DE19751575A1

DE19751575A1 - Mittel zur Therapie von Sehnenschäden bei Pferden, Verwendung dieses Mittels und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE19751575A1
Application number: DE19751575A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Dr Rapp
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 1999-05-27

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von Sehnen schäden bei Pferden sowie die Verwendung dieses Mittels und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Tendinitiden, also Sehnenschäden (Entzündungen, Faserrisse, u. a.), sind eine der häufigsten Ursachen von Lahmheiten bei Pferden. Die empfohlenen und in der Praxis auch eingesetzten Therapien sind so mannigfaltig wie bei keiner anderen Er krankung. Dies zeugt wiederum davon, daß es keine allgemein anerkannte Behandlungsform gibt. Das angestrebte Ziel der Therapie akuter Sehnenschäden ist die Wiederherstellung der Stabilität der defekten Sehnenstruktur und der Erhalt der Gleitfähigkeit der Sehne gegenüber den benachbarten anatomi schen Strukturen. In der Praxis findet sich als Endresultat eines ausgeheilten Sehnenschadens aber meist nur eine Über brückung des Defekts mit einem Narbengewebe, das sowohl quantitativ als auch qualitativ von gesundem Sehnengewebe abweichende Sehnenzellen und Kollagenfasern mit verminderter Belastbarkeit aufweist.

Ziel der Erfindung ist es, ein Mittel zur verbesserten Therapie von Sehnenschäden bei Pferden bereitzustellen.

Erfindungsgemäß besteht dieses Mittel aus lebenden Sehnen zellen in injizierbarer Form. Dies erlaubt die direkte, minimalinvasive Implantation lebender Sehnenzellen in einen Sehnendefekt. Die in günstigen Fällen selbst nach nur ein maliger Verabreichung festgestellte positive Wirkung auf den Defekt kann auf einem Anwachsen und Vermehren der injizier ten Sehnenzellen beruhen, so daß anstelle eines undifferen zierten, narbigen Bindegewebes ein stärker differenziertes Sehnenersatzgewebe entsteht. Ein alternativer oder zusätz licher Mechanismus könnte darin bestehen, daß die injizier ten Sehnenzellen dem Körper einen Anreiz bieten, vermehrt eigene Tendozyten zu bilden. Über den genauen Wirkungsmecha nismus liegen noch keine gesicherten Erkenntnisse vor.

Vorzugsweise stammen die Sehnenzellen von Equiden, da dies Unverträglichkeitsreaktionen minimiert. Die Sehnenzellen können insbesondere aus einer Sehne eines getöteten Pferdes oder eines toten Pferdefetus gewonnen werden. Auch die Ge winnung aus einem autologen Sehnenzellgewebe ist möglich und hat den Vorteil, daß Unverträglichkeitsreaktionen ausge schlossen sind.

Am besten geeignet sind Sehnenzellen, die als für die Injek tion zubereitete Zellsuspension vorliegen.

Diese Zellsuspension sollte eine Zelldichte von mindestens etwa 10⁵ Zellen/ml aufweisen. Eine obere Konzentrations grenze wird nur durch die Herstelltechnik gesetzt. Daß die Zellsuspension steril sein muß, liegt auf der Hand. Die Zellsuspension sollte aber auch frei von Eiweiß sein, einer seits um einer Abwehrreaktion des Empfängerorganismus gegen Fremdeiweiß vorzubeugen, andererseits um ein unkontrollier tes Vermehren der Zellen in der für die Injektion zubereite ten Suspension zu verhindern.

Bewährt hat sich eine Zubereitung, in der die Zellen in einer sterilen, isotonischen Lösung suspendiert sind. In Betracht kommt insbesondere isotonische Kochsalz- oder Ringerlösung. Der Lösung kann als Vorsichtsmaßnahme ein Antibiotikum zugesetzt werden.

Die Erfindung hat weiter die Verwendung lebender Sehnen zellen zur Therapie von Sehnenschäden bei Pferden in Form einer Suspension der Sehnenzellen zur lokalen Injektion zum Gegenstand.

Bewährt hat sich weiterhin, ca. 1 bis 10 ml der Zellsuspen sion (mit der angegebenen Mindestkonzentration) zu injizie ren. Es kann von Vorteil sein, mehrere kleine Volumina, z. B. 0,2 ml, in unterschiedliche Stellen des Defektes zu inji zieren, statt die Gesamtmenge in Form einer einzigen Injek tion in eine Stelle zu verabreichen.

