DE19820850A1

DE19820850A1 - Verfahren zur Markierung von lebenden Geweben

Info

Publication number: DE19820850A1
Application number: DE1998120850
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Gluesenkamp; Frank Seiler; Martin Wiemann; Harald Kosegarten; Detlef Steinweg; Heiner Goldbach
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-05-05
Filing date: 1998-05-05
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: DE19820850B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Farbmarkierung und Milieubestimmung von lebenden Geweben mit analytischen Sonden, Farbstoffen und zur kontrollierten Freisetzung von Wirksubstanzen mittels Boronsäure-Derivaten.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung von lebenden Geweben mit analytischen Sonden, Farbstoffen und zur kontrollierten Freisetzung von Wirksubstanzen und zur Herstellung chemischer Sonden und Markierung von lebenden Geweben. Ein großer Nachteil vieler bekannter analytischer Sonden z. B. Farbstoffe ist, daß diese aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften sich rasch im Gewebe verteilen und so gemessene Größen wie z. B. Fluoreszenz nur Durchschnittswerte darstellen können. So zeigt der Eisenfarbstoff NBD-Des ferral (Yona Chen et al., Plant Physiol. (1992), 99, 1329-1335) zwar eine von der Eisenkonzentration abhängige Fluoreszenz in pflanzlichen Geweben, aber diese Werte stellen keine kompartimentspezifische Meßgrößen sondern nur Durchschnittswerte dar. Aufgrund der hydrophoben Eigenschaften breitet sich dieser Farbstoff rasch im Gewebe aus. Erwünscht ist daher ein Verfahren zur kompartimentspezifischen Plazierung von Sonden, um raumaufgelöste Messung von, z. B. Ionen, zu erhalten. So ist es mit der vorliegende Erfindung möglich eine schonenden Markierung von polymeren Trägern, wie z. B. verschiedene Pflanzenzellen, Zellorganellen und Gewebeschnitten mit einer Vielzahl von unterschiedlichen biochemische Sonden (Proben), wie z. B. Farbstoffe, physiologische Indikatoren, Antibiotika, Enzyminhibitoren, Chelate, Lipide, Tracer, Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide bzw. die entsprechenden monomeren Bausteine, vorzunehmen.

Darüber hinaus ist es ebenfalls erwünscht, Wirkstoffe derart zu applizieren, daß ihre Wirkung im Organismus verstärkt wird und z. B. zelluläre Abbauvorgänge verhindert oder zumindest verlangsamt werden. Im Rahmen dieser Erfindung sind neuartige Arylboronsäuren entwickelt worden, die ein überraschend breites neues Anwendungsspektrum erlauben.

Die erfindungsgemäßen Arylboronsäuren können solche Boronsäure-Derivate der Formel (I) (Z)_k Y-B(OH)₂ sein, wobei
Y: ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2-Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, ist, sowie
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung ist, an welcher vorzugsweise ein oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)₂ oder -O-B(OH)₂ oder

sind,
worin L gleich T oder Z, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH-Gruppen aufweist,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen sind, und
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist,
und/oder Boronsäureester-Derivate der Formel (II) [(Z)_k Y-B]_m C sein, wobei

T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2-Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere ein Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: B(OH)₂ oder -O-B(OH)₂ oder

sind,
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierten oder unsubstituierten OH-Gruppen aufweist,
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und
m eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise 2 bis 6, noch mehr bevorzugt 1, 2, 3, 4 oder 5, ist.

Eine überraschend neue Anwendungsmöglichkeit der Farbstoff-Boronsäure-Addukte ist die Möglichkeit, Schnittblumen oder auch freiwachsenden Pflanzen gezielt anzufärben. Die Farbstoffe können über die Wurzeln oder auch im Falle von Schnittblumen, durch die Schnittfläche aufgenommen werden. Zusätzliche Substitution mit Boronsäuregruppen wirkt sich durch eine langanhaltende Farbstabilität aus. Darüber hinaus ist es möglich sein, durch gezielte Substitution des Farbstoffes mit Boronsäuregruppen sowie Mischungen von verschiedenen Farbstoff-Klassen bestimmte Bereiche der Pflanze z. B. Stengel, oder Blüten bevorzugt zu färben, um gezielt bestimmte Farbmuster zu erzeugen. Auf diese Weise können schon geringe Farbstoffmengen zu einer deutlichen Anfärbung von Blütenpflanzen führen.

