DE19812004A1

DE19812004A1 - Dehydrogenasen mit verbesserter NAD-Abhängigkeit, deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19812004A1
Application number: DE19812004A
Authority: DE
Inventors: Werner Hummel; Bettina Riebel
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 1998-03-19
Publication date: 1999-09-30
Also published as: WO1999047684A2; EP1002097A2; JP2001526547A; US6413750B1; WO1999047684A3

Abstract

Dehydrogenasen mit für präparative Zwecke tauglicher NADH-Abhängigkeit entsprechen k¶cat¶/K¶M¶ für NAD·+· >= 20 können mikrobiell dadurch gewonnen werden, daß man einen für das Enzym kodierenden Mikroorganismus mit einer Gen-Sequenz im genetischen Kode verwendet, die für das Enzym mit einer Aminosäure-Sequenz kodiert, deren basische Aminosäure(n) an der Coenzym-Bindungsstelle bzw. den -stellen zumindest teilweise durch ungeladene Aminosäure ersetzt ist bzw. sind. Das Verfahren wird insbesondere für die Gewinnung von short-chain Dehydrogenasen mit Coenzym-Bindungsstellen am N-Terminus angewandt. Gemäß Beispiel wurde Alkohol-Dehydrogenase mit Hilfe von E.coli HB101+(pUBS 520) gewonnen, der das für die Dehydrogenase kodierende mutierte Gen, kloniert im Expressionsplasmid pKK-117-3HB, überexpremiert enthält.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Dehydrogenase - insb. von short-chain Dehydrogenasen und vorzugsweise Alkohol-Dehydrogenasen - mit für präparative Zwecke tauglicher NADH-Abhängigkeit entsprechend einem k_cat/K_M-Wert für NAD⁺ ≧ 20 sowie danach erhältliche Dehydrogenasen und deren Verwendung.

Dehydrogenasen und insbesondere Alkohol-Dehydrogenasen (nachfolgend durch ADHn abgekürzt) sind wertvolle Katalysatoren zur Gewinnung chiraler Produkte durch stereoselektive Reduktion prochiraler Ketone zu den entsprechenden chiralen Alkoho len. Kommerziell verfügbar sind im wesentlichen entsprechende Enzyme aus Hefe (NAD-abhängig), Pferdeleber (NAD-abhängig) und Thermoanaerobium brockii (NADP-abhängig), für spezielle Substrate auch noch beispielsweise Steroid-Dehydro genasen (NAD und NADP-abhängig). Wegen des teilweise recht begrenzten Substrat spektrums sind in den letzten Jahren weitere neue ADHn gefunden worden, die gerade für den präparativen Einsatz gut geeignet sind, beispielsweise eine (S)-spezifische ADH aus Rhodococcus erythropolis (NAD-abhängig) oder (R)-spezifische Enzyme aus der Gattung Lactobacillus. Beide Enzymtypen setzen ein sehr breites Spektrum an Ketonen mit hoher Enantioselektivität um. Die Enzyme aus L. kefir (DE 40 14 573) oder L. brevis sind besonders interessant, da sie als einzige zu (R)-Alkoholen führen. Nachteilig für eine Anwendung dieser Enzyme ist allerdings, daß sie das Coenzym NADP⁺, bzw. NADPH benötigen, da dieses Coenzym beträchtlich instabiler und teurer (Faktor 5-10) als NAD ist.

Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Verbesserung der NAD⁺-Abhängigkeit solcher ADHn, das aber auch ganz allgemein zur entsprechende Verbesserung von Dehydrogenasen anwendbar ist.

Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man einen für das Gen kodieren den Mikroorganismus mit einer Gen-Sequenz im genetischen Kode verwendet, die für das Enzym mit einer Aminosäure-Sequenz kodiert, deren basische Aminosäure(n) an der Coenzym-Bindungsstelle bzw. den -stellen zumindest teilweise durch ungeladene Aminosäure ersetzt ist bzw. sind.

Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.

Dieses Verfahren geht davon aus, daß für die Mitwirkung des Coenzyms bei der enzy matischen Redoxreaktion eine Akzeptanz des Coenzyms an der Coenzym-Bindungs stelle bedeutsam ist, so daß durch Minderung der Basizität im "Andockbereich" des Enzyms für das Coenzym durch entsprechende Änderung der Aminosäure-Sequenz eine Verbesserung der Akzeptanz von NAD⁺ im Vergleich zum NADP⁺ erreicht werden kann. Die Realisierung einer solchen Abwandlung wurde gentechnologisch untersucht und auf diese Weise eine deutlich faßbare Verbesserung erzielt, wie aus der nachfolgen den Beschreibung ersichtlich werden wird.

Für die Untersuchungen wurde die ADH aus Lactobacillus brevis (DSM 20 054) verwendet, bei der eine Coenzym-Bindungsstelle im N-Terminus vermutet wird und deren Sequenz der ersten 50 Aminosäuren im N-terminalen Bereich lautet:

S-N-R-L-D-G-K-V-A-I₁₀-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L₂₀A-I-A-T-K-
F-V-E-E-G₃₀-A-K-V-M-I-T-G-R-H-S₄₀-D-V-G-E-K-A-A-K-S-V₅₀.

Die vollständige Sequenz einer Untereinheit dieser ADH, die aus vier identischen Untereinheiten besteht, ist in der Dissertation B. Piebel (1997, Universität Düsseldorf) veröffentlicht, ebenso dort die zugehörige DNA-Sequenz.

Durch an sich bekannte gentechnologische Methoden wurden bestimmte Aminosäuren ausgetauscht und die Veränderung der Akzeptanz von NAD⁺ an Hand von zwei Größen ermittelt: durch Bestimmung des K_M und des k_cat Wertes. Der K_M-Wert kann als Maß für die Affinität des Coenzyms zum Enzym betrachtet werden, vorteilhaft ist ein möglichst kleiner K_M-Wert. Der k_cat-Wert (Mol gebildetes Produkt/Mol Enzym × sec) ist ein Maß für den Umsatz, er sollte möglichst hoch sein. Ein kombinierter Wert, der beide Größen berücksichtigt, ist der Quotient k_cat/K_M.

