DE19818422A1

DE19818422A1 - Bestimmung der absoluten Mutagenizität; Differentielle Sequenzierung

Info

Publication number: DE19818422A1
Application number: DE19818422A
Authority: DE
Inventors: Stefan Harjes
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 1999-10-28

Abstract

Aufgabe der Erfindung ist die Bestimmung der absoluten Mutagenizität, also die Messung der von Substanzen oder Umgebungen verursachten Mutationsraten, oder die Bestimmung von Fehlerraten von Polymerasen. DOLLAR A Zur Bestimmung der Mutagenizität amplifiziert man eine Nukleinsäurevorlage mit Polymerasen. Es werden unter möglichst identischen Bedingungen Sequenziervorlagen vom Amplifikationsprodukt und Amplifikationsvorlage generiert. Meßgrößen sind die Fehlerraten der beiden Sequenzmengen sowie die gemessene Amplifikation. Mit diesen Werten berechnet man mit einer einfachen Formel die absolute Mutagenizität.

Description

Einleitung

Die Erfindung betrifft eine molekularbiologische Methode der Gentechnik.

Mit Mutagenizitäten und Polymerasegenauigkeiten beschäftigen sich u. a. (Kunkel 1984), (Kunkel 1985)), (Kunkel & Alexander 1986), (Boosalis et al. 1987), (Tindall & Kunkel 1988), (Krawczak et al. 1989), (Keohavong & Thilly 1989), (Reiss et al. 1990), (Eckert & Kunkel 1990), (Lundberg et al. 1991), (Kohler et al. 1991), (US. Patent Nr. 5.347.075), (Barnes 1992), (Kok et al. 1997).

Die Problematik stellt sich aus der seit langem bekannten Diskrepanz zwischen der Genauigkeit von in vitro Polymerisationsreaktionen und der Genauigkeit von in vivo Polymerisationsreaktionen.

Um Polymerisationsreaktionen im Hinblick auf die Genauigkeit optimieren zu können, ist es notwendig einen einfachen, gradlinigen, auf alle Arten von Mutatio nen anwendbaren und standardisierbaren Assay zu etablieren. Die Fehlerrate oder die absolute Mutagenizität wird einheitlich mit f in

angegeben.

Allein mit Sequenzierungen kann man feststellen welche Differenzen in einer Se quenzmenge vorkommen. Wenn man also die Fehlerrate in mehreren Sequenzmengen vor und nach Polymerisation, sowie den Grad der Polymerisation, also die Amplifika tion bestimmt, kann man mit Formel (3) die Fehlerrate der Reaktion berechnen. Für diese Erfindung wird Schutz begehrt.

Man kann mit dieser Erfindung Fehlerraten von Polymerasen bestimmen, aber auch die absolute Mutagenizität von Reaktionszusätzen wie z. B. von Nahrungsmitteln oder Medikamenten messen und absolute durch Strahlung erzeugte Krebsraten z. B. von Fernsehern oder Computermonitoren feststellen.

Es können alle Arten von Mutationen betrachtet werden (Substitutionen, Inser tionen und Deletionen) und zusammen oder einzeln eingeordnet werden. Einflüsse von Reparaturmechanismen oder in vivo existierenden Selektionsmechanismen gibt es nicht. Es handelt sich hier um reine in vitro (S1) Experimente, Tierexperimente sind nicht notwendig.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1: Produktzusammensetzung nach n Zyklen

Abb. 2: Fehlerverteilung nach n Zyklen

Abb. 3: Filtrationsprofil von säulengereinigter EN geprimter NF1- cDNA; Aufgefangen in zwei Tropfenfraktionen und untersucht mit C/E-PCR (30 Zyklen)

Abb. 4: Amplifikation von NF1 von Ratten Gehirn cDNA; Temperatur profil: 94°C, 30 sec; 68°C, 9 min. (als letzter Schritt 68°C 10 min); 22 anschließend 20 Zyklen amplifiziert; Spur 1: λ-HindIII Standard; 2: -; 3: -; 4: FAN/AD ohne SK; 5: FAN/AD Amplifikation mit SK; 6: Standard;

