DE19801120A1

DE19801120A1 - Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen, Genkonstrukt enthaltend dieses Gen und seine Verwendung

Info

Publication number: DE19801120A1
Application number: DE19801120A
Authority: DE
Inventors: Markus Dr Pompejus; Doval Jose Lui Prof D Revuelta; Garcia Maria Angeles Dr Santos
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 1999-07-22
Also published as: WO1999036432A2; IL137006A0; ATE296835T1; DE59812837D1; CN1161471C; CN1285873A; JP2002508950A; ZA99236B; WO1999036432A3; EP1047710B1; US6927026B1; EP1047710A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen, ein Gen konstrukt enthaltend dieses Gen oder seine Homologen und dessen Verwendung. Die Erfindung betrifft außerdem Vektoren oder Organismen enthaltend ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikroorganismen sowie ein Verfahren zum Einbringen von DNA in Uracil auxotrophe Mikroorganismen.

Vitamin B2, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Haut falten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, ver minderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme auftreten. Vitamin B2 hat daher wirtschaftliche Bedeutung ins besondere als Vitaminzusatz bei Vitaminmangel und als Futter mittelzusatz. Daneben wird es als Lebensmittelfarbstoff, bei spielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc. eingesetzt.

Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z. B. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z. B. D-Ribose, ein gesetzt werden müssen. Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die Herstellung dieses Stoffes durch Mikro organismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Roh stoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z. B. Candida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z. B. Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin- Produzenten beschrieben.

In der DE 44 20 785 wurden sechs Riboflavin-Biosynthesegene aus Ashbya gossypii beschrieben, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden und die Verwendung solcher Mikroorganismen zur Riboflavinsynthese.

Bisher werden Gene über die Marker leu2 (Leucin-Auxotrophie), thr4 (Threonin-Auxotrophie) oder kan (Kanamycin-Resistenz) in pilzliche Riboflavinproduzenten wie Ashbya gossypii eingebracht (WO 92/00379). In Hefen wird als weiterer Marker met15 (Methionin-Auxotrophie, Cost et al., Yeast, Vol. 12, 1996: 939-941) beschrieben. Von Nachteil bei diesen Marker ist, daß ent weder die Transformationseffizienz sehr gering ist und/oder aber zur Selektion ständig Antibiotika gegeben werden muß. In jedem Fall ist jedoch eine Gegenselektion auf den Verlust des Markers unter Erhalt der eingebrachten Gene im Mikroorganismen nicht oder nur unter einem sehr hohen Aufwand möglich, so daß weitere Gene mit diesen Markern in der Regel nicht mehr in die Mikroorganismen eingebracht werden können. Es ist deshalb wünschenswert einen Selektionsmarker, der eine hohe Transformationseffizienz auf weist, leicht selektionierbar ist und eine Gegenselektion er möglicht, zu haben.

Das Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen (= URA3-Gen) aus Saccharomyces cerevisiae ist einer der klassischen Marker, der die gewünschten Eigenschaften besitzt und mit dessen Hilfe Gene in Mikroorganismen wie Hefen und Pilze transformiert werden können. In einer Reihe von Arbeiten wird die Isolierung art spezifischer URA3-Gene bzw. die Isolierung des entsprechenden Gens aus Pilzen (= pyrG) sowie deren Sequenzen aus Pichia stipitis, Candida boidinii, Kluyveromyces marxianus, Yamadazyma ohmeri, Candida maltosa, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Mucor circinelloides, Phycomyces blakes leeanus, Penicillium chrysogenum, und Aspergillus awamori be schrieben (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 60, No. 12, 1994 4245-4254, Nucl. Acids Res., Vol. 18, No. 23, 1990: 7183, J. Ferment. Bioeng., Vol. 73, No 4, 1992: 255-260, Yeast, Vol. 9, 1993: 677-681, Yeast, Vol. 10, 1994: 1601-1612, Curr. Genet., Vol. 23, 1993: 205-210, Nucl. Acids Res., Vol. 16, No. 5, 1988: 2339, Curr. Genet., Vol. 16, 1989: 159-163, Gene, Vol. 61, 1987: 385-399, Gene, Vol. 116, 1992: 59-67, Mol. Gen. Genet., Vol. 224, 1990: 269-278, Nucl. Acids Res., Vol. 16, No. 16, 1988: 8177, Nucl. Acids Res., Vol. 18, No. 23, 1990: 7183 und Curr. Genet., Vol. 27, 1995: 536-540).

