DE69133389T2

DE69133389T2 - Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69133389T2
Application number: DE69133389T
Authority: DE
Inventors: Corinna Hernstadt; Joseph M. Fernandez; David A. Mead; Lloyd Smith
Original assignee: CHIMERX (SUBDIVISON OF MOLECULAR BIOLOGY RESOURCES INC); Chimerx (subdivison of Molecular Biology Resources Inc) Madison; CHIMERX SUBDIVISON OF MOLECULA; Invitrogen Corp
Current assignee: Chimerx (subdivison Of Molecular Biology Resou Us; Life Technologies Corp
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2011-09-28
Also published as: DE69133559T2; EP1396540A2; US5487993A; EP1790723A3; EP1396540A3; EP0550693A4; DE69119083D1; EP1790723A2; EP0738779A2; WO1992006189A1; DE69119083T2; EP0550693A1; HK1064124A1; EP0738779B1; AU8871891A; EP1396540B1; EP0738779A3; DE69133559D1; US5827657A; DE69133389D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung von Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein vereinfachtas Verfahren zur direkten Klonierung mittels Polymerase generierter Nukleinsäuren in Vektoren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Innerhalb der kurzen Zeitdauer, seitdem ausführbare PCR-Techniken zur Amplifikation von Nukleinsäurematerial zur Verfügung stehen, sind viele Anwendungsbereiche entwickelt worden. Beispielsweise hat die PCR zahlreiche Anwendungsbereiche in der Forschung gefunden, wie bei der Bestimmung genetischer Mutationen, bei der Herstellung Template-modifizierter Sequenzen unter Verwendung fehlgepaarter Primer-Sequenzen, und bei der Herstellung ausreichender Mengen genetischen Materials zur direkten Sequenzierung. Die PCR ist ebenfalls bei vielen medizinischen und rechtlichen Problemen angewendet worden, bei denen sie in solchen Bereichen wie der Diagnose von monogenen Erkrankungen, der Analyse von biologischen Beweismitteln, etc., eingesetzt worden ist. Weitere Anwendungen der PCR-Amplifikation werden in einer Reihe von Artikeln diskutiert. vgl. z. B. PCR Technology, H.A. Ehrlich, Hrsg., Stockman Press, 1989. Zweifellos werden zukünftig noch sehr viel mehr Anwendungsformen gefunden werden.
Bei der PCR werden spezifische Nukleinsäure-Target-Sequenzen durch eine Kettenreaktion transkribiert, bei der ein zu einem bestimmten Abschnitt eines Nukleinsäure-Templates komplementäres Primer-Molekül verwendet wird, um ein Extensionsprodukt des Primers zu bilden. Jedes Primer-Extension-Produkt anneliert in spezifischer Weise an ein komplementäres Primer-Molekül, und das resultierende, mit einem Primer versehene Template wirkt als ein Substrat für eine weitere Extensionsreaktion. Diese Schritte werden vielfach wiederholt, vorzugsweise unter Anwendung eines automatisierten zyklischen Verfahrens, wodurch das NukleinsäureAusgangsmaterial exponentiell amplifiziert wird. Die PCR ist besonders geeignet zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, die anfänglich nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind. Verfahren zur Durchführung der PCR sind umfangreich beschrieben worden. Vgl. z.B. US-Patente Nrn. 4 683 195 und 4 683 202 von Mullis et al., deren Beschreibungen durch Bezugnahme eingeschlossen werden.
Neuerdings wird die PCR durchgeführt unter Anwendung eines automatisierten Wechsels zwischen Denaturierung, Annelierung eines Oligonukleotid-Primers an ein genetisches Template, und Primer-Extension unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase, z.B. dem aus dem Bakterium Thermus Aquaticus isolierten Taq-Enzym. Vgl. z.B. US-Patent 4 889 818 von Gelfand et al., dessen Beschreibung durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
Während die PCR alleine für bestimmte Anwendungen wie z.B. der direkten Sequenzierung zufriedenstellend sein kann, ist es häufig erwünscht, einen Klon von PCR-amplifizierten Produkten zur weiteren Analyse, Modifikation oder zur Synthese von Sonden zu erhalten. Beispielsweise weisen eine Reihe von mRNA-Spezies polymorphe Transkripte auf. Nach molekularer Klonierung der PCR-Amplifikationsprodukte kann alternatives Spleißen der mRNA-Spezies zum Erhalt multipler Transkripte unzweideutig sequenziert werden (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998–9002 (1988)). Die Klonierung von mittels PCR generierter Proben zur Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann ebenfalls erwünscht sein.
Im allgemeinen kann von einer Vorgehensweise, bei der PCR-Produkte kloniert werden, erwartet werden, daß gegenüber der alleinigen Anwendung der PCR ein kleinerer Satz von Produkten generiert wird, wodurch der mit der direkten Sequenzierung von PCRProdukten zusammenhängende Hintergrund reduziert wird.
Bei dem bekanntesten Verfahren zur Klonierung von PCR-Produkten werden die Enden von Primer-Molekülen mit flankierenden, Restriktionsstellen versehen. Der PCR-Zyklus wird ausgeführt, und die amplifizierte DNA wird anschließend gereinigt, mit einer geeigneten Endonuklease(n) geschnitten und mit einer kompatiblen Vektor-Präparation ligiert. Demgemäß erfordern typische PCR-Klonierungsverfahren die Herstellung von PCR-Primer-Molekülen, an die zusätzliche Basensequenzen mit einer bevorzugten Restriktions-Erkennungssequenz angefügt sind. Ferner können diese Verfahren zu einer nicht beabsichtigten internen Restriktion von nichtcharakterisierten oder polymorphen Sequenzen führen. Derartige Beschränkungen der vorhergehenden Verfahren kommen zu den Kosten und der Komplexität der routinemäßigen Klonierung von PCR-Produkten hinzu.
Kürzlich ist berichtet worden, daß die Taq-Polymerase die nicht unter Verwendung eines Templates erfolgte Addition von einzelnen Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP) -Resten an die 3'Termini von glattendigen DNA-Duplexformen katalysiert (J.M. Clark, Nucl. Acids Res. 20:9677–9686 (1989)). Demgemäß schafft die Taq-Polymerase (und andere thermostabile Polymerasen) auf natürliche Weise Restriktionsähnliche Termini an DNA-Fragmenten. Da diese überhängenden Reste jedoch weitläufig als mit den meisten Vorgehensweisen zur molekularen Klonierung inkompatibel angesehen werden, werden die Reste routinemäßig mit Nukleasen wie S1, Klenow und T4 entfernt, um glatte Enden zu erzeugen.
In Anbetracht der vorhergehenden Überlegungen ist ein Verfahren zur direkten Klonierung von terminale 3'-dAMP-Reste enthaltenden PCR-Produkten in geeignete Plasmide erwünscht. Ein derartiges Verfahren wurde das Erfordernis der Herstellung von Primern mit Restriktions-Erkennungssequenzen und das Erfordernis einer Restriktion zur Herstellung des PCR-Produkts zur klonierung eliminieren. Zusätzlich würde ein derartiges Verfahren vorzugsweise die direkte Klonierung von PCR-Produkten ohne einen zwischengeschalteten Reinigungsschritt erlauben.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten DNA-Nukleinsäuremolekülen, die ein DNA-Segment einschließen, welches terminale 3'-dAMP-Reste aufweist. Derartige DNA-Segmente werden durch thermophile Polymerasen während der PCR-Amplifikation generiert. Demgemäß beinhaltet das Verfahren nach einer Ausführungsform der Erfindung die PCR-Amplifikation eines Target-DNA-Segments, so daß eine Vielzahl doppelsträngiger Nukleinsäuren, die das Segment einschließen, gebildet werden, wobei jede doppelsträngige Nukleinsäure einen einzelnen, überhängenden 3'-Desoxyadenosinmonophosphat (dAMP)-Rest besitzt. Die doppelsträngigen Nukleinsäuren werden vermischt mit einer heterologen Quelle linearer, doppelsträngiger DNA-Moleküle, wie linearisierten Plasmiden, welche mit einem einzelnen, überhängenden Desoxythymidylat (dTMP)-Rest am 3'-Termini der DNA-Moleküle bereitgestellt werden. Die Reaktionsmischung wird unter prädeterminierten Ligationsbedingungen gehalten, um eine Ligation der 3'-dAMP enthaltenden Nukleinsäuren mit den 3'-dTMP enthaltenden DNA-Molekülen zum Erhalt der rekombinanten Moleküle zu bewirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Target-DNA-Segment ein Gen. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird eine geeignete Wirtszellinie mit dem Gen transformiert, und das Gen wird unter prädaterminierten Reaktionsbedingungen gehalten, welche die Expression des Gens erlauben.
Die vorliegende Erfindung bietet Plasmide, welche eine erste Nukleotid-Sequenz, die von einem Restriktionsenzym erkannt wird, und eine zweite Nukleotid-Sequenz umfaßt, die von einem zweiten Restriktionsenzym erkannt wird. Jede Erkennungssequenz ist in der Lage, bei Reaktion mit den Restriktionsenzymen eine einzelne terminale 3'dTMP-Gruppe zu generieren. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Restriktionsenzyme identisch und entweder XcmI oder HphI. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das DNA-Fragment, das durch Restriktion entfernbar ist, als Oligonukleotid mit zusätzlichen Restriktionsstellen synthetisiert, die den ersten Satz an Restriktionsstellen derart flankieren, daß das Oligonukleotid einfach in in geeignetes Substrat insertiert werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt Kits bereit, die zur direkten Klonierung PCR-amplifizierter Produkte mit 3'-dAMP-Resten in die vorliegenden Plasmide geeignet sind. Die Kits schließen Plasmide ein, die mindestens zwei Nukleotidsequenzen aufweisen, welche von einem Restriktionsenzym erkannt werden, das in der Lage ist, an jeder Sequenz einzelne 3'-dTMP-Termini zu erzeugen. Die Kits schließen ferner ein Restriktionsenzym ein, welches in der Lage ist, die Plasmide an jeder Nukleotidsequenz zu spalten. Ferner können die Kits eine DNA-Ligase einschließen, welche in der Lage ist, die heterologen Stränge PCR-amplifizierter DNA mit den Plasmiden an den Restriktionsstellen zu ligieren.
Die vorliegende Erfindung bietet demgemäß neue Verfahren und damit zusammenhängende Plasmide und Kits zur direkten Klonierung rekombinanter DNA-Moleküle von Polynukleotiden, die terminale 3'-DesoxyAMP-Reste aufweisen, wie solchen, die durch PCR-Amplifikation gebildet werden. Es können amplifizierte Nukleinsäuren aus genomischer DNA, cDNA, oder rekombinanten Vektoren, die DNA-Inserts besitzen, wie λ-Phagen, Cosmide und YACS eingesetzt werden. Die vorliegenden Klonierungsverfahren erlauben über die Zelltransformation die Herstellung großer Mengen an genetischem Material, wodurch die direkte Sequenzierung langer Nukleotidsequenzen ausführbar wird. Die durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Sequenzinformationen sind aufgrund spezifischerer Ligationsreaktionen und einer reduzierten Anzahl von Restriktionsfragmenten zuverlässiger als solche, die zuvor anhand der direkten Saquenzierung von PCR-Amplifikationsprodukten erhältlich waren. Derartige Verfahren sind insbesondere geeignet bei der Klonierung von cDNA. Durch die vorliegenden Verfahren werden ferner verbesserte Matrizen zur Synthese von Sonden, die bei der genetischen Kartierung und bei der Klonierung geeignet sind, sowie Kopien kritischer diagnostischer Proben bereitgestellt, wie z.B. bei der Erstellung genetischer Fingerabdrücke. Ferner werden derzeitige PCR-Protokolle durch die varliegende Erfindung kostengünstiger und einfacher, da das Erfordernis der Synthese von Primer-Sequenzen mit spezifischen Erkennungssequenzen als auch das Erfordernis damit zusammenhängender Restriktionen beseitigt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt einen beispielhaften Klonierungsvektor, der erfindungsgemäß hergestellt wurde. Die Genkarten des Wirtsvektors (pT7T319U) und des klonierten Vektors (pTA12) sind dargestellt.