Ein Austausch wurde an den Stellen A9, R38, H39, K45 und/oder K48 vorgenommen. Die Charakterisierung der Mutanten zeigt, daß es tatsächlich möglich ist, diese Spezi fität der ADH aus L. brevis von NADP⁺ hin zum NAD⁺ zu verändern. Obwohl nur eine begrenzte Zahl von Aminosäure-Austauschen durchgeführt wurde, zeigen die Ergebnis se, daß die gewünschte Verbesserung der NAD-Abhängigkeit durch Basizitätsminde rung erreicht werden kann.

Abgesehen von den im N-Terminus-nahen Bereich der ADH aus L. brevis vorge nommenen - nicht erschöpfenden - Aminosäure-Austauschen kann ein solcher Austausch selbstverständlich auch in der verbleibenden Aminosäure-Kette (gemäß Dissertation, s. o.) durchgeführt werden und auf positiven Erfolg überprüft werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren setzt natürlich die Kenntnis der zu verändernden Aminosäure-Sequenz eines bestimmten, zu verbessernden Enzyms voraus, um einen gezielten Austausch basischer Aminosäuren durch ungeladene Aminosäuren vornehmen zu können. Der für die NAD-Spezifitätsverbesserung nützliche Austausch bzw. Aus tauschbereich ergibt sich dann - auch ohne Vorab-Kenntnis der Coenzym-Bindungs stelle - nach dem trial-and-error-Prinzip. Als basische Aminosäuren können insbeson dere Lysin und Arginin ausgetauscht werden, und zwar vorzugsweise gegen ungeladene wie beispielsweise Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Serin, Tyrosin oder Phenylalanin.

Da sich die biochemischen Eigenschaften der mutierten Enzyme geändert haben, wur den die einzelnen Mutanten umfassend charakterisiert: Dies beinhaltet die Bestimmung der kinetischen Parameter für die Coenzyme NAD⁺, NADP⁺, NADH und NADPH sowie die entsprechenden kinetischen Parameter für das Keton-Substrat (Acetophenon) und für die Oxidationsreaktion den Alkohol (Phenylethanol). Des weiteren wurde jeweils am Beispiel der Reduktion von Acetophenon geprüft, ob die Enantioselektivität erhalten geblieben ist; es wurden Temperatur-optima und -stabilität, pH-optima und -stabilität und der isoelektrischen Punkt bestimmt und mit den entsprechenden Daten für das nichtmutierte Wildtyp-Enzym verglichen.

Das Wildtyp-Enzym zeigt folgende Eigenschaften:

A) Kinetische Daten für die Coenzyme NADP⁺, NAD⁺, NADPH und NADH (Tab. 1)

Tabelle 1

Kinetische Daten für die oxidierten und reduzierten Coenzyme bei Reaktion mit der ADH aus Lactobacillus brevis

Tabelle 1 zeigt, daß das Coenzym NADH vom Wildtyp der ADH aus L. brevis im Rahmen der Nachweismöglichkeit nicht umgesetzt wird. Lediglich sehr hohe Konzen trationen von NAD⁺ werden mit schwacher Aktivität akzeptiert, so daß die Selektivität (k_cat/K_M) des Wildtyps für NAD⁺ (=7) im Vergleich zum Wert für NADP⁺ (=270) bei ca. 2,5% liegt.

B) Temperaturoptimum und -stabilität

Das Temperaturoptimum der Wildtyp-ADH liegt bei 55°C, nach 24-stündiger Inku bation bei verschiedenen Temperaturen zeigt es bei 30°C noch 100% Restaktivität, bei 37°C noch 50%.

C) pH-Optimum und -stabilität

Das pH-Optimum für die Reduktion von Acetophenon mit NADPH liegt bei 6,5. Der optimale Bereich ist sehr schmal, bereits bei pH 6,0 oder 7,0 findet man nur noch ca. 60% Restaktivität. Für die Oxidation von Phenylethanol mit NADP⁺ liegt das Optimum bei 8,0 mit einem breiteren Optimumsbereich von 7-9. Das Wildtyp-Enzym zeigt höchste Stabilität bei Lagerung bei pH 7,0 bis 8,5.

D) Bestimmung des isoelektrischen Punkts

Der isoelektrische Punkt des Wildtyp-Enzyms liegt bei 4,95.

E) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestim mung der Enantioselektivität dieser Umsetzung

Die Redaktion von Acetophenon mit NADPH mit dem Wildtyp-Enzym unter Coenzym-Regenerierung zeigt bei gaschromatographischer Trennung ausschließlich das (R)-Isomere von Phenylethanol.

In den folgenden Beispielen wird die Herstellung und Charakterisierung von Mutanten beschrieben, bei denen mit gentechnischen Methoden Aminosäuren im N-terminalen Bereich ausgetauscht wurden.

Beispiel 1 Herstellung und Charakterisierung der Mutante 1 (A9G, R38L, K45I)

Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zum Wildtyp drei Aminosäure-Austausche vorzunehmen: Arginin (R) in Position 38 soll gegen Leucin (L) ausgetauscht werden (R38L), Lysin (K) in Position 45 gegen Isoleucin (1) (K45I) und Alanin (A) in Position 9 gegen Glycin (G) (A9G). Mutante 1 kann also im Vergleich zum Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden kann: A9G, R38L, K45I.

A) Methode der Mutagenese

Ein wesentlicher methodischer Schritt bei der Herstellung der Mutanten stellt die PCR (Polymerase chain reaction) zur Vermehrung von DNA dar. Ausgangspunkt ist die DNA-Replikation durch DNA-Polymerasen, die anhand eines vorgegebenen Templats dieses in einem 1. Schritt einfach verdoppeln. Durch Zyklisierung dieses einfachen Schrittes wird jedes neu erzeugte und jedes alte Templat wieder Vorlage für die DNA- Replikation. Dadurch wird eine Vermehrung im exponentiellen Maßstab bewirkt (2ⁿ).