Arbeiten von Rose et al. (Gene, Vol. 29, 1984: 113-124) zeigten, daß das URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae sogar eine entsprechende Mutation (pyrF-Gen = URA3) in Prokaryonten wie Escherichia coli komplementieren kann und als Selektionsmarker sinnvoll verwendet werden kann.

Bei genetischen Arbeiten zur Riboflavinsynthese von Ashbya gossypii (Vitamin B2-Synthese) zeigte sich jedoch, daß das URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae oder das pyrF-Gen aus Escherichia coli keine Uracil auxotrophen Ashbya gossypii-Mutan ten komplementieren können und deshalb diese Gene zur Klonierung von Genen in Ashbya gossypii nicht verwendet werden kann.

Es wurde deshalb versucht, da daß dem URA3-Gen oder pyrF-Gen entsprechende Gen aus Ashbya gossypii unbekannt ist, dies zu klonieren. Versuche zur Klonierung des Ashbya-Gens nach den in der Literatur beschriebenen Methoden über beispielsweise Hybridi sierung mit URA3-Gen-Fragmenten oder über degenerierte Oligo nukleotide auf Basis konservierter Aminosäuresequenzen verschie dener Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasen und Screening einer "cDNA-library" mit diesen Oligonukleotiden und der PCR-Technik waren erfolglos (Bergkamp et al. Yeast, Vol. 9, 1993: 677-681, Piredda et al., Yeast, Vol. 10, 1994: 1601-1612, Benito et al., Gene, Vol. 116, 1992: 59-67 und Diaz-Minguez et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 224, 1990: 269-278).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, deshalb einen leicht selektionierbaren, mit hoher Ausbeute transformierbaren und ein fach gegenselektionierbaren Marker zur Verfügung zu stellen, der das Einbringen von Genen in Mikroorganismen ermöglicht.

Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäße Orotidin-5'-Phosphatde carboxylase mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen, die mindestens 80% Homologie zur Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweisen, gelöst.

Unter Homologe des erfindungsgemäßen Orotidin-5'-Phosphatde carboxylase-Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 80% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 90% Ho mologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% Homologie auf weisen. Die von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 1 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Sub stitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine vorteilhafterweise für das Einbringen eines oder mehrerer Gene jedoch erhalten bleiben sollte. Sollen mit Hilfe der SEQ ID NO: 1 und seiner Homologen im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Uracil auxo trophen Mikroorganismen jedoch Mutanten im Orotidin-5'-Phosphat decarboxylase-Gen hergestellt werden, so werden nicht funktio nelle Gene das heißt Gene, die zu enzymatisch inaktiven Proteinen führen, verwendet. Dabei werden vorteilhafterweise Sequenzen ver wendet, die Homologien zur SEQ ID NO: 1 oder seinen Homologen vorteilhaft am 3'- und 5'-Ende aufweisen.

Weiterhin sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 beispielsweise pilzliche oder pflanzliche Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzel strang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA- Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 90% über den gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.

Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie bei spielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio nalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Protein expression verändert bevorzugt erhöht wird.

Bevorzugt läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus Mikroorganismen der Familie Metschnikowiaceae, besonders bevor zugt aus Mikroorganismen der Gattungen Eremothecium, Ashbya oder Nematospora, ganz besonders bevorzugt aus Mikroorganismen der Gattung und Art Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii iso lieren.

