DE19800899A1

DE19800899A1 - Oligoliganden mit Bindungsvermögen etc.

Info

Publication number: DE19800899A1
Application number: DE1998100899
Authority: DE
Inventors: Alexander Dr Gasch; Douglas Friday; Kornelia Dr Berghof; Lutz Dr Mueller-Kuhrt
Original assignee: Biotecon GmbH Gesellschaft fuer Biotechnologische Entwicklung und Consultimg mbH
Current assignee: Biotecon Therapeutics GmbH
Priority date: 1998-01-13
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 1999-07-15
Also published as: WO1999036430A1; DE19980033D2; AU2616399A

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein System, das aus molekularen Monoliganden besteht, die durch in vitro Selektion gegen kleine biologische Moleküle (Bausteine) hergestellt werden. Diese Monoliganden werden nachfolgend miteinander verknüpft, um kombinatorische Bibliotheken von Oligoliganden zu schaffen. Solche Bibliotheken können für die Identifizierung von Affinitätsliganden zur Aufreinigung von Makromolekülen sowie für die Identifizierung von neuartigen, therapeutisch oder diagnostisch einsetzbaren Substanzen verwendet werden. Der Vorteil solcher Bibliotheken besteht darin, daß das Makromolekül nicht in reiner Form vorhanden sein muß, um geeignete Oligoliganden mit gewünschter Affinität oder Aktivität herzustellen bzw. zu identifizieren. Deshalb ist es möglich, Liganden zu fast jeder makromolekularen Zielsubstanz zu erhalten, auch wenn diese unbekannt ist.

Definitionen

In der vorliegenden Patentanmeldung werden die folgenden Begriffe durchgehend verwendet wie hier beschrieben:

Bausteine oder Bausteinmoleküle sind die einzelnen molekularen Einheiten (Monosaccharide, Aminosäuren, Nucleotide, Fettsäuren) sowie solche Einheiten in modifizierter Form (z. B. glykosyliert, phosphoryliert, acetyliert, sulfonyliert oder methyliert), aus denen größere biologische Moleküle (nachstehend: Makromoleküle) gebildet werden, beispielsweise Kohlenhydrate, Proteine, Glykoproteine, DNA/RNA/Nucleinsäuren, Fette. Bausteine können auch kurze oligomere Moleküle sein, wie z. B. Dimere oder Trimere etc.

Monomere sind einzelne Bausteinmoleküle. Oligomere sind die Produkte, wenn zwei (Dimer), drei (Trimer) oder mehrere Bausteinmoleküle durch klassenspezifische Bindungen (z. B. Peptidbindung bei Aminosäuren) miteinander verknüpft werden. Oligomere sind auch Moleküle, bei denen Bausteinmoleküle verschiedener Klassen miteinander verknüpft sind (z. B. glykosyliertes Peptid).

In vitro Selektion ist ein Prozeß, durch den aus einer komplexen Mischung Moleküle mit bestimmten Eigenschaften relativ schnell isoliert werden können. Dazu muß es möglich sein, Moleküle mit einer erwünschten Eigenschaft von anderen Molekülen ohne die erwünschte Eigenschaft zu trennen. Einige Methoden für die in vitro Selektion von Molekülen mit besonderen Eigenschaften sind beschrieben.

Eine Parent-Library ist eine Mischung von Liganden isoliert durch in vitro Selektion gegen ein einzelnes Bausteinmolekül. Eine Parent-Library kann aus mehreren Liganden bestehen, die die gewünschte Aktivität zeigen, oder im Extremfall aus einem einzelnen Liganden mit hoher Affinität oder Aktivität.

Ein Makromolekül ist ein größeres Molekül, das aus den o.g. Bausteinen besteht und in der Regel eine biologische Funktion hat (z. B. Enzym, Receptor, Erbinformationsträger, strukturelle Komponente, Energiequelle).

Ein Oligonucleotid kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es 10 bis 250 und vorzugsweise 20 bis 120 Nucleotide lang ist.

Ferner kann ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet sein, daß es einzelsträngig ist oder einen komplementären Strang aufweist.

Ferner kann ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet sein, daß es

i) als DNA oder
ii) als RNA oder
iii) als PNA vorliegt,

wobei das Oligonucleotidmolekül gegebenenfalls in einer für analytische Nachweisverfahren, insbesondere auf Basis von Hybridisierung und/oder Amplifizierung, in an sich bekannter Weise modifiziert oder markiert ist.

Ferner kann ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet sein, daß es sich um ein modifiziertes oder markiertes oder zusätzlich markiertes Nucleinsäuremolekül handelt, das in einer für analytische Nachweisverfahren an sich bekannten Weise eine oder mehrere radioaktive Gruppen, farbige Gruppen, fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an fester Phase, Gruppen für die Aufnahme in Zellen, Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere für enzymatische Reaktion, vorzugsweise mit Hilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen, und/oder anderweitige an sich bekannte modifizierende oder modifizierte Gruppen nucleinsäureähnlichen Aufbaus aufweist.

Aptamere sind in vitro selektionierte Oligonucleotide, die (aufgrund ihrer Sekundärstruktur) eine gewünschte Aktivität aufweisen. Diese Aktivität kann z. B. die Affinität zu einem Zielmolekül, die Inhibition eines Enzyms oder aber enzymatische Aktivität sein.