Die kompartimentspezifische Kopplung von Boronsäurederivaten kann man ausnutzen, um in geeigneten Indikatorpflanzen die Bodenbelastungen mit Umweltgiften wie z. B. mit Metallionen oder den Transport von Nährstoffen wie z. B. Eisen zu messen. Zum Beispiel besteht so eine maßgeschneiderte Sonde aus drei wichtigen Komponenten:

1. Ein ionenspezifischen Chelator, z. B. für Cu, Fe etc.
2. Ein Fluoreszenzfarbstoff z. B. NBD, Rhodamin etc. und
3. Ein oder mehrere Boronsäurekomponenten. Diese drei Komponenten sind kovalent miteinander verknüpft und gegebenenfalls noch mit hydrophilen, hydrophoben oder auch amphiphatischen modulatorischen Gruppen versehen, um einen optimalen Transport zum Zielort zu erreichen. Wenn der Chelator ein Metallion bindet, wird die Fluoreszenz in charakteristischer Weise verändert und es ist so möglich, die Metallionenkonzentration mit Hilfe der Fluoreszenzmeßmethode zu bestimmen.

Durch die Substitution der analytischen Sonden wie z. B. eines Farbstoffes mit mehreren Boronsäureresten konnte außerdem überraschenderweise eine deutliche Stabilitätssteigerung im Vergleich zu einem monovalenten Derivat erreicht werden und damit wird auch erstmalig die Möglichkeit eröffnet, die Verweilzeit im Kompartiment systematisch zu variieren und auch wesentlich empfindlicher zu messen.

Die spezifische Bindung der Boronsäurederivate an Zelloberflächen (enzymatisch oder über vicinale Diole) eröffnet die Möglichkeit auch bioaktive Verbindungen, wie z. B. Herbizide oder Pestizide über pH-labile Sollbruchstellen mit Boronsäure-Derivate kovalent zu verknüpfen. Diese maskierten Wirkstoffe (Prodrugs) hätten den Vorteil, daß einerseits eine rasche Haftung an Pflanzen gegeben ist und andererseits eine kontrollierte Freisetzung der aktiven Komponente erfolgen kann. Diese Vorgehensweise hat aus ökonomischer und ökologischer Sicht viele Vorteile, da gezielt mit geringen Konzentrationen gearbeitet werden kann.

Das Fluorescein-Boronsäure Addukt gemäß Strukturformel 1) von Abb. 1a kann mit benachbarten Hydroxylgruppe von Zellwänden unter physiologischen Bedingungen zum stabilen cyclischen Boronester-Derivat gemäß Strukturformel 2) von Abb. 1b unter Wasserabspaltung regieren. Das so gebundene Fluorescein stellt eine analytische Sonde für die H⁺-Ionen Konzentration dar, da diese Verbindung eine pH-abhängige Fluoreszenz aufweist. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß dieses Bindungsprinzip auch auf Säugetierzellen anwendbar ist. Mit Hilfe dieses Bindungsprinzips, ist es bisher zum ersten Mal gelungen den pH-Wert auf Neuronen von neugeborenen Ratten durch Fixierung des Adduktes gemäß Strukturformel 1) an die Außenmembran zu bestimmen. Durch die stabile Bindung des Adduktes gemäß Strukturformel 1) ist es außerdem möglich den extrazellulären pH-Wert an der Außenmembran auf Einzelzell-Niveau zu bestimmen. Auf diese Weise ist es möglich die bioelektrische Aktivität von Neuronen direkt zu beobachten und so durch verschiedenen geladenen und ungeladene Spezies ausgelöste geringe pH-Schwankungen zeitlich zu verfolgen. Bisher war die Beobachtung dieser neuronaler Aktivität nur durch indirekte Methoden (Wiemann et al., NeuroReport 9, 167-170, 1998) möglich. Diagramm 1 zeigt pH-Messungen mit dem Addukt gemäß Strukturformel 1) (Laborbezeichnung: Flubo-1) an zwei unterschiedlichen neuronalen, CO₂-sensitiven Rattenzellen. Das Meßsignal zeigt über mehrere Stunden eine ausgeprägte Stabilität und außerdem lassen sich so verschiedene Zellpopulationen in ihren Aktivitäten unterscheiden. Diagramm 2 zeigt die Reaktion neuronaler Zellen auf einen chemischen Impuls von NH₄Cl in der Konzentration von 20 mM. Der zeitliche Verlauf des pH-Wer tes (pHe = extrazellulärer pH) zeugt deutlich eine schwach alkalische Verschiebung. Diese pH-Verschiebung ist ein Ausdruck für die neuronale Aktivität dieser Zellen.