Die Injektion der Zellsuspension in eine oder mehrere Stel len des Defektes kann zur weiteren Förderung und Beschleuni gung der Heilung in Abständen von ca. einer Woche wiederholt werden.

Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Her stellung eines auslebenden Sehnenzellen in injizierbarer Form bestehenden Mittels. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte

- steriles Entnehmen eines frischen Stückes einer Sehne, vorzugsweise der Sehne eines Pferdes,
- Schneiden des Sehnenstücks quer zur Faserrichtung in ca. 3 mm dicke Präparate,
- Ansetzen der Präparate mit Zellkulturmedium in Kulturflaschen,
- Gewinnen und Vermehren einer Zellkultur in Form einer Suspension,
- Konzentrieren der Zellsuspension durch mehrfaches Waschen und Zentrifugieren bis zum Erreichen ei ner Zelldichte von mindestens etwa 10⁵ Zellen/ml als zu injizierendes Präparat,
- Austauschen des Zellkulturmediums gegen eine ste rile, isotonische Lösung,
- Verbringen der injektionsfähigen Sehnenzellsus pension in ein für Transport und Entnahme übli ches Gefäß.

Es wurde festgestellt, daß die nach diesem Verfahren herge stellte, gebrauchsfertige Zellsuspension in einem sterilen Gefäß wenigstens sieben Tage bei Zimmertemperatur verwen dungsfähig bleibt. Über längere Zeiträume ist die gebrauchs fertige Zellsuspension nur dann lagerfähig, wenn sie unmit telbar nach der Herstellung tiefgefroren wird.

Das Herstellverfahren nach der Erfindung wird nachfolgend anhand eines konkreten Beispiels erläutert.

Unmittelbar nach der Tötung eines Pferdes wurde unter steri len Bedingungen ein etwa 5 cm langes Stück der Achillessehne entnommen und vollständig in einer sterilen und isotonischen Kochsalzlösung (hier Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS), Sigma/Deisenhofen, Nr. D-5652) aufgenommen. Die in dieser PBS gründlich gespülte und von allen anhängenden Ge weberesten sorgfältig befreite Sehne wurde quer zur Faser richtung in 2 bis 3 mm dünne aber noch stabile Stücke ge schnitten. Diese Präparate wurden in kontaminationssicher verschließbare Kulturflaschen (25 cm³ Costar Nr. 3050) ein gebracht.

Als Nährmedium wurde Zellkulturmedium (500 ml MEM mit Earles Salzen, Nr. M-5650 + 50 ml fetales Kälberserum, Nr. F-2138 + 10 ml Penicillin/Streptomycin, Nr. P-0781, alle Sigma/Dei senhofen) verwendet. Auch andere Kulturmedien sind ver wendbar. 5 ml Zellkulturmedium reichten in der Regel aus, um das Präparat zu bedecken und ein Austrocknen der Oberfläche zu verhindern. Um bei der Sehnenentnahme eventuell erfolgte Kontaminationen zu unterdrücken und nachträglichen Kontami nationen, insbesondere durch Pilze, vorzubeugen, wurden je dem Ansatz außerdem 100 µl Amphotericin B (Serva/Heidelberg, Nr. 47982) zugefügt.

Die Präparate wurden in einem Brutschrank bei 37°C inku biert, der, wie für Zellkulturen üblich, gepuffert war (z. B. durch 5%ige CO₂-Begasung). Dabei wurden die Flaschen liegend mit leicht gelösten Deckeln gelagert.

Ab dem 6. Tag konnten am Rand der Präparate an der Wand der Kulturflaschen anhaftetende Zellen festgestellt werden. Ge wöhnlich nach ca. 12 Tagen waren so viele Zellen gewachsen, daß die Präparate mit einer sterilen Pinzette in neue Kul turflaschen mit je 5 ml des oben genannten Zellkulturmediums passagiert und vereinzelt werden mußten, um die Versorgung mit Nährmedium zu gewährleisten. Zum Passagieren wurden die in PBS zweimal gewaschenen Zellen mit 0,5 ml 2% Trypsinlö sung (20 ml Trypsin, Boehringer Mannheim GmbH, Nr. 210234 + 200 mg EDTA, + PBS ad 1000 ml) satt getränkt und der Über schuß abgegossen, dann die geschlossenen Kulturflaschen im Brutschrank bei 37°C für einige Minuten inkubiert, bis sich die Zellen von der Flaschenwand lösten. Die Trypsinlösung diente dazu, die Zellen von der Flaschenwand zu lösen und etwaige Zellaggregate aufzulösen. Die Zellen wurden mit 5 ml Kulturmedium je Flasche abgespült und aufgenommen.