Ein Monoligand ist ein Ligand, der aus einem einzelnen Molekül einer Parent-Library besteht und Affinität zu einem Bausteinmolekül aufweist. Ein Monoaptamer ist ein Monoligand, der aus einem Oligonucleotidmolekül besteht. Zwei oder mehrere Monoliganden können durch verschiedene Methoden miteinander verknüpft werden, um einen Oligoliganden zu produzieren. Falls der Oligoligand aus Aptamer-Molekülen besteht, handelt es sich um ein Oligoaptamer. Methoden für die Schaffung von Oligoliganden bzw. Oligoaptameren sind z. B.:

1) der Einbau komplementärer Basen am 5' Ende eines Aptameres und am 3' Ende des anderen Aptameres, welche eine Hybridisierung der beiden Aptamere erlauben,
2) der Einbau von Schnittstellen für Restriktionsenzyme, die komplementäre Enden produzieren, wodurch die Ligation der doppelsträngigen Aptamere nach Restriktionsspaltung möglich ist,
3) der Einbau von chemischen Gruppen an den Enden der Monoliganden, welche eine direkte oder indirekte Verknüpfung der Monoliganden erlauben, und
4) eine direkte Fusion während der Synthese der Monoliganden.

Um einen bestimmten Abstand zwischen den Domänen eines Oligoliganden zu erreichen, kann ein Spacer-Molekül zwischen die einzelnen Monoliganden integriert werden. Dies kann eine lineare oder verzweigte Kette von Molekülen sein, welche die entsprechenden Gruppen an den Enden trägt, um modifizierte oder unmodifizierte Liganden in kovalenter oder nicht kovalenter Form zu binden. Durch eine Variation der Flexibilität des Spacer-Moleküls kann eine zusätzliche Variabilität der Eigenschaften des Oligoliganden erreicht werden.

Die Eigenschaften der Parent-Libraries und der Methoden, mit denen diese miteinander verknüpft werden, entsprechen denen der Kombinatorik. Durch die Anwendung kleiner Bausteine für in vitro Selektion entstehen Bibliotheken von Monoliganden, die beliebig miteinander kombiniert werden können, um Oligoliganden mit neuen Spezifitäten zu schaffen.

Hintergrund

Aus US-A-5 637 459 bzw. WO-A-96/04403 ist es bekannt, Liganden gegen ein erstes und ein zweites Zielmolekül oder Liganden gegen verschiedene Epitope desselben Zielmoleküls jeweils in Gegenwart der Zielmoleküle zu selektionieren und anschließend zu verknüpfen. Ferner ist aus Science, 278 (1997) 497-499 bekannt, Liganden für Epitope desselben Zielmoleküls zu selektionieren und in Gegenwart des Zielmoleküls miteinander zu verknüpfen.

Affinitätsliganden sind in mehreren Bereichen einsetzbar: als spezifische Liganden bei der Affinitätschromatographie, bei Bindungsstudien sowie diagnostischen Tests oder als therapeutische Wirkstoffe. Solche Liganden zeigen hohe Spezifität zu ihrer jeweiligen Zielsubstanz oder Gruppe von Zielsubstanzen. Weit verbreitete Liganden sind z. B. Cofaktoren, Substratanaloga oder (monoklonale) Antikörper.

Letztere erkennen häufig kurze Sequenzen von Aminosäuren an der Proteinoberfläche (Epitope). Dies ermöglicht die Verwendung von Oligopeptiden als Immunogene für die Herstellung von Antikörpern gegen Proteine, welche die jeweilige Peptidsequenz enthalten. Die hier beschriebene Erfindung beruht auf einem ähnlichen Prinzip, wobei zunächst Liganden gegen verschiedene Bausteine in vitro durch eine der folgenden Methoden selektioniert und nachfolgend miteinander kombiniert werden:

1. "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Evolution" (SELEX) (Tuerk, C. & Gold, L.; 1990): Liganden für fast alle mögliche Zielsubstanzen (z. B. Proteine, Aminosäuren, Peptide, Nucleotide, Kohlenhydrate) (L. Gold; 1995) werden aus einer Ausgangsmischung von 10¹³-10¹⁵ hoch degenerierten einzelsträngigen Nucleinsäuren oder Nucleinsäureanaloga (ca. 20-100 degenerierte Basen) durch Bindung an eine Zielsubstanz selektioniert. Nach geeigneten Waschschritten werden gebundene Moleküle eluiert und vervielfältigt. Dies erfolgt mittels PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) im Falle von DNA Liganden bzw. RT-PCR (Reverse Transkriptase - PCR) im Falle von RNA Liganden. Die PCR wird durch konstante Primerbindungsstellen ermöglicht, welche die randomisierten Basen flankieren. Einer von diesen flankierenden Bereichen kann einen Promotor beinhalten, um mittels in vitro Transkription mit z. B. bakteriellen oder viralen RNA- Polymerasen die Übersetzung in einzelsträngige RNA zu ermöglichen. Alternativ kann die amplifizierte doppelsträngige DNA (dsDNA) z. B. durch asymmetrische PCR oder durch Immobilisierung eines Stranges und anschließende Denaturierung in einzelsträngige DNA (ssDNA) konvertiert werden. Nach mehreren Runden Selektion und Amplifikation unter Bedingungen steigender Stringenz, dominieren solche Oligonucleotide in der Mischung, die eine hohe Affinität zur Zielsubstanz bzw. eine erwünschte Aktivität aufweisen. Durch zusätzliche "Counter Selection" mit unerwünschten Zielmolekülen z. B. der Matrix, an der das Zielmolekül immobilisiert ist, mit nah verwandten Zielmolekülen oder mit den "falschen" chemischen Gruppen (wie z. B. α-Amino Gruppe einer Aminosäure) können Sequenzen entfernt werden, die unerwünschte Affinität zu diesen Gruppen/Zielmolekülen aufweisen. Individuelle Aptamere können schließlich durch Klonierung isoliert und charakterisiert werden.
Ein großes Problem bei der Anwendung von Oligonucleotidliganden in biologischen Flüssigkeiten ist, daß sie in manchen Fällen (z. B. in Blut) sehr schnell von Nucleasen abgebaut werden. Für die Nutzung von Oligonucleotidliganden in Nuclease-haltigen Flüssigkeiten ist es daher vorteilhaft, wenn diese vor Nucleaseabbau geschützt sind. Dies kann erreicht werden durch die Integrierung chemisch modifizierter Nucleotide (z. B. mit 2'- Amino-, 2'-Fluoro- oder 2'-O-Methyl-Gruppen) (Jellinek, D; 1995; Eaton, B & Picken, W; 1995). Eine interessante Alternative besteht in der Selektion von Aptameren gegen natürlich nicht vorkommende oder nur vereinzelt vorkommende optische Isomere von Zielmolekülen (z. B. D-Aminosäuren, L-Zucker, L-Nucleotide) und der nachfolgenden Synthese der entsprechenden L-Aptamere. Diese sogenannten Spiegelmere binden die natürlichen Zielsubstanzen und sind erheblich stabiler in biologischen Flüssigkeiten (Nolte, A.,Klußmann, S., Bald, R., Erdmann, V. & Fürste, J; 1996).
2. Screening von Peptidbibliotheken:
a) Synthetische Peptidbibliotheken: Oligopeptide von einer Länge von ca. 6-7 Aminosäuren werden durch "Split Synthesis" synthetisiert (Furka, A., Sebestyen, F., Asgedum, M. & Dibo, G; 1988). Dabei wird die Synthese mit z. B. 20 parallelen Ansätzen gestartet, wobei in jedem dieser Ansätze mit einer anderen Aminosäure begonnen wird. Jeder dieser Syntheseansätze wird wiederum in z. B. 20 Syntheseansätze geteilt und die Synthese mit jeweils einer anderen der 20 Aminosäuren fortgeführt. Dies wird wiederholt, bis die gewünschte Länge (X) erreicht wird. Eine solche Bibliothek besteht aus 20^X Peptidsequenzen. Die Peptide können entweder auf einer Matrix (z. B. Beads) oder in einer Lösung auf Affinität oder Aktivität gescreent werden und aktive Peptide durch Peptidsequenzierung identifiziert werden. Eine Alternative ist die "Synthetic Peptide Combinatorial Library" (SPLC) Methode (Houghten, R., Pinilla, C. et al; 1991). In diesem Fall wird eine Bibliothek von Peptiden mit einer Länge von ca. 6-7 Aminosäuren synthetisiert, wobei die Sequenz der ersten zwei Aminosäuren definiert ist. Diese z. B. 400 separaten Peptidmischungen - jede mit einer unterschiedlichen Dipeptidsequenz am NH₂-Terminus - werden auf eine Affinität oder Aktivität durchmustert. Die Peptidmischungen, welche die höchsten Aktivitäten zeigen, werden nun an der Position der dritten Aminosäure variiert, wobei die restlichen Aminosäuren wiederum nicht festgelegt werden. Der Prozeß wird wiederholt, bis die Aminosäuresequenz des Peptides definiert ist.
b) "Phage Display Libraries": Peptide werden auf der Oberfläche von Bakteriophagen exprimiert (Scott, J. & Smith, G.: Science; 1990). Eine kurze randomisierte DNA Sequenz kodierend für ca. 6 bis 7 Aminosäuren oder ein längeres Peptid oder Protein wird am Ende des "minor coat- Protein" Lokus (Gen III) eines filamentösen Phagen eingebaut. Das entsprechende Peptid wird als Teil des Hüllproteins exprimiert. Jeder Phage in einer solchen Bibliothek exprimiert ein definiertes Peptid. Die exprimierten Peptide können auf Affinität oder Aktivität gescreent werden, und die Phagen mit der erwünschten Eigenschaft können isoliert werden. Um die Peptidsequenz(en) zu bestimmen, wird DNA aus den Phagen isoliert und anschließend sequenziert. Nach Übersetzung der DNA-Sequenz in Aminosäure-Sequenz kann das freie Peptid für andere Anwendung synthetisiert werden oder es kann auf der Oberfläche des Phagen direkt verwendet werden.

Beschreibung der Erfindung

Gemäß einer Ausführungsform wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit Bindungsvermögen an Makromoleküle gegebenenfalls unbekannten Aufbaus aus Bausteinen gelöst, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch:

a) Selektion von Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein,
b) Selektion von Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein,
c) Kombination und variable Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b),
d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf Bindung an ein oder mehrere Makromolekül (e), gegenüber denen die Oligoliganden Bindungsvermögen besitzen sollen, und
e) Isolation des (der) bindenden Oligoliganden nach d),

wobei das oder die Makromoleküle bei den Stufen a) bis c) nicht zugegen sind.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch:

a) Selektion von Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein,
b) Selektion von Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein,
c) Kombination und variable Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b),
d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf gewünschte biologische Aktivität, wie Stimulation oder Inhibition von Zellteilung oder Inhibition einer enzymatischen Aktivität, und
e) Isolation des (der) Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität.

Bei den Liganden kann es sich um RNA-Oligonucleotide oder einzelsträngige DNA-Oligonucleotide handeln, wobei die Liganden durch SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) gewonnen sein können. Ferner kann es sich bei den Liganden um Peptide handeln, die durch

a) chemische Synthese und
b) Expression auf der Oberfläche von Phagen (Phage Display) oder auf der Oberfläche von Bakterien gewonnen worden sind.

Bei Bausteinen kann es sich um Aminosäuren, Dipeptide, Tripeptide, Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, Mononucleotide, Dinucleotide, Trinucleotide oder Fettsäuremoleküle handeln.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein oder mehrere Liganden oder Oligoliganden, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gewinnbar sind.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein oder mehrere Liganden oder Oligoliganden, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und nachfolgende Herstellung in größerer Menge gewinnbar sind, insbesondere durch

a) chemische Synthese,
b) in vitro Transkription mittels gereinigter RNA-Polymerasen,
c) in vitro Amplifikation, insbesondere mittels PCR, LCR und/oder 3SR, und/oder
d) Klonierung, insbesondere in E. coli.