Unter Trägern wird auch im Sinne der Erfindung Träger oder Trägermaterialien wie polymere Verbindungen z. B. verschiedene Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, lebende oder tote Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen verstanden. Unter Träger können auch die Monomere der polymeren Träger verstanden werden.

Unter biospezifischen Verbindungen oder Sonden werden im Sinne der Erfindung biochemisch wirksame Verbindungen, pharmazeutisch wirksame Verbindungen, biologisch wirksame Verbindungen und/oder diagnostisch wirksame Verbindungen verstanden.

Insbesondere versteht man unter biochemisch wirksamen Verbindungen im Sinne der Erfindung auch Proben oder Verbindungen zum qualitativen und quantitativen Nachweis, Anreicherung, Isolierung, Reindarstellung oder Erkennen von Konzentrationen, Mengen etc. eines Stoffes, einer Komponente, insbesondere des biologischen Typs oder von Milieu in Organismen oder Teilen derselben wie in Gewebe, in Organen, Zellen, Zellkompartimenten, Zell-, Gewebeextrakten etc., z. B. Farbstoffe, physiologische Indikatoren, oder
ebenso pharmazeutisch wirksamen Verbindungen solche zur Behandlung von Krankheitszuständen, wie Antibiotika, Antimykotika, Enzyminhibitoren, Chelate, oder
biologisch wirksamen Verbindungen, welche enzymatisch katalysierte Reaktionen in beispielsweise Zellen, Geweben, Organen, Organismen zu beeinflussen vermögen, wie Pestizide oder Herbizide, und/oder
diagnostisch wirksamen Verbindung, welche Zellen oder Zellkompartimente eines bestimmten Status wie entartete Zellen erkennen können bzw. an solche zu binden imstande sind, verstanden. Sonden können sein Farbstoffe, physiologische Indikatoren, Antibiotika, Antimykotika, Enzyminhibitoren, Chelate, Lipide, Tracer, Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide oder dergleichen bzw. die entsprechenden monomeren Bausteine.

Unter Boronsäure ist die ältere Bezeichnung für organische Derivate der Borsäure zu verstehen, entsprechendes gilt für die Bezeichnung Boronat.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate, zur schonenden Markierung von, vorzugsweise polymeren, Trägern mit biospezifischen Verbindungen, ist dadurch gekennzeichnet ist, daß

a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure- Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, und einer Base, wie Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
b) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung ein organisches Lösungsmittel als Fällungsmittel, insbesondere Ether, zu dem Ansatz gegeben wird,
c) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate ist gerichtet zur schonenden Markierung von, vorzugsweise polymeren, Trägern mit biospezifischen Verbindungen, wobei

a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure- Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, und einer Base, vorzugsweise Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
c) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird,
d) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird und
e) anschließend mit einem, vorzugsweise polymeren, Träger mit benachbarten Hydroxyl- Gruppen, vorzugsweise bei Raumtemperatur, bei pH 6 bis 8, vorzugsweise pH 7, verestert wird.

Ebenso kann die Verwendung der erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate als biologisch wirksame Verbindung, als biochemisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung erfolgen und kann die Verwendung der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate als biologisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung erfolgen.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate können als Alkyliden bivalente Gruppen wie Ethyliden, Propyliden, Tetramethylen, 2-Methyltrimethylen oder 2,2-Di methyltrimethylen sein. Diese können weiter substituiert sein. Als Arylen sind bivalente aromatische Gruppen wie 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,4-Phenylen, oder auch substituierte bivalent aromatische Gruppen wie 4-Methyl-1,3-Phenylen, 4-Amino- 1,3-Phenylen.