Die in den Ansatzkulturflaschen verbliebenen Zellen wurden mit PBS zweimal gewaschen, um tote Zellen und Mediumreste zu entfernen und erhielten wiederum je 5 ml Zellkulturmedium, so daß die Zellen bedeckt waren.

Anschließend wurden die Präparate, abhängig von der Dichte des Zellrasens um das jeweilige Präparat, im Durchschnitt wöchentlich (alle 5 bis 12 Tage), weiter umgesetzt, die jeweils verbliebenen Zellen gewaschen, Zellen und Präparat inkubiert, usw.

Sehnenzellen wachsen überwiegend aber nicht ausschließlich als Monolayer, so daß es gelegentlich auch zu Anhäufungen von Zellen kam. Dann wurden diese Zellkolonien vereinzelt, um jeder Zelle eine optimale Versorgung mit Nährmedium zu bieten.

Die Größe der neuen Kulturflaschen und die überimpfte Menge der Zellsuspension richteten sich nach deren Zelldichte. Zum Vereinzeln von Zellanhäufungen wurde die gesamte Menge in eine neue Flasche übertragen. Zum Ausdünnen dicht bewachse ner Kulturflaschen wurde nur ein Teil der Zellsuspension ausgesät und mit frischem Zellkulturmedium zu 5 ml Gesamt volumen ergänzt.

Auf diese Weise wurden Zellen über mehrere Monate etwa wö chentlich passagiert und - je nach Bedarf - lediglich erhal ten oder zur therapeutischen Anwendung in großem Umfang ver mehrt.

Für die Herstellung einer gebrauchsfertigen, also zur Injek tion bestimmten Zellsuspension wurden Zellen aus 6 bis 7 dicht bewachsenen, größeren Kulturflaschen (75 cm³, Costar, Nr. 3275) verwendet. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen trypsiniert und die gesamte Menge aus allen Fla schen in 10 ml PBS aufgenommen. Anschließend wurden die Fla schen zweimal mit je 10 ml PSB gespült, um auch die noch zurückgebliebenen Zellen zu gewinnen.

In autoklavierten Reaktionsgefäßen (1,5 ml, Eppendorf, Nr. 3810) wurden die Zellsuspension und die zum Spülen benutzte PBS für 1,5 Minuten zentrifugiert (Eppendorf Centrifuge 5412, 12000 UpM). Die beim Zentrifugieren entstandenen Zellpellets zerfielen beim nochmaligen Waschen mit PBS wieder weitgehend in Einzelzellen, wurden nach erneutem Zentrifugieren in 1 ml Zellkulturmedium wie oben angegeben, jedoch ohne Zusatz von Kälberserum aufgenommen und in ein steriles, silikonisiertes (Silikonlösung, Serva/Heidelberg, Nr. 35130) Glasgefäß (ca. 3 ml Volumen) überführt. Auf Serum wurde verzichtet, um einer möglichen Abwehrreaktion des Empfängerorganismus gegen Fremdeiweiß vorzubeugen und um ein unkontrolliertes Vermehren der definierten Zellzahl in der gebrauchsfertigen Zellsuspension zu verhindern. Das Siliko nisieren des Glasgefäßes verhindert ein Anhaften der adhä renten Zellen an die Glaswand.

Die Reaktionsgefäße wurden zweimal mit 1 ml serumfreiem Zellkulturmedium wie vor gespült und diese Spüllösung eben falls in das obengenannte Glasgefäß pipettiert.

Die mikroskopische Zählung der Zellen in der so erhaltenen Probe von 3 ml Zellsuspension ergab eine Zelldichte von ca. 10⁶ bis 10⁷ Zellen/ml. Diese Zellsuspension erwies sich als gebrauchsfertig.

Als Gefäßverschluß diente ein steriler Gummistopfen, durch den die Zellsuspension mit einer Kanüle und Spritze direkt entnommen werden konnte. Etwaige Zellaggregate ließen sich durch einmaliges Aufziehen und Entleeren der Spritze lösen. Um ein Auslaufen der gebrauchsfertigen Zellsuspension wäh rend des Versandes zu verhindern, wurde der Gummistopfen mit einem Streifen Parafilm "M" (American Can Company) zusätz lich fixiert und abgedichtet. Bis zum klinischen Einsatz innerhalb von drei Tagen wurde die gebrauchsfertige Suspen sion bei Zimmertemperatur aufbewahrt.