Erfindungsgemäße Liganden oder Oligoliganden können dadurch gekennzeichnet sein, daß es sich um modifizierte oder markierte oder zusätzlich modifizierte oder markierte Nucleinsäuremoleküle oder Peptidmoleküle handelt, die in einer für analytische Nachweisverfahren an sich bekannten Weise eine oder mehrere radioaktive Gruppen, farbige Gruppen, fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an fester Phase, Gruppen für die Aufnahme in Zellen, Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere für eine enzymatische Reaktion, vorzugsweise für eine Reaktion mit Hilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen, und/oder anderweitige an sich bekannte modifizierende oder modifizierte Gruppen nucleinsäureähnlichen Aufbaus aufweisen.

Bei den erfindungsgemäßen Liganden oder Oligoliganden kann es sich um PNA handeln. Die erfindungsgemäßen Liganden oder Oligoliganden können vor Nucleaseabbau geschützt sein, insbesondere durch Einbau von modifizierten Nucleotiden, die insbesondere durch 2'-Amino-, 2'-Fluoro- oder 2'-O- Methylgruppen modifiziert sind.

Erfindungsgemäße Liganden oder Oligoliganden können ganz oder teilweise aus L-, RNA oder L-DNA bestehen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Oligoliganden bei der Affinitätschromatographie mit den Schritten:

a) Immobilisierung der Oligoliganden an einer Gelmatrix,
b) Kontakt einer Substanzmischung mit den immobilisierten Oligoliganden,
c) Entfernen unspezifisch gebundener Substanzen und
d) Elution der gebundenen Substanzen.

Ferner betrifft eine Ausführungsform die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Oligoliganden zum Nachweis von Makromolekülen unbekannten Aufbaus aus Bausteinen, wobei man die Oligoliganden und Makromoleküle inkubiert und nach Waschschritten gebundene Oligoliganden detektiert. Dabei kann man die Makromoleküle in Zellextrakten oder in Gewebeschnitten (in vitro) oder an/in lebenden Zellen, Geweben oder Organismen (in vivo) detektieren.

Ferner betrifft eine Ausführungsform die Verwendung von erfindungsgemäßen Oligoliganden für therapeutische Zwecke.

Eine weitere Ausführungsform betrifft die therapeutische Verwendung von erfindungsgemäßen Oligoliganden mit antibakterieller, antiviraler oder cytostatischer Wirksamkeit.

Schließlich betrifft eine Ausführungsform die Einleitung von erfindungsgemäßen Oligoliganden in infizierte Zellen, Gewebe oder Organismen zur Infektions- oder Tumorbekämpfung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind also kombinatorische Bibliotheken von oligomeren Molekülen, die eine Affinität zu einer oder mehreren Zielsubstanz(en) bzw. eine gewünschte biologische, biochemische oder chemische Aktivität aufweisen. Um eine solche Bibliothek zu schaffen, werden zunächst Monoliganden gegen Bausteinmoleküle (z. B. Monosaccharide, Aminosäuren, Nucleotide sowie kurze Oligomere) in vitro selektioniert. Zwei oder mehrere der einzelnen selektionierten Monoliganden werden nachfolgend miteinander verknüpft, um neue Spezifität oder Aktivität zu schaffen. Die Oligoliganden werden schließlich auf die neue Spezifität bzw. Aktivität getestet:

1. Isolation von Affinitätsliganden für Bausteinmoleküle
Zunächst werden Bausteinmoleküle (z. B. Monosaccharide, glykosylierte Aminosäuren, Nucleotide sowie kurze Oligomere) an einer Festphase immobilisiert, optional unter Verwendung eines geeigneten Spacermoleküls. Geeignete Matrices sind z. B. aktivierte Sepharose Beads oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (MTP). Die Bausteine werden durch ihre chemische Gruppen, z. B. -OH, -NH₂, -COOH und/oder -PO₃, so gebunden, daß z. B. die Seitenketten von Aminosäuren oder die Basen von Nucleotiden den potentiellen Liganden zugänglich sind. Dadurch wird die Chance erhöht, daß die Liganden für den jeweiligen Baustein spezifisch sind und, daß sie auch dann an den jeweiligen Baustein binden, wenn dieser Bestandteil eines oligomeren- oder Makro-Moleküls ist. Liganden werden aus einer Mischung von degenerierten einzelsträngigen Oligonucleotiden (SELEX) bzw. aus einer Mischung der auf der Oberfläche von Phagen exprimierten Peptide (Phage Display) oder aus einer Mischung von synthetisch hergestellten Peptiden ("Synthetic Peptide Combinatorial Library") mit den immobilisierten Bausteinen in vitro selektioniert.
2. Vortests
Ein optionaler Zwischenschritt besteht in der Überprüfung, welche der Liganden gegen Bausteine bereits signifikante Affinität zum jeweiligen Zielmakromolekül aufweisen und/oder eine erwünschte Aktivität aufweisen. Der Test kann z. B. in einer MTP oder auf einer Membran durchgeführt werden: wenn das Makromolekül in reiner Form vorhanden ist, wird es z. B. in den Vertiefungen einer MTP bzw. als Spot auf einer Membran immobilisiert. Monoliganden, die mit einer geeigneten Markierung (wie z. B. radioaktive, farbige, fluoreszierende Gruppen oder Gruppen, die direkt oder indirekt einen enzymatischen Nachweis erlauben) versehen sind, werden mit der immobilisierten Substanz inkubiert. Nach einem Waschschritt werden gebundene Liganden über die Markierung detektiert. Wenn die Zielsubstanz nicht in reiner Form verfügbar ist, sondern nur in einer Mischung, wie z. B. einem Proteinextrakt, kann der Extrakt zunächst in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine Membran geblottet werden. Inkubation und Detektion erfolgen dann wie oben.
3. Zwei oder mehrere der o.g. Monoliganden werden miteinander verknüpft. Dabei werden die Klassen von Monoliganden verwendet, die die jeweiligen Makromoleküle binden (z. B. Liganden gegen Aminosäuren für Proteine oder Polypeptide als Makromoleküle). Es besteht jedoch ebenso die Möglichkeit, Monoliganden gegen Bausteine unterschiedlicher Klassen miteinander zu verknüpfen. Hierdurch können Oligoliganden gegen z. B. modifizierte Proteine geschaffen werden (z. B. gegen myristoylierte, glykosylierte oder mit Nucleinsäuren komplexierte bzw. kovalent verknüpfte Proteine). Die Verknüpfung könnte nach einer der folgenden Methoden erfolgen:
- a) Klonierung (bei Aptameren): Das DNA Produkt von Aptamer 1 enthält eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 1 (z. B. Bam HI) in dem Bereich von einer der beiden flankierenden Primerbindungsstellen und eine Schnittschnelle für Restriktionsenzym 2 (z. B. Hind III) in dem Bereich der anderen flankierenden Primerbindungsstellen. Aptamer 2 enthält ebenfalls eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 (z. B. Hind III) in einer flankierenden Region und eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 3 (z. B. Eco RI) in der anderen flankierenden Region. Die Aptamere werden dann mit dem Fachmann geläufigen Methoden (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989) an der Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 miteinander fusioniert und in einen Plasmidvektor ligiert. Große Mengen des Diaptamers können dann durch Vermehrung des Plasmides in z. B. Escherichia coli, Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen und Denaturierung der inserierten DNA gewonnen werden. Die Schaffung von Oligoaptameren durch Klonierung hat den Vorteil, daß die Sequenz der Monoaptamere nicht bekannt sein muß, und daß bei der Klonierung leicht Spacer-Sequenzen variabler Länge und Sequenz eingefügt werden können.
- b) Klonierung (bei Peptidliganden): Wenn die Aminosäuresequenzen von zwei oder mehr Monoliganden bekannt ist, können diese in DNA-Sequenz übersetzt werden und in einer Expressionskassette auf beliebige Weise miteinander fusioniert werden. Diese Vorgehensweise erlaubt die Expression großer Mengen der jeweiligen Fusionsproteine sowie das Einfügen von Spacer-Sequenzen variabler Länge und Sequenz
- c) Chemische Synthese: Zwei oder mehr Monoliganden, deren Sequenz vorher bestimmt wird, können direkt durch chemische Synthese, unter Beibehaltung der klassenspezifischen Bindungen (z. B. Phosphodiesterbindung bei Aptameren), miteinander fusioniert werden. Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, daß direkt bei der Synthese Gruppen eingefügt werden können, welche eine direkte oder indirekte Aufreinigung, Detektion oder Kopplung (an z. B. cytotoxische Agentien) des resultierenden Oligoliganden ermöglichen. Wie bei a) und b) besteht zusätzlich die Möglichkeit der Einführung von Spacer-Molekülen variabler Größe und Sequenz.
- d) Chemische Kopplung: Bei der Synthese der Monoliganden werden - vorzugsweise an den Enden der Monoliganden - reak tive Gruppen eingeführt, die über einen mindestens bifunktionalen Spacer die kovalente Verknüpfung von zwei oder mehreren Monoliganden im Anschluß an die Synthese ermöglichen. Alternativ können zwei oder mehr Monoliganden direkt mit einem mindestens bifunktionalen Spacer sequentiell eingesetzt werden. Beide Verfahren resultieren in der allgemeinen Struktur; vgl. das folgende Schema.
  Diese Synthesen können in Lösung oder an fester Phase erfolgen und erlauben nach Standardtechniken die kombinatorische Synthese definierter Konjugate in hoher Diversität.
  Diese chemische Kopplung hat den Vorteil, daß Monoliganden auch über nichtklassenspezifische Bindungen miteinander verknüpft werden kann, und daß gleichzeitig eine immense Vielfalt verschiedener Spacer-Moleküle eingeführt werden kann. Letzteres wiederum resultiert in einer unterschiedlichen Orientierung und Entfernung der miteinander verknüpften Monoliganden. Zusammen mit der Flexibilität des eingeführten Spacer-Moleküls sowie dessen Polyfunktionalität sind dies wichtige Parameter, mit denen die Spezifität des resultierenden Oligoliganden moduliert werden kann.
4. Die Mono- oder Oligoliganden werden anschließend auf die Bindung zu Zielsubstanzen bzw. auf Aktivität z. B. in Form eines Mikrotiterplatten-Tests getestet. Einzelne Mono- oder Oligoliganden werden z. B. jeweils in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte immobilisiert (z. B. mittels Biotin/Streptavidin) und mit einer Mischung von Makromolekülen (z. B. einem Zellextrakt) inkubiert. Das gebundene Zielmolekül wird durch einen spezifischen Aktivitätstest nachgewiesen. Eine Voraussetzung eines solches Ansatzes ist, daß ein geeigneter Test existieren muß, mit dem das gesuchte Makromolekül nachgewiesen werden kann. Durch einen solchen Test können Mono- oder Oligoliganden identifiziert werden, welche sich z. B. als Liganden für die affinitätschromatographische Aufreinigung eines Zielmakromoleküls eignen.
Alternativ kann auch direkt die Bindung bzw. Inhibition von zumindest partiell aufgereinigten Zielmakromolekülen untersucht werden. Hierzu werden z. B. ein Zielmakromolekül an einer Festphase immobilisiert und diejenigen Mono- bzw. Oligoliganden detektiert (z. B. über eingeführte Gruppen, siehe Abschnitt 2), die die höchste Affinität zum Zielmakromolekül zeigen, bzw. die größte inhibitorische Wirkung auf das Zielmakromolekül ausüben.
Alternativ können eine oder mehrere Mono- oder Oligoliganden auch mittels eines in vivo-Systems auf ihre modulierende Eigenschaft von biologischen Prozessen untersucht werden. So könnte z. B. eine Population verschiedener Mono- oder Oligoliganden systematisch mittels geeigneter Testsysteme auf cytostatische und antibakterielle Eigenschaften untersucht werden. Mono- oder Oligoliganden mit schwacher Aktivität in einem solchen Testsystem könnten über die oben geschilderten Strategien miteinander kombiniert werden, bis ein Oligoligand mit ausreichender Aktivität/Spezifität gefunden wird.

