Handelt es sich beispielsweise bei der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B um die einzige(n) Phosphodiester bindung(en), die durch eine Endonuclease gespalten wird/werden, so würde eine solche Spaltung im Sinne der vor liegenden Erfindung als spezifisch bezeichnet werden. Bindun gen, die nicht durch Nucleasen gespalten werden können, sind z. B. Phosphorothioat-, Methylphosphonat- oder Peptidbindungen. Handelt es sich hingegen bei der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B um eine oder mehrere Phos phodiesterbindungen, und wird das Oligo-/Polynucleotid mit einer unspezifisch spaltenden Endonuclease behandelt, so wird diese Behandlung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als spezifische Spaltung betrachtet, sofern zwei oder mehrere der Nucleoside des Nucleinsäuremoleküls A und/oder B ebenfalls über (eine) Phosphodiesterbindung(en) miteinander verknüpft sind und diese auch durch die verwendete Endonuclease gespal ten wird/werden. Eine chemische Modifikation des Oligo- /Polynucleotids und eine anschließende chemische Spaltung, wie sie z. B. bei der Sequenzierungsmethode nach Maxam & Gilbert eingesetzt wird, würde, um ein weiteres Beispiel zu geben, un ter den Begriff "spezifische Spaltung" fallen, wenn durch eine solche Behandlung nur die Verbindung X und/oder deren kova lente Bindungen mit A und B gespalten werden würde. Würde eine solche Behandlung nicht nur zur Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B, sondern auch zur Spaltung von einer oder mehreren weiteren Bindungen in den Nucleinsäuremolekülen A und/oder B führen, so wäre dies keine spezifische Spaltung im Sinne der vorliegenden Erfindung.

Die Oligo-/Polynucleotide der vorliegenden Erfindung erlauben es vorteilhafterweise, Gemische herzustellen, die zwei oder mehrere Oligo- und/oder Polynucleotide in (einem) bestimmten Verhältnis(sen) enthalten. Enthält das erfindungsgemäße Poly nucleotid beispielsweise 1 Nucleinsäuremolekül A und 1 Nucleinsäuremolekül B, so erhält man nach Spaltung der Ver bindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B ein Gemisch, das das Nucleinsäuremolekül A und B exakt oder im we sentlichen im Verhältnis 1 : 1 enthält. Enthält das er findungsgemäße Polynucleotid z. B. 2, 3 oder 4 Kopien des Nucleinsäuremoleküls B, so lassen sich Gemische herstellen, die die Nucleinsäuremoleküle A und B exakt oder im wesentli chen im Verhältnis 1 : 2, 1 : 3 oder 1 : 4 enthalten. Es ist zu er warten, daß je nach Wahl der Oligo-/Polynucleotidsequenz und/oder der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B und des entsprechenden Agens, möglicherweise nicht jedes Oligo-/Polynucleotid oder gegebenenfalls nicht jede Ver bindung X und/oder deren kovalente Bindungen innerhalb eines Oligo-/Polynucleotids mittels des Agens gespalten wird, so daß das erzielte Verhältnis vom theoretisch erwarteten Wert ge ringfügig abweichen kann. Solche möglicherweise auftretenden geringfügigen Abweichungen von dem theoretisch erwarteten Verhältnis verleihen den entsprechenden Nucleinsäuregemischen nichtsdestotrotz die erfindungsgemäßen vorteilhaften Eigen schaften, wodurch solche Gemische ebenfalls von der vorliegen den Erfindung umfaßt sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Oligo-/Polynucleotid durch die allgemeine Formel 3'-A[-X-B]_n-5' oder 5'-A[-X-B]_n-3' gekennzeichnet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Oligo-/Polynucleotid ist 1 ≦ n < 100. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist 1 ≦ n < 50, und am meisten bevorzugt ist 1 ≦ n < 10.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Er findung ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Oligo- /Polynucleotids wie oben beschrieben, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elonga tion des im vorangegangenen Schritt erzeugten Moleküls dar stellt, und (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wieder holung der Schritte (b) und (c), wobei die Nucleinsäuresyn these nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchge führt wird (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552).