1B zeigt eine repräsentative DNA-Sequenz von Plasmiden, die erfindungsgemäß hergestellt worden sind. Die Plasmide werden mit zwei XcmI-Restriktionsstellen zwischen HindIII- und EcoRI-Stellen bereitgestellt. Ferner sind das Ergebnis der Spaltung mit XcmI sowie das Ergebnis der Ligation mit einem 3'-dAMP-PCR-amplifizierten Produkt dargestellt.
2A ist ein Diagramm, welches die Herstellung eines Vektors zeigt, der 2 HphI-Stellen enthält. Der Vektor ist gegenüber Kanamycin resistent und besitzt ein Farbindikatorsystem (β-Galaktosidase).
2B zeigt eine repräsentative DNA-Sequenz von Plasmiden, die derart hergestellt sind, daß sie auf beiden Seiten einer EcoRV-Erkennungsstelle eine HphI-Restriktionsstelle einschließen. Eine HphI-Stelle ist im Wirtsvektor vorhanden, während die zweite HpHI-Stelle durch ein insertiertes Oligonukleotid bereitgestellt wird. Ferner sind das Ergebnis eines Verdaue mit HphI sowie das Ergebnis der Ligation mit terminalen 3'-dAMP-Nukleinsäuren dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Definitionen
Basenpaar (bp): eine Partnerschaft von Adenin (A) und Thymin (T), oder von Cytosin (C) und Guanin (G) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül. In einer RNA ist Thymin durch Uracil (U) substituiert. Basenpaare werden als "komplementär" bezeichnet, wenn deren Basen sich normal paaren, wenn ein DNA- oder RNA-Molekül eine dogpelsträngige Konfiguration annimmt.
Komplementäre Nukleotidsequenz: eine Sequenz von Nukleotiden in einem einzelsträngigen DNA- oder RNA-Molekül, die ausreichend komplementär zu einem anderen Einzelstrang ist, um in spezifischer Weise (nicht zufällig) mit ihr unter nachfolgender Wasserstoffbindung zu hybridisieren.
Konserviert: eine Nukleotidsequenz ist in bezug auf eine vorher ausgewählte (Bezugs-)Sequenz konserviert, wenn sie nichtzufällig mit einem exakten Komplement der vorher ausgewählten Sequenz hybridisiert.
Duplex-DNA: ein doppelsträngiges Nukleinsäure-Molekül, das zwei Stränge von im wesentlichen komplementären Polynukleotiden umfaßt, welche durch eine oder mehrere Wasserstoffbrücken zwischen jeder der in einem Basenpaar der Duplexform vorhandenen komplementären Basen zusammengehalten werden. Da die ein Basen paar bildenden Nukleotide entweder eine Ribonukleotidbase oder eine Desoxyribonukleotidbase sein können, bezieht sich der Begriff "Duplex-DNA" entweder auf eine zwei DNA-Stränge (ds DNA) umfassende DNA-DNA-Duplexform oder auf eine RNA-DNA-Duplexform, die einen DNA- und einen RNA-Strang umfaßt.
Gen: eine Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz für ein RNA, DNA- oder Polypeptidmolekül kodiert. Gene können ununterbrochene Sequenzen von Nukleotiden sein, oder sie können solche intervenierenden Segmente wie Introns, Pramotor-Regionen, Spleißstellen und repetitive Sequenzen einschließen. Ein Gen kann entweder in RNA- oder DNA-Form vorliegen.
Hybridisierung: die Paarung von komplementären Nukleotidsequenzen (Nukleinsäuresträngen) zur Bildung einer Duplex-, Heteroduplex- oder Komplexform, welche mehr als zwei einzelsträngige Nukleinsäuren enthält, durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen/unter komplementären Basenpaaren. Die Hybridisierung ist eine spezifische, d.h. nicht-zufällige Interaktion zwischen/unter komplementären Polynukleotiden, die kompetitiv inhibiert werden kann.
Hybridisierungsprodukt: das Produkt (auch mit "Hybrid" oder "Duplexform" bezeichnet) bildet sich, wenn ein Polynukleotid mit einer einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert. Wenn ein Polynukleotid mit einer doppelsträngigen Nukleinsäure hybridisiert, wird das gebildete Hybridisierungsprodukt als Tripelhelix oder als tripelsträngiges Nukleinsäuremolekül bezeichnet (Moser et al., Science, 238:645–650 (1987)).
Nukleotid: eine monomere DNA- oder RNA-Einheit, die aus einem Zuckerrest (Pentose), einer Phosphatgruppe und einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base besteht. Die Base ist mit dem Zuckerrest über den glykosidischen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) verknüpft, und diese Kombination aus Base und Zucker ist ein Nukleosid. Wenn das Nukleosid eine Phosphatgruppe enthält, die an die 3'- oder 5'-Position der Pentose gebunden ist, wird es als Nukleotid bezeichnet. Eine Sequenz von operativ verknüpften Nukleotiden wird vorliegend typischerweise als "Basensequenz" oder "Nukleotidsequenz" bzw. mit deren grammatikalischen Äquivalenten bezeichnet, und wird vorliegend anhand einer Formel dargestellt, deren Orientierung von links nach rechts in der üblichen Richtung vom 5'-Terminus zum 3'-Terminus angegeben ist.
Nukleotidanalog: ein Purin- oder Pyrimidin-Nukleotid, das sich hinsichtlich seiner Struktur von einer A-, T-, G-, Coder U-Base unterscheidet, das aber hinreichend ähnlich ist, um das normale Nukleotid in einem Nukleinsäuremolekül zu substituieren. Inosin (I) ist ein Nukleotidanalog, das mit jedem der anderen Nukleotide A, T, G, C oder U Wasserstoffbrücken ausbilden kann. Ferner sind methylierte Basen bekannt, die bei einer Nukleinsäure-Hybridisierung beteiligt sein können.
Polynukleotid: ein Polymer aus einzel- oder doppelsträngigen Nukleotiden. Vorliegend schließen der Begriff "Polynukleotid" und dessen grammatikalische Äquivalente die volle Bandbreite von Nukleinsäuren ein. Typischerweise bezieht sich ein. Polynukleotid auf ein Nukleinsäuremolekül, das aus einem linearen Strang von zwei oder mehreren Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden aufgebaut ist. Die exakte Größe ist von vielen Faktoren abhängig, welche ihrerseits von den tatsächlichen Anwendungsbedingungen abhängen, wie im Stand der Technik gut bekannt ist. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide schließen Primer, Sonden, RNA/DNA-Segmente, Oligonukleotide (relativ kurze Polynukleotide), Gene, Vektoren, Plasmide und dergleichen ein.
Primer: ein Polynukleotid, entweder aus einem Restriktionsansatz einer Nukleinsäure gereinigt oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn Bedingungen vorliegen, bei denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang als Matrize komplementären Primer-Extension-Produkts induziert wird, d.h. in Anwesenheit von Nukleotiden und einem Mittel zur Polymerisation, wie DNA-Polymerase, reverse Transkriptase und dergleichen, unter geeigneten Temperatur- und pH-Reaktionsbedingungen.
Rekombinantes DNA (rDNA)-Molekül: ein durch operative Verknüpfung einer Nukleinsäuresequenz wie einem Gen mit einer erfindungsgemäßen Sequenz eines DNA-Moleküls hergestelltes DNA-Molekül. Demgemäß ist ein rekombinantes DNA-Molekül ein DNA-Hybridmolekül, welches mindestens zwei Nukleotidsequenzen umfaßt, die in der Natur normalerweise nicht zusammen angetroffen werden. rDNA's, die keinen gemeinsamen biologischen Ursprung aufweisen, d.h. evolutionär unterschiedlich sind, werden als "heterolog" bezeichnet.
Vektor: ein DNA-Molekül, welches in der Lage ist, sich in einer Zelle autonom zu replizieren, und mit welchem ein DNA-Segment wie z.B. ein Gen oder ein Polynukleotid operativ verknüpft werden kann, um eine Replikation des angefügten Segments zu gewährleisten. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression von Genen zu steuern, weiche für ein oder mehrere Proteine kodieren, werden vorliegend als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Besonders wichtige Vektoren erlauben die Klonierung von cDNA (komplementäre DNA) aus mRNAs unter Verwendung von reverser Transkriptase.
B. DNA-Segmente
sIn lebenden Organismen steht die Aminosäuresequenz eines Proteins oder Polypeptids über den genetischen Rode in direktem Zusammenhang mit der Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenz des Strukturgens, das für das Protein kodiert. Demgemäß kann ein Strukturgen durch die Aminosäuresequenz, d.h. Protein oder Polypeptid, definiert werden, für die es kodiert.
Ein wichtiges und bekanntes Merkmal des genetischen Kodes ist seine Redundanz. Dies bedeutet, daß für die meisten der zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren mehr als ein kodierendes Nukleotid-Triplett (Radon) kodieren oder einen bestimmten Aminosäurerest bestimmen kann. Demgemäß kann eine Reihe von unterschiedlichen Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz kodieren. Derartige Nukleotidsequenzen werden als funktionell äquivalent betrachtet, da sie in allen Organismen zur Produktion derselben Aminosäuresequenz führen. Gelegentlich kann eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in eine gegebene Nukleotidsequenz eingebaut werden. Solche Methylierungen beeinflussen die Kodierungs-Eigenschaften jedoch in keiner Weise. Eine erfindungsgemäße DNA-Target-Sequenz umfaßt nicht mehr als etwa 2000 Nukleotid-Basenpaare und kann ein Strukturgen einschließen. Gewöhnlich liegt die DNA-Sequenz in Form einer ununterbrochenen, linearen Abfolge von Kodons vor, bei der jedes Kodon für einen Aminosäurerest kodiert, d.h., daß die DNA-Sequenz keine Introns enthält.
Erfindungsgemäß wird jedoch ebenfalls jedes gewünschte Target-Fragment, wie eine Nukleinsäure mit einer intervenierenden Sequenz, ein Promotor, eine regulatorische Sequenz, eine repetitive Sequenz, eine flankierende Sequenz, oder eine synthetische Nukleinsäure in Betracht gezogen.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Segment kann anhand chemischer Techniken wie zum Beispiel nach dem Phosphortriester-Verfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981), leicht synthetisiert werden. Durch chemische Synthese der kodierenden Sequenz kann natürlich jedwede gewünschte Modifikation einfach vorgenommen werden, indem die für die native Aminosäuresequenz kodierenden Basen durch die geeigneten Basen substituiert werden.
Die erfindungsgemäßen DNA-Segmente sind typischerweise DNA-Moleküle in der Duplexform mit kohäsiven Termini, d.h. "überhän genden" einzelsträngigen Bereichen, die sich über den doppelsträngigen Bereich des Moleküls hinaus erstrecken, Die Anwesenheit von kohäsiven Termini an den erfindungsgemäßen DNA-Molekü-len wird allgemein bevorzugt.
Ferner werden erfindungsgemäß Ribonukleinsäure (RNA)-Äquivalente der oben beschriebenen DNA-Segmente in Betracht gezogen.
