DE10209363A1

DE10209363A1 - Verfahren zur Herstellung von Riboflavin

Info

Publication number: DE10209363A1
Application number: DE10209363A
Authority: DE
Inventors: Henning Althoefer
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2002-03-02
Filing date: 2002-03-02
Publication date: 2003-09-11
Also published as: WO2003074721A3; KR20040096643A; AU2003206964A1; EP1483398A2; CN1639353A; JP2005527200A; AU2003206964A8; WO2003074721A2; CA2477849A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Transkriptions-Terminatoren, einen Organismus, enthaltend wenigstens einen dieser Transkriptions-Terminatoren, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin, wobei ein zur Riboflavinproduktion fähiger Organismus gezüchtet wird, der wenigstens einen dieser Transkriptions-Terminatoren aufweist, wobei der jeweilige Transkriptions-Terminator mit wenigstens einem rib-Gen operativ verknüpft ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Transkriptions-Terminatoren, einen zur Riboflavin- Produktion fähigen Organismus enthaltend wenigstens einen dieser Transkriptions- Terminatoren sowie ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Riboflavin, bei dem ein zur Riboflavin-Produktion fähiger Organismus gezüchtet wird, der wenigstens einen der genannten Transkriptions-Terminatoren aufweist.

Vitamin B2, auch Riboflavin genannt, wird von allen Pflanzen und einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt. Für Mensch und Tier ist es essentiell, da sie nicht in der Lage sind, es zu synthetisieren. Riboflavin spielt eine wichtige Rolle im Metabolismus. So ist es beispielsweise an der Verwertung von Kohlenhydraten beteiligt. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme auftreten. Vitamin B2 hat deshalb eine große wirtschaftliche Bedeutung beispielsweise als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Es wird verschiedensten Lebensmitteln zugesetzt. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc. verwendet.

Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z. B. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z. B. D-Ribose, eingesetzt werden müssen.

Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die fermentative Herstellung des Vitamin B2 durch Mikroorganismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Rohstoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z. B. Candida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z. B. Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin-Produzenten beschrieben. In EP-A-0 405 370 und EP-A-0 821 063 wird die Herstellung von Riboflavin mit rekombinanten Bakterienstämmen beschrieben, wobei die Stämme durch Transformation mit Riboflavin-Biosynthesegenen aus Bacillus subtilis erhalten wurden.

In Patent WO 95/26406 bzw. WO 93/03183 sowie in DE 44 20 785 wird die Klonierung der für die Riboflavin-Biosynthese spezifischen Gene aus den eukaryontischen Organismen Ashbya gossypii bzw. Saccharomyces cerevisiae, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden, und die Verwendung solcher Mikroorganismen zur Riboflavinsynthese beschrieben.

In beiden Organismen katalysieren 6 Enzyme ausgehend von Guanosintriphosphat (GTP) und von Ribulose-5-Phosphat die Bildung von Riboflavin. Hierbei setzt die GTP-Cyclohydrolase-II (rib1-Genprodukt) GTP zu 2,5-Diamino-6-(ribosylamino)-4- (3H)-pyrimidinon-5-phosphat um. Diese Verbindung wird anschließend durch die 2,5- Diamino-6-(ribosylamino)-4-(3H)-pyrimidinon-5-phosphat-Reduktase (rib7-Genprodukt) zu 2,5-Diamino-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidin-5-phosphat reduziert und dann durch eine spezifische Deaminase (rib2-Genprodukt) zu 5-Amino-6- ribitylamino-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion-5-phosphat deaminiert. Durch eine unspezifische Phosphatase wird daraufhin das Phosphat abgespalten.

Ribulose-5-phosphat, neben GTP das zweite Ausgangsprodukt der letzten enzymatischen Schritte der Riboflavinbiosynthese, wird durch die 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat-Synthase (rib3-Genprodukt) zu 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4- phosphat (DBP) umgesetzt.

Sowohl DBP als auch 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-Pyrimidindion sind die Edukte der enzymatischen Synthese von 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin. Diese Reaktion wird durch das rib4-Genprodukt (DMRL-Synthase) katalysiert. DMRL wird daraufhin durch die Riboflavin-Synthase (rib5-Genprodukt) zu Riboflavin umgesetzt (Bacher et al. (1993), Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag).

Trotz dieser Fortschritte in der Herstellung von Riboflavin besteht nach wie vor ein Bedarf zur Verbesserung und Steigerung der Vitamin B2-Produktivität um den steigenden Bedarf zu decken und die Herstellung von Riboflavin effizienter zu gestalten.

Es bestand daher die Aufgabe die Vitamin B2-Produktivität weiter zu verbessern.

Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin, wobei ein zur Riboflavinproduktion fähiger Organismus gezüchtet wird, der wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 aufweist, wobei der jeweilige Transkriptions-Terminator mit wenigstens einem rib-Gen (Gen der Riboflavinbiosynthese) operativ verknüpft ist und das verstärkt gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium aufbereitet wird.

Erfindungsgemäß vorteilhaft erfolgt bei dem Verfahren zur Riboflavin-Produktion eine operative Verknüpfung mit wenigstens einem Gen aus der Gruppe rib1, rib2, rib3, rib4, rib5 oder rib7.

Durch die operative Verknüpfung eines erfindungsgemäßen Transkriptions- Terminators ausgewählt aus der Gruppe gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 mit wenigstens einem Gen der Riboflavinbiosynthese (rib-Gen) wird bei Vorliegen einer solchen Kombination in Bakterien, Pilzen, Hefen und Pflanzen die Expression des entsprechenden Gens oder der entsprechenden Gene gesteigert und/oder ein stabilisierender Effekt auf das gebildete oder die gebildeten Transkripte ausgeübt und folglich die Riboflavinproduktion (im Vergleich mit dem Wildtyp der Gattung Ashbya ATCC 10895) in diesen Organismen gesteigert. Hierbei ist eine operative Verknüpfung eines erfindungsgemäßen Terminators aus der genannten Gruppe mit einem oder mehreren rib-Genen möglich, wobei jedes Gen einzeln mit diesem Termintor operativ verknüpft ist oder eine Gengruppe (z. B. Cluster oder Operon) mit einem solchen Terminator operativ verknüpft ist. Ferner ist in den zur Riboflavinproduktion geeigneten Organismen das Vorliegen verschiedener der genannten Terminatoren umfaßt. Hierbei können die verschiedenen Terminatoren jeweils einzeln mit einem rib-Gen operativ verknüpft sein oder es liegen die verschiedenen Terminatoren in einer operativen Verknüpfung mit gruppiert angeordneten rib-Genen vor. Somit kann im Sinne der vorliegenden Erfindung in einem zur Riboflavinproduktion geeigneten Organismus jeder der genannten Transkriptions-Terminatoren einzeln oder zwei davon oder alle drei in jeder denkbaren Kombination mit rib-Genen operativ verknüpft vorliegen. Auch ist eine operative Verknüpfung der erfindungsgemäßen Transkriptions-Terminatoren mit einem oder mehreren anderen an der Riboflavinproduktion beteiligten Genen denkbar.

Unter einer operativen Verknüpfung ist die sequenzielle Anordnung von Nukleotidsequenzen mit regulatorischer und kodierender Funktion, wie beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente zu verstehen, derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Gentechnische Vorgehensweisen zur operativen Verknüpfung von Nukleotidsequenzen gehören zur gängigen Laborpraxis und sind beispielsweise in D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9) nachzulesen. Ebenfalls hier nachzulesen, sind Methoden zur Synthese und zum Austausch von Basen in einer Nukleotidsequenz, die dem Fachmann bekannt sind.

Vorteilhaft führt die operative Verknüpfung wenigstens eins der rib-Gene mit einem der erfindungsgemäßen Transkriptions-Terminatoren gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 zu einer verstärkten Termination der Transkription. Dies wiederum nimmt indirekt Einfluß auf die Transkriptionsrate des Gens, das dem Terminator vorgeschaltet ist, da der Transkriptionsapparat, d. h. RNA-Polymerase und unterstützende Transkriptionsfaktoren, nach Ablesung des erfindungsgemäßen Terminators effizienter freigesetzt wird und somit schneller für eine neue Transkriptionsrunde zur Verfügung steht (Alberts et al., 3. Auflage, Molekularbiologie der Zelle, VCH Verlag). Folglich wird auf diese Weise eine erhöhte Transkriptionsrate der entsprechenden Gene ermöglicht. D. h., es kommt zu einer Erhöhung der Genexpression verbunden mit einer Erhöhung der Aktivität der entsprechend kodierten Genprodukte, die schließlich zu einer deutlich gesteigerten Riboflavin- Produktivität führt. Ferner kann ein jeder der erfindungsgemäßen Transkriptions- Terminatoren einen stabilisierenden Effekt auf das gebildete Transkript ausüben. Hierbei kann beispielsweise der Abbau (z. B. durch eine Exonuklease) von 3'-Ende des Transkripts verlangsamt oder nahezu verhindert werden. Dies hat zur Folge, daß die Transkripte, da sie weniger schnell abgebaut werden, verstärkt translatiert werden können, was wiederum zu einer erhöhten Aktivität der entsprechend kodierten Enzyme führt.