Unter dem erfindungsgemäßen Genkonstrukt sind die URA3-Gen sequenzen SEQ ID No. 1 und seine Homologen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Bei spielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht ent fernt. Statt dessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafter weise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine er höhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequen zen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die URA3-Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein, wobei das oder die Gene auch in aktiviert sein können. Mit Hilfe dieses oder dieser inaktivierten Gene können im erfindungsgemäßen Verfahren Uracil-auxotrophe Mutanten erzeugt werden. Zum Einbringen weiterer Gene in einen Mikroorganismus sind im Genkonstrukt vorteilhafterweise weitere Gene enthalten. Diese Gene können innerhalb eines URA3-Genes liegen, wobei vorteilhaft eine intakte Kopie des URA3-Gens und/oder ein anderes selektierbares Gen wie leu2, thr4 oder kan im Konstrukt enthalten sein sollte, oder sie können außerhalb des URA3-Genes liegen. Auch im Falle eines intakten URA3-Gens im Genkonstrukt können noch weitere Marker wie die oben genannten gegebenenfalls zur Selektion im Genkonstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor ent halten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungs gemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Im Genkonstrukt können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Mikroorganismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können innerhalb oder außerhalb der Markergene wie ura3, leu2, thr4 oder kan inseriert sein. Prinzipiell können alle Arten von Genen mit Hilfe des erfindungsgemäßen URA3-Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen in Mikro organismen eingebracht werden. Vorteilhafterweise lassen sich regulatorische Gene wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, die über ihre enzymatische Aktivität in die Regulation eingreifen, oder ein oder mehrere oder alle Gene eines Bio syntheseweges wie die Gene der Riboflavinbiosynthese wie bei spielsweise die rib-Gene oder Gene von Biosynthesewegen, die zu anderen Feinchemikalien, Sekundärmetaboliten oder Proteinen führen wie die Gene der Biotin-, Lysin-, Methionin-, Vitamin B12- oder Carotinoidbiosynthese, oder Gene, die zu Aroma-, Wuchs- oder Geruchsstoffen führen oder einzelne Gene für Enzyme wie Proteasen oder Lipasen über die URA3-Sequenz in Wirtsorganismen einbringen und exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Die eingebrachten Gene können einen eigenen Promotor haben oder aber unter der Regulation des Promotors der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seiner Homologen liegen.

Das Genkonstrukt wird zur Expression in den oben genannten Wirts organismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, puCl8, pUCl9, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhafterweise enthält das Genkonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5, Termi nale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beein flussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Trans kriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispiels weise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfin dungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Genkonstrukt als Vektor bestehen.

Als Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Genkonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikro organismen wie Bakterien, Pilze, Hefen, tierische oder pflanz liche Zellen verwendet. Bevorzugt werden Pilze oder Hefen, beson ders bevorzugt Pilze, ganz besonders bevorzugt Pilze der Familie Metschnikowiaceae wie Eremothecium, Ashbya oder Nematospora ver wendet.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikroorganismen. Zur Erzeugung von Uracil auxotrophen Mutanten wird das Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase Gen mit der SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen beispielsweise durch Mutagenese so verändert, daß das durch das Gen codierte Protein inaktiviert wird. Dieses inaktivierte Gen wird anschlie ßend in einen Mikroorganismus beipielsweise über Transformation oder Elektroporation eingeführt. Durch homologe Rekombination in den Mikroorganismen entstehen schließlich auxotrophe Mutanten, die über ihre Resistenz gegen 5-Fluororotsäure gescreent werden können (siehe Boeke et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 197, 1984: 345-346).

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Einbringen von DNA in Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einen Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen (= URA3-Gen) defizienten Organismus bevorzugt einen Mikroorganismus einen Vektor ein bringt, der ein intaktes URA3-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen vorteilhafterweise zusammen mit weiterer DNA vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Gen enthält, und die sen Organismus auf oder in einem Kulturmedium kultiviert, das kein Uracil enthält. In diesem Medium können nur diese Organismen wachsen, die den Vektor erhalten haben. Bevorzugt wird in diesem Verfahren als Vektor eine lineare DNA verwendet. Als Mikro organismen werden in diesem Verfahren bevorzugt Pilze besonders der Familie Metschnikowiaceae wie Eremothecium, Ashbya oder Nematosprora, besonders bevorzugt Mikroorganismen der Gattung Ashbya verwendet.

Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2 m Plasmids aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Frag ment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987).

Das erfindungsgemäße URA3-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen lassen sich vorteilhaft als Selektionsmarker im erfindungsgemäßen Verfahren verwenden. Bevorzugt lassen sich Gene unter Verwendung dieses Selektionsmarkers Gene in Ashbya gossypii einbringen.

Von Vorteil ist weiterhin, daß man bei der Transformation von Ashbya gossypii mit Hilfe dieses Genes selektionieren kann, ohne Fremd-DNA (d. h. DNA, die nicht aus Ashbya gossypii stammt) ver wenden zu müssen.