In der hier beschriebenen Erfindung werden für die in vitro Selektion von Liganden monomere Bausteine von Makromolekülen eingesetzt, z. B. Aminosäuren, Monosaccharide, Nucleotide bzw. kurze Oligomere (z. B. Dimere, Trimere etc.) sowie diese in modifizierter Form (z. B. glykosylierte, sulfonylierte, acetylierte Aminosäuren, phosphorylierte Zucker, methylierte Nucleotide). Die Komplexität der möglichen Ligandenbibliotheken steht im Zusammenhang mit der Größe des Zielmoleküls. So gibt es z. B. 20 natürliche Aminosäuren aber bereits 400 (20²) Dipeptide. Wenn also z. B. das Ziel eine umfangreiche Kollektion von proteinbindenden Liganden unterschiedlicher Spezifität ist, sollte die bevorzugte Strategie die Selektion von Liganden gegen Monomere sein. Aus der begrenzten Anzahl von Monoliganden (max. 20) kann durch unterschiedliche kovalente Verknüpfung bzw. durch Einführung variabler Spacer-Moleküle eine immense Vielfalt an Oligoliganden mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten gewonnen werden. Gegenüber der Alternativstrategie - der Selektion von Liganden gegen z. B. Oligopeptide - ist der Arbeitsaufwand stark reduziert.

Die SELEX Methode für die Herstellung von Oligonucleotidliganden mit hoher Affinität zu Zielmolekülen ist in den Patenten WO 91/19813 und US 5270163, beide mit dem Titel "Nucleic Acid Ligands", beschrieben.

Methoden für die Herstellung von Nuclease-resistenten Oligonucleotiden durch den Einbau von modifizierten Nucleotiden (z. B. von Nucleotiden, die an der 2' oder 5' Position chemisch modifiziert sind) sind in der Patentanmeldung US 08/117,991 mit dem Titel "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides" beschrieben.

Patent US 5637459 und Patentanmeldung WO 96/04403, beide mit dem Titel "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX", beschreiben Methoden, bei denen Oligonucleotidmoleküle von zwei oder mehr Parent-Libraries gegen bekannte Zielmoleküle gemischt und miteinander verknüpft werden, um eine neue Bibliothek zu produzieren. Die chimären Moleküle dieser Bibliotheken binden gleichzeitig entweder zwei Epitope eines Zielmoleküls oder zwei Epitope in verschiedenen Zielmolekülen. Die hier vorliegende Erfindung unterscheidet sich von diesen wie folgt:

- Die einzelnen mittels SELEX oder mittels anderer Verfahren produzierten Liganden werden durch Selektion an Bausteine von Makromolekülen selektioniert. Solche Liganden binden extrem unspezifisch an die jeweiligen Makromoleküle und die Bindungsstellen können nicht als "Epitope" bezeichnet werden.
- Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Liganden für fast jedes Makromolekül herzustellen, auch zu solchen, die noch nicht vollständig charakterisiert oder isoliert sind. Die Monoliganden der Parent Libraries sind relativ unspezifisch und die Spezifität wird erst erreicht durch die Kombinatorik der Oligoliganden.
- Nachdem die einzelnen Liganden verknüpft sind, wird keine weitere Selektion, wie z. B. durch SELEX oder andere Verfahren, durchgeführt. Hingegen dienen z. B. die chimären Aptamere in der o.g. Erfindung als Quelle neuer Komplexität in weiteren SELEX Runden.

Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Technik zur Identifizierung von hochaffinen Molekülen. Der größte Vorteil besteht darin, daß Liganden für jede bzw. fast jede makromolekulare Zielsubstanz hergestellt werden können, auch wenn diese Zielsubstanz bisher nicht charakterisiert wurde oder nicht in reiner Form vorliegt. Zusätzlich ist die Wahrscheinlichkeit, verglichen mit anderen kombinatorischen Bibliotheken, deutlich erhöht, daß man Liganden mit Affinität zu der jeweiligen Makromolekülklasse findet. Dies ist vor allem dann von Bedeutung, wenn in biologischen Tests nach Substanzen mit einer biologischen Aktivität gesucht wird, da die Wahrscheinlichkeit, Substanzen mit den gewünschten Eigenschaften zu finden, stark erhöht ist. Weiterhin läßt der modulartige Aufbau der beschriebenen Oligoliganden vermuten, daß auch gegen solche Epitope Affinitätsliganden gefunden werden können, die mit konventionellen Methoden nicht zugänglich sind.

Beispiel 1 Isolation von Aptameren mittels SELEX

Aptamere werden gegen verschiedene Bausteine selektioniert:
Zielmoleküle sind: Aminosäuren und modifizierte (z. B. glycosylierte, phosphorylierte) Aminosäuren (wie z. B. Tyrosin, Phosphotyrosin, Glucothreonin), Zucker (Glucose, Ribulosephosphat), Nucleotide (z. B. Thymine, GTP, Methyl-GTP) sowie Oligomere solcher Bausteine.