Erfindungsgemäß vorteilhaft ist ein Verfahren bei dem ein Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1 eingesetzt wird, der gegenüber der Sequenz des Transkriptions-Terminators des rib2-Gens des Wildtyps ATCC 10895 an der Position 13 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist. Gleichermaßen vorteilhaft ist auch ein Verfahren bei dem ein Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 2 eingesetzt wird, der gegenüber der Sequenz des Transkriptions-Terminators des rib2-Gens des Wildtyps ATCC 10895 an der Position 25 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist. Ebenso vorteilhaft ist ein Verfahren bei dem ein Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 3 eingesetzt wird, der gegenüber der Sequenz des Transkriptions-Terminators des rib2-Gens des Wildtyps ATCC 10895 an den Positionen 13 und 25 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist. Bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem ein Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 3 eingesetzt wird.

Gegebenenfalls kann jeder der erfindungsgemäßen Transkriptions-Terminatoren zahlenmäßig einmal oder aber auch in mehrfachen Kopien im Genom des zur Riboflavinproduktion eingesetzten Organismus vorkommen. Dies hängt davon ab, ob der Terminator mit einem oder mehreren Genen operativ verknüpft wird. So ist z. B. die operative Verknüpfung des Terminators gemäß SEQ ID No. 1 mit nur einem rib- Gen oder mit mehreren, bevorzugt getrennt organisierten, rib-Genen (oder anderen an der Riboflavinsynthese beteiligten Genen) denkbar. Das gleiche gilt für einen Terminator gemäß SEQ ID No. 2 oder gleichermaßen für einen Terminator gemäß SEQ ID No. 3.

Erfindungsgemäß umfaßt ist somit der Einsatz eines jeden einzelnen Transkription- Terminators oder der Kombination aller drei erfindungsgemäßer Transkriptions- Terminatoren und zwar jeweils in einfacher Kopie oder mehrfachen Kopien im Genom eines zur Riboflavinproduktion geeigneten Organismus.

Vorteilhaft wird das Verfahren zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin mit einem zur Riboflavin-Produktion fähigen Organismus durchgeführt. Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich prinzipiell alle Organismen, die in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Riboflavin synthetisieren können. Aber auch Organismen, die aufgrund des Einbringens der kompletten Vitamin B2-Synthesegene in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren, sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind Organismen wie Bakterien, Hefen, Pilze oder Pflanzen geeignet.

Beispielhaft seien eukaryontische Organismen wie Pilze, die in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschrieben werden, wie Ashbya oder Eremothecium, Hefen wie Candida, Saccharomyces oder Pichia oder Pflanzen wie Arabidopsis, Tomate, Kartoffel, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, Hirse, Baumwolle, Leguminosen, Zuckerrübe, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Canola, Hafer, Tabak, Alfalfa, Salat oder die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies oder prokaryontische Organismen wie gram-positive oder gram- negative Bakterien wie Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Escherichia oder Klebstella genannt.

Bevorzugt werden Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Ashbya, Eremothecium, Candida oder Saccharomyces oder Pflanzen wie Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Kartoffel oder Tomate.

Besonders bevorzugt werden Organismen der Gattung und Art Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii, Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Corynebacterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis. Als Pflanzen werden besonders bevorzugt Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Kartoffel und Tomate. Insbesondere werden Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii bevorzugt.

Erfindungsgemäß umfaßt sind auch Riboflavin-Produktionsstämme. Diese können z. B. ausgehend von zur Riboflavinproduktion geeigneten Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden und ggf. weitere genetische Veränderungen als die im Rahmen der rib-Gene aufweisen.

Bei den zuvor genannten rib-Genen sind erfindungsgemäß solche umfaßt, die aus Organismen stammen, die zur Riboflavinproduktion fähig sind. Bevorzugt werden Gene aus Organismen, wie Bacillus subtilis, Saccharamyces cerevisiae oder Ashbya gossypii. Besonders bevorzugt sind rib-Gene aus Ashbya gossypii. Umfaßt sind hierbei auch Funktionsanaloga, funktionelle Äquivalente oder Derivate dieser Gene.

Unter Funktionsanaloga sind beispielsweise funktionelle Homologe der rib-Gene oder deren enzymatischen Aktivitäten, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie die rib-Gene katalysieren, zu verstehen.

Unter funktionellen Äquivalenten sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 35% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 40% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 45% Homologie, ganz besonders bevorzugt 50% Homologie aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von den bekannten DNA- Sequenzen der rib-Gene oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten oder Prokaryonten als Ashbya gossypii wie oben genannt isolieren. Diese DNA- Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereich, die über Vergleiche mit den entsprechenden Genen aus E. coli und B. subtilis in einer dem Fachmann bekannten Weise ermittelt werden können, verwendet.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC und in Gegenwart von 50% Formamid zu verstehen. Die experimentellen Bedingungen für die DNA- Hybridisierung sind einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben. Weiterhin sind unter Homologe verkürzte Sequenzen oder Einzelstrang-DNA zu verstehen.