C. PCR-Primer
Erfindungsgemäß wird die nachfolgend beschriebene PCR-Technik angewendet, um größere Mengen einer Target-Nukleotidsequenz zu generieren. Bei der PCR-Technik werden zur Initiation der Primer-Elongationsreaktion Primer-Moleküle eingesetzt. Der Primer muß ausreichend lang sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in Gegenwart der Polymerisationsmittel zu starten. Die exakten Längen der Primer sind van vielen Faktoren abhängig, einschließlich der Temperatur und der Quelle des Primers. Beispielsweise enthält ein Polynukleotid-Primer in Abhängigkeit der Komplexität der Template-Sequenz typischerweise 15 bis 25 oder mehr Nukleotide, obgleich er weniger Nukleotide enthalten kann. Es ist berichtet worden, daß eine Verwendung von 8 Nukleotiden in einem Polynukleotid-Primer effektiv ist (Studier et al., Proc. Nato,. Acad. Sci. USA, 86:6917–6921 (1989)). Kurze Primer-Moleküle benötigen im allgemeinen niedrigere Temperaturen, um mit einem Template ausreichend stabile Hybridisierungskomplexe zur Initiation der Primer-Extension zu bilden.
Die vorliegend verwendeten Primer werden so ausgewählt, daß sie "im wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen einer jeden zu synthetisierenden oder amplifizierenden spezifischen Sequenz sind. Folglich muß der Primer an seinem 3'-Terminus eine Nukleotidsequenz enthalten, die ausreichend komplementär ist, um mit ihrem entsprechenden Template-Strang nichtzufällig zu hybridisieren. Demgemäß kann es sein, daß die Primer-Sequenz die exakte Sequenz des Templates nicht widerspiegelt.
Beispielsweise kann an das 5'-Ende des Primers ein nicht-komplementäres Polynukleotid angefügt werden, wobei der Rest der Primer-Sequenz am wesentlichen komplementär zu dem Strang ist. Derartige nicht-komplementäre Polynukleotide könnten für eine Stelle zur Proteinbindung kodieren oder einfach eingesetzt werden, um den Leserahmen der Kodons einzustellen. Alternativ können in den Primer nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen unter der Voraussetzung eingeführt werden, daß die Primer-Sequenz hinreichend komplementär zu der Sequenz des Template-Stranges ist, um eine nicht-zufällige Hybridisierung herbeizuführen, so daß unter Bedingungen zur Synthese von Polynukleotiden ein Extensiansprodukt gebildet werden kann.
Sommer et al., Nucl. Acid. Res., 17:6749 (1989), berichten, daß Primer, die an ihrem 3'-Ende eine exakte Paarung über drei Nukleotide aufweisen, in der Lage sind, die Primer-Extensionsprodukte in spezifischer Weise zu initiieren, obgleich es zu einer weniger unspezifischen Hybridisierung kommt, wenn der Primer an seinem 3'-Ende mehr Nukleotide aufweist, die zu der Template-Sequenz exakt komplementär sind. Demgemäß muß ein im wesentlichen komplementärer Primer, wie er vorliegend verwendet wird, an seinem 3'-Ende mindestens drei Nukleotide enthalten, die zu der Template-Sequenz exakt komplementär sind. Ein im wesentlichen komplementärer Primer enthält an seinem 3'-Ende vorzugsweise mindestens 10 Nukleotide, noch bevorzugter mindestens 18 Nukleotide, und am meisten bevorzugt mindestens 24 Nukleotide mit der vorgenannten Komplementarität, Noch bevorzugter sind Primer, deren gesamte Nukleotidsequenz zu der Template-Sequenz exakt komplementär ist.
Die Auswahl der Nukleotidsequenz eines Primers ist abhängig von Faktoren wie dem Abstand zwischen der Region auf der Nukleinsäure, die für die gewünschte spezifische Nukleinsäuresequenz, welche in einer interessierenden Nukleinsäure vorhanden ist, kodiert, und ihrer Hybridisierungsstelle auf der Nukleinsäure in bezug zu irgendeinem zweiten zu verwendenden Primer.
Der Primer wird wegen maximaler Effizienz vorzugsweise in einzelsträngiger Form bereitgestellt, er kann alternativ aber auch doppelsträngig sein. Wenn der Primer doppelsträngig ist, wird er zunächst zur Auftrennung seiner Stränge behandelt, bevor er zur Herstellung von Extensionsprodukten eingesetzt wird. Vorzugsweise ist der Primer ein Polydesoxyribonukleotid.
Polynukleotide können nach einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich chemischer de novo-Synthese und Ableitung von Nukleinsäurefragmenten von nativen Nukleinsäuresequenzen, die als Gene oder Teile von Genen in einem Genom, Plasmid oder einem anderen Vektor existieren, wie durch Restriktionsendonuklease-Verdau von gräßeren doppelsträngigen Nukleinsäuren und Strangtrennung oder durch enzymatische Synthese unter Verwendung eines Nukleinsäure-Templates.
Die chemische de novo-Synthese eines Polynukleotids kann unter Anwendung irgendeines geeigneten Verfahrens durchgeführt werden, wie z.B. den Phosphortriester- oder Phosphordiester-Verfahren. Vgl. Narang et al., Meth. Enzymol., 68:90 (1979); US-Patent Nr. 4 356 270; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem., 53:323–356 (1989); und Brown et al., Meth. Enzymol., 68:109 (1979).
Die Ableitung eines Polynukleotids von Nukleinsäuren beinhaltet die Klonierung einer Nukleinsäure in einem geeigneten Wirt mittels eines Klonierungsvektors, die Replikation des Vektors und daher die Vervielfachung der Menge an klonierter Nukleinsäure, und die anschließende Isolierung von Subfragmenten der klonierten Nukleinsäuren. Zur Beschreibung der Subklonierung von Nukleinsäurefragmenten, vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 390–401 (1982); und vgl. US-Patente Nrn. 4 416 988 und 4 403 036.
D. Hybridisierung
Nach den vorliegenden Verfahren zu hybridisierende Template-Nukleinsäuresequenzen können in irgendeiner Nukleinsäure enthaltenden Probe vorhanden sein, solange die Probe in einer Form vorliegt, welche im Hinblick auf Reinheit und Konzentration mit der Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion kompatibel ist. Die Isolierung von Nukleinsäuren in einem für Hybridisierungszwecke geeigneten Ausmaß ist allgemein bekannt und kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. Beispielsweise können Nukleinsäuren aus einer Vielzahl von Nukleinsäure enthaltenden Proben einschließlich Körpergewebe, wie Haut, Muskel, Haar und dergleichen, sowie Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Urin, Amnionflüssigkeiten, Liquor cerebrospinalis und dergleichen, isoliert werden. Vgl. z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labaratory (1982); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons (1987).
Die Hybridisierungsreaktionsmischung wird unter Hybridisierungsbedingungen für einen Zeitraum gehalten, der ausreicht, damit der Primer mit komplementären Nukleinsäuresequenzen, die in der Probe vorhanden sind, unter Bildung eines Hybridisierungsprodukts, d.h. eines Komplexes, der Primer und Template-Nukleinsäurestränge enthält, hybridisiert.
Der Begriff "Hybridisierungsbedingungen" und seine grammatikalischen Äquivalente bedeuten im Zusammenhang mit der Zeitdauer der Aufrechterhaltung das Unterwerfen der Hybridisierungsreaktionsmischung, im Zusammenhang mit den Konzentrationen von Reaktanten und begleitenden Reagenzien in der Mischung, unter Zeit-, Temperatur- und pH-Bedingungen, die ausreichend sind, um dem Primer das Annealing mit der Template-Sequenz zu erlauben, was typischerweise geschieht, um eine Nukleinsäure in Duplexform zu bilden. Derartige Zeit-, Temperatur- und pH-Bedingungen, die zur Herbeiführung der Hybridisierung erforderlich sind, hängen bekanntermaßen von der Länge des zu hybridisieren den Primers, dem Ausmaß der Komplementarität zwischen dem Primer und dem Template, dem Guanosin- und Cytidin-Gehalt des Polynukleotids, der erwünschten Stringenz der Hybridisierung, und der Anwesenheit von Salzen oder zusätzlichen Reagenzien in der Hybridisierungsreaktionsmischung ab, durch die die Kinetiken der Hybridisierung beeinflußt werden. Verfahren zur Optimierung von Hybridisierungsbedingungen für eine gegebene Hybridisierungsreaktionsmischung sind im Stand der Technik gut bekannt.
Typische Hybridisierungsbedingungen schließen die Verwendung von Lösungen ein, die auf pH-Werte zwischen 4 und 9 gepuffert sind, und werden bei Temperaturen von 18 °C bis 75 °C, vorzugsweise etwa 37 °C bis etwa 65 °C, nach bevorzugter bei etwa 54 °C, und für einen Zeitraum von 0,5 Sekunden bis 24 Stunden, vorzugsweise für 2 Minuten eingehalten.
Die Hybridisierung kann bekanntermaßen in einem homogenen oder heterogenen Format durchgeführt werden. Die homogene Hybridisierungsreaktion erfolgt vollständig in Lösung, in der sowohl die Primer- als auch die Template-Sequenzen, die hybridisiert werden sollen, in löslicher Form in Lösung vorhanden sind. Eine heterogene Reaktion beinhaltet die Verwendung einer in dem Reaktionsmedium unlöslichen Matrix, an die entweder der Primer oder das Template gebunden ist.
Ebenfalls bevorzugt sind die homogenen Hybridisierungsbedingungen, wie sie für eine reverse Transkription von isolierter mRNA oder viraler RNA zur Bildung einer cDNA, zum Didesoxy-Sequenzieren und andere Verfahren unter Anwendung von Primer-Extension-Reaktionen angewendet werden, bei denen die Primer-Hybridisierung einen ersten Schritt darstellt. Besonders bevorzugt ist die homogene Hybridisierungsreaktion, bei der das Template über eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wird.
Wenn die Nukleinsäure, die eine Template-Sequenz enthält, in doppelsträngiger (ds) Form vorliegt, ist es bevorzugt, die dsDNA zunächst z.B. durch Erhitzen oder Alkali-Behandlung zu denaturieren, bevor die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Die Denaturierung der dsDNA kann vor dem Vermischen mit einem zu hybridisierenden Primer erfolgen, oder sie kann nach der Vermischung der dsDNA mit dem Primer durchgeführt werden. wenn der Primer selbst in Form eines doppelsträngigen Moleküls bereitgestellt wird, kann auch er vor dem Beimischen denaturiert werden, oder er kann gleichzeitig mit der das Template enthaltenden dsDNA denaturiert werden.
E. Primer-Extension-Reaktionen
Das mit einem Primer versehene Template kann verwendet werden, um einen Nukleinsäurestrang mit einer Nukleotidsequenz, die zu dem Template komplementär ist d.h. ein Template-Komplement herzustellen.
Wenn das Template, dessen Komplement hergestellt werden soll, in Form einer doppelsträngigen Nukleinsäure vorliegt, wird sie zunächst gewöhnlich durch Schmelzen zu Einzelsträngen wie ssDNA denaturiert. Die Nukleinsäure wird anschließend einer (ersten) Primer-Extension-Reaktion zugeführt, indem die Nukleinsäure mit einem (ersten) Primer zur Polynukleotidsynthese behandelt (kontaktiert) wird, der als Teil seinen Nukleotidsequenz eine Sequenz aufweist, die als im wesentlichen komplementär zu einem Bereich der Sequenz des Templates ausgewählt ist. Der Primer ist in der Lage, eine Primer-Extension-Reaktion zu initiieren, indem er mit einer spezifischen Nukleotidsequenz hybridisiert, vorzugsweise über eine Länge von mindestens etwa 8 Nukleotiden und noch bevorzugter über eine Länge von mindestens etwa 20 Nukleotiden. Dies geschieht durch Vermischen einer wirksamen Menge des Primers mit der Template-Nukleinsäure mit einer wirksamen Menge von Nukleotid-Reaktanten, um eine Primer-Extension-Reaktionsmischung zu bilden. Die Mischung wird für einen Zeitraum unter Bedingungen zur Synthese von Polynukleoti den gehalten, welche typischerweise prädeterminiert ist und zur Bildung eines Primer-Extension-Reaktionsprodukts ausreicht.