Im Falle der substituierten Boronat-Gruppe, wenn

ist, steht L beispielsweise für einen polymeren Trägerrest oder für eine biospezifische Verbindung Z, wobei Sauerstoff an vicinalen Kohlenstoffatomen des Trägerrestes bzw. der biospezifischen Verbindung, nicht an geminalen, kovalent gebunden ist.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Borsäure-Derivate der Formel Z-Y-B(OH)₂ kann
Y: für 1,3-Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl,
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung stehen; weiterhin kann die biospezifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise Isothiocyanato-Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino-Gruppe kovalent gekoppelt sein.

Zudem ist es möglich bei den erfindungsmäßen Boronsäure-Derivate, daß die biospezifische Verbindung mindestens ein Vertreter der eine biologisch wirksame Verbindung, eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, eine biochemisch wirksame Verbindung und eine diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist. Die biologisch wirksamen Verbindungen können Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide, die pharmazeutisch wirksamen Verbindungen ein Antibiotikum oder Antimykotikum sein. Der polymere Trägerrest kann Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen sein. K kann sein eine ganze Zahl von 2 bis 8, vorzugsweise 4 bis 6, noch mehr bevorzugt 1, 2, 3 oder 4.

Die erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate der Formel (Z)_k Y-B C können dadurch gekennzeichnet sein, daß

k und/oder m eine ganze Zahl von 1 bis 5, noch mehr bevorzugt 1, 2, 3, 4 oder 5,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen,
E: -B(OH)₂ oder -O-B(OH)₂ oder

sind,
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH-Gruppen aufweist.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate können als Alkyliden bivalente Gruppen wie Ethyliden, Propyliden, Tetramethylen, 2-Methyltrimethylen oder 2,2-Dimethyltrimethylen sein. Diese können weiter substituiert sein. Als Arylen sind bivalente aromatische Gruppen wie 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,4-Phenylen, oder auch substituierte bivalent aromatische Gruppen wie 4-Methyl-1,3-Phenylen, 4-Amino-1,3-Phenylen.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Borsäureester-Derivate können Y für 1,3-Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl und Z für eine substituierte biospezifische Verbindung stehen; weiterhin kann die biospezifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise mittels Isothiocyanato-Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino-Gruppe kovalent gekoppelt sein. Im Falle der substituierten Boronat-Gruppe, wenn

ist, steht T beispielsweise für einen polymeren Trägerrest, wobei Sauerstoff an vicinalen Kohlenstoffatomen des Trägerrestes, nicht an geminalen, kovalent gebunden ist.

Ebenso wenn

ist, steht L beispielsweise für einen polymeren Trägerrest T oder für eine biospezifische Verbindung Z, wobei Sauerstoff an vicinalen Kohlenstoffatomen des Trägerrestes bzw. der biospezifischen Verbindung, nicht an geminalen, kovalent gebunden ist.

Ebenso ist es möglich, daß

T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: 1,3-Phenylen und
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung sind. Ebenso kann k eine ganze Zahl von 1 bis 5, noch mehr bevorzugt 1, 2, 3, 4 oder 5 sein.

Ebenso kann eine Verbindung für die erfindungsgemäßen Verwendungen benutzt werden
wobei ein polymerer Träger mit einer biospezifischen Verbindung der Formel Z-Y-B C gekoppelt wird mit

T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten OH-Gruppen, welcher Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitte, Lektine oder Nukleinsäure-Derivate ist,
Y: 1,3-Phenylen oder Imino-3-Phenyl und
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung sind, die mindestens ein Vertreter der biologisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung und diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist, wobei
1 bis 20 mMol biospezifische Verbindung, welche mindestens ein Vertreter der biologisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung und diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist, mit 1 bis 20 mMol substituiertes Boronsäure-Derivat in 5 bis 40 ml polarem Lösungsmittel und einem Äquivalent Triethylamin 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird,
die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird und
anschließend mit dem polymeren Träger mit benachbarten Hydroxyl-Gruppen, welcher Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitte, Lektine oder Nukleinsäure-Derivate ist, bei Raumtemperatur bei pH 6 bis 8 verestert wird.