Unter Derivaten sind Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Weiter vorteilhaft zur Steigerung der Vitamin-B2-Produktivität ist eine Kombination aus der Steigerung der natürlichen Enzymaktivität kodiert durch die genannten rib- Gene und der Erhöhung der Genexpression durch ein zusätzliches Einbringen wenigstens eines der oben genannten Gene oder auch einer Kombination mehrerer dieser Gene in einen zur Riboflavin-Produktion fähigen Organismus.

Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten die Enzymaktivität der rib-Genprodukte in der Zelle zu erhöhen.

Eine Möglichkeit besteht in der operativen Verknüpfung der Gene mit einem der erfindungsgemäßen Terminatoren aus der Gruppe gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3, wodurch eine erhöhte Transkriptionrate des jeweiligen Gens oder mehrerer der genannten Gene erreicht wird und/oder eine Stablisierung des oder der gebildeten Transkripte.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die endogenen rib-Gene so zu verändern, daß sie für Enzyme mit gegenüber den nicht-veränderten (Ausgangs- oder Wildtyp)- Enzymen erhöhter rib-Aktivität kodieren. Eine Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung der katalytischen Zentren ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzyminhibitoren aufgehoben wird. D. h. die Enzyme weisen eine erhöhte spezifische Aktivität auf oder ihre Aktivität wird nicht gehemmt.

Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform durch Erhöhung der Enzymsynthese in der Zelle erfolgen, beispielsweise durch Ausschaltung von Faktoren, welche die Enzymsynthese reprimieren oder durch Erhöhung der Aktivität von Faktoren oder Regulatorelementen, die eine verstärkte Synthese fördern.

Auch das Einbringen weiterer Genkopien kann zu einer erhöhten spezifischen Enzymaktivität führen. Durch diese Maßnahmen wird die Gesamtaktivität der Genprodukte in der Zelle erhöht, ohne die spezifische Aktivität zu verändern. Es kann auch eine Kombination dieser Methoden verwendet werden, das heißt Erhöhung der spezifischen Aktivität sowie Erhöhung der Gesamtaktivität. Diese Änderungen können prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die Nukleinsäuresequenzen der Gene, Regulationselemente, Terminatoren oder deren Promotoren eingebracht werden.

Hierzu können die Sequenzen beispielsweise einer Mutagenese wie einer "site directed mutagenesis" unterzogen werden wie sie in D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Kapitel 6, Seite 193 ff beschrieben wird. Von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) wird eine PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese beschrieben. Die Verwendung einer "in-vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution wird von Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschrieben. Von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) wird die Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode beschrieben. Die veränderten Nukleinsäuresequenzen werden anschließend wieder über Vektoren in die Organismen zurückgebracht.

Es können zur Erhöhung der Enzymaktivitäten auch veränderte Promotorbereiche vor die natürlichen Gene gebracht werden, so daß die Expression der Gene gesteigert wird und damit die Aktivität letztlich angehoben wird.

Vorteilhafte Promotorsequenzen sind beispielsweise cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, Iac-, Ipp-Iac-, Iac^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P- 60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin- Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Weitere vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 9321334) Promotor. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245). Auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Auch am 3'-Ende kann, neben der erfindungsgemäß effizienteren Termination der Transkription, durch Einsatz wenigstens eines der Transkriptions-Terminatoren aus der Gruppe gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3, beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöht werden und dadurch eine erhöhte Translation ermöglicht werden. Dies führt ebenfalls zu einer höheren Enzymaktivität der entsprechend exprimierten Gene. Die Stabilisierung der Transkripte kann ferner durch zusätzlich eingebrachte Sequenzen am 3'-Ende verstärkt werden.

Vorteilhaft ist ein zusätzliches Einbringen wenigstens eines der oben genannten rib- Gene oder auch einer Kombination mehrerer dieser Gene, in operativer Verknüpfung mit wenigstens einem der erfindungsgemäßen Transkriptions-Terminatoren, in einen zur Riboflavin-Produktion fähigen Organismus zur Erhöhung der Genexpression durch Erhöhung der Genkopienzahl. Diese Genkopien können der natürlichen Regulation unterliegen, einer veränderten Regulation, wobei die natürlichen Regulationsregionen derart verändert wurden, das sie eine erhöhte Expression der Gene ermöglicht oder aber es können Regulationssequenzen fremder Gene oder sogar artfremder Gene verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist eine Kombination der oben genannten Methoden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Genkonstrukt enthaltend wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 sowie wenigstens ein mit einem dieser Terminatoren operativ verknüpftes rib-Gen. Bevorzugt enthält das erfindungsgemäße Genkonstrukt wenigstens ein Gen aus der Gruppe rib1, rib2, rib3, rib4, rib5 oder rib7. In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor umfaßt, enthaltend wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 oder ein Genkonstrukt der zuvor genannten Art sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion sowie zur Replikation in der Wirtszelle oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.