Die gebrauchsfertige Zellsuspension läßt sich durch Tiefge frieren in eine haltbare, jederzeit verfügbare Form über führen. Zu diesem Zweck kann die Zellsuspension beispiels weise nach Zugabe von Glyzerin (7% Endkonzentration) und Dimethylsulfoxid (5% Endkonzentration) als Zellschutz stu fenweise bei -18°C (für 12 Stunden), -70°C (für 12 Stunden) und -193°C (Lagerung in flüssigem Stickstoff) tiefgefroren werden. Eine derart während vier Wochen tiefgefroren aufbe wahrte, gebrauchsfertige Zellsuspension zeigte nach dem Auftauen im Brutschrank bei 37°C und Zugabe von Zellkultur medium weiteres Zellwachstum und Zellvermehrung.

In ausgesuchten Fällen von akuter Tendinitis der oberfläch lichen Beugesehne wurde die zubereitete Sehnenzellsuspension klinisch eingesetzt. Nach steriler Vorbereitung des Hautfel des über der geschädigten Sehne wurde am aufgehobenen Bein die Zellsuspension mittels einer Kanüle (0,7 mm) direkt in den zuvor sonographisch identifizierten Sehnendefekt inji ziert. Anschließend wurde ein Schutzverband angelegt und die übliche Nachbehandlung mit nichtsteroidalen Antiphlogistika, Schrittbewegung und regelmäßigen Ultraschallkontrollen durchgeführt. Es zeigten sich keine Unverträglichkeitsreak tionen und die Sehnendefekte heilten komplikationslos aus.

Die beschriebene Therapie hat folgende Vorteile:

- die Sehnenzellsuspension ist einfach herstellbar;
- die Injektion ist leicht durchführbar (lokale Injek tion, keine Vollnarkose nötig);
- die Therapie durch Injektion ist minimal invasiv (In jektion mit dünner Kanüle 0,7 mm);
- die Sehnenzellsuspension ist lokal verträglich (keine Unverträglichkeitsreaktion).

Claims

1. Mittel zur Behandlung von Sehnenschäden bei Pferden, bestehend auslebenden Sehnenzellen in injizierbarer Form.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sehnenzellen von Equiden stammen.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die lebenden Sehnenzellen als gebrauchsfertige Zellsuspension vorliegen.

4. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gebrauchsfertige Zellsuspension eine Zelldichte von mindestens etwa 10⁵ Zellen/ml aufweist.

5. Mittel nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gebrauchsfertige Zellsuspension frei von wei terem Eiweiß ist.

6. Mittel nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, daß die Zellen in einer sterilen, isoto nischen Lösung suspendiert sind.

7. Mittel nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß der Zellsuspension mindestens ein Antibiotikum zugesetzt ist.

8. Verwendung lebender Sehnenzellen zur Therapie von Seh nenschäden bei Pferden in Form einer Suspension der Sehnenzellen zur lokalen Injektion.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Sehnenzellen von Equiden stammen.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sehnenzellen aus fetalem oder autologem Seh nenzellgewebe gewonnen wurden.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, zur In jektion von ca. 1 bis 10 ml der Zellsuspension an min destens einer Stelle des Defektes.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, zur min destens einmaligen Wiederholung der Injektion an min destens einer Stelle des Defektes in einem Abstand von ca. einer Woche.

13. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch folgende Schritte

- Entnehmen eines frischen Stückes einer Sehne,
- Schneiden des Sehnenstücks quer zur Faserrichtung in ca. 3 mm dicke Präparate,
- Ansetzen der Präparate mit Zellkulturmedium in Kulturflaschen,
- Gewinnen und Vermehren einer Zellkultur in Form einer Suspension,
- Konzentrieren der Zellsuspension durch mehrfaches Waschen und Zentrifugieren bis zum Erreichen ei ner Zelldichte von mindestens etwa 10⁵ Zellen/ml als zu injizierendes Präparat,
- Austauschen des Zellkulturmediums gegen eine ste rile, isotonische Lösung.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das gebrauchsfertige Mittel tiefgefroren wird.