Weiterhin kann in besonderen Ausführungsformen der Boronsäure-Derivaten und der Boronsäureester-Derivaten die biospezifische Verbindung ein Vertreter oder mehrere ein und dieselben oder mehrere verschiedene Vertreter sein aus der Gruppe, die eine biologisch wirksame Verbindung, eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, eine biochemisch wirksame Verbindung und eine diagnostisch wirksame Verbindung umfaßt; so können die Boronsäureester-Derivate oder Boronsäure-Derivate zum Beispiel zwei verschiedene Vertreter umfassen, wie eine pharmazeutisch wirksame Verbindung und eine biochemisch wirksame Verbindung, oder zwei ein und dieselben Vertreter, wie zwei biochemisch wirksame Verbindungen, umfassen. Als biologisch wirksame Verbindungen eignen Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide, als pharmazeutisch wirksame Verbindungen ein Antibiotikum oder Antimykotikum und als polymere Trägerrest Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen. Vorzugsweise ist die biospezifische Verbindung mindestens ein Farbstoff, vorzugsweise substituiertes Fluorescein.

In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate kann die biospezifische Verbindung mindestens ein Vertreter der biochemisch, wie ein Farbstoff, ein physiologischer Indikator, eine biologisch, diagnostisch und/oder pharmazeutisch wirksame Verbindung, Chelate, Lipide, Tracer, Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide oder dergleichen umfassenden Gruppe sein, wobei beispielsweise die biologisch, insbesondere Enzyminhibitoren, oder pharmazeutisch wirksame Verbindung, insbesondere ein Antibiotikum, Antimykotikum, sein können. Hinzukommend kann der polymere Träger Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen oder substituierte Lectine, Nukleinsäure-Derivate oder dergleichen sein. Jedoch kann der Träger auch ein Monomer des polymeren Trägers oder die biospezifische vicinale Hydroxyl-Gruppen aufweisende Verbindung sein.

Die chemischen Bindungen zwischen den Trägern und den Sonden sind cyclische Borsäureester mit einer überraschend hohen Stabilität unter physiologischen Bedingungen. Eine Voraussetzung für diese Verknüpfung kann sein, daß der polymere Träger benachbarte Hydroxyl-Gruppen (vicinale Diolgruppen) enthält und der Ligand mindestens eine Boronsäure- Gruppe mit einem organischen Rest, welcher z. B. aus der Acyclen, Aromaten, Alicyclen, wie Cycloalkane, Cycloalkene, Cycloalkine, und Heterocyclen wie 5- oder 6-Ringheterocyclen umfassenden Gruppe ausgewählt ist umfaßt. Vorzugsweise kann die substituierte Boronsäure- Gruppe als organischen Rest ein Alkyl des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten-unverzweigten oder ungesättigt-verzweigten Typs, ein cyclischer Rest des gesättigten oder aromatischen Typs wie Phenylboronsäure-Gruppen sein.

Da Zellen, wie z. B. Pflanzenzellen eine Vielzahl von polymeren Kohlenhydraten mit freien, vicinalen Diolgruppen enthalten, ist eine gezielte Markierung mit Borsäurederivaten möglich. Ein weiterer, neben der unerwartet hohen Stabilität der Bindung, hervorzuhebender Vorteil gegenüber gängigen Immobilisierungsmethoden ist die sehr schonende Kopplungschemie, die es überraschenderweise erlaubt, z. B. bei pH 7.0 und in physiologischen Puffersystemen Markierungen durchzuführen.

Cyclische Borsäureester sind als Schutzgruppen in der Organischen Synthesechemie bekannt (Th. W. Greene; P.G.M. Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, John Wiley & Sons, 1991, S. 141 ff). Völlig neu aber ist der Einsatz von Borsäure- Derivaten zur gezielten Immobilisierung von analytischen Sonden an z. B. Zellkompartimente. Die überraschenderweise sehr selektive Kopplungschemie eröffnet ein nicht vorhersehbares, außerordentlich breites Anwendungsspektrum. Das chemoselektive Reaktionsverhalten dieser Borsäure-Derivate erlaubt es, neuartige Verbindungen herzustellen, die z. B. für die kompartimentspezifische Markierung von Pflanzenzellwänden bedeutsam werden können. Es ist literaturbekannt, daß die Molekülgröße maßgeblich die Eindringtiefe in Geweben bestimmt. Darüberhinaus ist bekannt, daß viele Zellkompartimente von Membranen umgeben sind, die nur Moleküle bis zu einen bestimmten Molekulargewicht wie z. B. 10 kD passieren lassen. Maßgeschneiderte Sonden mit unterschiedlichen Molekulargewichten machen so eine kompartimentspezifische Markierung möglich, die zum Studium von Membraneigenschaften, wie z. B. pH-Messung und/oder auch Messung von Ionenströmen, wie z. B. Fe²⁺/Fe³⁺-Trans port geeignet sind. Außerdem ist es möglich, verschiedene analytische Sonden miteinander zu kombinieren, um verschiedenen Parameter wie z. B. pH-Wert und Fe³⁺-Kon zentration gleichzeitig zu quantifizieren.