In dem erfindungsgemäßen Genkonstrukt können auch noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die rib-Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene, die eine gesteigerte Synthese ermöglichen.

Das Genkosntrukt wird zur Expression in den oben genannten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2αM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 beschrieben.

Vorteilhafterweise enthält das Genkonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'- und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression dieser Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor bestehen.

Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2αm Plasmids aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Fragment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987). Dabei können die rib-Gene einzeln im Genom an verschiedenen Orten oder auf verschiedenen Vektoren vorliegen oder gemeinsam im Genom oder auf einem Vektor vorliegen.

Die erfindungsgemäßen Transkriptions-Terminatoren, die zuvor genannten Genkonstrukt oder die zuvor genannten Vektoren enthaltend erfindungsgemäß bevorzugt wenigstens ein rib-Gen und entsprechend damit operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, wie u. a. wenigstens einer der erfindungsgemäßen Transkriptions-Terminatoren, lassen sich prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die verwendeten Organismen einführen.

Vorteilhaft werden sie über Transformation, Transfektion, Elektroporation, mit der sog. Partikelgun oder über Mikroinjektion in die Organismen bzw. deren Zellen eingebracht. Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.

Als vorteilhaft seien beispielhaft Methoden wie das Einbringen der DNA über homologe oder heterologe Rekombination beispielsweise mit Hilfe des ura-3-Gens, speziell des ura-3-Gens von Ashbya, wie in der deutschen Anmeldung DE 198 01 120.2 beschrieben und/oder über die im folgenden beschriebene REMI- Methode (= "Restriktion-Enzyme-Mediated-Integration"), genannt.

Die REMI-Technik basiert auf der Kotransformation eines linearen DNA-Konstruktes, das an beiden Enden mit derselben Restriktionsendonuklease geschnitten wurde, zusammen mit der Restriktionsendonuklease, die für diese Restriktion des DNA- Konstrukts verwendet wurde, in einen Organismus. Die Restriktionsendonuklease schneidet daraufhin die genomische DNA des Organismus, in den das DNA- Konstrukt zusammen mit dem Restriktionsenzym eingebracht wurde. Dies führt zu einer Aktivierung der zelleigenen Reparaturmechanismen. Diese Reparaturmechanismen reparieren die durch die Endonuklease hervorgerufene Strangbrüche der genomischen DNA und bauen dabei mit einer gewissen Frequenz auch das kotransformierte DNA-Konstrukt mit ins Genom ein. In der Regel bleiben dabei die Restriktionsschnittstellen an beiden Enden der DNA erhalten.

Diese Technik wurde von Bölker et al. (Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552) für die Insertionsmutagenese von Pilzen beschrieben. Von Schiestl und Petes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589) wurde die Methode zur Aufklärung, ob es bei Saccharomyces eine heterologe Rekombination gibt, verwendet. Zur stabilen Transformation und regulierten Expression eines induzierbaren Reportergens wurde die Methode von Brown et al. (Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80) beschrieben. Das System wurde bisher noch nicht als gentechnisches Werkzeug zur Optimierung von Stoffwechselwegen oder zur kommerzielle Überexpression von Proteinen eingesetzt.

Am Beispiel der Riboflavinsynthese wurde gezeigt, daß mit Hilfe der REMI-Methode Biosynthesegene in das Genom der oben genannten Organismen integriert werden können und damit Produktionsverfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten des Primär- oder Sekundärmetabolismus speziell von Biosynthesewegen beispielsweise von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin oder Tryptophan, Vitaminen wie Vitamin A, B2, B6 B12, C, D, E, F, S-Adenosylmethionin, Biotin, Panthotensäure oder Folsäure, Carotinoiden wie β-Carotin, Lycopin, Canthaxanthin, Astaxanthin oder Zeaxanthin oder Proteinen wie Hydrolasen wie Lipasen, Esterasen, Amidasen, Nitrilasen, Proteasen, Mediatoren wie Cytokine z. B. Lymphokine wie MIF, MAF, TNF, Interleukine wie Interleukin 1, Interferone wie γ-Interferon, tPA, Hormone wie Proteohormone, Glykohormone, Oligo- oder Polypetidhormone wie Vassopressin, Endorphine, Endostatin, Angiostatin, Wachstumsfaktoren Erythropoietin, Transkriptionsfaktoren, Integrine wie GPIIb/IIIa oder α_vβIII, Rezeptoren wie die verschiedenen Glutamatrezeptoren, Angiogenesefaktoren wie Angiotensin optimiert werden können.