Abb. 5: Bestimmung der Fehlerraten von NF1 Stücken

Abb. 6: Produktzusammensetzung nach 22 Zyklen

Abb. 7: Produktzusammensetzung nach 42 Zyklen

Abb. 8: Wertetabelle von Abb. 6 und Abb. 7; Koeffizienten entwickelt nach Abb. 2; % bezogen auf 2²² bzw. 2⁴²; y in cm: 20% ≈ 8 cm

Abb. 9: Skizze von NF1 mit Position der Primer

Herleitung

Während einer Polymerisationsreaktion macht eine Polymerase beim Einbau von L Nukleotiden in den entstehenden Doppelstrang F Fehler. Die Reaktion hat also eine Fehlerrate von

Bei der Kopie eines einzelsträngigen Moleküls der Länge l macht eine Polymerase in 1. Näherung l.f Fehler. Wahrscheinlichkeiten sind additiv. Bei der Synthese der Kopie der Kopie des Moleküls der Länge l macht das Enzym in erster Näherung wieder l.f Fehler. Nach zwei Synthese Zyklen beinhaltet ein Molekül also l.2.f Fehler mehr. Nach n Zyklen findet man in einem Molekül der Länge l also l.n.f Fehler mehr als vor der Synthese. Das Original hat den Fehler or. Ohne Kopie gibt es also l.or Fehler im Ausgangsmaterial. Ein Molekül enthält nach n Kopierungen also F(n, f) Fehler:

F(n, f) = l.(or+n.f) (1)

Wichtig ist aber jetzt, wieviele Moleküle mit wievielen Fehlern im Endprodukt vorlie gen. Im Endprodukt findet man sowohl das Original, als auch seine Kopien. In Abb. 1 ist die Produktzusammensetzung nach n Zyklen beschrieben, wobei jedes Molekül nur dadurch gekennzeichnet ist, wie oft es kopiert wurde.

Diese Verteilung entspricht der von B. Pascal (1665) publizierten Dreiecksver teilung (Chevalier 1954). Abb. 2 ist die mathematischere Schreibweise von Abb. 1. Man findet also z. B. nach 6 Reaktionszyklen 20 Moleküle die 3 mal kopiert wurden, aber nur ein Molekül, welches 6 mal kopiert wurde. Wie man deutlich ablesen kann (Abb. 2, Abb. 6, Abb. 7), hat der größte Teil der Moleküle nach einer Amplifikation

Fehler.

Da die Häufigkeit der Moleküle die n mal kopiert wurden in Bezug auf n symme trisch verteilt ist (Abb. 6, Abb. 7), und die Fehlerrate proportional zur Anzahl dieser Synthesezyklen ist, ist auch die Fehlerrate symmetrisch verteilt. Die mittlere Fehlerrate ist damit:

Wenn man Fehlerraten vor und nach Amplifikation bestimmt, indem man die Anzahl der Fehler F in einer Menge von L sequenzierten Nukleotiden bestimmt:

kann man aus der Differenz die Fehlerrate der Reaktion ermitteln:

Also

Das Verteilungsmodell kann man testen, indem man kontrolliert, ob bei einer gege benen Anzahl von Zyklen das Produkt die vorhergesagte Fehlerverteilung aufweist (Abb. 6, Abb. 7).

Da DNA doppelsträngig ist und der eine Strang immer die Kopie des anderen Stranges ist, ist die Anzahl der Fehler des kopierten Stranges immer l.f größer. Die Sequenziervorlagen sind hier doppelsträngige DNA-Fragmente. Mit einer Wahrschein lichkeit von l.f findet man in einer Sequenzierung beider Stränge zwei Nukleotide für eine Position. Dieser Fehler ist von der Polymerase im letzten Zyklus generiert wor den. Auch ein solcher Fehler wird auf die Menge L = 2.l der insgesamt sequenzierten Nukleotide bezogen.