Abb. 1 zeigt beispielhaft das Reaktionsverhalten einer maßgeschneiderten Sonde in
in 1a) die substituierte biospezifische Verbindung hier Fluorescein-Boronsäure- Derivat (hier Addukt 1) und
in 1b) das stabile Fluorescein-Boronsäureester-Derivat (hier Addukt 2).

Das Fluorescein-Boronsäure Addukt 1 (Abb. 1a) kann mit benachbarten Hydroxylgruppen von z. B. Zellwänden unter physiologischen Bedingungen zum stabilen cyclischen Boronsäureester-Derivat 2 (Abb. 1b) unter Wasserabspaltung regieren. Das so gebundene Fluorescein stellt eine analytische Sonde für die H⁺-Ionen Konzentration dar, da diese Verbindung eine pH-abhängige Fluoreszens aufweist.

Das nachfolgende Ausführungsbeispiel zeigt lediglich eine Ausgestaltung der Erfindung.

Synthese- und Ausführungsbeispiele Herstellung des Adduktes gemäß Strukturformel 1)

0.173 g (0.001 Mol) Aminobenzolboronsäure-Hydrochlorid (Fa. Aldrich) und 0.389 g (0.001 Mol) Fluoresceinisothiocyanat (Fa. Aldrich) wird in 20 ml Dimethylformamid eingerührt und 1 Äquivalent Tritethylamin hinzugefügt. Nach 5 h wird das Addukt 1 in Ether gefällt, mit Ether gewaschen und anschließend getrocknet. Ausbeute: 0.5 g (93%). HPLC: Rt: = 27.5 min; 0.01 M Ammoniumformiat pH 5, Methanol; 100 bis 0% (30 min). 2. Herstellung des Adduktes 2 (Abb. 1b; FITC-Markierung von Pflanzenzellen): Ausgesuchte Wurzeln von 2 Wochen alten prekultivierten Weizenkeimen wurden auf Objektträger plaziert und anschließend sofort mit 2% Agarnährlösung (PBS) bedeckt. Proben dieser Zellen wurden bei verschiedenen Temperaturen mit unterschiedlich konzentrierten Lösungen vom Addukt 1 (10-100 Mmolar in PBS) und als Kontrolle mit dem entsprechenden nicht derivatisiertem Fluorescein für 1 bis 12 h im dunkeln inkubiert. Danach wurden die Proben nach ausgiebigem Waschen mit einem konfokalen Lasermikroskop (Anregung 490 nm, Fluoreszenz bei 600 nm) miteinander verglichen. Die Proben, die mit dem Addukt gemäß Strukturformel 1) inkubiert wurden, zeigten ein stabiles Fluoreszenzsignal. Im Gegensatz dazu wiesen die Proben, die mit nicht markiertem FITC behandelt wurden keine-stabile Fluoreszenz auf.

Extrazelluläre pH-Messung mit FLUBO-1

Im Gegensatz zu intrazellulären pH-Messungen mit der Ratio-Imaging Methode (mittels BCECF-AM (1)) sind extrazelluläre Messungen mit Fluoreszenzfarbstoffen schwierig: Sie verlangen, daß der Farbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC, gebunden an Makromoleküle (1, 2) punktuell in das Gewebe injiziert wird. Dabei kommt es zu störenden Aufweitungen des extrazellulären Raumes. Auswaschungen und schlechte Lokalisierbarkeit der prospektiven Injektionsstelle im ungefärbten Gewebe sind weitere Nachteile. Der hier vorgestellte Farbstoff ist wasserlöslich, bindet fest an die Oberfläche von Zellen um Gewebeverband und erlaubt so Messungen des extrazellulären pH-Werts an der Oberfläche von Zellen in vitro. Dabei können einzelne Zellen erkannt und meßtechnisch unterschieden werden. Das Verfahren ist daher analog zur intrazellulären BCECF-AM Färbung zu verstehen (1). Die so erhaltenen Informationen sind für die experimentelle Zellbiologie/Neurophysiologie relevant, da sie insbesondere pH-Veränderungen auf der Oberfläche von Zellen deren Funktion maßgeblich bestimmen.