Bei der Transformation von Ashbya gossypii mit dem Gen mit der SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen können beliebige weitere Gene miteingebracht werden. Dadurch ist es möglich, Stämme zu kon struieren, die einzelne Gene oder mehrere Gene in weiteren Kopien entweder auf Plasmiden oder im Genom tragen.

Des weiteren ist es möglich, Ashbya-Stämme zu konstruieren, bei denen chromosomale Kopien von Genen durch die Insertion des URA3 Gens mit der SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen zerstört wurden.

Ein besonderer Vorteil des AgURA3 Gens ist die Möglichkeit, den Marker mehrfach hintereinander im gleichen Stamm zu verwenden. Wenn man 5' und 3' des Gens identische Nukleotidsequenzen in gleicher Orientierung (sogenannte direct repeats) setzt, kann man den AgURA3 Marker bei Bedarf durch Homologe Rekombination und Selektion auf Uracil- und FOA-haltigen Medium wieder entfernen und dann in einer weiteren Runde zusätzliche DNA mit Hilfe dieses Gens einbringen. Ein weiterer Vorteil ist die deutlich höhere Transformationseffizienz im Vergleich zu den Markern thr, leu oder kan.

Im erfindungsgemäßen Verfahren enthält der Vektor als weiteres Gen mindestens ein Gen der Riboflavinsynthese. Unter Gene der Riboflavinsynthese sind solche Gene zu verstehen, die an der Synthese im gesamten Stoffwechsel von Riboflavinproduzenten wie Ashbya beteiligt sind.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypii ATCC10895

Genomische DNA aus Ashbya gossypii ATCC10895 wurde nach dem in WO97/03208 beschriebenen Verfahren präpariert. Die genomische Genbank, ausgehend von dieser DNA, wurde nach der in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press bzw. in F.M. et al. (1994) Current proto cols in molecular biology, John Wiley and Sons beschriebenen Me thode in pRS314 und in YEp351 (Hill et al., Yeast, Vol. 2, 1986: 163-167) erstellt. Wie beispielsweise WO97/03208 zu entnehmen ist, sind auch andere Plasmide wie Plasmide der pRS-Reihe (Sikorski und Hieter, Genetics, 1989: 19-27) oder Cosmiden, wie z. B. SuperCos1 (Stratagene, La Jolla, USA) für die Herstellung der Genbank geeignet.

Beispiel 2

Es wurde zunächst versucht das Gen für die Orotidin-5'-Phosphat decarboxylase (= OMP-DC) aus Ashbya gossypii über eine funktio nelle Komplementation einer entsprechenden URA3 auxotrophen Mutante von Saccharomyces cerevisiae zu klonieren.

Dazu wurde eine Genbank von genomischer Ashbya gossypii DNA in pRS314 erstellt (wie in Beispiel 1 beschrieben). Mit dieser DNA wurde der S. cerevisiae Stamm MW3317-21A (Genotyp: MAT α, trp1, ade8ΔKpn, ura3-52, hom3-10, met13, met4, ade2, his3-Kpn, siehe z. B. Kramer et al., Mol. Cell. Biol. 9, 1989: 4432-4440), nach der Lithiumacetat-Methode (siehe z. B. Kramer et al., Mol. Cell. Biol. 9, 1989: 4432-4440) transformiert. Es wurde kein Klon erha1ten, bei dem die genomische Deletion des ura3 Gens des S. cerevisiae-Stammes durch ein Genfragment aus Ashbya komple mentiert wurde.

Auch der Versuch über eine funktionelle Komplementation in einer pyrF-Mutante von E. coli das URA3 Gen von Ashbya gossypii zu klonieren schlug fehl.

Beispiel 3

Auch ein Versuch, das OMP-DC-Gen aus Ashbya gossypii über Hybridisierung mit einem Fragment des entsprechenden Gens aus Saccharomyces cerevisiae zu klonieren, gelang nicht.

Dazu wurde das komplette URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae (Genbank entry yscodcd) als Sonde (1,1 kb Länge) verwendet, um eine genomische Cosmid-Genbank von Ashbya gossypii (siehe Bei spiel 1) zu screenen. Der Versuch wurde wie in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons beschrieben durchgeführt, wobei Hybridisierungstemperaturen von 52°C bis 68°C verwendet wurden. Es konnten keine Klone in der Genbank identi fiziert werden, die ein positives Signal mit dem URA3-Gen aus S. cerevisiae als Sonde lieferten.