Generierung einer Amplifikationsvorlage

Adultes Ratten Gehirn wird in filtrierter Lösung homogenisiert (ca. 2 ml pro 100 mg Gewebe):

- 5 M Guadiniumthiocyanat,
- 100 mM Tris-HCl (pH 7.6),
- 10 mM EDTA,
- 0.5% Laurylsarcosin und
- 0.1 M 2-Mercaptoethanol

Zur klaren Lösung werden

- 2/10 Volumen Chloroform
- 1 Volumen saures Phenol
- 1/10 Volumen Natriumacetat (pH 4)

gegeben. Anschließend wird extrahiert und zentrifugiert, die wäßrige Phase wird abgenommen und mit 1 Volumen Isopropanol gefällt (-20°C, 1 Stunde) (Chomczynski & Sacchi 1987). Die so gewonnene RTA wird in

- 100 mM Tris-HCl (pH 7.6)
- 10 mM EDTA
- 0.5% Laurvlsarcosin

gelöst und mit 1 g/ml CsCl versetzt. In einem Cellulosenitrat-Zentrifugenröhrchen wird ein CsCl-Polster mit RNA-Lösung im Verhältnis 1/3 überschichtet. Durch Zentrifugation (30 000-50 000 Upm, 16°C, 16 Stunden) (Meselson et al. 1967) präzi pitierte RNA wird in:

- 100 mM Tris-HCl (pH 7.6)
- 10 mM EDTA
- 0.5% Laurylsarcosin

gelöst. CsCl wird durch zweimaliges Umfällen abgetrennt (100 mM NaCl, 2.5 Volumen Ethanol, -20°C, 1 Stunde) (Glisin et al. 1974). Die erhaltene RNA wird gelöst (65°C, 5 min):

- 74 mM Tris-HCl (pH 7.6)
- 10 mM EDTA
- 0.1% SDS

und auf 500 mM NaCl gebracht. Festphasen gekoppeltes Oligo dT wird zugegeben und hybridisiert (37°C, 10 min) (Gilham 1964). Gewaschen wird dreimal in:

- 74 mM Tris-HCl (pH 7.6)
- 10 mM EDTA
- 0.1% SDS
- 0.5 M NaCl

und dreimal mit:

- 74 mM Tris-HCl (pH 7.6)
- 10 mM EDTA
- 0.1% SDS
- 0.1 M NaCl

Eluiert wird bei 60°C, 5 min mit:

- 74 mM Tris-HCl (pH 7.6)
- 10 mM EDTA
- 0.1% SDS

Für NF1 cDNA-Synthese werden 20 µg mRNA in Wasser mit Primer EN (AGC TTC ACA CGA TCT TCT TAA TGC) und 1 U RNAsin gelöst und denaturiert (94°C, 1 min). Bei Synthesetemperatur (42°C) werden Reverse-Transcriptase-Bedingungen eingestellt:

- 50 mM Tris-HCl (pH 8.3),
- 50 mM KCl,
- 10-3 mM MgCl₂,
- 1-5 mM DTT,
- 1 mM dNTP's und
- 5 U RNAsin.
- 200-20 nM Primer

200 U MMLV werden zugegeben und es folgt eine Inkubation (42°C, 1/2 Stunde). 1-5 U AMV und 100 U MMLV werden addiert und es wird weiter inkubiert (60°C, 1/2 Stunde). Anschließend versetzt man die Probe mit 1 µl RNAse A (Stammlösung: 1 mg/ml in 5 mM Tris-HCl (pH 8); gekocht: 10 min. 100°C) denaturiert 1 min bei 94°C und lagert die Probe bei 4°C.