Versuchsdurchführung

Organotypische Kulturen der Medulla oblongate wurden mit 0,045 g oder auch mit 0,045 mg FLUBO-1/ml R 16 (Zellkulturmedium) für eine h gefärbt (Einzelheiten zur Versuchsanordnung, zum Messprinzip usw. siehe (1). pH-Änderungen wurden anhand von Änderungen des Excitation Ratios 440-460 nm/490 nm(R) festgestellt. Um definierte intra- und extrazelluläre pH-Änderungen zu erzeugen, wurde die Ammonium Prepuls Methode (20-40 mM Ammoniumchlorid für 1 min) und der Bicarbonat-Entzug für 10 min angewandt. Beim Ammonium-Prepuls erfolgt durch die Abscheidung der Pufferkomponenten NH₃ und NH₄⁺ eine extrazelluläre Acidose, aber eine intrazelluläre Alkalose. Beim Entzug von Bicarbonat erfolgt eine langanhaltende intrazelluläre Acidose, aber keine extrazelluläre pH-Änderung (vergl. 1, 2). Daher sind diese Methoden geeignet um zu unterscheiden, ob ein pH-Farbstoff intra- oder extrazellulär lokalisiert ist.

Ergebnisse

Wiederholtes Einwaschen von Ammoniumchlorid für eine Minute führte reproduzierbar zu einer gleichförmigen Erhöhung von R (Diagramm 1), wie es nur bei einer extrazellulären Acidose zu erwarten ist (s. o.). Diese Antwort ist in Verlauf von Stunden (< 6 h) am selben Präparat mehrfach reproduziert worden, was auf intakte Biomembranen hinweist. Ein Auswaschen der Fluoreszenz erfolgt nicht. Entzug von Bicarbonat (Diagramm 2) wurde nicht von einer Zunahmen von R begleitet (vgl. (1)). Daher deutet auch dieser Befund auf die extrazelluläre Lokalisation. Im gefärbten Gewebe waren einzelne Zellen auszumachen, so daß Aussagen zu individuellen pH-Regulationsmechanismen möglich waren. Basierend auf dem Vorwissen über definierte pH-Veränderungen (unter unseren Versuchsbedingungen, vgl. (1)) lassen diese Versuche den Schluß zu, daß FLUBO-1 nicht membranschädigend ist, nicht internalisiert wird und daher als Indikator zur extrazelluläre pH-Änderungen im Gewebe einsetzbar ist. Die Anwendung ist nicht auf neuronale Zellen oder in vitro Verfahren begrenzt. Dem pH-Indikator wird darüber hinaus eine Bedeutung bei konfokalen Mikroskopieverfahren zugemessen. Literatur:
(1) Wiemann, M., Bally, R.E., Bonnet, U. und Bingmann, D., CO₂ sensitive medullary neurons: activation by extracellular acidification, NeuroReport 9, 167-170 (1998),
(2) Gottfried, J.A., Chesler, M. Temporal Resolution of activity-dependent pH-shifts in rat hippocamp . . ., J. Neurophysiol. 76, 2804-2807 (1996).

Synthese eines Farbstoffes zum Färben von Pflanzenzellen

1 g (0.001 mol) Cibacron Brilliantrot 3B-A (Fa. Aldrich) werden in 5 ml Dimethylformid gelöst und anschließend mit 0.173 g (0.001 mol) 3-Aminobenzolboronsäuresäurehydrochlorid und 0.1 ml Triethylamin versetzt und über Nacht gerührt. Danach wird mit Ether der Boronsäurefarbstoff gefällt und anschließend getrocknet. Ausbeute 1.0 g (91%) eines Farbstoffes, der bei ⚫ = 520 nm ein Absorptionsmaximum aufweist.

Anfärben von Schnittblumen: Zwei weiße Rosen zum Beispiel Pflanzenstengel mit Blüte werden jeweils in einer Lösung von 1 g Farbstoff (Boronsäureaddukt bzw. unsubstituierten Farbstoff) auf 100 ml H₂O über Nacht inkubiert. Die weißen Blütenblätter zeigten unterschiedliche, charakteristische rote Färbemuster. Im Falle des Boronsäurefarbstoffes gemäß Strukturformel 3) blieb die Färbung wesentlich länger, über viele Tage stabil. Abb. 2 zeigt diesen Farbstoff.