Beispiel 4

Im nächsten Ansatz wurde die Klonierung des Gens für OMP-DC aus Ashbya gossypii über Amplifikation von Genfragmenten mit Hilfe von degenerierten Oligonukleotiden und der PCR-Technik versucht.

Für diesen Versuch wurden die bekannten Aminosäuresequenzen der verschiedenen Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylasen aus den folgen den Organismen miteinander verglichen und Bereiche ausgewählt, die in allen Enzymen höchstmöglich konserviert sind:
Aspergillus niger (Acc. number: P07817)
Aspergillus nidulans (Acc. number: P10652)
Schizosaccharomyces pombe (Acc. number: P14965)
Penicillium chrysogenum (Acc. number: P09463)
Kluyveromyces lactis (Acc. number: P07922)
Candida albicans (Acc. number: P13649)
Neurospora crassa (Acc. number: P05035)
Ustilago maydis (Acc. number: P15188)
Saccharomyces cerevisiae (Acc. number: P03962)
Drosophila melanogaster (Acc. number: Q01637)
Mouse (Acc. number: P13439)
Human (Acc. number: P11172).

Die in den Klammer angegebenen Nummern stammen aus der SWISS & PIR- Translated Datenbank Release 103.

Auf Basis dieser Informationen wurden degenerierte Olgonukleotide synthetisiert.

Unter degenerierten Oligonukleotiden versteht man Oligo nukleotide, bei denen während der Synthese an mehreren Positionen Mischungen von Nukleotiden eingebaut wurden.

R steht dabei für G oder A, Y steht dabei für C oder T, W steht dabei für A oder T, M steht dabei für A oder C, K steht dabei für G oder T, S steht dabei für C oder G, H steht dabei für A, C oder T, V steht dabei für A, C oder G, B steht dabei für C, G oder T, D steht dabei für A, G oder T, N steht dabei für G,A,T oder C.

Es wurden folgende Oligonukleotide verwendet:

Mit diesen Oligonukleotiden als Primer wurden PCR Reaktionen durchgeführt mit genomischer DNA von Ashbya gossypii als Matrize verwendet.

Es wurden folgende Primerkombinationen verwendet:

URA3-A + URA3-B; URA3-A + URA3-D; URA3C + URA3-B and URA3-C + URA3-D.

Folgende Hybridisierungstemperaturen wurden verwendet:

52°C, 48°C, 44°C, 40°C und 37°C.

Die aus den PCR-Reaktionen entstandenen Produkte wurden nach üblichen Methoden in den Vektor pGEMT (Promega) kloniert und sequenziert. Es konnten keine Fragmente amplifiziert werden, die Homologie zu bekannten oben genannten OMP-DC Genen zeigten.

Beispiel 5

Wie in DE 44 20 785 A1 (Beispiel 1) beschrieben wurden eine cDNA- Bank von Ashbya gossypii erstellt.

Beispiel 6 Analyse von Nukleinsäuresequenzen der Genbank

Von E.coli Klonen, die die in Beispiel 5 beschriebene Genbank von Ashbya gossypii enthalten, wurden Einzelklone selektiert. Nach üblichen Methoden wurden die Zellen in geeigneten Medien (z. B. Luria-Broth mit 100 mg/l Ampicillin) kultiviert und Plasmid-DNA aus diesen Zellen isoliert.

Es wurde Oligonukleotide, die im Vektoranteil hybridisieren als Primer für die Sequenzierung der cDNA Klone verwendet. Dabei wurden Fragmente der klonierten cDNAs erfasst. Die Sequenzen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert.

Beispiel 7

Es wurde eine Computer-unterstützte Analyse der gefundenen Nukleotidsequenzen über Sequenzvergleiche neu identifizierter Sequenzen mit bestehenden DNA und Proteindatenbanken mit Hilfe folgender Algorithmen z. B. mit BLAST Algorithmen (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410), dem Clustal Algorithmus mit Hilfe der PAM250 Gewichtungstabelle oder dem Wilbur-Lipman DNA alignment Algorithmus (wie z. B. in dem Programmpaket MegAlign 3.06 der Firma DNAstar implementiert) durchgeführt. Auf diesem Weg konnten Ähnlichkeiten der neu entdeckten Sequenzen mit bereits bekannten Sequenzen entdeckt und neue Gene oder Teil sequenzen von Genen in ihrer Funktion beschrieben werden.