Der ganze Ansatz wird mit einer Sepharose 4-bcl Säule gelfiltriert. Laufmittel ist:

- 10 mM Tris-HCl (pH 8)
- 1 mM EDTA
- 100 mM NaCl

Das Eluat wird in zwei Tropfen Fraktionen gesammelt und untersucht. 2 µl der Frak tionen werden mit PCR amplifiziert (Primer C: CAG AAT TCC CCC CTC AAC TTC GAA GT und Primer E: AAG TGT TGC CAT CTT ATC AAA AGG TC):

- 20 mM Tris-HCL (pH 8.8)
- 10 mM KCl
- 2 mM MgSO₄
- 0.1% Triton X-100
- 100 µg/ml BSA
- 400 µM dNTPs
- 0.25 U hitzestabile DNA Polymerase
- 400 nM Primer
- Temperaturprofil:
- - 94°C, 1 min,
- - 60°C, 1 min,
- - 73°C, 1 min

Die Proben werden mit 5 × Probenpuffer:

- 0.025% Bromphenolblau,
- 0.025% Xylencyanol,
- 20% Ficoll und
- 100 mM EDTA

versetzt und in einem Ethidiumbromid gefärbten 2%igem Agarosegel:

- 89 mM Tris-Borat (pH 8),
- 89 mM Borsäure,
- 2 mM EDTA,
- 0.4 µg/ml Ethidiumbromid und
- 2% Agarose

untersucht (

Abb.

3).

NF1 haltige Fraktionen werden gepoolt und gefällt. Die cDNA wird in

- 10 mM Tris-HCl (pH 8)
- 1 mM EDTA

gelöst.

Amplifikation

8 µl des cDNA Ansatzes werden mit 12 µl 25 mM Mg(OAc)₂ und 8 µl Wasser verdünnt. Diese Mischung wird bei 94°C 1 min denaturiert. 7 µl werden zu vorgeheiztem Reaktionsmix:

- 15.15 µl 3.3 × Polymerasepuffer
- 2 µl 5 µM Primer CAT TGT ACC TAG TTA ATT AAT CTC CAC CAT GGT CGC ACA CAG GCC GGT GGA (FAN)
- 1 µl SK-Primer (Harjes 1998)
- 2 µl 5 µM Primer AAT GGA TTG GTT GCG GCC GCC TAT CAC ACG ATC TTC TTA ATG CTA TTA CGT TTG AAA CTG CCA GCA CTC CTT TGC (AD)
- 1 U Tth_XL Polymerase (Myers & Gelfand n. d.)
- 1 µl 10 mM dNTPs
- 20.85 µl Wasser

gegeben (94°C). Amplifiziert wird 22 Zyklen mit folgendem Temperaturprofil:

- 68°C, 9 min
- 94°C, 30 sec
- letzter Schritt: 68°C, 10 min

Mit 12 µl 25 mM Mg(OAc)₂ und 12 µl Wasser verdünnt man 4 µl dieser Amplifika tion, heizt auf 94°C, gibt Reaktionsmix zu und amplifiziert erneut (20 Zyklen). Die Produkte der 42 Zyklenamplifikation sind in Abb. 4 dargestellt.

Klonierung

Um die Differenzen von Formel (3) bilden zu können, muß man unter möglichst iden tischen Bedingungen Sequenziervorlagen von Produkt und Vorlage generieren. Hierzu wird ein Teil der Amplifikation von Abb. 4. Spur 5 nach 22 und 42 Zyklen mit teilhomo logen Primern reamplifiziert. (Primer ES-5: CCG GAATTC _EcoRI GCC GCC ATG GGG AGG CCT TTT AAT GAT TTT GTG; und Primer ES-3: GCT CTA GA _XbaIC TAC TTG TGC TCC GGA GGA CCC mit XbaI):

- 20 mM Tris-HCL (pH 8.8)
- 10 mM KCl
- 2 mM MgSO₄
- 0.1% Triton X-100
- 100 µg/ml BSA
- 400 µM dNTPs
- 0.25 U hitzestabile DNA Polymerase
- 400 nM Primer
- - Temperaturprofil:
- - 94°C, 1 min
- - 50°C, 1 min
- - 73°C, 1 min