Die Primer-Extension wird unter Anwendung irgendeines geeigneten Verfahrens durchgeführt. Im allgemeinen sind Bedingungen zur Synthese von Polynukleotiden solche, bei denen die Reaktion in einer gepufferten wäßrigen Lösung abläuft, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7–9, noch bevorzugter bei etwa 8. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß (für genomische Nukleinsäure gewöhnlich etwa 10⁶:1 Primer:Template) des Primers mit dem Puffer vermischt, welcher den Template-Strang enthält. Ein großer molarer Überschuß wird bevorzugt, um die Effizienz des verfahrens zu verbessern. Im Falle von Polynukleotid-Primern mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nukleotiden liegt ein typisches Verhältnis im Bereich von 50 nq zu 1 μg, vorzugsweise 250 ng Primer pro 100 ng bis 500 ng genomischer Säuger-DNA oder pro 10 bis 50 ng Plasmid-DNA.
Die Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und dTTp werden der Primer-Extension-Reaktionsmischung ebenfalls in Mengen beigemischt, die angemessen sind, um die Synthese der Primer-Extension-Produkte zu unterstützen, wobei diese van der Größe und Anzahl der zu synthetisierenden Produkte abhängen. Die resultierende Lösung wird für etwa 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise für 1 bis 4 Minuten auf etwa 90 °C–100 °C erhitzt. Mach diesem Erhitzen läßt man die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, die für die Primer-Hybridisierung bevorzugt wird. Zu der abgekühlten Mischung wird ein geeignetes Agens zur Induktion oder zur Katalyse der Primer-Extension zugegeben, und man läßt die Reaktion unter bekannten Bedingungen ablaufen. Die Synthesereaktion kann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur erfolgen, oberhalb derer das Induktionsmittel nicht mehr effizient arbeitet. Demgemäß liegt die Temperatur im Falle der Verwendung einer DNA-Polymerase als Induktionsmittel gewöhnlich nicht höher als etwa 40 °C, sofern die Polymerase nicht hitzestabil ist.
Das Induktionsmittel kann irgendeine Verbindung oder irgendein System sein, das zur Synthese von Primer-Exteasion-Produkten führt, einschließlich Enzyme. Geeignete Enzyme für diesen Zweck schließen z.B. E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, T7 DNA-Polymerase, rekombinante modifizierte T7 DNA-Polymerase, andere verfügbare DNA-Polymerasen, reverse Transkriptase, und andere Enzyme ein, einschließlich hitzestabile Enzyme, die eine Kombination der Nukleotide in der korrekten Weise derart vereinfachen, daß die zu jedem Nukleinsäurestrang komplementären Primer-Egtension-Produkte gebildet werden.
Hitzestabile (thermophile) DNA-Polymerasen sind besonders bevorzugt, da sie in der am meisten bevorzugten Ausführungsform, bei der die PCR in einer einzigen Lösung durchgeführt und die Temperatursteuerung zyklisch erfolgt, stabil sind. Repräsentative hitzestabile Polymerasen sind DNA-Polymerasen, die aus Bacillus stearothermophilus (BioRad, Richmond, CA), Thermus thermoilus (FINZYME, ATCC Nr. 27634), Thermus species (ATCC Nr. 31674), Thermus aquaticus-Stamm TV 1151B (ATCC Nr. 25105), sulfolobus acidocaldarius, beschrieben von Bukhrashuili et al., Biochem. Biophys. Acta, 1008:102–107 (1989), und von Elie et al., Biochem. Biophys Acta, 951:261–267 (1988), Thermus filiformis (ATCC Nr. 43280), isoliert sind, sowie die aus Thermus flavus isolierte Polymerase (Molecular Biology Resources, Milwaukee, WI), und "Vent"-Polymerasen (New England Biolabs, Beverly, MA). Besonders bevorzugt sind die Tag-DNA-Palymerase, die aus einer Vielzahl von Quellen einschließlich Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT), Promega (Madison, WI) und Stratagene (La Jolla, CA) erhältlich sind, und die AmpliTaq^®-DNA-Polymerase, eine von Perkin-Elmer Cetus erhältliche rekombinante Tag-DNA-Polymerase.
In einer bevorzugten Ausführungsform dient die ausgewählte Polymerase als eine 3'-terminale Transferase, welche in der Lage ist, eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem einzelnen, überhängenden Nukleotidrest zu versehen. Nach einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird einer nicht mit einem Template versehenen Nukleinsäure durch die Transferase ein 3'-Adenosinrest angefügt, wie es durch die Taq-Polymerase geschieht. In alternativen Ausführungsformen werden durch die Transferase andere Nukleoside angefügt, z.B. Guanosin, Cytidin, Thymidin.
Durch die vorliegende Erfindung wird jegliches Nukeinsäuresegment in Betracht gezogen, das von einer Polymerase entweder in vitro oder in vivo gebildet worden ist. Jede Polymerase, die in der Lage ist, eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem vorstehenden 3'-terminalen AMP zu produzieren, wodurch dessen Einführung in einen erfindungsgemäßen Vektor erleichtert wird, ist für die Ausführung der Erfindung geeignet. Besonders bevorzugt sind DNA-abhängige DNA-Polymerasen und RNA-abhängige DNA-Polymerasen. DNA-abhängige DNA-Polymerasen schließen die Taq-Polymerase ein.
Im allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet in 5'-Richtung entlang des Template-Stranges fort, bis die Synthese, bei der Moleküle verschiedener Längen produziert werden, beendet wird. Es können jedoch bei Anwendung des selben, oben beschriebenen Verfahrens Induktionsmittel zugegen sein, welche die Synthese am 5'-Ende initiieren und in der obigen Richtung voranschreiten lassen.
Das Primer-Extension-Reaktionsprodukt kann anschließend einer zweiten Primer-Extension zugeführt werden, indem es mit einem zweiten Primer zur Polynukleotidsynthese behandelt wird, welcher eine präselektierte Nukleotidsequenz aufweist, Der zweite Primer ist in der Lage, die zweite Reaktion zu initiieren, indem er mit einer in dem ersten Produkt gefundenen Nukleotidsequenz hybridisiert, vorzugsweise über eine Länge von mindestens etwa 8 Nukleotiden und noch bevorzugter über eine Länge von mindestens etwa 20 Nukleotiden. Dies erfolgt durch Vermischen des zweiten Primers, vorzugsweise einer prädeterminierten Menge davon, mit dem ersten Produkt, vorzugsweise einer prädetermi nierten Menge davon, um eine zweite Primer-Extension-Reaktionsmischung zu bilden. Die Mischung wird unter Bedingungen zur Polynukleotidsynthese für einen Zeitraum gehalten, welcher typischerweise prädeterminiert ist und zur Bildung eines zweiten Primer-Extension-Reaktionsprodukts ausreicht.
In bevorzugten Strategien sind die ersten und zweiten Primer-Extension-Reaktionen die ersten und zweiten Primer-Extension-Reaktionen in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Die PCR wird durchgeführt, indem die oben beschriebenen ersten und zweiten Primer-Extension-Reaktionen zyklisch, d.h. sequentiell in einer Mischung durchgeführt werden, wobei jeder Zyklus eine Polynukleotidsynthese und eine nachfolgende Denaturierung der gebildeten doppelsträngigen Palynukleotide umfaßt. Verfahren und Systeme zur Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sind beschrieben in den US-Patenten Nr. 4 683 195 und Nr. 4 683 202 von Mullis et al., und den Lehren in PCR Technology, Ehrlich, Hrsg., Stockton Press (1984), Faloona et al., Methode in Enzymol., 155:335–350 (1987), und Polymerase Chain Reaction, Ehrlich et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratories Press (1989).
F. PCR-Zyklus
Die PCR erfolgt durch zyklische Abfolge der folgenden Schritte in einer Mischung: 1) Denaturierungsschritt zur Bildung einzelsträngiger Templates, 2) Hybridisierungsschritt zur Hybridisierung von Primer mit 55-Template, und 3) Primer-Extension-Schritte zur Bildung des verlängerten Produkts. Die PCR wird in der obigen Sequenz (Zyklus) durchgeführt, indem die Temperatur der PCR-Mischung jeweils so verändert wird, daß sie mit jedem Schritt kompatibel ist.
Die Reaktionsbedingungen für die Primer-Extension beinhalten das Halten der Reaktionsmischung für einen Zeitdraum und bei einer Temperatur, die zur Herbeiführung einer DNA-Polymerase vermittelten Primer-Extension zur Bildung van Primer-Extension-Produkten ausreichen, wie im Stand der Technik bekannt ist. Die Bedingungen zur Durchführung einer Primer-Extension sind gut bekannt. In einem PCR-Format wird das Halten rasch durchgeführt, um zahlreiche Zyklen zu ermöglichen, in etwa 1 Sekunde bis 5 Minuten, vorzugsweise etwa 1,5 Minuten, und bei etwa 40 °C bis 75 °C, vorzugsweise etwa 72 °C. Die Durchführung mindestens eines PCR-Zyklus führt zur Bildung amplifizierter Nukleinsäureprodukte. Die PCR erfolgt typischerweise über mindestens 15 Zyklen, wobei etwa 20 bis 40 Zyklen bevorzugt sind.
Die Hybridisierungsbedingungen wurden zuvor beschrieben und sind zur Anwendung im PCR-Format geeignet. Es wird jedoch bevorzugt und es bietet sich an, die Hybridisierung in kurzen Zeiträumen durchzuführen, 5 Sekunden bis 12 Minuten, vorzugsweise in 2 Minuten, und die Temperatur im Bereich von 30 °C bis 75 °C zu halten, vorzugsweise bei etwa 40 °C bis 65 °C, und noch bevorzugter bei etwa 54 °C.
G. Nachweis des PCR-Produkts
Der Nachweis eines amplifizierten Nukleinsäureprodukts kann anhand einer Vielzahl bekannter Techniken durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das amplifizierte Produkt auf der Grundlage des Molekulargewichts mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, und die aufgetrennten Produkte werden anschließend durch Verwendung van Nukleinsäure-spezifischen Farbstoffen sichtbar gemacht, die es erlauben, die einzelnen Spezies der im Gel vorhandenen aufgetrennten amplifizierten Produkte zu beobachten. Obgleich zahlreiche Nukleinsäure-spezifische Farbstoffe existieren und zur Sichtbarmachung der elektrophoretisch aufgetrennten Nukleinsäuren geeignet wären, wird Ethidiumbromid bevorzugt.
Alternative Verfahren, die zum Nachweis des amplifizierten Nukleinsäureprodukts geeignet sind, schließen auf eine Hybridisierung basierende Nachweismittel ein, bei denen eine markierte Polynukleotidsonde eingesetzt wird, welche in der Lage ist, mit dem amplifizierten Produkt zu hybridisieren. Beispiele derartiger Nachweismittel schließen eine Southern-Blot-Analyse, eine Ribonuklease-Schutzanalyse unter Verwendung von in vitro-markierten Polyribonukleotidsonden, sowie ähnliche Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit spezifischen Nukleotidsequenzen ein. Vgl. z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley an Sons, 1987.