Jeder einzelne Zyklus einer PCR besteht aus 3 Schritten, einem Denaturierungsschritt bei 94-96°C, wo die doppelsträngige DNA in den einzelsträngigen Zustand versetzt wird, einem Annealingschritt bei wählbarer Temperatur, wo sogenannte Primer an die jetzt einzelsträngige DNA binden können, und einem Polymeraseschritt bei 72°C (dem gängigen Temperaturoptimum thermophilen Polymerasen), wo diese Polymerasen an die Primer binden und den Einzelstrang der DNA wieder zu einem Doppelstrang vervollständigen. Da es sich hierbei um doppelsträngige DNA handelt, müssen Primer für beide Stränge, den sense und den antisense Strang, zugegeben werden. Diese Primer werden entsprechend sense und antisense Primer genannt. Als Annealingtemperatur wird bei allen Fusions-PCR-Schritten 52°C verwendet, bei den anderen PCR-Schritten bei der Herstellung der Mutanten 1 und 2 eine Temperatur von 52°C und den Mutanten 1/1 und 2/2 ein von 56°C.

Diese 3 Schritte sind beliebig oft wiederholbar, so daß in ein und demselben Reaktions gefaß die gleichen 3 Schritte in dieser Reihenfolge an der stetig wachsenden Zahl der vorliegenden und neu erzeugten Template durchgeführt werden.

Die im 2. Schritt erwähnten Primer sind notwendig für das richtige Ansetzen der Poly merase und setzen auch die Spezifität der PCR fest. Durch die vorgegebene Primer sequenz werden die gewünschten DNA-Abschnitte amplifiziert. Primer können jedoch nur an die Ziel-DNA binden, wenn sie eine mehr oder minder komplementäre Sequenz in der Ziel-DNA vorfinden. Die komplemetäre Bindungskapazität wird einerseits durch die Sequenzhomologie und andererseits durch die Annealingtemperatur des 2. Schritts festgelegt, wobei die Annealingtemperatur aus der Schmelztemperatur des Primers resultiert.

Die PCR wurde in dem vorliegenden Fall für die Generierung der einzelnen Cofaktor mutanten eingesetzt. Dabei wurden die Punktmutationen an der Ziel-DNA durch die Verwendung solcher Primer eingeführt, d. h. die Primer zeigten in einzelnen Basen nicht die korrekte Homologie zur DNA-Sequenz. Da jedoch die Homologie der Primer trotz Punktmutationen noch 94% betrug, war eine Durchführung der PCR möglich (bei einer Basenlänge der Primer von durchschnittlich 33 Basen wurden 2 Basen ausgetauscht).

Die Punktmutationen müssen für eine korrekte Änderung der Zielsequenz auf beiden Strängen der doppelsträngigen DNA eingefügt werden. Das bedeutet, das für die Ein führung einer Punktmutation im Gen zwei einzelne PCR-Reaktionen benötigt werden. In einer Reaktion wird vom 5' Ende des Gens (sense-Primer) bis zur Mutation (anti sense-Primer) eine PCR durchgeführt, in der 2. Reaktion wird von der Mutation (sense- Primer) bis zum 3' Ende des Gens (antisense-Primer) eine PCR durchgeführt.

Sollen mehrere Punktmutationen eingeführt werden, deren Abstände zueinander die endliche Länge eines Primers (40-60 Basen) überschreiten, muß für jede Punktmutation die oben angeführten 2 PCR-Reaktionen gesondert durchgeführt werden.

Sind nun solche Punktmutationen durch PCR eingeführt worden, liegt in der Regel kein komplettes Gen vor, sondern die aus den Einzelreaktionen hervorgegangenen Teilstücke des Gens, das 5' Ende bis zur Mutation und das Stück von der Mutation bis zum 3' Ende. Diese müssen durch eine sogenannte Fusions-PCR zu einem kompletten Gen fusioniert werden.

Fusions-PCR

Das Prinzip dieser PCR entspricht der oben beschriebenen, nur werden in diesem Fall 2 verschiedene Template zugegeben, die aber in dem Mutationsbereich eine 100% Homo logie aufweisen, und zwar für die Länge des vorher eingesetzten Mutationsprimer (in der Regel ca. 30-40 Basen). Dieser Mutationsbereich fungiert durch seine Homologie als ein Primer der PCR, d. h. nach Denaturierung der DNA in die Einzelstränge können sich im darauffolgenden Annealingschritt die beiden Ausgangsstränge wieder zusam men finden, aber auch die beiden verschiedenen Strange in dem Homologiebereich paaren. Die Polymerase kann dann von dem Mutationsbereich als dem Primer die restliche DNA wieder zu einem Doppelstrang vervollständigen. Um nur diese Variante als Möglichkeit zuzulassen, werden bei der Fusions-PCR in den ersten 5-10 Cyclen keine genspezifischen Primer zugegeben.

Nach 5-10 Zyklen liegt genügend vervollständigte Gen-DNA zur Verfügung, so daß dann nach Zugabe der 5' und 3'Primer des Gens dieses zur Amplifikation in den folgenden Zyklen gebracht wird. Die vorher zugegebenen Genstücke können nicht amplifiziert werden, da für jedes Genteilstück immer nur ein Primer zur Verfügung steht (entweder nur der sense oder nur der antisense). Nur das in den ersten Zyklen komplettierte Gen kann mit beiden Primern amplifiziert werden.

Die erste nach dieser Methode erzeugte Mutante enthält im Vergleich zum Wildtyp- Enzym drei Aminosäure-Austausche: Arginin (R) in Position 38 wurde gegen Leucin (L) ausgetauscht (R38L), Lysin (K) in Position 45 gegen Isoleucin (I) (K45I) und Alanin (A) in Position 9 gegen Glycin (G) (A9G).