Mit Hilfe der REMI-Methode können die erfindungsgemäßen Transkriptions- Terminatoren, die oben genannten Genkonstrukte oder die zuvor genannten Vektoren enthaltend wenigstens einen der erfindungsgemäßen Transkriptions- Terminatoren in operativer Verknüpfung mit wenigstens einem rib-Gen an transkriptionsaktive Stellen im Genom plaziert werden.

Vorteilhafterweise werden die Transkriptions-Terminatoren und/oder die genannten Genkonstrukte zusammen mit mindestens einem Reportergen in ein weiteres DNA- Konstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo- oder Biolumineszenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotikaresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Glucosidasegene, Peroxidasegen oder Biosynthesegene wie die Riboflavingene, das Luciferasegen, β- Galactosidasegen, gfp-Gen, Lipasegen, Esterasegen, Peroxidasegen, β- Lactamasegen, Acetyl-, Phospo- oder Adenyltransferasegen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transkriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Im Falle, daß die Biosynthesegene selber eine leichte Detektierbarkeit ermöglichen, kann wie beispielsweise im Falle des Riboflavins auf ein zusätzliches Reportergen verzichtet werden.

Sollen mehrere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können. Auch Genfragmente, die für die jeweiligen Aktivitäten kodieren können in der REMI-Technik eingesetzt werden.

Für das Verfahren zur Integration von regulatorischen Sequenzen oder Genkonstrukten in das Genom von Organismen eignen sich prinzipiell alle bekannten Restriktionsenzyme. Restriktionsenzyme, die nur 4 Basenpaare als Restriktionsschnittstelle erkennen, sind weniger bevorzugt, da sie zu häufig im Genom oder im zu integrierenden Vektor schneiden, bevorzugt sind Enzyme die 6, 7, 8 oder mehr Basenpaare als Schnittstelle erkennen wie BamHI, EcoRI, BgIII, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, SaII, ClaI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, Bpn1, NotI, SrfI oder SfiI um nur einige der möglichen Enzyme zu nennen. Von Vorteil ist, wenn die verwendeten Enzyme keine Schnittstellen mehr in der einzuführenden DNA haben, dies erhöht die Effizienz der Integration. In der Regel werden 5 bis 500 U, bevorzugt 10 bis 250, besonders bevorzugt 10 bis 100 U der Enzyme im REMI-Ansatz verwendet. Die Enzyme werden vorteilhaft in einer wäßrigen Lösung eingesetzt, die Substanzen zur osmotischen Stabilisierung wie Zucker wie Saccharose, Trehalose oder Glucose, Polyole wie Glycerin oder Polyethylenglycol, eine Puffer mit einer vorteilhaften Pufferung im Bereich von pH 5 bis 9, bevorzugt 6 bis 8, besonders bevorzugt 7 bis 8 wie Tris, MOPS, HEPES, MES oder PIPES und/oder Substanzen zur Stabilisierung der Nukleinsäuren enthalten wie anorganische oder organische Salze von Mg, Cu, Co, Fe, Mn oder Mo. Es können gegebenenfalls noch weitere Stoffe enthalten sein wie EDTA, EDDA, DTT, β-Mercaptoethanol oder Nukleasehemmstoffe. Es ist aber auch möglich die REMI-Technik ohne diese Zusätze durchzuführen. Das Verfahren wird in einem Temperaturbereich von 5 bis 80°C, bevorzugt von 10 bis 60°C, besonders bevorzugt von 20 bis 40°C durchgeführt. Für das Verfahren eignen sich alle bekannten Methoden zur Destabilisierung von Zellmembranen wie beispielsweise die Elektroporation, die Fusion mit beladenen Vesikeln oder die Destabilisierung über verschiedene Alkali- oder Erdalkalisalze wie Lithium, Rubidium- oder Calziumsalze bevorzugt sind die Lithiumsalze.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben.

Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.

Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner einen Organismus, der zur Riboflavinproduktion fähig ist, enthaltend wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ3 oder ein Genkonstrukt oder einen Vektor der erfindungsgemäßen Art.

Vorteilhaft handelt es sich um einen Organismus aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Escherichia, Cyanobacter, Ashbya, Eremothecium, Pichia, Candida oder Saccharomyces oder Pflanzen wie Arabidopsis, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Hirse, Hafer, Zuckerrübe, Kartoffel, Sonnenblume, Leguminosen oder Tomate. Bevorzugt ist ein Organismus ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Candida, Eremothecium oder Ashbya oder Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Kartoffel oder Tomate. Besonders bevorzugt handelt es sich um Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii, Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Corynebacterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis. Insbesondere handelt es sich um Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii.

Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch Organismen ein, die sich als Riboflavin produzierende Mutanten oder Produktionsstämme auszeichnen. Diese können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden und ggf. weitere genetische Veränderungen als die im Rahmen der rib-Gene aufweisen.