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei.wie oben definierten Nucleinsäuremolekülen A und B, das folgende Schritte umfaßt: (a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A, (b) kovalente Verknüpfung einer wie oben definierten Verbindung X mit dem Nucleinsäuremolekül A, (c) Synthese des Nucleinsäure moleküls B, wobei die Synthese des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im vorangegangenen Schritt erzeugten Moleküls darstellt, (d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederhol ung der Schritte (b) und (c), und (e) Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B, wobei darunter selbstverständ lich auch Ausführungsformen fallen, in denen nach Wie derholung der Schritte (b) und (c) die Bindung(en) in B-X-B gespalten werden können, und wobei die Nucleinsäuresynthese nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt wird (Köster und Heidmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 10 (1973), 859-860; Stengele und Pfleiderer, Tetrahedron Letters 31 (1990), 2549-2552).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Oligo-/Polynucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B gekoppelt an einer Festphase synthetisiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, die Synthesekosten dadurch zu reduzieren, daß die Kosten für das Festphasenmaterial halbiert bzw. noch weiter reduziert werden, da zwei oder mehr Oligo- und/oder Polynucleotide ge koppelt an einer Festphase synthetisiert werden, und nicht für jedes Oligo- und/oder Polynucleotid separat Festphasenmaterial bereitgestellt werden muß. Die Kopplung an die Festphase erfolgt vorteilhafterweise nach konventionellen Verfahren. Weiterhin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu, Zusammensetzungen herzustellen, die nur Nucleinsäure moleküle enthalten, die aus der vollständigen gewünschten Se quenz bestehen und nicht mit Molekülen verunreinigt sind, die aufgrund eines frühzeitigen Abbruchs der Synthese nicht die vollständige gewünschte Sequenz aufweisen. Wird beispielsweise für ein Nucleinsäuremolekül A eine Sequenz gewählt, die kom plementär zu der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls B ist, und ist das zu synthetisierende Oligo-/Polynucleotid so an die Synthesematrix gekoppelt, daß es bei Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B nicht von der Synthesematrix abgespalten wird, so erhält man nach der Syn these des Oligo-/Polynucleotids und Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B ein an die Synthesematrix gekoppeltes Nucleinsäuremolekül A und ein in Lösung vorhandenes Nucleinsäuremolekül B, das aufgrund der Komplementarität der Sequenzen an das Nucleinsäuremolekül A hybridisieren kann. Über einen Temperaturgradient lassen sich nun "affinitätschromatographisch" alle Nucleinsäuremoleküle B abtrennen, die nicht die vollständige gewünschte Sequenz auf weisen, da diese abhängig von der Anzahl der hybridisierenden Nucleotide, die im Vergleich zu der vollständigen Sequenz fehlen, ab einer entsprechend hohen Temperatur nicht mehr in der Lage sind, mit dem Nucleinsäuremolekül A zu hybridisieren, und bei entsprechend hoher Temperatur nur noch in ihrer Se quenz vollständige Nucleinsäuremoleküle B hybridisieren. Auf diese Weise aufgereinigte in ihrer Sequenz vollständige Nucleinsäuremoleküle B lassen sich schließlich z. B. durch kur zes Erhitzen auf 100°C isolieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das er findungsgemäße Verfahren nach dem letzten Schritt eine Abspal tung des Oligo-/Polynucleotids oder des Nucleinsäuremoleküls A von der Festphase (Synthesematrix).

Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben es dem Fachmann also vorteilhafterweise, mittels einer Synthese zwei oder mehrere Oligo- und/oder Polynucleotide herzustellen. Neben den oben diskutierten Vorteilen, weisen die erfindungsgemäßen Verfahren eine Reihe weiterer vorteilhafter Eigenschaften auf. Zu diesen Eigenschaften zählt u. a., daß die Synthesekapazität von Nucleinsäure-Synthesemaschinen deutlich erhöht werden kann. Ist das Ziel der Synthese beispielsweise ein Gemisch von zwei Oligonucleotiden, so können bei Durchführung des er findungsgemäßen Verfahrens die zwei Oligonucleotide wie im Falle der Synthese eines einzelnen Oligonucleotids auf einer Synthesematrix synthetisiert werden. Außerdem findet nur eine Programmierung des Geräts statt. Wird eine Nucleinsäure-Syn thesemaschine nun mit einer maximal möglichen Anzahl von Syn theseeinheiten bestückt, so wird durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der Reduktion der notwendigen Ar beitsschritte die Synthesekapazität der Synthesemaschine deut lich erhöht.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Fest phase eine planare Oberfläche oder "controlled pore size glas" (CPG).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Oligo-/Polynucleotid bzw. ein oder mehrere der mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B mit einer kopplungsfähigen Gruppe, einem Hapten, einem Chromophor, einem oder mehreren Fluorophoren, einem oder mehreren Chelatoren, einer enzymatisch modifizierbaren Gruppe oder einem Paar von modifizierenden Gruppen markiert.