Dazu wurde im einzelnen folgendermaßen vorgegangen:
Als Templat für die Herstellung der Punktmutationsfragmente diente rekombinantes Plasmid [recADHpkk-177-3H], aus dem durch Restriktionsanalyse über Restriktions- Endonucleasen Eco Rl und Hind III das ADH-Gen (recADH) ausgeschnitten wurde. Das ausgeschnittene Fragment wurde nach Reinigung über ein Agarosegel in die PCR eingesetzt. Als Primer für die Mutante 1 dienten:
R38LK46I: acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa ata gca gct (36 bp) (5'-Primer sense) und
BRAS: gcgc aag ctt cta cta ttg agc agt gta gcc acc gtc aac tac aaa ttc aga (3'-Primer antisense), die das große Fragment B ergeben; sowie
BRS: gcgc gaa ttc atg tct aac cgt ttg gat ggt (5'-Primer sense) und
R38LK46Irev: agc tgc tat ftc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt (3'-Primer antisense), die das kleine Fragment A ergeben.

Alle Primer sind stets in 5' → 3' Leserichtung aufgeführt, die Primer BRS und BRAS entsprechen den 5' bzw. 3' Enden des recADH Gens. Die Komponenten und die jeweils verwendeten Konzentrationen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

PCR-Ansätze (NTP=je 0,2 mM von dTTP, dATP, dCTP und dGTP; Puffer (Stammlösung) = 100 mM Tris/HCl pH 8,8; 15 mM MgCl₂; 500 mM KCl; 1% Triton X-100 (v/v); Taq = Thermus aquaticus-Polymerase). Die Erläuterungen der Abkürzungen gelten für alle folgenden Tabelle mit PCR-Ansätzen.

Je nach Volumina der einzelnen Substanzen wird der Reaktionsansatz mit Wasser auf 100 µl ergänzt, das gilt im folgenden für alle PCR-Ansätze.

Die PCR-Fragmente wurden aufgereinigt und durch den überlappenden Teil in der Fusions-PCR (Tabelle 3) zu dem kompletten Gen mit den enthaltenden Punktmutationen zusammengefügt.

Tabelle 3

PCR-Ansatz (Abkürzungen s. Tab. 2)

Die Fragmentmengen sind abhängig von der Größe der Fragmente, es müssen für die Fusions-PCR gleiche pmol-Mengen an freien Enden der Fragmente vorhanden sein, d. h. bei gleicher Konzentration in ng haben kleinere Fragmente eine höhere Anzahl an pmol Enden als größere Fragmente. Für Mutante 1 ist das Verhältnis 1 : 4,4 (kleines zu großes Fragment), d. h. von dem kleinen muß 4,4 mal weniger eingesetzt werden als von dem großen.

Einführung der dritten Mutation A9G

A9G: ggt aag gta gga atc att aca (5'Primer) und BRAS: (3'Primer), die das große Fragment ergeben. BRS: (5'Primer) und A9Grev: tgt aat gat tcc tac ctt acc (3'Primer), die das kleine Fragment ergeben (Komponenten und Konzentrationen siehe Tabelle 4).

Tabelle 4

PCR-Ansätze (Abkürzungen s. Tab. 2)

Die aus der PCR entstandenden amplifizierten Fragmente werden erneut über Fusions- PCR zusammengefügt (Tabelle 5).

Tabelle 5

PCR-Ansatz

Die Fragmente wurden im Verhältnis von 1 : 14.5 eingesetzt (klein zu groß). Das Produkt aus dieser PCR stellt die Mutante 1 dar, es wurde nach Reinigung in den Expressions vektor pkk-177-3H kloniert und in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert. Das mutierte Genstück kann selbstverständlich auch in andere Vektoren als den pkk-177-3H eingefügt werden, beispielsweise pBTac (Fa. Boebringer Mannheim), pKK-233 (Fa. Stratagene) oder pET (Fa. Novagen). Ebenso können als Wirtsorganismus andere E. coli-Stamme als HB101+ (pUBS520) verwendet werden wie E. coli NM 522, E. coli RR1, E. coli DH5α oder E. coli TOP 10⁻, die von öffentlichen Stammsammlungen oder Vektor-vertreibenden Firmen erhältlich sind.

B) Enzymgewinnung Zellvermehrung

Zellmasse für die Aufarbeitung der einzelnen Mutanten wurde immer durch 5 L Schüttelkolbenfermentation produziert, als Wirt für die mutierten recADH Plasmide diente immer der HB101+ Stamm, d. h. man benötigt für die Anzucht doppelten Selektionsdruck durch Ampicillin und Neomycin. Nach Anzucht in Flüssigkultur (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl; PH 7,5) bei 37°C bis zu einer OD₅₅₀von 0.5 wurde das Enzym dann durch Zusatz von 1 mM IPTG induziert. Nach weiteren 4 h Stunden Wachstum wurden die Zellen geerntet, und die Genexpression nach Zellauf schluß durch Aktivitätsnachweis und SDS-PAGE der Proteine überprüft. Alternativ können die durch Fermentation gewonnenen Zellen auch bei -20°C eingefroren gelagert werden.

Zellaufschluß durch Ultraschall

Zur Freisetzung des Enzyms können Standard-Aufschlußmethoden angewandt werden. In diesem Fall wurden die rekombinanten Organismen durch gepulsten Ultraschall auf geschlossen. Die in Tris-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM MgCl₂) resuspendierten Zellen wurden einem Aufschluß mit 2 × 25 sec Zyklen mit 30 sec Intervall zur Kühlung am Pulsed Sonifier (Fa. Branson) mit 25% Intensität unterzogen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden zentrifugiert und der Überstand abpipettiert, er wird im folgenden als Rohextrakt bezeichnet.

Wie die nachfolgenden Charakterisierungen zeigen werden, ist dieses mutierte Enzym (Mutante 1), gerade im Vergleich zur Enzymmutante 2, relativ stabil.

Aufreinigung der Enzymmutante 1

Zur Gewinnung von gereinigtem Enzym wurden Standardverfahren der Proteinreini gung verwendet. Eingesetzt wurden 3 Reinigungsschritte durch Chromatographie an Phenylsepbarose 6 FF, Q-Sepharose FF und Octylsepharose FF (alles kommerziell erhältliche Produkte der Fa. Pharmacia, Freiburg). Tabelle 6 faßt die Aktivitäten und Ausbeuten der Reinigungsschritte zusammen.