Die monomeren oder oligomeren Bausteine werden an einer Gelmatrix (z. B. Sepharose) immobilisiert und in eine Säule gegeben. Nach Auftragung von degenerierten, einzelsträngigen Oligonucleotiden auf die Säule wird intensiv mit Bindungspuffer (z. B. 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM CaCl₂ 1 mM MgCl₂, pH 7,2) gewaschen, und die gebundenen Oligonucleotide werden (z. B. mit freier Zielsubstanz) eluiert. Falls es sich bei den Oligonucleotiden um RNA-Moleküle handelt, werden diese mit Reverse Transkriptase in cDNA umgewandelt. Die eluierte ssDNA oder cDNA wird mittels PCR amplifiziert und das dsDNA Produkt wird entweder in ssDNA oder RNA konvertiert. Der Prozeß wird wiederholt, bis eine Affinität von Kd < 10^-4 M erreicht ist.

Beispiel 2 Schaffung von Liganden höherer Affinität/Spezifität durch Verknüpfung zweier oder mehrerer Monoliganden gegen monomere oder oligomere Bausteine

Wenn das Zielmakromolekül ein Protein ist, werden z. B. Aptamere gegen monomere oder oligomere Aminosäuren durch Ligation in eine Plasmidvektor miteinander verknüpft. Das DNA Produkt von Aptamer 1 enthält eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 1 (z. B. Bam HI) in dem Bereich einer der beiden flankierenden Primerbindungsstellen und eine Schnittschnelle für Restriktionsenzym 2 (z. B. Hind III) in dem Bereich der anderen flankierenden Primerbindungsstelle. Aptamer 2 enthält ebenfalls eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 (z. B. Hind III) in einer flankierenden Region und eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 3 (z. B. Eco RI) in der anderen flankierenden Region. Die Aptamere werden dann mit dem Fachmann geläufigen Methoden an der Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 miteinander fusioniert und in einen Plasmidvektor ligiert. Große Mengen des Diaptamers können dann durch Spaltung des Plasmides und Denaturierung der inserierten DNA gewonnen werden.

Die Mono- oder Oligoliganden werden anschließend auf die Bindung zu Proteinen in Form eines Mikrotiterplatten-Tests geprüft. Einzelne Mono- oder Oligoliganden werden jeweils in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte immobilisiert (z. B. mittels Biotin/Streptavidin) und mit einer Mischung von Makromolekülen (z. B. einem Zellextrakt) inkubiert. Das gebundene Zielmolekül wird durch einen spezifischen Aktivitätstest nachgewiesen. So können verschiedene Mono-, oder Oligoaptamere identifiziert werden, die hohe Affinität zum jeweiligen Zielprotein aufweisen.

Beispiel 3 Mono-, oder Oligoliganden als Liganden für die Affinitätschromatographie

Mono-, oder Oligoliganden werden an einer Matrix immobilisiert und für die Affinitätschromatographie verwendet. Die Aufreinigung der Makromoleküle erfolgt sequentiell. Eine partiell gereinigte oder ungereinigte Substanzmischung (z. B. ein Zellextrakt) wird aufgetragen. Gebundene Makromoleküle (z. B. Proteine) werden nach einem Waschschritt eluiert und auf ihre Aktivität und ihren Reinheitsgrad untersucht. Durch Anwendung weiterer Mono-, oder Oligoliganden, die unter Beispiel 2 identifiziert wurden, kann bei Bedarf ein oder mehrere weitere(r) Reinigungsschritt(en) des Makromoleküls erfolgen.

Beispiel 4 Diagnostische Anwendungen: Spezifischer Nachweis aus einem Subset von phosphorylierten Proteinen

Moleküle von einer Parent-Library von Liganden gegen Phosphotyrosin werden mit denen von einer Parent-Library von Liganden gegen andere mono- oder oligomere Aminosäuren verknüpft. Diese Diliganden werden z. B. mit einem Zellextrakt kontaktiert. Durch eine Markierung (z. B. direkte oder indirekte Markierung mit z. B. alkalischer Phosphatase) des Di- oder Oligoliganden kann die Anwesenheit des Zielmoleküls nachgewiesen werden.

a) Die Probe z. B. ein Zellextrakt wird in einem SDS- Polyacrylamidgel getrennt und nachfolgend auf eine Membran geblottet.
b) Die Membran wird mit dem markierten Di- oder Oligoligand inkubiert.
c) Die Bindung des Di- oder Oligoligand an Proteine auf der Membran wird durch eine geeignete Detektionsreaktion (je nach eingeführter Markierung, z. B. Lumineszenz) dargestellt.

Beispiel 5 Antitumorale Anwendungen

Kombinatorische Oligoliganden werden isoliert, die eine Affinität zu einem Protein aufweisen, das eine Rolle in der Tumorentwicklung aufweist. Durch in vitro Screening der kombinatorischen Ligandbibliothek werden Moleküle isoliert, die an das Zielprotein binden und dieses möglicherweise auch inhibieren. So könnten identifizierte Mono- oder Oligoliganden bei der Tumorbekämpfung eingesetzt werden. Hierbei kann es sich um Rezeptoren oder Tumorantigene handeln (z. B. HER 2), intrazelluläre Proteine (z. B. Telomerase, Proteinkinasen), sekretierte Proteine (z. B. Matrix-Metalloproteinasen, angiogenetische Faktoren), die bei dem Tumorwachstum bzw. bei der Entstehung von Metastasen eine essentielle Rolle spielen. Burch Bindung der Di- bzw. Oligoliganden wird die Tumorzellproliferation bzw. Metastasierung inhibiert. Die geeigneten Di- bzw. Oligoliganden werden durch Screening von kombinatorischen Bibliotheken in in vitro Assays gewonnen z. B. in einem Proliferationsassay mit Tumorzellen oder in einem Enzymassay (Protease, Telomerase, Proteinkinase).