Der erfindungsgemäße Organismus zeichnet sich ferner dadurch aus, daß er gegenüber dem Wildtyp der Gattung Ashbya ATCC 10895 eine erhöhte Transkriptionsrate wenigstens eines rib-Gens aufweist, das mit einem der Transkriptions-Terminatoren gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 operativ verknüpft ist. Ferner ist der erfindungsgemäße Organismus gegenüber dem Wildtyp der Gattung Ashbya ATCC 10895 zu einer verbesserten Riboflavin- Produktion fähig.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die für die Herstellung von Riboflavin verwendeten Organismen in einem Medium, welches das Wachstum dieser Organismen ermöglicht, angezüchtet. Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.

Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zuckerquellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6- bisphosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronensäure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie ein Aminosäurengemisch beispielsweise sog. Casamino acids (Difco) oder einzelne Aminosäuren wie Glycin oder Asparaginsäure oder Aminozucker, die letztgenannten können auch gleichzeitig als Stickstoffquelle verwendet werden.

Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH₄Cl oder (NH₄)₂SO₄, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquellwasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelprotein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen können.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Cobalt, Molybdän, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phosphation zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kontrolle der Fe²⁺- oder Fe³⁺-Ionenkonzentration im Produktionsmedium.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Phenylalanin, Ornithin oder Valin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorgelegt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 festgehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, besonders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an.

Wie Medien vorteilhaft optimiert werden können, kann der Fachmann beispielsweise dem Lehrbuch Applied Microbiol Physiology, "A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL-Press, 1997, Seiten 53-73, ISBN 0 19 963577 3) entnehmen. Vorteilhafte Medien und Anzuchtsbedingungen sind für Bacillus und weitere Organismen beispielsweise der Schrift EP-A-0 405 370 speziell dem Beispiel 9, für Candida der Schrift WO 88/09822 speziell Tabelle 3 und für Ashbya der Schrift von Schmidt et al. (Microbiology, 142, 1996: 419-426) zu entnehmen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich in batch- oder fed-batch-weise durchgeführt werden.

Abhängig davon wie hoch die Ausgangsproduktivität des verwendeten Organismus ist, läßt sich die Riboflavin-Produktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich stark steigern. In der Regel läßt sich die Produktivität vorteilhaft um mindestens 5%, bevorzugt um mindestens 10%, besonders bevorzugt um 20%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% jeweils gegenüber dem Ausgangsorganismus steigern.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner eine Verwendung eines Organismus der erfindungsgemäßen Art enthaltend wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 oder ein Genkonstrukt oder einen Vektor der erfindungsgemäßen Art zur verbesserten Herstellung von Riboflavin. Bevorzugt handelt es sich um den Organismus Ashbya gossypii.

Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung wenigstens eines Transkriptions-Terminators gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 zur Herstellung eines Produktionsorganismus zur verbesserten Herstellung von Riboflavin. Ebenso ist eine Verwendung wenigstens eines Transkriptions- Terminators gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 zur Erhöhung der Transkriptionsrate von Genen, die an der Riboflavin-Produktion beteiligt sind, erfindungsgemäß umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die Verwendung wenigstens eines Transkriptions-Terminators gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 zur verbesserten Herstellung von Riboflavin.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert aber nicht limitiert.

Allgemeine Methoden

Allgemeine Nukleinsäureverfahren wie z. B. Klonierung, Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Mikroorganismen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wenn nichts anderes beschrieben wurde wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.

Isolierung der rib-Gene

Die Isolierung der rib-Gene 1, 2, 3, 4, 5 und 7 aus Ashbya gossypii und Saccharomyces cerevisiae wird in den Patenten WO 95/26406 und WO 93/03183 und speziell in den Beispielen beschrieben und wurde entsprechend durchgeführt. Auf diese Schriften wird hier ausdrücklich Bezug genommen.

Sequenzvergleich der Terminator-Region

Ausgehend von den isolierten rib-Genen wurde auch die Terminatorregion des rib2- Gens identifiziert und analysiert. Dabei ergab sich folgende Sequenz:
Terminator des rib2-Gens von Ashbya ATCC 10895 (SEQ ID No. 4):
Stop-TGATTTTGCTGCGAATTGTAGATGG

Die erfindungsgemäßen Terminatoren weisen folgende Sequenzen auf:
Erfindungsgemäßer Terminator gemäß (SEQ ID No. 1):
Stop-TGATTTTGCTGCAAATTGTAGATGG
Erfindungsgemäßer Terminator gemäß (SEQ ID No. 2):
Stop-TGATTTTGCTGCGAATTGTAGATGAErfindungsgemäßer Terminator gemäß (SEQ ID No. 3):
Stop-TGATTTTGCTGCAAATTGTAGATGA

Unterschiedliche Nukleotide sind durch Unterstreichung dargestellt. Die Vorgehensweisen zur Synthese von Nukleotidsequenzen oder zum Austausch oder zur Mutagenese von einzelnen Nukleotiden wurden nach gängiger Laborpraxis durchgeführt und sind u. a. in D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9) beschrieben.