Tabelle 6

Aufreinigung der Mutante 1

C) Bestimmung der kinetischen Parameter

Die Charakterisierung der ADH-Mutante 1 bezüglich der kinetischen Daten ergab fol gende, in Tabelle 7 zusammengefaßte Werte.

Tabelle 7

Kinetische Daten für die Enzymmutante 1

Im Vergleich zum Wildtyp ist bei dieser Mutante 1 bereits eine deutliche Verbesserung in der Reaktivität gegenüber dem Coenzym NAD⁺ eingetreten: Der K_M-Wert hat sich signifikant von 2,9 auf 1,8 mM verringert, gleichzeitig hat sich die Aktivität (k_cat) von 21 auf nahezu 80 erhöht. Beide Verbesserungen zusammengenommen zeigen, daß diese Mutante NAD⁺ bereits deutlich besser akzeptiert. Während die Selektivität (k_cat/K_M) des Wildtyps für NAD⁺ im Vergleich zu NADP⁺ bei nur ca. 2,5% liegt, ist dieser Wert bei der Mutante 1 auf ca. 10% angestiegen.

D) Temperaturoptimum und -stabilität

Das Temperaturoptimum wurde für Reduktionsreaktionen bei pH 7,0 mit den beiden Coenzymen NADH und NADPH aufgenommen. Es liegt in beiden Fällen bei 55°C. Die Temperaturstabilität wurde als Restaktivität nach 25 h Inkubation bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Bei 37°C wurden dabei noch 95% Restaktivität erhalten, bei 42°C noch 34%.

E) pH-Optimum und -stabilität

Zur Bestimmung des pH-Optimums wurden folgende Puffer verwendet:
pH 4,6 = Na-Aeetat; pH 5,0 und 5,5 = Na-Acetat; pH 6,0 und 6,5 = Kpi oder MES; pH 7,0 und 7,5 = Kpi oder TEA; pH 8,0 und 8,5 = Tris; pH 9,0 = Bicine. Alle Puffer wur den in einer Konzentration von 100 mM eingesetzt. Zur Bestimmung der Reduktions reaktion wurde 10 mM Acetophenon zugesetzt und für die Oxidation 25 mM Phenyl ethanol. Die Konzentration an NADP/NAD betrug jeweils 2 mM. Die Konzentration an NADH/NADPH betrug je 0,25 mM. Für die Messung wurden 970 µl der jeweiligen Pufferlösung, die bereits mit Substrat in der richtigen Konzentration versetzt war, mit 20 µl der Stammlösung an dem gewünschten Coenzym gemischt. Die Reaktion wurde mit 10 µl Enzym gestartet, je nach Aktivität unverdünnt oder so verdünnt, so daß die Aktivität bei der Messung zwischen 1 und 3 U/ml lag.

Das pH-Optimum der Mutante für die Reduktions-Reaktionen liegt sowohl bei Verwen dung von NADH als auch mit NADPH im relativ sauren Bereich zwischen 5,0 und 6,0. Bei pH 7,5 wurden dazu im Vergleich nur noch 4% Aktivität gemessen. Für die Oxidations-Reaktionen mit NAD und NADP erhält man maximale Aktivität bei einem pH-Wert von 7,0.

Die pH-Stabilität wird als Restaktivität nach 25-ständiger Inkubation bei verschiedenen pH-Werten ausgedrückt, wobei die gleichen Puffer wie zur Bestimmung des pH-Opti mums verwendet wurden. 45 µl des jeweiligen Puffers wurden mit 5 µl der Enzym lösung gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Probenahmen erfolgten nach 30 min, 60 min, 6 h und 25 h.

Bei Mutante 1 erhielt man die höchste Restaktivität (100%) bei Lagerung bei pH 5,0. Bereits ein pH von 5,5 resultiert in nur noch 80% Restaktivität und pH 7,0 ergibt nur noch 34% Aktivität nach 25 h.

F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts

Der isoelektrische Punkt liegt nach Bestimmung mit isoelektrischer Fokussierung (IEF) bei pH 4,28. Das ist gerade im Vergleich zur Mutante 2 (s. Beispiel 4) bemerkenswert. Bei Mutante 2 liegt der IP bei 4,65, obwohl in beiden Mutanten jeweils ein Lysin ausgetauscht wurde: bei Mutante 1 das Lysin-45 (in Isoleucin) und bei Mutante 2 das Lysin-48 (in Methionin).

G) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestimmung der Enantioselektivität dieser Umsetzung

Im Batch-Ansatz zur Reduktion von Acetophenon unter Coenzym-Regenerierung mit Isopropanol wurde eine vollständige Umsetzung zu Phenylethanol erreicht, eingesetzt wurden dazu 960 µl Triethanolamin-Puffer, 50 mM pH 7,0 mit 11 mM Acetophenon; 10 µl Magnesiumchlorid (100 mM Stammlösung); 25 µl NADP⁺ (10 mM Stamm lösung); 9,4 µl Isopropanol; 1 U Alkohol-Dehydrogenase. Die Bestimmung der Enan tiomerenreinheit mittels Gaschromatographie in einer Probe nach vollständigem Umsatz (4 h) zeigt, daß nur der (R)-Alkohol erhalten wurde, (S)-Phenylethanol war nicht nach weisbar.

Beispiel 2 Herstellung und Charakterisierung der Mutante 1/1 (A9G, R38L, K45M)

Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zu Mutante 1 das Lysin in Position 45 in Methionin an Stelle von Isoleucin (Mutante 1) auszutauschen. Die übrigen in Mutante 1 vorgenommenen Austausche in Position 9 und 38 sind beibehalten worden, so daß Mutante 1/1 im Vergleich zum Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden kann:

A9G, R38L, K45M.

A) Gewinnung von Mutante 1/1

Zur Gewinnung von Mutante 1/1 wurden prinzipiell die gleichen Methoden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Da die Mutante 1/1 ist eine Erweiterung der Mutante 1, daher wird als Templat für die nachfolgende PCR die Mutante 1 verwendet.

R38LK45M: acc ggc etg cac agc gat gtt gaa atg gca (5'Primer) und BRAS (3' Primer), die das große Fragment ergeben.