Bei einem Ansatz zum Nachweis der Gegenwart einer spezifischen Nukleinsäuresequenz schließen die in der Primer-Extension verwendeten Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) einen Marker oder eine nachweisbare Gruppe ein, wodurch ein Primer-Extension-Produkt nachweisbar wird. Typischerweise schließen derartige Marke radioaktive Atome, chemisch modifizierte Nukleotidbasen und dergleichen ein.
Operativ mit einem dNTP verknüpfte oder ein Teil desselben bildende radioaktive Elemente bieten brauchbare Mittel zur Vereinfachung des Nachweises eines DNA-Primer-Extension-Produkts. Ein typisches radioaktives Element produziert β-Strahlen. Elemente, die β-Strahlen emittieren, wie ³H, ¹⁴C, ³⁷P und ³⁵S repräsentieren eine Klasse von β-Strahlen erzeugenden radioaktiven Markern.
Alternativen zu radioaktiv markierten dNTPs sind dNTPs, die derart chemisch modifiziert sind, daß sie Metall-Komplexbildner, Biotin enthaltende Gruppen, fluoreszierende Verbindungen und dergleichen enthalten.
Ein geeigneter Metall-Komplexbildner ist eine durch ein Lanthanidmetall und β-Diketonatliganden gebildete Lanthanid-Chelatverbindung, wobei das Lanthanid derart an die Nukleinsäure oder an das Polynukleotid über eine chelatbildende Verbindung wie einem EDTA-Analog gebunden ist, daß ein fluoreszierender Lanthanidkomplex gebildet wird. Vgl. US-Patente Nr. 4 374 120 und Nr. 4 569 790 und die veröffentlichten internationalen Patentanmeldungen Nr. EP 0 139 675 und Nr. WO87/02708.
Biotin- oder Acridinester-markierte Oligonukleotide und deren Verwendung in Polynukleotiden sind beschrieben worden. Vgl. US-Patent Nr. 4 107 404, veröffentlichte internationale Patentanmeldung EP 0 212 951 und europäisches Patent Nr. 0 087 636. Geeignete fluoreszierende Markerverbindungen schließen Fluorescein, Rhodamin, Texas Red, NBD und dergleichen ein.
Ein in einer Nukleinsäure vorhandener markierter Nukleotidrest sorgt für eine Markierung der Nukleinsäure als solche, welche demgemäß gegenüber anderen in einer zu analysierenden Probe vorhandenen Nukleinsäuren unterscheidbar ist. Der Nachweis des Vorhandenseins des Markers in der Nukleinsäure und damit der Gegenwart der spezifischen Nukleinsäuresequenz beinhaltet typischerweise die Trennung der Nukleinsäure von jeglichen markierten dNTPs, die nicht als Teil eines Primer-Extension-Reaktionsprodukts vorliegen.
Techniken zur Trennung einzelsträngiger Polynukleotide wie einer nicht-hybridisierten markierten Polynukleotidsonde von DNA-Duplexformen sind gut bekannt und beinhalten typischerweise die Trennung von einzelsträngigen und doppelsträngigen Nukleinsäuren auf der Grundlage ihrer chemischen Eigenschaften. Häufiger beinhalten Techniken zur Trennung die Anwendung eines heterogenen Hybridisierungsformats, bei dem die nicht-hybridisierte Sonde typischerweise durch Waschen von der DNA-Duplexform getrennt wird, welcher an einer unlöslichen Matrix gebunden ist. Beispielhaft ist die Southern-Blotting-Technik, bei der die Matrix eine Nitrocellulosefolie und der Marker ³²P sind. Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975).
Nach einem weiteren Ansatz zum Nachweis des Vorhandenseins einer DNA-Duplexform, wobei der vorliegend angewendete für eine bevorzugte Ausführungsform beispielhaft ist, wird die DNA-Duplexform wie vorliegend beschrieben amplifiziert, und das resultierende amplifizierte Nukleinsäureprodukt wird nachgewiesen.
Zahlreiche Anwendungsformen des auf der PCR basierenden Verfahrens zur Amplifikation, die für einen Fachmann leicht erkennbar sind, werden in Betracht gezogen. Beispielsweise kann die Klonierung von mRNA durch reverse Transkription zur Herstellung einer cDNA durch eine auf der PCR basierenden Amplifikation der gebildeten cDNA sensitiver gestaltet werden. Insofern, als das Sequenzieren einer Nukleinsäure mit PCR-amplifizierter Nukleinsäure durchgeführt werden kann, kann die vorliegende Erfindung angewendet werden, um eine Sequenzierung amplifizierter Nukleinsäuren zu verbessern.
H. Rekombinante DNA-Moleküle
Es ist bekannt, daß die Auswahl eines Vektors, mit dem eine erfindungsgemäße DNA-Target-Sequenz operativ verknüpft wird, von den erwünschten funktionellen Eigenschaften wie z.B. der Proteinexpression sowie von der zu transformierenden Wirtszelle abhängt. Diese Beschränkungen sind der Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle immanent. Ein von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogener Vektor ist jedoch zumindest in der Lage, die Replikation und vorzugsweise auch die Expression eines operativ mit dem Vektor verknüpften Gens zu steuern.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt ein von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogener Vektor ein prokaryontisches Replikon ein, d.h. eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit zur direkten autonomen Replikation und der extrachromosomalen Beibehaltung des rekambinanten DNA-Moleküls in einer prokaryontischen Wirtszelle wie einer bakteriellen Wirtszelle, die damit transformiert ist. Derartige Replikons sind im Stand der Technik gut bekannt. Zusätzlich können solche Ausführungsformen, die ein prokaryontisches Replikon einschließen, auch ein Gen einschließen, dessen Expression einem damit transformierten bakteriellen Wirt eine Wirkstoffresistenz verleiht. Typische bakterielle Wirkstoff-Resistenzgene sind solche, die Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin verleihen.
Solche Vektoren, die ein prokaryontisches Replikon einschließen, können ferner einen prokaryontischen Promotor einschließen, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) des damit transformierten Gens zu steuern. Ein Promotor ist ein Expressions-Kontrollelement, welches durch eine DNA-Sequenz gebildet wird, die das Binden einer RNA-Polymerase erlaubt und die Transkription ermöglicht. Mit bakteriellen Wirten kompatible Promotor-Sequenzen werden typischerweise in Plasmidvektoren bereitgestellt, die Restriktionsstellen enthalten, welche für die Insertion eines erfindungsgemäßen PCR-Produktmoleküls geeignet sind. Typische derartige Vektorplasmide sind pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329, erhältlich von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) und pPL, pKK223, pTZ18U, pTZ19U und pT7T319U, erhältlich von Pharmacia (Piscataway, NJ).
Zur Bildung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle können auch Expressionsvektoren eingesetzt werden, die mit eukaryontischen Zellen kompatibel sind, vorzugsweise solche, die mit vertebratenzellen kompatibel sind. Expressionsvektoren für eukaryontische Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt und aus mehreren kommerziellen Quellen erhältlich. Typischarweise werden solche derartige Vektoren bereitgestellt, die geeignete Restriktionsstellen zur Insertion des gewünschten Gens enthalten. Typische derartige Vektoren sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pEPv-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), und pTDT1 (ATCC Nr. 31255).
In bevorzugten Ausführungsformen schließen die zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle verwende ten Expressionsvektoren für eukaryontische Zellen einen Selektionsmarker ein, der in einer Eukaryontenzelle wirksam ist, vorzugsweise einen Wirkstoffresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Wirkstoff-Resistenzmarker ist das Gen, dessen Expression zur Neomycinresistenz führt, d.h. das Neomycinphosphortransferase (Neo)-Gen. Southern et al., J .,Mol. Appl. Genet., 1:327–341 (1982).
Die Verwendung von retroviralen Expressionsvektoren zur Bildung der erfindungsgemäßen rDNAs wird ebenfalls in Betracht gezogen. Der vorliegend verwendete Begriff "retroviraler Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, welches eine Promotor-Sequenz einschließt, die von der Region langer terminaler Wiederholungen (LTR) eines retroviralen Genoms abgeleitet ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Expressionsvektor typischerweise ein retroviraler Expressionsvektor, der vorzugsweise in Eukaryontenzellen Replikations-inkompetent ist. Die Herstellung und Verwendung von retroviralen Vektoren ist beschrieben worden von Sorge et al., Mol. Cell, Biol., 4:1730–1737 (1984).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt der ausgewählte Vektor in seiner linearisierten Farm kahäsive Termini, die zu den Termini komplementär sind, die durch die bei der PCR-Amplifikation verwendete Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, generiert wurden. Demgemäß ist eine geeignete Vektorzubereitung zur direkten Klonierung 3'-dAMP-terminaler PCR-Produkte ein Plasmid, welches in seiner linearisierten Form einzelne, überhängende 3'-dTMP-Termini aufweist. (Bei dem dTMP-Rest kann dessen Monophosphatgruppe an das 3'- oder, noch bevorzugter, an das 5'-Ende des Thymidinnukleosids angeheftet sein.) Da Thymin zu sich selbst nicht komplementär ist, werden die verwendeten 3'-dTMP-terminalen Vektoren von größeren Plasmiden abgeleitet, welche ein entfernbares verknüpfendes Fragment einschließen, das die beiden 3'-dTMP-Gruppen verbindet, bis die Bildung des linearisierten Vektors gewünscht wird. Die Herstellung des linearisierten Vektors erfolgt durch Restriktion des größeren Plasmids an den gewünschten dTMP-Stellen unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Restriktionsenzyme nach bekannten Verfahren und nach den Angaben des Herstellers geeigneter Enzyme.
Die vorliegende Erfindung kann angewendet werden, um ein cDNA-Fragment in einen erfindungsgemäßen Vektor zu insertieren. Vorzugsweise wird die cDNA in den Vektor in spezifischer Orientierung eingeführt. Dies kann erfolgen, indem ein Primer-Polynukleotid eingesetzt wird, welches eine Spaltstelle wie eine Restriktionsendonukleasestelle enthält, um die Abspaltung des vorstehenden 3'-AMPs van einem Ende der cDNA zu ermöglichen. Diese Restriktionsendonukleasestelle wird genutzt, um dieses mit der Restriktionsendonuklease abgespaltene Ende der cDNA in den Vektor einzuführen. Das andere Ende der cDNA wird in den Vektor unter Nutzung des auf jenem Ende der cDNA vorhandenen vorstehenden 3'-AMPs eingeführt, um eine Insertion in einen erfindungsgemäßen Vektor mit einem vorstehenden 5'-TMP zu erleichtern. Diese Vorgehensweise ermöglicht die Einführung der cDNA in einen Vektor in einer bestimmten Orientierung, wodurch die Expression der klonierten DMA erleichtert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Primer, der die zur Insertion einer cDNA in einen erfindungsgemäßen Vektor verwendete Spaltstelle enthält, ein Polymerase-Kettenreaktion-Primer. Vorzugsweise ist die Spaltstelle im zweiten Primer, der bei der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt wird, nicht enthalten. Ein erfindungsgemäßer Vektor kann ein Expressionsvektor, ein Klonierungsvektor, ein Shuttle-Vektor und dergleichen sein.