Die Sequenzen der erfindungsgemäßen Terminatoren sowie des Terminators des rib2-Gens aus Ashbya ATCC 10895 sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 4 dargestellt. SEQUENCE LISTING

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin, wobei

a) ein zur Riboflavinproduktion fähiger Organismus gezüchtet wird, der wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 aufweist, wobei der jeweilige Transkriptions- Terminator mit wenigstens einem rib-Gen operativ verknüpft ist und

b) das gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium aufbereitet wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die operative Verknüpfung mit wenigstens einem Gen aus der Gruppe rib1, rib2, rib3, rib4, rib5 oder rib7 erfolgt.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 1 verwendet wird, dessen Sequenz gegenüber der Sequenz des Transkriptions-Terminators des rib2-Gens des Wildtyps ATCC 10895 an der Position 13 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 2 verwendet wird, dessen Sequenz gegenüber der Sequenz des Transkriptions-Terminators des rib2-Gens des Wildtyps ATCC 10895 an der Position 25 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Transkriptions-Terminator gemäß SEQ ID No. 3 verwendet wird, dessen Sequenz gegenüber der Sequenz des Transkriptions-Terminators des rib2-Gens des Wildtyps ATCC 10895 an den Positionen 13 und 25 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Organismus, der zur Riboflavinproduktion fähig ist, ein Bakterium, eine Hefe, ein Pilz oder eine Pflanze eingesetzt wird.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Escherichia, Cyanobacter, Ashbya, Eremothecium, Pichia, Candida oder Saccharomyces oder Pflanzen wie Arabidopsis, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Hirse, Hafer, Zuckerrübe, Kartoffel, Sonnenblume, Leguminosen oder Tomate.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Organismen Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii, Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Corynebacterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis verwendet werden.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii verwendet wird.

10. Transkriptions-Terminator mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No. 1.

11. Transkriptions-Terminator mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No. 2.

12. Transkriptions-Terminator mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No. 3.

13. Transkriptions-Terminator gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er gegenüber dem Transkriptions-Terminator des rib2-Gens aus Ashbya ATCC 10895 an der Position 13 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist.

14. Transkriptions-Terminator gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er gegenüber dem Transkriptions-Terminator des rib2-Gens aus Ashbya ATCC 10895 an der Position 25 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist.

15. Transkriptions-Terminator gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er gegenüber dem Transkriptions-Terminator des rib2-Gens aus Ashbya ATCC 10895 an den Positionen 13 und 25 durch Austausch von Guanin gegen Adenin verändert ist.

16. Genkonstrukt enthaltend wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15 sowie wenigstens ein rib-Gen, das dem jeweiligen Terminator operativ verknüpft ist.

17. Genkonstrukt gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Gen aus der Gruppe rib1, rib2, rib3, rib4, rib5 oder rib7 enthält.

18. Vektor enthaltend wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15 oder ein Genkonstrukt gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion sowie zur Replikation in der Wirtszelle oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.

19. Organismus, der zur Riboflavinproduktion fähig ist, enthaltend wenigstens einen Transkriptions-Terminator gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15 oder ein Genkonstrukt gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 oder einen Vektor gemäß Anspruch 18.

20. Organismus gemäß Anspruch 19, ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Escherichia, Cyanobacter, Ashbya, Eremothecium, Pichia, Candida oder Saccharomyces oder Pflanzen wie Arabidopsis, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Hirse, Hafer, Zuckerrübe, Kartoffel, Sonnenblume, Leguminosen oder Tomate.

21. Organismus gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii, Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Corynebacterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis handelt.

22. Organismus gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii handelt.

23. Organismus gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß er gegenüber dem Wildtyp der Gattung Ashbya ATCC 10895 eine erhöhte Transkriptionsrate eines rib-Gens aufweist, das mit einem Transkriptions- Terminator aus der Gruppe SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 oder SEQ ID No. 3 operativ verknüpft ist.

24. Organismus gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß er gegenüber dem Wildtyp der Gattung Ashbya ATCC 10895 zu einer verbesserten Riboflavin-Produktion fähig ist.

25. Verwendung eines Organismus gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24 zur verbesserten Herstellung von Riboflavin.

26. Verwendung wenigstens eines Transkriptions-Terminators gemäß einem der Ansprüche 10-15 zur Herstellung eines Produktionsorganismus zur verbesserten Herstellung von Riboflavin.

27. Verwendung wenigstens eines Transkriptions-Terminators gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15 zur Erhöhung der Transkriptionsrate von Genen, die an der Riboflavin-Produktion beteiligt sind.