BRS (5'Primer) und R38LK45Mrev: tgc cat ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt (3'Primer), die das kleine Fragment ergeben.

Tabelle 8

PCR-Ansatz

Die Fragmente wurden aufgereinigt und in die Fusions-PCR eingesetzt.

Tabelle 9

PCR-Ansatz

Die Fragmente wurden im Verhältnis 1 : 4.4 in die PCR eingesetzt. Das Produkt stellt die Mutante 1/1 dar, da ja aus Mutante 1 die Mutation A9G übernommen wurde.

Wie bei Mutante 1 wurde auch hier die eingeführten Mutationen durch Sequenzierung des Gens bestätigt. Zur Gewinnung der Enzymmutante wurde das Gen dann in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert.

B) Enzymgewinnung

Fermentation und Zellaufschluß entsprechen der in Beispiel 1 beschriebenen Vor gehensweise.

Aufreinigung der Enzymmutante 1/1

Die Aufreinigung dieses mutierten Enzyms entspricht der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Tabelle 10 faßt die charakteristischen Daten zusammen.

Tabelle 10

Aufreinigung der Enzymmutante 1/1

C) Bestimmung der kinetischen Parameter für die Enzymmutante 1/1

Die Charakterisierung der ADH-Mutante 1/1 bezüglich der kinetischen Daten für die Coenzyme ergab die folgenden in Tabelle 11 zusammengestellten Werte.

Tabelle 11

Kinetische Daten für die oxidierten und reduzierten Coenzyme für die Enzymmutante 1/1

Die kinetischen Daten zeigen, daß diese Mutante das Coenzym NAD⁺ genauso gut akzeptiert wie NADP⁺. Der K_M-Wert für NAD⁺ hat sich signifikant erniedrigt, er liegt bei 0,5 mM an Stelle von 2,9 für den Wildtyp. Diese Mutante zeigt also bereits eine besonders gute, niedrige Affinität zum Coenzym NAD⁺. Auch der k_cat-Wert hat sich leicht verbessert, er liegt bei 33,3 sec^-1. Der Vergleich der Selektivitäten (k_cat/K_M) für beide Coenzyme zeigt für NAD⁺ denselben Wert von 66 mM^-1.sec^-1 wie für NADP⁺. Im Vergleich zum Wildtyp, der NAD⁺ zu ca. 2,5% bezogen auf NADP⁺ umsetzt, wird NAD⁺ von dieser Mutante mit 100% umgesetzt.

D) Temperaturoptimum und -stabilität

Das Temperaturoptimum für die Enzymmutante 1/1 liegt mit NADPH gemessen bei mindestens 65°C, höhere Temperaturen wurden meßtechnisch bedingt nicht erreicht. Wird das Temperaturoptimum mit dem Coenzym NADH bestimmt, findet man einen optimalen Wert bei 40°C. Vermutlich wird NADH bei höheren Temperaturen nicht mehr so gut am Enzym gebunden, so daß dann nur noch verminderte Aktivität nach weisbar ist. Die Messung zur Temperaturstabilität zeigt; daß nach 25 Std. nur bei 25°C noch 100% Restaktivität nachweisbar ist, bei 30°C nur noch 59%. Die Temperatur stabilität der Mutante 1/1 hat sich im Vergleich zum Wildtyp-Enzym also signifikant verschlechtert.

E) pH-Optimum und -stabilität

Das pH-Optimum für die Reduktionsrichtung (Messung mit Acetophenon) liegt sowohl mit NADPH als auch mit NADH gemessen bei ca. 6,0. Für die Oxidation liegt das Optimum bei 7,0 (NADP⁺) bzw. 7,5 (NAD⁺).

F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts

Der isoelektrischen Punkts der Enzymmutante 1/1 liegt bei 4,85.

G) Reduktion von Acetophenon im Batch unter Coenzym-Regenerierung und Bestim mung der Enantioselektivität dieser Umsetzung

Die Reduktion von Acetophenon unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen ergab nur das (R)-Isomere von Phenylethanol.

Beispiel 3 Herstellung und Charakterisierung der Mutante 2 (A9G, R38L, K48M)

Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zu Mutante 1 das Lysin in Position 48 in Methionin auszutauschen an Stelle des Lysin-45. Die übrigen in Mutante 1 vorge nommenen Austausche in Position 9 und 38 sind beibehalten worden, so daß Mutante 2 im Vergleich zum Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden kann: A9G, R38L, K48M.

A) Methode der Mutagenese

Zur Gewinnung von Mutante 2 wurden prinzipiell die gleichen Methoden wie in Bei spiel 1 beschrieben verwendet. Da die Mutante 2 unabhängig von Mutante 1 hergestellt wurde, wurde hier wieder das Gen der Wildtyp-ADH (recADH) als Templat eingesetzt.

R38LK48M: acc ggc ctg cac agc gat gtt ggt gaa aaa gca gct atg agt gtc (5'Primer) und BRAS (3 'Primer), die das große Fragment ergeben;
BRS (5'Primer) und
R38LK48Mrev: gac act cat agc tgc ttt ttc acc aac atc gct gtg cag gcc ggt (3 'Primer), die das kleine Fragment ergeben.

Tabelle 12

PCR-Ansätze

Die Fragmente wurden aufgereinigt und in die Fusions-PCR eingesetzt.

Tabelle 13

PCR-Ansatz

Die Fragmente wurden in einem Verhältnis von 1 : 4.4 eingesetzt, das Produkt dieser Fusions-PCR ist ein Zwischenprodukt der Mutante 2, da die Mutation A9G noch eingefügt werden muß.

Einführung der dritten Mutation A9G

A9G: ggt aag gta gga atc att aca (5'Primer) und BRAS: (3'Primer), die das große Fragment ergeben;
BRS: (5'Primer) und A9Grev: tgt aat gat tcc tac ctt acc (3'Primer), die das kleine Fragment ergeben (Tabelle 18).

Tabelle 14

PCR-Ansätze

Die Fragmente wurden im Verhältnis 1 : 14.5 in die Fusions-PCR (Tabelle 19) eingesetzt.