Synthese eines Ionenspezifischen Indikators: 0.656 g (0.001 mol) Desferral hydrogenmethanosulfonat (Fa. Immuno Tec) wird in 5 ml trockenem Dimethylformamid mit 0.184 g (0.001 mol) Cyanurchlorid (Fa. Aldrich) und 2 Äquivalenten Tritethylamin versetzt und anschließend 2 h bei 4°C gerührt. Das Addukt wird mit Aceton gefällt und getrocknet. HPLC: Rt: = 25.5 min; 0.01 M Ammoniumformiat pH 5, Methanol; 100 bis 0% (30 min). 0.850 g (0.001 mol) des Adduktes wird anschließend in trockenem Dimethylformamid aufgenommen und mit 0.173 g (0.001 Mol) Aminobenzolboronsäure-Hydrochlorid (Fa. Aldrich) und einem Äquivalent Triethylamin versetzt und 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Addukt wird mit Aceton gefällt und getrocknet. HPLC: Rt: = 22.5 min; 0.01 M Ammoniumformiat pH 5, Methanol; 100 bis 0% (30 min).). 0.980 g (0.001 mol) des Adduktes wird anschließend in trockenem Dimethylformamid aufgenommen und mit 0.323 g (0.001 Mol) 5-Aminofluorescein (Fa. Molekular Probes) und einem Äquivalent Triethylamin versetzt und 5 h bei Raumtemperatur gerührt. . Das Addukt wird mit Diethylether gefällt und getrocknet. HPLC: Rt: = 29.5 min; 0.01 M Ammoniumformiat pH 5, Methanol; 100 bis 0% (30 min). Abb. 3 zeigt die eisenspezifische Sonde zur Markierung von Pflanzenzellen gemäß Strukturformel 4): Ausgesuchte Wurzeln von 2 Wochen alten prekultivierten Weizenkeimen wurden auf Objektträger plaziert und anschließend sofort mit 2% Agarnährlösung (PBS) bedeckt. Proben dieser Zellen wurden bei verschiedenen Temperaturen mit unterschiedlich konzentrierten Lösungen vom Desferral-Addukt (Verbindung der Strukturformel 3) laut Abb. 3) (10-100 Mmolar in PBS) und als Kontrolle mit dem entsprechenden nicht derivatisiertem Fluorescein für 1 bis 12 h im dunkeln inkubiert. Danach wurden die Proben nach ausgiebigem Waschen mit einem konfokalen Lasermikroskop (Anregung 490 nm, Fluoreszenz bei 600 nm) miteinander verglichen. Die Proben, die mit dem Addukt inkubiert wurden, zeigten ein stabiles Fluoreszenzsignal. Im Gegensatz dazu wiesen die Proben, die mit nicht markiertem FITC behandelt wurden keine stabile Fluoreszenz auf Durch Inkubation der Zellen mit einer Lösung von 1 µM Fe³⁺ verschwand die Fluoreszenz durch die Bindung des Eisenions am Desferral (Quenchung). Nach der Metabolisierung des Eisens durch die Pflanze zeigte sich nach 2 h wieder ein stabiles Fluoreszenzsignal.

Claims

1. Verwendung der Verbindung der Strukturformel 1)
zur Bestimmung des extracellulären pH an einer Oberfläche einer Außenmembran von Zellen des pflanzlichen oder tierischen Typs mittels einer Inkubation der Zellen mit einer wäßrigen Lösung, welche die Verbindung der Strukturformel 1) enthält.

2. Verwendung der Verbindung der Strukturformel 3)
zum Anfärben von Blütenblättern mittels einet Inkubation von Pflanzenstengeln mit einer Blüte mit einer wäßrigen Lösung, welche die Verbindung der Strukturformel 3) enthält.

3. Verwendung der Verbindung der Strukturformel 4)
zur Bestimmung von Metallionenkonzentration in Geweben oder Zellen mittels einer Inkubation von Pflanzengeweben mit einer wäßrigen Lösung, welche die Verbindung der Strukturformel 4) enthält.