Bei einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Restriktionsenzym verwendet, welches in der Lage ist, einzelne, überhängende 3'-dTMP-Termini zu generieren. Es sind jedoch nur ein paar Restriktionsenzyme bekannt, die zur Herstellung derartiger Termini in Plasmiden angegeben werden können, d.h. HphI, MboII und XcmI (New England Biolabs). Darüber hinaus zeigen zwei dieser Enzyme (MboII und XcmI) eine geringe Ligationseffizienz (< 20 %) , Ferner finden zwei Enzyme (HphI und boII) offenbar in nahezu jedem bekannten Plasmid Erkennungssequenzen, z.B. spalten beide das Plasmid pUC19 an 7 Stellen, wodurch viele unerwünschte Fragmente entstehen. Daher kann es erwünscht sein, die obigen Enzyme bei bestimmten Anwendungen hinsichtlich ihrer Aktivitäten und Ligationseffizienzen zu untersuchen. Diese Verfahren sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und werden durch die nachfolgend beschriebenen Beispiele veranschaulicht.
Eine Vielzahl von Verfahren sind entwickelt worden, um DNA über komplementäre kohäsive Termini operativ mit Vektoren zu verknüpfen. Beispielsweise können komplementäre homo- oder heteropolymere Bereiche an die Enden der dAMP-terminalen verknüpfenden Fragmente angefügt werden, die aus dem Vektor mit einem Restriktionsenzym entfernt werden können, wenn es erwünscht ist, die durch die PCR generierten 3'-dAMP-terminalen Produkte zu ligieren. Demgemäß ist der Vektor mit dem entfernbaren Fragment über verbindende Sequenzen und durch Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Enden des Vektors und der verkrüpfenden Sequenz und zwischen den verknüpfenden Sequenzen und dem entfernbaren Fragment kovalent verbunden.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform besitzt das als Vektor ausgewählte Plasmid EcoRI- und HindIII-Restriktionsstellen, durch die eine DNA-Sequenz insertiert werden kann, die an ihren Termini komplementäre Reste aufweist, welche eine Restriktion mit EcoRI und HindIII erlauben. Die interne Region des Fragments wird zwei oder mehrere Restriktionsstellen aufweisen, die von den Enzymen XcmI, HphI oder MboII, oder einer Kombination derselben, erkannt werden, so daß für eine nachfolgende Verbindung mit 3'-dAMP-terminalen DNA-Segmenten 3'-terminale dTMP-Raste generiert werden können. Eine Restriktion der geeigneten Erkennungssequenzen führt zu einem entfernbaren DNA-Fragment und einem linearisierten Plasmid. Das kleinere DNA-Fragment kann durch bekannte Techniken der Geltrennung entfernt werden.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Restriktionsstellen enthalten, sind bei einer Reihe von Anbietern erhältlich, einschließlich International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT. Die Gebrauchsanweisungen können van dem Anbieter bezogen werden. Polynukleotidsequenzen, die die entfernbaren Fragmente und/oder die verknüpfenden Sequenzen einschließen, werden vorzugsweise durch direkte Synthesetechniken hergestellt, wie sie z.B. zur Herstellung van PCR-Primermolekülen beschrieben werden.
Erfindungsgemäß werden ferner RNA-Äquivalente der oben beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle in Betracht gezogen.
Die 3'-dAMP-Nukleinsäuren werden mit linearen DNA-Molekülen in einer Mischung davon kombiniert, und eine Ligase wird hinzugegeben, um die Ligation der Komponenten herbeizuführen. Unter Anwendung bekannter Verfahren und Bedingungen kann jede im Handel erhältliche Ligase zur effektiven Durchführung der Ligationsreaktion eingesetzt werden. Eins bevorzugte Ligase ist die T4 DNA-Ligase.
Volumen-Ausschlußagenzien können ebenfalls eingesetzt werden, um die Ligationsreaktion zu beschleunigen. Solche Agenzien können jedoch in einigen Fällen exzessive intramolekulare Ringbildungen verursachen.
Ferner wird besonders in Betracht gezogen, daß bestimmte Nukleinsäuren, deren Klonierung erwünscht ist, nur über einen terminalen 3'-dAMP-Rest pro Duplex verfügen. Diese Situation kann sich aus der unvollständigen Reaktion einer PCR-Polymerase, z. B. Tag, mit einem amplifizierten Produkt ergeben. Eine derartige Eventualität wird jedoch erfindungsgemäß erwartet, und daher erlaubt die vorliegende Erfindung in einigen Fällen die direkte Klonierung von monoligierten (linearen) Rekombinanten, solange die zur Klonierung vorgesehene Nukleinsäure mindestens an einen terminalen 3'-dTMP-Rest bindet, der von dem Vektor präsentiert wird. Zusätzlich wird es in diesen Fällen normalerweise wahrscheinlich zu Feiner Transformation von Zellen mit monoligierten rekambinanten DNA-Molekülen kommen, wobei die Ligation am zweiten 3'-dTMP-Terminus intrazellulär erfolgt.
I. Transformation von Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Einführen der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle in Wirtszellen durch ein Verfahren, welches gewöhnlich als Transformation oder Transfektion bezeichnet wird. Die Wirtszelle kann entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryontische Wirtszellen und gehören typischerweise einem E. coli-Stamm an, wie z.B. dem Stamm DH1αF. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen schließen Hefe- und Säugerzellen und vorzugsweise Vertebratenzellen ein, wie solche von einer Fibroblasten-Zellinie der Maus, der Ratte, des Affen oder des Menschen. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen schließen Ovarial (CHO)-Zellen des Chinesischen Hamsters, erhältich von der ATCC unter CCL61, sowie die embryonalen Zellen der NIH-Swiss-Maus NIH/3T3 ein, die van der ATCC unter CRL 1658 erhältlich sind. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herbeiführung der Transformation ist die Elektroporation.
Die Transformation geeigneter Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen rekambinanten DNA-Molekül erfolgt anhand bekannter Verfahren, die typischerweise von dem verwendeten Vektortyp abhängen. Hinsichtlich der Transformation prokaryontischer Wirtszellen, s. z.B. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972); und Maniatis et al., Molecular Cloning. A.Labo ratory Manual, Cold Spring Harbor Labaratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Hinsichtlich der Transformation von Vertebratenzellen mit rDNAs enthaltenden retroviralen Vektoren, s. z.B. Sorge et al., Mol. Cell. Biol., 4:1730–1737 (1984); Graham et al., Virology, 52:456 (1973); und Wigler et al., Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 76:1373–1376 (1979).
J. Assays für rekombinante Vektoren
Erfolgreich transformierte Zellen, d.h. Zellen, die ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül enthalten, können anhand bekannter Techniken identifiziert werden. Beispielsweise können Zellen, die aus der Einführung einer erfindungsgemäßen rDNA resultieren, kloniert werden, um monoklonale Kolonien zu bilden. Zellen aus diesen Kolonien können geerntet und lysiert weiden, und ihr DNA-Gehalt kann auf Anwesenheit der rDNA untersucht werden, indem ein Verfahren eingesetzt wird, wird es beschrieben ist von Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975), oder von Berent et al., Biotech., 3:208 (1985).
Zusätzlich zum direkten Assay hinsichtlich der Anwesenheit von rDNA kann eine erfolgreiche Transformation durch bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA in der Lage ist, die Expression eines bestimmten Palypeptids zu steuern. Beispielsweise produzieren Zellen, die erfolgreich mit einer entsprechenden rDNA transformiert sind und einen Expressionsvektor enthalten, ein Polypeptid, welches eine charakteristische Antigenität aufweist. Die Proben einer Kultur, die Zellen enthält, von denen angenommen wird, daß sie transformiert sind, werden geerntet und hinsichtlich der Untersuchung eines bestimmten Polypeptids einem Assay zugeführt, wobei Antikörper verwendet werden, die für das Polypeptidantigen spezifisch sind, wie solche, die von einer geeigneten Hybridomzelle produziert werden.
Demgemäß zieht die vorliegende Erfindung zusätzlich zu den tranaformierten Wirtszellen eine Kultur solcher Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur, oder eine Kultur in einem Nährmedium in Betracht, die von einer monoklonalen Kultur abgeleitet ist. Nährmedien, die zur Kultivierung transformierter Wirtszellen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt und können von verschiedenen kommerziellen Anbietern bezogen werden. In Ausführngsformen, bei denen die Wirtszelle eine Säugerzelle ist, wird vorzugsweise "serumfreies" Medium verwendet.
Das vorliegende Verfahren umfaßt eine Kultur, die ein Nährmedium umfaßt, welche Wirtszellen enthält, die mit einem erfindungsgemäßen rekambinanten DNA-Molekül transformiert sind, das in der Lage ist, ein für ein bestimmtes Polypeptid kodierendes Gen zu exprimieren. Die Kultur wird für einen Zeitraum gehalten, der ausreicht, damit die transformierten Zellen das gewünschte Polypeptid exprimieren können. Das exprimierte Polypeptid wird anschließend aus der Kultur gewonnen.
Die Verfahren zur Gewinnung eines exprimierten Polypeptids aus einer Kultur sind bekannt und schließen eine Fraktionierung des das Polypeptid enthaltenden Anteils der Kultur unter Anwendung bekannter biochemischer Techniken ein. Beispielsweise können die Verfahren der Gelfiltration, Gelchramatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese, Ionenaustausch-, Affinitätschromatographie und dergleichen, wie solche, die zur Fraktionierung von Proteinen bekannt sind, eingesetzt werden, um die in der Kultur gefundenen exprimierten Proteine zu isolieren. Zusätzlich können immunchemische verfahren wie Immunaffinität, Immunabsorption und dergleichen unter Anwendung bekannter Methoden durchgeführt werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der E. coli-Phänotyp Lac Z' blau/weiß eingesetzt, um einen sichtbaren Assay in bezug auf effektive Klonierung zu ermöglichen. Um dieses Assayverfahren anzuwenden, werden phasengleich zum Lac Z'-Leserahmen Restriktionsstellen erzeugt. Demgemäß unterbricht ein in dieses Indikatorgen eingeführtes DNA-Fragment die normale Translation des Proteins β-Galaktosidase, wodurch auf Kulturmedium, welches den chromogenen Farbstoff XGAL enthält, Kolonien mit weißem Phänotyp entstehen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten Antibiotikaresistenzgene wie das Ampicillinresistenzgen oder Kanamycinresistenzgene. Während diese besonderen Kanamycinresistenzgene bevorzugt sind, können andere äquivalente Gene und Plasmide wie die Gene in dem von Pharmacia vertriebenen Kanamycinresistenz-Gene Block, oder das Kanamycinresistenzplasmid pMON 530 und dergleichen geeignet sein.
K. Zusammensetzungen und Kits
Viele der im Rahmen der vorliegenden Beschreibung angesprochenen Verbindungen und Gruppen (z.B. Nukleinsäuren) können eine Reihe von Formen wie insbesondere variabel protonierte Formen annehmen, die jeweils im Gleichgewicht zueinander stehen. Der ausgebildete Praktiker wird erkennen, daß eine Bezugnahme auf eine Form einer Verbindung oder Gruppe vorliegend sämtliche Formen davon einschließen soll, die zueinander im Gleichgewicht stehen.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bedeutet "μM" mikromolar, "μl" bedeutet Mikroliter und "μg" bedeutet Mikrogramm.