Tabelle 15

PCR-Ansatz

Das Produkt dieser Fusions-PCR stellt die Mutante 2 dar, diese wurde wie alle anderen Mutanten in den Expressionsvektor pkk-177-3H einkloniert. Zur Gewinnung der Enzymmutante wurde das Gen dann in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert.

B) Enzymgewinnung Fermentation und Zellaufschluß

Fermentation, Zellaufschluß und Enzymreinigung entsprechen der in Beispiel 1 be schriebenen Vorgehensweise. Tabelle 20 faßt die charakteristischen Daten der Reinigung zusammen.

Tabelle 16

Aufreinigung der Enzymmutante 2

C) Bestimmung der kinetischen Parameter für die Enzymmutante 2

Die Charakterisierung der ADH-Mutante 2 bezüglich der kinetischen Daten für die Coenzyme ergab die folgenden in Tabelle 21 zusammengestellten Werte.

Tabelle 17

Kinetische Daten für die oxidierten Coenzyme für die Enzymmutante 2

Bei dieser Mutante haben sich im Vergleich zum Wildtyp beide Parameter vorteilhaft bezüglich NAD⁺ verändert, der K_M-Wert ist von 2,9 auf 0,62 mM gesunken, der k_cat- Wert hat sich von 21 auf 33 verbessert. Damit hat sich der k_cat/K_M-Wert von 7,3 auf 54 verbessert. Gleichzeitig haben sich bei dieser Mutante vor allem Affinität zu NADP⁺ (K_M-Wert), aber auch der k_cat-Wert drastisch verschlechtert, so daß diese Mutante bevorzugt NAD⁺ als Coenzym verwendet.

D) Temperaturoptimum und -stabilität

Das Temperaturoptimum liegt deutlich niedriger als beim Wildtyp-Enzym, mit NADP gemessen liegt es bei 50°C, mit NAD⁺ bei 33-37°C. Die Temperaturstabilität zeigt, daß nach 25 h nur bei 25°C noch 100% Restaktivität vorhanden sind, bei 30°C nur noch 40%.

E) pH-Optimum und -stabilität

Das pH-Optimum für die Reduktion von Acetophenon liegt mit NADPH gemessen bei 8,0, mit NADH gemessen dagegen bei 6,5. Dieses Optimum-bei 6,5 entspricht dem Wildtyp-Enzym, gemessen mit NADPH. Vergleichbar mit dem Wildtyp-Enzym zeigt auch die mit NADH gemessene Aktivität nur einen schmalen Aktivitätsbereich, bei pH 7,0 findet man nur noch 46% Restaktivität. Die Stabilität der Enzymmutante bei verschiedenen pH-Werten nach 25 h zeigt ein Maximum bei pH 7,0, bei pH 6,0 wie auch bei 8,0 wurden noch 84% Restaktivität gemessen.

F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts

Der isoelektrische Punkt der Enzymmutante liegt bei pH 4,65.

Beispiel 4 Herstellung und Charakterisierung der Mutante 2/2 (A9G, R38L, H39L, K48M)

Ziel dieser Mutation war es, im Vergleich zu Mutante 2 noch zusätzlich einen weiteren Aminosäure-Austausch einzuführen, indem die basische Aminosäure Histidin in Position 39 gegen eine neutrale Aminosäure, das Leucin, ausgetauscht wurde. Die Mutante 2/2 kann also in Bezug auf den Wildtyp folgendermaßen beschrieben werden:

A9G, R38L, H39L, K48M.

A) Methode der Mutagenese

Zur Gewinnung von Mutante 2/2 wurden prinzipiell die gleichen Methoden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet. Da die Mutante 2/2 eine Folgemutante der Mutante 2 darstellt, wurde diese als Templat für die PCR eingesetzt.

R38LH39L: acc ggc ctg etc agc gat gtt (5'Primer) und BRAS (3'Primer), die das große Fragment ergeben;
BRS (5'Primer) und R38LH39Lrev: aac atc gct gag cag gcc ggt (3'Primer), die das kleine Fragment ergeben.

Tabelle 18

PCR-Ansätze

Die Fragmente wurden aufgereinigt und in die Fusions-PCR eingesetzt, in einem Verhältnis von 1 : 4.4 (klein zu groß).

Tabelle 19

PCR-Ansatz

Das Produkt dieser Fusions-PCR stellt die komplette Mutante 2/2 dar, die Mutationen K48M und A9G wurden aus der Mutante 2 übernommen. Zur Gewinnung der Enzym mutante wurde das Gen dann in E.coli HB101+ (pUBS520) überexprimiert.

B) Enzymgewinnung Fermentation, Zellaufschluß und Aufreinigung der Enzymmutante 2/2

Die Enzymproduktion und Aufreinigung dieses mutierten Enzyms entspricht der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Tabelle 24 faßt die charakteristischen Daten der Enzymreinigung zusammen.

Tabelle 20

Reinigung der Enzmmutante 2/2

C) Bestimmung der kinetischen Parameter für die Enzymmutante 2/2

Die Charakterisierung der ADH-Mutante 2/2 bezüglich der kinetischen Daten ergab folgende in Tabelle 25 aufgeführte Werte:

Tabelle 21

Für NAD⁺ hat sich im Vergleich zum Wildtyp-Enzym der u-Wert von 2,9 auf 0,96 mM erniedrigt. Für NADP⁺ haben sich K_M- wie auch k_cat-Wert leicht verschlechtert.

Auffallend ist die besonders gute Affinität der Mutante gegenüber NADH, der K_M-Wert liegt bei 0,07 mM.

D) Temperaturoptimum und -stabilität

Das Temperaturoptimum der Mutante 2/2, gemessen bei pH 5,0, liegt bei 42°C, gemessen mit NADPH und bei Verwendung von NADH bei 50°C. Diese Optima sind relativ breit, mit NADPH gemessen erhält man noch 95% Aktivität bei Messung bei 50°C, mit NADH gemessen bei 60°C noch 70%. Die Stabilität bei Lagerung (6h) bei verschiedenen Temperaturen ergibt für 30°C noch 67%, bei 37°C nur noch 7%.