Um das Hybridisieren der Primer an die zu klonierende Sequenz zu ermöglichen, wird der erste Annealing Schritt bei ca. 40°C gefahren (21/19 3'-Basen der Primer hybri disieren an die NF1 Sequenz). Der Ansatz mit 22 Zyklen wird 20 Zyklen reamplifiziert, der Ansatz nach 42 Zyklen wird 15 Zyklen reamplifiziert. Die PCR Produkte werden Ethanol gefällt und EcoRI/XbaI geschnitten:

- 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
- 10 mM MgCl₂
- 100 mM NaCl
- 1 mM DTE
- 30 U EcoRI
- 150 U XbaI
- in 100 µl Wasser

Die Restriktionsendonukleasen werden hitzeinaktiviert (70°C, 10 min) und die DNA wird präzipitiert (2.5 Volumina CH₃CH₂OH, -20°C, 1 Stunde). Die Fragmente werden in H₂O gelöst und in vorgeschnittenen (EcoRI/XbaI) dephosphorylierten Klonierungs vektor legiert (15°C, 2 Stunden).

- 100 ng Klonierungsvektor
- 100 ng EcoRI/XbaI Fragment ≈ 3 × molarer Überschuß an Fragment)
- 1 × Ligationspuffer
- 1 U Ligase
- 1 mM ATP

Die Ligationsansätze werden in kompetente Bakterien transfiziert. Diese werden auf Agar-Platten ausgestrichen und 12 Stunden vermehrt. Von einzelnen Kolonien werden 5 ml Kulturen angeimpft und vermehrt. Plasmid wird aufgereinigt und untersucht. Fragment enthaltender Plasmid wird nach der Methoden von (Sanger et al. 1977) sequenziert. Von der Amplifikation nach 42 Zyklen wurden Klon 42₁ und 42₂ sequen ziert, von der Amplifikation nach 22 Zyklen wurden Klon 22₁ bis Klon 22₆ sequenziert (Abb. 5).

Auswertung

Es wurde gemessen (Abb. 5):

Es ergibt sich für f:

Wenn man bei den Sequenzierungen eine Sequenziergenauigkeit von 1 Nukleotid in 1398 sequenzierten Nukleotiden annimt, ergibt sich eine Schwankung von Δf ≈

Für exakte Messungen ist es notwendig die Amplifikation quantitativ zu bestim men. Hier wird Δn ≈ 10^-3...30 großzügig geschätzt.

Mit diesen Fehlerschranken ergibt ein Bereich von:

also

Zusammenfassung

Es wurde erstmals die Genauigkeit f der hitzestabilen DNA-Polymerase Tth_XL in 1 × Tth_XL-Puffer mit NF1-cDNA als Vorlage differentiell gemessen:

Mit dieser Methode kann man absolute Mutagenizitäten berechnen und Polymerase fehler standardisieren.

Mit differentiellen in vitro Messungen kann man Mutagenizitäten von in vivo Si tuationen absolut charakterisieren.