Ein Paar von modifizierenden Gruppen kann z. B. ein Fluorophor und ein Quenchermolekül umfassen, oder ein Paar von Fluoropho ren, die in der Lage sind, Fluoreszenz-Resonanz-Energietrans fer (FRET) durchzuführen. Chelatoren können verwendet werden, um verschiedene Metalle und Übergangsmetalle wie z. B. fluo reszierendes Europium oder Ruthenium zu binden und damit das Emissionsspektrum einer Fluoreszenzanregung zugunsten einer vorteilhafteren Filterkombination zu verschieben.

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des Oligo- /Polynucleotids oder des Verfahrens der vorliegenden Erfindung weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 2 und 40 Nucleotiden auf.

Stellt es sich heraus, daß z. B. bestimmte Di-, Tri- oder Tet ramere eine besondere z. B. therapeutische oder prophylaktische Wirkung besitzen, so lassen sich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens solche Nucleinsäuremoleküle enthaltende Lösungen einfach und kostengünstig herstellen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwi schen 10 und 30 Nucleotiden auf.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 13 und 25 Nucleotiden auf.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das Oligo-/Polynucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B einzelsträngig.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Die vorliegende Erfindung erlaubt es natürlich auch, Oligo nucleotide für Techniken herzustellen, die Varianten der PCR darstellen. Solche Techniken wie beispielsweise die sogenannte "Ligase Chain Reaction" (LCR) sind dem Fachmann bekannt (Lee, Biologicals 3 (1996), 197-199; Barany, PCR Methods Appl. 1 (1991), 5-16).

Die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B können im Sinne der vorliegenden Erfindung jedoch auch zwei in ihrer Se quenz komplementäre Nucleinsäuremoleküle sein. Nach Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B kann eine Hybridisierung der komplementären Nucleinsäure moleküle z. B. durch kurzes Erhitzen und langsames Abkühlen der die Nucleinsäuremoleküle enthaltenden Lösung erzielt werden. Da die Nucleinsäuremoleküle z. B. im Verhältnis 1 : 1 vorliegen, erlaubt es die vorliegende Erfindung, doppelsträngige Nuclein säuremoleküle herzustellen, die im wesentlichen nicht durch einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle verunreinigt sind. Auf diese Weise hergestellte doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle können vorteilhafterweise z. B. als Linker eingesetzt werden, die an die Enden von DNA- oder RNA-Fragmenten ligiert werden können und somit diese Fragmente mit Restriktionsendonuclease- Schnittstellen z. B. zu Clonierungszwecken versehen. Die er findungsgemäß hergestellten doppelsträngigen Nucleinsäure moleküle können auch in sogenannten "Electrophoretic Mobility Shift Assays" (EMSAs) eingesetzt werden. Durch entsprechende Wahl der Sequenzen und entsprechender Anzahl von Nucleinsäure molekülen B ist es mittels der erfindungsgemäßen Verfahren natürlich auch möglich, Gemische von verschiedenen doppel strängigen Nucleinsäuremolekülen herzustellen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung X ein 5'-O-(o-Nitrophenyl)alk oxycarbonylnucleosid, ein Dicarbonsäure-di-cis-diolester oder eine thermisch spaltbare Verbindung.