Die als Wirtsvektoren dienenden Zusammensetzungen können in Form eines Kits verpackt werden. Der vorliegend verwendete Begriff "Packung" bezieht sich auf eine in einem System gewöhnlich verwendete feste Matrix oder ein festes Material, welches in der Lage ist, innerhalb bestimmter Grenzen eine oder mehrere der in einem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Reaktionsteilnehmer zu halten. Derartige Materialien schließen Glas- und Kunststoff- (z.B. Polyethylen-, Polypropylen- und Polycarbonat) -flaschen, -röhrchen, Papier, mit Kunststoff und Kunststoffolien laminierte Hüllen und dergleichen ein. Demgemäß kann eine Packung beispielsweise ein Glasröhrchen sein, das verwendet wird, um die angemessenen Mengen an Polynukleotid-Primer(n), Plasmiden, Restriktionsenzyme(n), DNA-Polymerase, DNA-Ligase, oder eine Kombination davon zu enthalten. Ein zur Durchführung mindestens eines Klonierungsprogramms ausreichendes Aliquot einer jeden Komponente wird in jedem Behälter bereitgestellt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor operativ mit einem Marker wie z.B. einem Indikatorgen verknüpft, wodurch Mittel zum Nachweis eines in ein Target-Plasmid eingeführten DNA-Segments bereitgestellt werden. Bevorzugte Marker sind im Stand der Technik bekannt und schließen die zuvor diskutierten ein, insbesondere den sichtbaren Lac Z'-Marker. Andere selektierbare Marker können verwendet werden und sind auf dem Gebiet bekannt.
Zur Herstellung eines Template-Komplements oder zur Amplifikation oder zum Nachweis einer spezifischen Nukleinsäuresequenz unter Anwendung der Methodik einer Primer-Extension geeignete Kits schließen typischerweise in getrennten Behältern dNTPs, wobei N Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin ist, und andere ähnliche Agenzien zur Durchführung von Primer-Extension-Reaktionen ein.
Die Reagensspezies, Anzeigemittel oder Reagenzien für die Primer-Extension irgendeines vorliegend beschriebenen Systems, können in Lösung wie in Form einer flüssigen Dispersion oder als im wesentlichen trockenes Pulver bereitgestellt werden, z.B. können die Plasmide in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. Wenn die Reagensspezies oder das Anzeigemittel ein Enzym ist, kann auch das Substrat des Enzyms in einer getrennten Packung eines Systems bereitgestellt werden. Ein fester Träger und ein oder mehrere Puffer können ebenfalls als getrennt verpackte Elemente in dieses System eingeschlossen werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgend beschriebenen spezifischen Beispiele und durch die anhängenden Ansprüche näher erläutert.
BEISPIEL 1
Herstellung modifizierter Plasmide
Die zur Vektorherstellung ausgewählten Ausgangsplasmide gehörten zur Varietät pT7T319U (Mead et al., Protein Engineering, 1:67–74 (1986)), welche ein Derivat von pTZ19U ist und bei Pharmacia LKB bezogen werden kann.
Komplementäre Einzelstränge von Nukleinsäuren wurden mit Hilfe eines automatischen DNA-Synthesizers "Gene Assembler" von Pharmacia synthetisiert, wobei die vom Hersteller empfohlenen Bedingungen angewendet wurden. Man ließ die einzelsträngigen Sequenzen hybridisieren, wodurch eine komplementäre asymmetrische DNA-Duplexform mit der in 1 dargestellten Nukleotidsequenz entstand. Dieses Oligonukleotid erlaubt die Spaltung durch HcmI an zwei Stellen (zwischen den Resten 18 und 19 der oberen Kette und zwischen den Resten 14 und 15 der unteren Kette) unter Bildung eines einzelnen, überhängenden dTMP-Terminus am 3'-Ende eines jeden Stranges.
Die oben hergestellten Plasmide pT7T319U und Oligonukleotide wurden getrennt mit HindIII- und EcoRI-Restriktionsenzymen behandelt, wobei die von dem Anbieter der Enzyme, New England Biolabs, empfohlenen Reaktionsbedingungen angewendet wurden. Die bei pT7T319U vorhandenen Restriktionsstellen wurden so ausgewählt, daß der Lac Z'-Leserahmen der Plasmide durch irgendein darin befindliches Insert unterbrochen werden würde, wodurch ein visueller Assay unter Anwendung des bekannten blau/weißen Phänotyps von β-Galaktosidase ermöglicht wird.
Die linearisierten Plasmide wurden durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel von den zwischen den EcoRI- und HindIII-Stellen freigesetzten Fragmenten getrennt, und die linearisierten Plasmide wurden aus dem Gel durch Elektroelution entfernt. In ähnlicher Weise erfolgte die Trennung der zentralen Sequenz des Oligonukleotids von seinen durch EcoRI und HindIII freigesetzten flankierenden Segmenten.
Die gereinigten linsarisierten Plasmide und Oligonukleotide wurden im Verhältnis 1:1 bis 1:3 vermischt und mit T4 DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) unter den vom Hersteller angegebenen Reaktionsbedingungen ligiert. Die auf diese Weise gebildeten rekombinanten Plasmide werden vorliegend mit pTA12 bezeichnet. In 1A sind die Genkartierungen der Wirts- und pTA12-Plasmide dargestellt.
BEISPIEL 2
Herstellung des Klonierungsvektors
Gemäß Beispiel 1 hergestellte pTA12-Plasmide wurden mit XcmI gespalten nach dem vom Hersteller, New England Biolabs, empfohlenen verfahren. Das kleine Fragment zwischen den beiden XcmI-Restriktionsstellen (s. 1B) wurde von dem großen Wirtsfragment getrennt durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel und nachfolgender Elektroelution, oder, in einigen Fällen, durch differentielle Präzipitation mit Isopropanol.
Das mit pTA12-L bezeichnete isolierte linearisierte pTA12 wurde in getrennten Ansätzen mit jedem der folgenden ungereinigten PCR-Amplifikationsprodukte ligiert: (1) ribosomalen RNA-Genen, amplifiziert van genomischer DNA von Sarcophaga bullata, (2) ribosomalen RNA-Genen, amplifiziert von genomischer DNA von Vairimorpha necatrix, und (3) dem Gen für die schwere Myosinkette, amplifiziert von genomischer DNA von Caenorhabditis elegans.
Die bei der Herstellung der PCR-amplifizierten Nukleinsäuren verwendeten Primer waren die folgenden:
Die Ligationsreaktionen erfolgten unter Verwendung von T4 DNA-Ligase unter den folgenden Bedingungen:

25 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,8)
10 mM MgCl₂
1 mM DTT
1 mM ATP
50–100 ng Vektor-DNA (gelgereinigtes, mit XcmI gespaltenes pTA12)
1–9 μl PCR-Reaktionsprodukte (ungereinigt)
1 μl T4 DNA-Ligase (New England Biolabs)

Jede Reaktionsmischung wurde 16 bis 24 Stunden lang auf 16 °C gehalten. Die gebildeten Reaktionsprodukte wurden verwendet, um Zellen für einen Assay hinsichtlich der Klonierungseffizienz gemäß nachfolgender Beschreibung zu transformieren, wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 dargestellt sind.
BEISPIEL 3
Transformation und Assay von XcmI generierten Vektoren Ungefähr 10 μl einer jeden gemäß Beispiel 2 hergestellten Ligationsmischung wurden verwendet, um kompetente Zellen des E. coli-Stammes DH1αF zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden anschließend auf XGAL enthaltendem Medium ausplattiert.
Die Anzahl an blauen und weißen Kolonien wurde aufgezeichnet, und ausgewählte weiße Kolonien wurden hinsichtlich insertierter DNA-Fragmente analysiert, indem kleine Mengen der Plasmid-DNA gereinigt und mit dem geeigneten Restriktionsenzym restringiert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Insgesamt 120 weiße Kolonien wurden auf Anwesenheit von Inserts analysiert, und 108 (90 %) enthielten Fragmente, die mit den ursprünglichen PCR-Produkten korrespondierten.
Das aus den obigen Experimenten erhaltene Verhältnis zwischen weißen und blauen Kolonien liegt im Bereich von 0,01 bis 0,15. Die berechneten Klonierungseffizienzen betrugen ungefähr 1–5 × 10⁴ Kolonien/μg PCR-Produkt. Es wurden optimale Klonierungseffizienzen von ungefähr 12 % weißen/Gesamtzahl von Kolanien unter Verwendung von kompetenten Zellen erhalten, die in der Lage sind, 10⁸ Zellen/μg Superhelix-DNA zu ergeben.
Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse bieten mehrere wichtige Beobachtungen. Erstens zeigen die Ergebnisse der Ligation von glattendigem pTZ18U, restringiert mit SmaI, und glattendigem M13mp18, restringiert mit AluI, daß die gewählten Ligationsbedingungen für eine Ligation günstig sind. Zweitens ergibt ein Vergleich der Klonierungseffizienzen von S. bullata- und C-elegans-PCR-Produkten mit XcmI-gespaltenen pTA12 (T-verlänngert)-Plasmiden gegenüber den Klonierungseffizienzen von SmaI-gespaltenen pTZ18U (glatt)-Plasmiden eine sehr viel höhere Klonierungseffizienz mit den T-verlängerten Plasmiden. Drittens zeigen selbst die mit XcmI-gespaltenen pTA12-Plasmide gute Klonierungseffizienzen mit glattendigen Fragmenten, z.B. M13mp18/AluI.
BEISPIEL 4
Assay HphI-generierter Vektoren
Rekombinante Vektoren, die zwei HphI-Restriktionsstellen einschließen, wurden hergestellt unter Anwendung von Techniken, die denjenigen zur Konstruktion der oben beschriebenen XcmI-Vektoren ähnlich sind.
Kurz ausgedrückt, wurde pTA112 in der nachfolgend beschriebenen Weise von dem PHSS6 (2A) abgeleitet, welcher beschrieben ist in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:735–739 (1986). Das Plasmid pH 556 wurde mit der Restriktionsendonuklease NotI gespalten. Das das Kanamycinresistenzgen und den Replikationsursprung enthaltende Fragment wurde isoliert.
Ein die pUC19-Polylinker-Region und das β-Galaktosidase-Gen enthaltende HaeIII-Fragment wurde aus pUC19 durch Restriktionsverdau mit HaeIII isoliert. NotI-Linker (New England Biolabs) wurden mit dem HaeIII-Fragment ligiert. Nach Entfernung der extra NotI-Linker durch Restriktionsendonukleaseverdau wurde dieses β-Galaktosidase enthaltende Fragment durch Ligation in das das Kanamycinresistenzgen enthaltende Fragment insertiert, welches oben zur Herstellung von pH SS6* (2A) isoliert worden war.
Das pH SS6* wurde unter Verwendung der Oligo-Primer und unter Anwendung der in PCR Protocols, Academic Press, New York (1990), beschriebenen Vorgehensweise zur standardisierten Mutagenese durch Polymerase-Kettenreaktion behandelt, um die im Kanamycinresistenzgen vorhandene HphI-Stelle zu entfernen. Diese Vorgehensweise zur Mutagenese führte zu pTA (2A).
Der Polylinker von pTA wurde durch den in 2B dargestellten HphI enthaltenden Polylinker ersetzt, indem pTA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und EcoRV geespalten und mit dem I enthaltenden Polylinker ligiert wurde, um pTA112 zu ergeben. pTA112 wurde mit mit HphI linearisiert, und das resultierende große Fragment wurde gereinigt und mit pTA112-L bezeichnet.
Die cDNA-Fragmente wurden generiert durch PCR-Amplifikation von MS2-RNA, bezogen bei Boehringer Mannheim (Mannheim, West-Deutschland). Die Herstellung von cDNA-Templates der RNA erfolgte nach dem von U. Gülder et al. beschriebenen Verfahren, Gene, 25:263 (1983). Die cDNA-Präkursoren wurden über PCR unter Verwendung vorwärts gerichteter und reverser Primer, die mit den terminalen Sequenzen der cDNA-Fragmente korrespondieren, amplifiziert. Die Primer wurden auf einem "Gene Assembler" von Pharmacia synthetisiert. Der vorwärts gerichtete Primer hatte die Sequenz 5'-CCTTAGGTTCTGGTAATGAC-3', und der reverse Primer hatte die Sequenz 5'-GGGTGCAATCTCACTGGGAC-3'.