Literatur

Barnes, W. M. (1992), "The fidelity of taq polymerase catalyzing pcr is im proved by an n-terminal deletion", Gene 112, 29-35.
Boosalis, M. S., Petruska, J. & Goodman, M. F. (1987), "Dna polymerase insertion fidelity", The Journal of Biological Chemistry 262(30), 14689- 14696.
Chevalier, J. (1954), uvres completes, Édition Gallimard. S. 91.
Chomczynski, P. & Sacchi, N. (1987), "Single-step method of rna isolation by acid guadinium thiocyanat-phenol-chloroform extraction", Analyti cal Biochemistry 162, 156-159.
Eckert, K. A. & Kunkel, T. A. (1990), "High fidelity dna synthesis by the ther mus aquaticus dna polymerase", Nucleic Acids Research 18(13), 3739- 3744.
Gilham, P. T. (1964), "The synthesis of polynucleotide-celluloses and their use in the fractionation of polynucleotides", Journal of the American Chemical Society 86, 4982-4985.
Glisin, V., Crkvenjakov, R. & Byrus, C. (1974), "Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation", Biochemistry 13(12), 2633-2637.
Harjes, S. (1998), Neurofibromin, PhD thesis, Ruhr-Universität-Bochum, in Vorbereitung.
Keohavong, P. & Thilly, W. G. (1989), "Fidelity of dna polymerases in dna amplification", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9253-9257.
Kohler, S. W., Provost, G. S., Fieck, A., Kretz, P. L., Bullock, W. O., Sorge, J. A., Putmann, D. L. & Short, J. M. (1991), "Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lac i gene in transgenic mice", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7958-7962.
Kok, R. G., D'Argenio, D. A. & Ornston, N. (1997), "Combined localized pcr mutagenesis and natural transformation in direct genetic analysis of a transcriptional regulator gene, pobr", J. of Bacteriology 13, 4270-4276.
Krawczak, M., Reiss, J., Schmidtke, J. & Rösler, U. (1989), "Polymera se chain reaction: replication errors and reliability of gene diagnosis", Nucleic Acids Research pp. 2197-2201.
Kunkel, T. A. (1984), "Mutational specifity of depurination", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1494-1498.
Kunkel, T. A. (1985), "The mutational specificity of dna polymerase-β during in vitro dna synthesis", The Journal of Biological Chemistry 9, 5787- 5796.
Kunkel, T. A. & Alexander, P. S. (1986), "The base substitution fidelity of eucaryotic dna polymerases", The Journal of Biological Chemistry 261(1), 160-166.
Lundberg, S. K., Shoemaker, D. D., Adams, M. W. W., Short, J. M., Sorge, J. A. & Mathur, E. J. (1991), "Amplification using a thermostable dna polymerase isolated from pyrococcus furiosus", Gene 108, 1-6.
Meselson, M., Stahl, F. W. & Vinograd, J. (1967), "Quilibrium seqdimenta tions of macromolekules in densitiy gradients", Proc. Natl. Acad. Sci. USA pp. 581-588.
Myers, T. W. & Gelfand, D. H. (n. d.), "Reverse transcription and dna am plification by a thermus thermophilius dna polymerase", Biochemistry 30(11), 7661-7665.
Reiss, J., Krawczak, M., Schlosser, M., Wagner, M. & Cooper, D. N. (1990), "The effect of replication errors on the mismatch analysis of pcr-amplified dna", Nucleic Acids Research 18(4), 973-978.
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. (1977), "Dna sequenzing with chain terminating inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564.
Tindall, K. R. & Kunkel, T. A. (1988), "Fidelity of dna synthesis by the thermus aquaticus dna polymerase", Biochemistry 27, 6008-6013.

Claims

1. Methode zur Bestimmung der absoluten Mutagenizität, dadurch ge kennzeichnet, daß diese differentiell bestimmt wird.

2. Methode zur Bestimmung der absoluten Mutagenizität, dadurch ge kennzeichnet, daß die Fehlerrate
mit Sequenzierung bestimmt wird.

3. Methode zur Bestimmung der absoluten Mutagenizität, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Amplifikation quantitativ bestimmt.

4. Methode zur Bestimmung der absoluten Mutagenizität, dadurch ge kennzeichnet, daß diese nach Formel 3 berechnet wird.

5. Methode zur Bestimmung der absoluten Mutagenizität, dadurch ge kennzeichnet, daß die mittlere Fehlerrate der zu bestimmenden DNA proportional zur Hälfte der Amplifikation ist.

6. Methode zur Bestimmung der absoluten Mutagenizität, dadurch ge kennzeichnet, daß die Fehlerrate symetrisch verteilt ist.