Beispiel 8 Identifikation von E. coli Klonen, die das Gen für OMP-DC aus Ashbya gossypii (AgURA3) tragen

Nach Untersuchung einer Vielzahl von Klonen wie in Bsp. 6 und 7 (< 100 Klone) beschrieben wurde eine Sequenz gefunden, die Ähnlichkeiten zu den bekannten OMP-DC Genen zeigte. Mit dieser homologen Sonde wurde dann die genomische Ashbya Genbank (siehe Beispiel 1) nochmals gescreent und es konnten Klone bzw. Cosmide identifiziert werden, die ein spezifisches positives Signal er gaben und ein gemeinsames 1,3 kb XhoI-EcoRI-Fragment trugen. Die Sequenzierung der Klone ergab die Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 beschrieben. Die Sequenz zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten URA3 Genen und codiert für ein ca. 29246 Dalton großes Protein.

Beispiel 9 Disruption der chromosomalen Kopie des AgURA3 Gens mit Anti biotika-Resistenzgenen

Unter Disruption eines Genes versteht man die Zerstörung der Funktionalität einer genomischen Kopie des Gens entweder durch (a) Entfernen eines Teiles der Gensequenz, oder durch (b) der Unterbrechung des Gens durch Einfügung eines Stückes Fremd-DNA in das Gen oder durch (c) Ersatz eines Teil des Gens durch Fremd- DNA. Die verwendete Fremd-DNA ist beliebig, bevorzugt aber ein Gen, das Resistenz gegen eine beliebige Chemikalie bewirkt. Zur Disruption von Genen können beliebige Resistenzgene verwendet werden.

Zur Disruption des AgURA3-Gens von Ashbya gossypii ATCC10895 wurde das Kanamycin-Resistenzgen aus Tn903, das unter Kontrolle des TEF-Promotors von Ashbya gossypii (siehe Yeast 10, S. 1793-1808, 1994 oder WO92/00379) verwendet. Das Gen ist 5, und 3' von mehreren Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen flankiert, so daß eine Kassette aufgebaut werden konnte, die be liebige Konstruktionen von Gen-Disruptionen mit üblichen Methoden der in vitro Manipulation von DNA ermöglichen.

Das interne 370 bp PstI-KpnI Fragment von AgURA3 (Position 442-892 in der Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde durch eine wie oben skiz zierte Resistenzkassette ersetzt. Das erhaltene Konstrukt erhielt den Namen ura3::G418. Das erhaltene Plasmid läßt sich nach Trans formation in E.coli vermehren. Das XhoI-SphI-Fragment des Kon struktes ura3::G418 (siehe Fig. 1) wurde über Agarosegel-Elek trophorese und nachfolgender Elution der DNA aus dem Gel (siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619, 1979) aufgereinigt und zur Transformation von Ashbya gossypii eingesetzt. Fig. 1 zeigt in Abb. A eine Restriktionskarte des kodierenden Bereichs des AgURA3-Gens und der 5'- und 3'-nicht translatierten Regionen (= 5'-UTR und 3'-UTR). Abb. B zeigt die Situation nach Insertion der oben beschriebenen Kanamycin-Resistenzkassette (= TEF-kanR).

Das Fragment wurde entweder über Protoplastentransformation (Gene 109, 99-105, 1991) oder aber bevorzugt durch Elektroporation (BioRad Gene Pulser, Bedingungen: Küvetten mit Spaltbreite 0,4 mm, 1500 V, 25 µF, 100 Ω) in Ashbya gossypii transformiert. Die Selektion transformierter Zellen erfolgte auf G418-haltigem Fest medium (WO 97/03208).

Erhaltene G418-resistente Klone wurden mit üblichen Methoden der PCR und Southern-Blot Analyse (Sambrook, J. et al. (1989) Mole cular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press bzw. in F.M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons) daraufhin untersucht, ob die genomische Kopie des AgURA3 Gens tatsächlich zerstört wurde. Klone, deren AgURA3 Gen zerstört wurde, sind Uracil- auxotroph und resistent gegen 1 mg/ml 5'-Fluoro-Orotsäure (FOA).