E) pH-Optimum und -Stabilität

Das pH-Optimum liegt für die Reduktion von Actophenon mit NADPH bei 6,0, bei Verwendung von NADH bei 5,0. Gerade mit NADH ist diese Mutante eigentlich nur im sauren Bereich aktiv, bei pH 7,0 erhält man nur noch 6% Aktivität im Vergleich zum Wert bei 5,0. Auch für die Oxidation ist das Optimum signifikant leicht in den sauren Bereich verschoben, maximale Aktivität findet man sowohl mit NADP⁺ als auch NAD⁺ bei pH 7,5. Bei pH 8,0, dem Optimum des Wildtyps, findet man nur noch 77% (NADP⁺) bzw. 61% (NAD⁺) Aktivität. Wird das Enzym bei verschiedenen pH-Werten gelagert und die Restaktivität nach 6 h gemessen, findet man noch 100% Restaktivität bei pH 7,0. Bei pH 8,5 erhält man nur noch 58%.

F) Bestimmung des isoelektrischen Punkts

Der isoelektrische Punkt der Enzymmutante 2/2 liegt bei 4,47.

Anhang

Aminosäure-Sequenzen von Wildtyp- und mutierten ADHn aus Lactobacillus brevis im N-terminalen Bereich bis zur 50. Aminosäure (die Austausche in Bezug auf den Wildtyp sind durch Unterstreichung hervorgehoben):

A) Wildtyp-Enzym:

S-N-R-L-D-G-K-V-A-I₁₀

-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L₂₀

-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G₃₀

-
A-K-V-M-I-T-G-R-H-S₄₀

-D-V-G-E-K-A-A-K-S-V₅₀

B) Mutante 1

S-N-R-L-D-G-K-V-G

-I₁₀

-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L₂₀

-A-I-A-T-K-F-V-E-E-Q₃₀

-
A-K-V-M-I-T-G-L

-H-S₄₀

-D-V-G-E-I

-A-A-K-S-V₅₀

C) Mutante 1/1

S-N-R-L-D-G-K-V-G

-I₁₀

-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L₂₀

-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G₃₀

-
A-K-V-M-I-T-G-L

-H-S₄₀

-D-V-G-E-M

-A-A-K-S-V₅₀

D) Mutante 2

S-N-R-L-D-G-K-V-G

-I₁₀

-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L₂₀

-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G₃₀

-
A-K-V-M-I-T-G-L

-H-S₄₀

-D-V-G-E-K-A-A-M

-S-V₅₀

E) Mutante 2/1

S-N-R-L-D-G-K-V-G

-I₁₀

-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L₂₀

-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G₃₀

-
A-K-V-M-I-T-G-L

-L

-S₄₀

-D-V-G-E-K-A-A-M

-S-V₅₀

Claims

1. Verfahren zur mikrobiellen Gewinnung von Dehydrogenase mit für präparative Zwecke tauglicher NADH-Abhängigkeit entsprechend k_cat/K_M für NAD⁺ ≧ 20 dadurch gekennzeichnet, daß man einen für das Enzym kodierenden Mikroorganismus mit einer Gen-Sequenz im genetischen Kode verwendet, die für das Enzym mit einer Aminosäure-Sequenz kodiert, deren basische Aminosäure(n) an der Coenzym-Bindungsstelle bzw. den -stellen zumindest teilweise durch ungeladene Aminosäure ersetzt ist bzw. sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Herstellung von short-chain Dehydrogenasen mit Coenzym-Bindungsstellen am N-Terminus.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Herstellung von Alkohol- Dehydrogenasen, insbesondere von (R)-spezifischen Alkohol-Dehydrogenasen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase ausgehend von die Dehydrogenase erzeugenden Mikroorganismen mit Hilfe von gentechnologisch gebildeten Enzymproduzenten-Stämmen gewonnen wird, deren genetischer Kode die Information zur Bildung der gewünschten Aminosäure- Sequenz enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase mit Hilfe von E.coli, insb. von E.coli HB101+(pUBS520), gewonnen wird, der das für die gewünschte Dehydrogenase kodierende mutierte, in einem Expressionsplasmid, insb. pKK-117-3HB, klonierte Gen überexpremiert enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Alkohol-Dehydrogenase ausgehend von Lactobacillen, insbesondere von L. brevis oder L. kefir gewonnen wird.

7. Für präparative Zwecke taugliche (R)-spezifische Alkohol-Dehydrogenase mit einem k_cat/K_M für NAD⁺ ≦ 20, erhältlich ausgehend von Lactobacillus-Stämmen, insb.

von L.brevis oder L.kefir, mit einem für short-chain Dehydrogenasen mit Coenzym- Bindungsstelle im N-Terminus kodierenden Gen durch Abwandlung der entsprechen den Gen-Sequenz für einen Austausch basischer Aminosäure(n) an der Coenzym- Bindungsstelle durch ungeladene Aminosäure(n).

8. Alkohol-Dehydrogenase nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch zumindest einen A9G-, R38L-, H39L-, K45I-, K45M- und/oder K48M-Austausch bei der Alkohol- Dehydrogenase aus L.brevis im N-terrninalen Sequenz-bereich, der - unverändert - S-N-R-L-D-G-K-V-A-I₁₀-I-T-G-G-T-L-G-I-G-L₂₀-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G₃₀-A-K-V- M-I-T-G-R-H-S₄₀-D-V-G-E-K-A-A-K-S-V₅₀ lautet, insb. durch einen der folgenden Austausche

- R38L, K45I, A9G;
- R38L, K45M, A9G;
- R38L, K48M, A9G;
- R38L, H39L, K48M, A9G.

9. Verfahren zur stereo-selektiven Gewinnung von (R)-Hydroxy-Verbindungen durch enzymatische Reduktion entsprechender Keto-Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhältliche Dehydrogenase verwendet.

10. Verfahren zur stereo-selektiven Gewinnung von S-Hydroxy-Verbindungen aus Racematen durch enzymatische Oxidation der R-Hydroxy-Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhältliche Dehydrogenase verwendet.