Thermisch spaltbare Verbindungen, die vorteilhafterweise im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind beispielsweise solche, die durch eine thermisch induzierte Cycloreversion des Typs (4+2) nach Diels-Alder gespalten wer den können.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Oligo-/Polynucleotids oder des er findungsgemäßen Verfahrens ist die Verbindung X 5'- oder 3'-O- [2,2'-Di-(2-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl]-thymidin, Succinyl- 2,3-dihydroxytetrafuran oder Di-1,2-Hydroxycyclopentansuccin säurediester.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Verfahrens ist das Agens ein chemisches und/oder physikalisches Agens.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das chemi sche Agens eine Säure oder Base.

Idealerweise wird/werden für die Durchführung des er findungsgemäßen Verfahrens die Verbindung(en) X und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B so gewählt, daß die Behandlung des Polynucleotids zur Abtrennung von der Festphase nach der Synthese oder zur Abspaltung der zum Schutz der Basen vorhandenen chemischen Gruppen auch zu einer Spaltung der Ver bindung X und/oder deren kovalenten Bindungen mit A und B führt. Somit kann A auch über X an die Matrix gebunden sein. Eine übliche Behandlung zur Abspaltung der Schutzgruppen von chemisch synthetisierten Nucleinsäuremolekülen ist die mehr stündige Inkubation bei ca. 55°C in einer konzentrierten Ammoniaklösung. Wird/werden nun während der Synthese des Polynucleotids eine oder mehrere Verbindung(en) X inkorporiert, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch Alkalibehandlung gespalten wird/werden, so erhält man in einem Arbeitsschritt ein Gemisch von einsatzbereiten Nuc leinsäuremolekülen.

In einer zusätzlichen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B thermisch und/oder photoinduziert.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Spaltung der Verbindung X und/oder deren ko valenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäure molekülen A und B eine Eliminierungsreaktion, eine intramolekulare Umlagerungsreaktion, eine hydrolytische Reak tion, die Umkehrung einer Additionsreaktion oder eine Cyclo reversion.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Spal tung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit A und B eine β-Eliminierungsreaktion, eine Umkehrung einer Mi chaelis-Addition, eine Woodward-Hoffmann-Reaktion oder eine Diels-Alder-Reaktion.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Oligo-/Polynucleotids oder Verfahrens erzeugt die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B eine 5'- und 3'-OH-Gruppe oder eine 5'-Phosphatgruppe und eine 3'-OH-Gruppe in den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B.

Die in dieser Anmeldung zitierten Publikationen sind hiermit per Referenz in die Anmeldung inkorporiert.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 Schematische Darstellung der internen Spaltungsreak tion in einem Oligonucleotid an einer vorbestimmten Stelle durch Einbau einer labilen Amiditverbindung während der Synthese, und nachfolgende Spal tungsreaktion:
M = Synthesematrix, O = labile Gruppe, - = Sequenz.

Fig. 2 Plasmidclonierung und Linkeradaptor.
A: Plasmidende links (HindIII, schwarzer Balken),
B: Adaptor (HindIII, hellgrauer Balken, EcoRI),
C: zu ligierendes Fragment (EcoRI, dunkelgrauer Balken, AatII),
D: Plasmidende rechts (AatII, schwarzer Balken)

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Für eine Clonierungsreaktion wird ein doppelsträngiges Adap tormolekül benötigt, das in einer eigentlich inkompatiblen Li gationsreaktion eine geeignete Verbindung schafft zwischen einem Plasmid und einem zu ligierenden Fragment. Dies wird durch Inkorporation einer neuen Restriktionsschnittstelle mit geeignetem Überhang bewerkstelligt.

Üblicherweise würden nun zwei Oligonucleotide bei dem Synthe sedienstleister bestellt, die

1. teilweise komplementär zueinander sind, des weiteren
2. teilweise komplementär sind mit passenden einzel-strängi gen Überhängen, zum einen an dem einen Plasmidende (A : B),
3. zum anderen am linken Ende des zu ligierenden Fragmentes (B : C).

Das Syntheselabor würde für je einen Strang der Einzelstrang- DNA zwei Synthesen durchführen, und der Forscher müßte dann zur Herstellung des Adaptors die beiden einzelsträngigen DNAs in exakt dem gleichen Verhältnis mischen und diese dann für die Clonierung vorbereiten.