Beispiel 6 Antibiotische Tests an Bakterienzellen (Wachstumsinhibition) oder Viren

Zur Bekämpfung von bakteriellen und viralen Infektionen werden ebenfalls Di- bzw. Oligoliganden eingesetzt. Die Di- bzw. Oligoliganden binden an Oberflächenantigene von Bakterien oder Viren und blockieren so das Wachstum der Mikroorganismen bzw. die Bindung zu Wirtzellen. Viren binden an spezifische Rezeptoren und besitzen dafür geeignete Proteine. Durch Blockierung dieser Proteine läßt sich die Infektion verhindern. Zum Screening werden in Bindungsassays kombinatorische Ligandbibliotheken eingesetzt und bindende Di- bzw. Oligoliganden identifiziert. Diese Moleküle können dann zur Neutralisation der Mikroorganismen eingesetzt werden. Andere Di- bzw. Oligoliganden können durch Screening von Bibliotheken in Wachstumsassays gewonnen werden.

Literatur

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Jellinek, D; 1995: Biochemistry, 34, 11363-11372
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Houghten, R., Pinilla, C. et al; 1991: Nature, 354, 84-86
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Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 2^nd

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Furka, A., Sebestyen, F., Asgedum, M. & Dibo, G; 1988: Highlights of Mod. Biochem: Proceedings of the 14^th

Int. Congress of Biochemistry, 5, 47.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit Bindungsvermögen an Makromoleküle gegebenenfalls unbekannten Aufbaus aus Bausteinen, gekennzeichnet durch:

a) Selektion von Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein,
b) Selektion von Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein,
c) Kombination und variable Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b),
d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf Bindung an ein oder mehrere Makromolekül (e), gegenüber denen die Oligoliganden Bindungsvermögen besitzen sollen, und
e) Isolation des (der) bindenden Oligoliganden nach d), wobei das oder die Makromoleküle bei den Stufen a) bis c) nicht zugegen sind.

2. Ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität, gekennzeichnet durch:

a) Selektion von Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein,
b) Selektion von Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein,
c) Kombination und variable Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b),
d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf gewünschte biologische Aktivität, wie Stimulation oder Inhibition von Zellteilung oder Inhibition einer enzymatischen Aktivität und
e) Isolation des (der) Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität.

3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Liganden RNA Oligonucleotide sind.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Liganden einzelsträngige DNA Oligonucleotide sind.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Liganden durch SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) gewonnen werden.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Liganden Peptide sind, gewonnen durch

a) chemische Synthese oder
b) Expression auf der Oberfläche von Phagen (Phage Display) oder auf der Oberfläche von Bakterien.

7. Ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Aminosäuren sind.

8. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Dipeptide sind.

9. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Tripeptide sind.

10. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Monosaccharide sind.

11. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Disaccharide sind.

12. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Trisaccharide sind.

13. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Mononucleotide sind.

14. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Dinucleotide sind.

15. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Trinucleotide sind.

16. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Fettsäuremoleküle sind.

17. Ein oder mehrere Ligand(en) oder Oligoliganden, gewinnbar durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.

18. Ein oder mehrere Ligand(en) oder Oligoliganden, gewinnbar durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 und nachfolgende Herstellung in größerer Menge, insbesondere durch

19. Ein oder mehrere Ligand(en) oder Oligoliganden nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um modifizierte oder markierte oder zusätzlich modifizierte oder markierte Nucleinsäuremoleküle oder Peptidmoleküle handelt, die in einer für analytische Nachweisverfahren an sich bekannten Weise eine oder mehrere radioaktive Gruppen, farbige Gruppen, fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an fester Phase, Gruppen für die Aufnahme in Zellen, Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere für eine enzymatische Reaktion, vorzugsweise für eine Reaktion mit Hilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen, und/oder anderweitige an sich bekannte modifizierende oder modifizierte Gruppen nucleinsäureähnlichen Aufbaus aufweisen.

20. Ein oder mehrere Ligand(en) oder Oligoliganden nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um PNA handelt.

21. Ein oder mehrere Ligand(en) oder Oligoliganden nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er(sie) vor Nucleaseabbau geschützt ist (sind), durch Einbau von modifizierten Nucleotiden, die insbesondere durch 2'-Amino, 2'-Fluoro oder 2'-O-Methyl Gruppen modifiziert sind.

22. Ein oder mehrere Ligand(en) oder Oligoliganden nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er(sie) ganz oder teilweise aus L-RNA oder L-DNA besteht (bestehen).

23. Verwendung von einem oder mehreren Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22 bei der Affinitätschromatographie mit den Schritten:

a) Immobilisierung der Oligoliganden an einer Gelmatrix,
b) Kontakt einer Substanzmischung mit den immobilisierten Oligoliganden
c) entfernen unspezifisch gebundener Substanzen und
d) Elution der gebundenen Substanzen.

24. Verwendung von einem oder mehreren Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 zum Nachweis von Makromolekülen unbekannten Aufbaus aus Bausteinen, dadurch gekennzeichnet, daß Oligoliganden und Makromoleküle inkubiert werden und nach Waschschritten gebundene Oligoliganden detektiert werden.

25. Verwendung nach Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, daß Makromoleküle in Zellextrakten oder in Gewebeschnitten (in vitro) oder an/in lebenden Zellen, Geweben oder Organismen (in vivo) detektiert werden.

26. Verwendung der Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 für therapeutische Zwecke.

27. Therapeutische Verwendung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 mit antibakterieller Wirksamkeit.

28. Therapeutische Verwendung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 mit antiviraler Wirksamkeit.

29. Therapeutische Verwendung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 mit cytostatischer Wirksamkeit.

30. Einleitung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 in infizierte Zellen, Gewebe oder Organismen zur Infektions- oder Tumorbekämpfung.