Beispiel 10 Disruption der chromosomalen Kopie des AgURA3 Gens ohne Ver wendung von Antibiotika-Resistenzgenen

Ein besonderer Vorteil der Verwendung von URA3 Genen ist die Möglichkeit sowohl auf An- als auch auf Abwesenheit des Genes zu selektionieren. Man kann mit FOA Mikroorganismen screenen, die ein funktionell inaktiviertes URA3 Gen besitzen, und mit Hilfe der Selektion auf Uracil- Prototrophie auf ein funktionell aktives URA3 Gen selektionieren.

Zur Disruption der genomischen Kopie des URA3 Gens wurde einfach heitshalber ein internes Fragment (= PstI-Fragment) des URA3 Gens aus dem kodierenden Bereich des Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 deletiert (Position 442 bis 520 in der Sequenz SEQ ID NO: 1). Die Transformation von Ashbya gossypii mit diesem deletierten ura3-Fragment wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt. Anstelle der Deletion von Teilbereichen des Gens können prinzi piell auch alle anderen Methoden zur Inaktivierung des Gens wie Mutationen über Insertionen, Duplikationen, Reversionen, Aus tausch mehrerer Nukleotide oder Punktmutationen verwendet werden. Punktmutationen sind weniger bevorzugt, da sie leicht rever tieren.

Die Selektion der Transformanten wurde durch Resistenz gegen FOA durchgeführt. Im Gegensatz zu Wild-Typ-Klonen sind Klone, die eine Disruption des AgURA3 Gens tragen sind resistent gegen 1 mg/ml FOA.

Beispiel 11 Verwendung des AgURA3 Gens zum Einbringen weiterer DNA in A. gossypii

Das in WO 97/03208 beschriebene Isocitrat1yasegen wurde mit Hilfe des Plasmids pAG100, wie in WO 97/03208 (Beispiel 4 und 5) beschrieben, in AgURA3-Disruptionsmutanten A. gossypii (siehe Beispiel 9 und 10) eingebracht, wobei als Selektionsmarker in A. gossypii anstelle der beschriebenen G418-Resistenz das AgURA3 Gen verwendet wurde.

Claims

1. Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen, die mindestens 80% Homologie zur Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweisen.

2. Homologe nach Anspruch 1, deren durch sie codierten Gen produkte funktionell sind.

3. Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen oder seine Homologen aus Ashbya gossypii stammt.

4. Aminosäuresequenzen codiert durch ein Gen oder seine Homologe gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.

5. Aminosäuresequenzen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um enzymatisch aktive Proteine handelt.

6. Genkonstrukt enthaltend ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxy lase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Gen oder seine Homologen funktionell mit einem oder mehreren Regulations signalen verknüpft ist.

7. Genkonstrukt nach Anspruch 6, deren Genexpression durch die Regulationssignale erhöht wird.

8. Vector enthaltend ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 6 oder 7.

9. Mikroorganismus enthaltend mindestens ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 6 oder 7.

10. Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikro organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Orotidin-5'- Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 so verändert, daß das durch das Gen codierte Protein inaktiv ist, und daß man dieses veränderte Gen in die Mikroorganismen einführt und über homologe Rekombination in das Genom der Organismen integriert und anschließend diese Mikroorganismen auf 5-Fluororotsäureresistenz selektioniert.

11. Verfahren zum Einbringen von DNA in Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einen Orotidin-5'-Phosphat decarboxylase-Gen defizienten Mikroorganismus einen Vector einbringt, der ein intaktes Orotidin-5'-Phosphatdecarboxy lase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zusammen mit mindestens einem weiteren Gen enthält, und diesen Mikroorganismus auf oder in einem Kulturmedium ohne Uracil anzieht.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Vector eine lineare DNA verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen defizienter Mikroorganismus ein Ashbya gossypii Stamm verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als weiteres Gen mindestens ein Gen der Riboflavin synthese in den Mikroorganismus eingebracht wird.

15. Verwendung einer Gen-Sequenz oder seiner Homologen gemäß Anspruch 1 bis 3 als Selektionsmarker.

16. Verwendung nach Anspruch 15 in Ashbya gossypii.