Im vorliegenden Falle wurden die beiden einzelsträngigen DNAs jedoch in einer Synthese hintereinandergeschaltet und zeit gleich in der gleichen Synthesesäule synthetisiert, indem die beiden Sequenzen bei der Synthese durch den Einbau eines Di- Diol-Succinsäureesteramidits miteinander verbunden wurden.

Bei der Ammoniumabspaltung der Schutzgruppen nach der Synthese spalten sich die beiden einzelsträngigen Oligos voneinander ab und können sich dann aneinanderlagern. Das richtige stöchio metrische Verhältnis (1 : 1) wurde durch das Syntheseverfahren bereits eingestellt. Das Adaptormolekül konnte so fertig zur Ligation direkt ausgeliefert werden.

Ligationspuffer

1 µl Ligationspuffer (T4-DNA-Ligase, BioLabs)
1 µl Ligase (1 U)
1 µl Plasmid pNEB193 (50 ng)
1 µl Fragment pAO1-15 (150 ng)
1 µl Adaptoroligonucleotid (10 ng)
5 µl H₂

O
10 µl

Gesamtansatz

Die Ligationsreaktion erfolgte 5 h bei 16°C. Der Ligationsan satz wurde mit Ethanol gefällt und mit 70% Ethanol an schließend gewaschen, getrocknet und nach Standardprotokoll in kompetente DH10α-E. coli Zellen transformiert und auf Ampicil linplatten (50 µg/ml, Amp) plattiert. Zwanzig Transformanten wurden ausgewählt und in LB-Medium (50 µg/ml Ampicillin) ange zogen.

Die Analyse der Transformanten erfolgte nach der Plasmid präparation-Alkali-Methode: A rapid alkaline extraction method für the isolation of plasmid DNA, Birnboim, HC., Methods Enzymol. 1983; 100: 243-55 mittels Restriktionsanalyse (EcoRI- AatII).

Beispiel 2

Für eine generelle PCR-Strategie zum Nachweis und zur Diffe renzierung verschiedener Lactobacillenspezies wie z. B. Lacto bacillus fermentum, L. fructivorans, L. brevis und/oder L. cremoris in Sauerteig wurden im stöchiometrischen Verhältnis (1 : 1) ein Primer-Paar zum Nachweis der 16S RNA auf einem DNA- Array eingesetzt.
41f-Primer: GCTCAGATTGAACGCTGGCG
1066R-Primer: ACATTTCACAACACGAGCTG

Mit diesem Primerpaar aus hochkonservierten Sequenzen ist es möglich, die divergierenden Sequenzen aus vielen verschiedenen Bakterienspezies, die zwischen den Primersequenzen liegen, zu amplifizieren und in einem Hybridisierungsexperiment voneinan der zu trennen, wobei die entstehenden Signale einer be stimmten Bakterienspezies zugeordnet werden können.

Die entsprechenden Primersequenzen wurden in einer Oligo nucleotid-Synthese in einer Sequenzfolge am Stück synthe tisiert. Die einzelnen Sequenzabschnitte wurden durch den Ein bau von Trityl-di-cis-diol-dicarbonsäureamidite miteinander verbunden. Bei der Ammoniumabspaltung der Schutzgruppen nach der Synthese spalteten sich die zwei verschiedenen einzel strängigen Oligos voneinander ab und können direkt in der PCR- Reaktion Verwendung finden. Das Primerpaar konnte in einer Synthese hergestellt und direkt im PCR-Experiment eingesetzt werden. Die entstehenden Fragmente wurden zum Hybridisie rungsexperiment mit FITC-dUTP intern markiert.

Claims

1. Oligo/Polynucleotid, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel:
A[-X-B]_n,
wobei:

1. n gleich 1, oder ein ganzzahliges Vielfaches von 1 ist;
2. A und B gleiche oder verschiedene Nucleinsäure moleküle darstellen, wobei im Falle von n < 1 B gleiche oder verschiedene Nucleinsäuremoleküle dar stellen kann; und
3. X eine Verbindung ist, die und/oder deren kovalente Bindungen mit A und B durch ein Agens sequenzunab hängig und spezifisch gespalten werden kann/können.