Die Bedingungen für die PCR-Amplifikation entsprachen den vom Hersteller empfohlenen und waren:

	100 ng Plasmid (900 by MS2)
	0,2 μg Primer (vorwärts/revers)
	1 μl 25 mM dNTP's
	5 μl 10 × PCR-Puffer
	50 μl Gesamtvolumen
Zyklen:	(1) 94 °C, 1 min; 55 °C, 2 min; 72 °C, 3 min
	(2) 72 °C, 7 min;
	(3) 25 °C, 10 min.

Die Fragmente wurden mittels PCR unter Verwendung von drei unterschiedlichen Polymerasen amplifiziert: (1) "Taq"-Polymerase, isoliert aus Thermus aquaticus und erhalten von Perkin-Elmer Cetus, (2) "Vent"-Palymerase, vertrieben von New England Biolabs, und (3) der thermophilen Palymerase "Thermo", isoliert aus Thermus flavus und erhalten von Molecular Biology Resources. Diese ungereinigten PCR-Produkte wurden mit einem HphI-Analog von pTA12, nachfolgend bezeichnet mit pTA112, ligiert, wobei entsprechend der obigen Beschreibung für von XcmI erkannte Plasmide vorgegangen wurde. Die Nukleotidsequenz für das synthetisch hergestellte Oligonukleotid mit EcoRI- und EcoRV-Termini sowie das Ergebnis der Spaltung mit HphI und der Ligation mit 3'-dAMP-PCR-Produkten sind in 2 dargestellt.
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse ermöglichen einen Vergleich der Klonierungseffizienzen für HphI-gespaltene (T-verlängerte) pTA112-Plasmide und glattendige Kontrollplasmide (pTA112, gespalten mit EcoRV) unter Verwendung von ungereinigter, PCR-amplifizierter MS2, welche mit drei verschiedenen Polymerasen generiert worden war.
Demgemäß zeigen mit HphI-gespaltene Plasmide mit jeder untersuchten Polymerase und über einen 3fachen Bereich des PCR-Produkt-Verhältnisses eine Klonierungseffizienz von nahezu 100 %. In äußerst signifikanter Weise zeigen die Reaktion von T-verlängerten (mit HphI gespaltenen) Plasmiden und van glattendigen (mit EcoRV gespaltenen) Plasmiden von Taq-generierten NS2-Produkten, daß die d-AMP-terminalen MS2-Produkte mehr als 10fach effizienter in die T-verlängerten Plasmide kloniert werden, als es unter Verwendung glattendiger Vektoren der Fall ist
BEISPIEL 5
Repräsentativer Kit

Ein zur Verwendung bei der direkten Klonierung von DNA-Segmenten mit terminalen 3'-dAMP-Resten regräsentativer Kit schließt eine oder mehrere, und vorzugsweise sämtliche der folgenden Komponenten in getrennten Behältern ein:

Behälter 1:	Beschreibung
Komponente
Bezeichnung
TA1	Steriles Wasser: 1 ml
TA2	10 × Ligatianspuffer: 100 μl
TA3	Ligationsfertiger Klonierungsvektor: 1,1 μg (lyophilisiertes pTA112-L oder pTA12-L)
TA4	1 × Tris-EDTA-Puffer: 100 μl
TA5	T4 DNA-Ligase; 22 μl
TA6	Kontrollvektor: 1 μg/10 μl Tris-EDTA
TA7	Vorwärts gerichteter Primer: (0,2 μg/μl): 5 μl
TA8	Reverser Primer: (0,2 μg/μl): 5 μl
TA9	10 × PCR-Puffer: 100 μl
TA10	25 mM dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate)
TA11	0,5 M BME
TA12	Plasmid pUC18 in Superhelix-Form (Kontrolle): 10 μl
Behälter 2:
TA13	21 Aliquots von kompetenten E. coli-Zellen (Stämme NM522 oder NM522 sind bevorzugt) von jeweils 50 μl
TA14	SOC-Medium zur Kultivierung der Zellen etwa 20 ml (p A.2 von Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press {1989))

Der obige Kit beinhaltet ausreichend Reagenzien zur Durchführung von 20 Klonierungsreaktionen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Kit mindestens die Komponenten TA3, TA6, TA7 und TA8 ein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt der Kit mindestens die Komponenten TA3, TA4, TA6, TA7, TA8, TA13 und TA14 ein.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform schließt der Kit mindestens die Komponenten TA3 und TA13 ein.
Obgleich die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispiele zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses detailliert beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß bestimmte Modifikationen ausgeführt werden können, die vom Schutzumfang der anhängenden Ansprüche umfaßt werden. Demgemäß sollen der Schutzumfang der Erfindung und Äquivalenten davon eher unter Bezugnahme auf die anhängenden Ansprüche als unter Bezugnahme auf die obige Beschreibung bestimmt werden.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer Vielzahl rekombinanter, jeweils ein Ziel-DNA-Segment enthaltender DNA-Moleküle, das die Schritte umfasst: (a) Bilden einer Vielzahl doppelsträngiger, das DNA-Segment enthaltender Nukleinsäuren, die jede einen einzelnen, überhängenden 3'-dAMP-Rest an jedem Ende der Nukleinsäure aufweisen; (b) Bilden einer Mischung für die Ligierungsreaktion durch Mischen der Vielzahl doppelsträngiger Nukleinsäuren mit linearen, doppelsträngigen DNA-Molekülen, wobei jedes der DNA-Moleküle einen einzelnen, überhängenden 3'-dTMP-Rest an jedem Ende des DNA-Moleküls aufweist; und (c) Halten der Mischung bei Ligierungsreaktions-Bedingungen für eine Zeitdauer, die ausreicht, um Ligieren der Nukleinsäuren an die DNA-Moleküle zur Erzeugung der rekombinanten DNA-Moleküle zu bewirken.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das DNA-Segment ein Gen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die doppelsträngigen Nukleinsäuren durch Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner Transformieren einer geeigneten Wirtszelllinie mit den rekombinanten DNA-Molekülen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, das ferner Inkubieren der Zellen für eine ausreichende Zeitdauer umfasst, um eine Expression des Gens zu ermöglichen.
Verfahren zum Herstellen rekombinanter, jeweils ein ZielDNA-Segment enthaltender DNA-Nukleinsäuremoleküle, das die Schritte umfasst: (a) Unterwerfen einer das DNA-Segment enthaltenden Zielnukleotidsequenz einer Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um eine Vielzahl das DNA-Segment enthaltender doppelsträngiger Nukleinsäuren zu erzeugen, wobei jede der Nukleinsäuren einen einzelnen, überhängenden (ungepaarten) dAMP-Rest an einem 3'-Ende der Nukleinsäure lokalisiert aufweist; (b) Bilden einer Mischung für die Ligierungsreaktion durch Mischen einer Vielzahl doppelsträngiger Nukleinsäuren mit linearen, doppelsträngigen DNA-Molekülen, wobei jedes der DNA-Moleküle einen einzelnen, überhängenden (ungepaarten) dTMP-Rest an jedem 3'-Ende des DNA-Moleküls aufweist; und (c) Halten der Mischung bei vorbestimmten Reaktionsbedingungen für eine Zeitdauer, die ausreicht, um Ligieren der Nukleinsäuren an die DNA-Moleküle zur Erzeugung der rekombinanten DNA-Nukleinsäuremoleküle zu bewirken.
Verfahren zum Herstellen einer Vielzahl rekombinanter, jeweils ein Ziel-DNA-Segment enthaltender DNA-Moleküle, das die Schritte umfasst: (a) Unterwerfen einer das DNA-Segment enthaltenden Zielnukleotidsequenz einer Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung einer thermophilen Polymerase mit 3'-terminaler Adenosintransferase-Aktivität, um eine Vielzahl das DNA-Segment enthaltender doppelsträngiger Nukleinsäuren zu erzeugen, wobei jede der Nukleinsäuren einen einzelnen, überhängenden 3'-dAMP-Rest an jedem Ende der Nukleinsäure aufweist; (b) Umsetzen einer Vielzahl Plasmide mit einem mindestens zwei Nukleotidsequenzen innerhalb jedes der Plasmide erkennenden Restriktionsenzym, so dass eine Vielzahl linearer DNA-Molekülen gebildet wird, wobei jedes der Moleküle einen einzelnen, überhängenden 3'-dTMP-Rest an jedem Ende aufweist; (c) Verbinden der doppelsträngigen Nukleinsäuren und der linearen DNA-Moleküle mit einem vorausgewählten Ligaseenzym zur Bildung einer Mischung; (d) Halten der Mischung bei vorbestimmten Reaktionsbedingungen für eine Zeitperiode, die ausreicht, um Ligieren der Nukleinsäuren an die DNA-Moleküle zur Erzeugung der rekombinanten DNA-Moleküle zu bewirken.
Plasmid, das eine erste Nukleotidsequenz, die durch ein erstes Restriktionsenzym erkannt wird, und eine zweite Nukleotidsequenz, die durch ein zweites Restriktionsenzym erkannt wird, umfasst, wobei jedes Enzym in der Lage ist, eine einzelne, terminale 3'-dTMP-Gruppe beim Reagieren mit der ersten und zweiten Nukleotidsequenz zu generieren.
Kit zum Einbringen einer Nukleotidsequenz in ein Plasmid, wobei das Kit eine Packung umfasst, die in getrennten Behältern enthält: ein Aliquot von Plasmiden, wobei jedes dieser Plasmide mindestens zwei Nukleotidsequenzen aufweist, die durch Restriktionsenzyme erkannt werden, die in der Lage sind, eine einzelne, überhängende 3'-dTMP-Gruppe zu generieren; und ein Aliquot der Restriktionsenzyme, die in der Lage sind, jedes der Plasmide an der Nukleotidsequenz zu erkennen und die Plasmide zu spalten, wobei die Restriktionsenzyme in dem Aliquot in einer Menge ausreichend zur Spaltung von mindestens einem Teil der Plasmide enthalten sind.
Kit zum Einbringen einer Nukleotidsequenz in ein Plasmid, wobei das Kit eine Packung umfasst, die in getrennten Behältern enthält: ein Aliquot von lyophylisierten Klonierungsplasmiden, wobei jedes der Plasmide mindestens zwei Nukleotidsequenzen aufweist, die durch ein Restriktionsenzym erkannt werden, das in der Lage ist, ein einzelnes, überhängendes 3'-dTMP zu generieren; und ein Aliquot kompetenter Wirtszellen, die in der Lage sind, die Plasmide nach Transformation mit ihnen zu replizieren.
Kit zum Einbringen einer Nukleotidsequenz in ein Plasmid, wobei das Kit eine Packung umfasst, die in getrennten Behältern enthält: ein Aliquot linearer Plasmid-DNA mit einzelnen, überhängenden 3'-dTMP-Enden; ein Aliquot eines ein DNA-Insert enthaltenden Kontrollvektors, wobei der Kontrollvektor in einer Menge vorliegt, welche die Amplifikation des DNA-Inserts mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines thermostabilen Enzyms mit 3'-terminaler Adenosintransferase-Aktivität erlaubt; ein getrenntes Aliquot von jeweils einem forward- und reverse-PCR-Primer, die für die Amplifizierung des DNA-Inserts aus dem Klonierungsvektor mittels PCR geeignet sind; und ein Aliquot von DNA-Ligase, wobei die DNA-Ligase in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um ein DNA-Insert zu ligieren, das durch Amplifizierung des DNA-Inserts des Kontrollvektors mittels PCR unter Verwendung der forward- und reverse-PCR-Primer und einer thermostabilen Polymerase mit 3'-terminaler Adenosintranferase-Aktivität erzeugt wurde.