2. Oligo-/Polynucleotid nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel
3'-A[-X-B]_n-5'
oder
5'-A[-X-B]_n-3'.

3. Verfahren zur chemischen Synthese eines Oligo-/Polynucleo tids nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Schritte:

a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A;
b) kovalente Verknüpfung einer Verbindung X, wie in An spruch 1 definiert, mit dem Nucleinsäuremolekül A;
c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Syn these des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des in Schritt (b) erzeugten Moleküls darstellt; und
d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (b) und (c).

4. Verfahren zur chemischen Synthese eines Gemischs aus den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B wie in An spruch 1 oder 2 definiert, umfassend die Schritte:

a) Synthese des Nucleinsäuremoleküls A;
b) kovalente Verknüpfung einer Verbindung X wie in An spruch 1 definiert mit dem Nucleinsäuremolekül A;
c) Synthese des Nucleinsäuremoleküls B, wobei die Syn these des Nucleinsäuremoleküls B eine Elongation des im Schritt (b) erzeugten Moleküls darstellt;
d) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (b) und (c); und
e) Spaltung der Verbindung X und/oder deren kovalenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäure molekülen A und B.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Oligo-/Poly nucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B gekoppelt an eine Festphase synthetisiert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, das nach Schritt (d) oder (e) eine Abspaltung des Oligo-/Polynucleotids oder des Nuc leinsäuremoleküls A von der Festphase umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Festphase eine planare Oberfläche oder "controlled pore size glas" (CPG) ist.

6. Oligo-/Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Oligo-/Polynucleotid oder ein oder mehrere der mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und 8 mit einer kopplungsfähigen Gruppe, einem Hapten, einem Chromophor, einem oder mehreren Fluorophor(en), einem oder mehreren Chelator(en), einer enzymatisch modifizierbaren Gruppe oder einem Paar von modifizierenden Gruppen markiert ist.

9. Oligo-/Polynucleotid nach Anspruch 1, 2 oder 8, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 2 und 40 Nucleotiden aufweisen.

10. Oligo-/Polynucleotid oder Verfahren nach Anspruch 9, wobei die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 10 und 30 Nucleotiden aufweisen.

11. Oligo-/Polynucleotid oder Verfahren nach Anspruch 10, wobei die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B eine Länge zwischen 13 und 25 Nucleotiden aufweisen.

12. Oligo-/Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 8 bis 11, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei das Oligo-/Polynucleotid oder die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B einzelsträngig sind.

13. Oligo-/Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 8 bis 12, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12, wobei die mindestens zwei Nucleinsäuremoleküle A und B Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind.

14. Oligo-/Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 8 bis 13, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, wobei die Verbindung X ein 5'-O-(o-Nitrophenyl)alkoxy carbonylnucleosid, ein Dicarbonsäure-di-cis-diolester oder eine thermisch spaltbare Verbindung ist.

15. Oligo-/Polynucleotid oder Verfahren nach Anspruch 14, wo bei die Verbindung X 5'- oder 3'-O-[2,2'-Di-(2-Nitrophe nyl)ethoxycarbonyl]-thymidin, Succinyl-2,3-dihydroxytetra furan oder Di-1,2-Hydroxycyclopentansuccinsäurediester ist.

16. Oligo-/Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 8 bis 15, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 15, wobei das Agens ein chemisches und/oder physikalisches Agens ist.

17. Oligo-/Polynucleotid oder Verfahren nach Anspruch 16, wo bei das chemische Agens eine Säure oder Base ist.

18. Oligo-/Polynucleotid oder Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Spaltung der Verbindung X und/oder deren ko valenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäure molekülen A und B thermisch und/oder photoinduziert ist.

19. Oligo-/Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 8 bis 18, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 18, wobei die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kova lenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäure molekülen A und B eine Eliminierungsreaktion, eine in tramolekulare Umlagerungsreaktion, eine hydrolytische Reaktion, die Umkehrung einer Additionsreaktion oder eine Cycloreversion ist.

20. Oligo-/Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 8 bis 19, oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 19, wobei die Spaltung der Verbindung X und/oder deren kova lenter Bindungen mit den mindestens zwei Nucleinsäure molekülen A und B eine 5'- und 3'-OH-Gruppe oder eine 5'- Phosphatgruppe und eine 3'-OH-Gruppe in den mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen A und B erzeugt.