DE19745001A1 - Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren mit mindestens einem Liganden, der eine Affinität zum zu markierenden Oligo- oder Polymer und mindestens eine erfaßbare Eigenschaft aufweist, das Oligo- oder Polymer mindestens eine Affinitätsbindungsstelle für den mindestens einen oder mehrere Liganden besitzt und die mindestens eine Affinitätsbindungsstelle des Oligo- oder Polymeren durch rekombinante oder synthetische Methoden in dem Oligo- oder Polymer erzeugt worden ist, sowie Verbindungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Mit verschiedenen modernen Methoden lassen sich einzelne Moleküle in Lösung oder an Oberflächen erfassen. Konfokale Fluoreszenzmethoden wie die in WO 94/16313 (EVOTEC BioSystems GmbH) beschriebene Methode der Fluoreszenz­ korrelationsspektroskopie oder die in der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 (EVOTEC BioSystems GmbH) beschriebene Methode der molekularen Helligkeitsanalyse sowie auf Ansätzen der Nahfeldspektroskopie beruhende Verfahren, wie sie beispielsweise in DE 44 38 391 (EVOTEC BioSystems GmbH) dargestellt sind, erlauben eine sichere und schnelle Detektion von Molekülen. So können beispielsweise Moleküle aufgrund ihres Diffusionsverhaltens oder aufgrund spektraler Unterschiede von gekoppelten Fluoreszenzmarkern identifiziert werden.

Die Notwendigkeit, einen Fluoreszenzmarker an biologisch aktive Proteine oder andere Moleküle zu koppeln, ohne daß die biologische Aktivität modifiziert wird, ist eine Schwierigkeit, die oft hohen experimentellen Aufwand erforderlich macht. Dies stellt eine erhebliche Einschränkung bei der Verbreitung der oben genannten Technologien und der Anwendung dieser Technologien z. B. in der Forschung nach neuen pharmakologischen Wirkstoffen dar. Eine spezifische Markierung von Oligo- oder Polymeren wird durch die Vielzahl reaktiver Gruppen in dem jeweiligen Molekül nahezu unmöglich. So erfolgt die Einführung von fluoreszierenden Gruppen oftmals über kovalente Bindung an chemisch reaktive Gruppen wie z. B. Lysine, Cysteine oder Serine bzw. Threonine eines Proteins, sofern diese Gruppen an der Proteinoberfläche sterisch gut zugänglich sind. Häufig sind mehrere dieser Gruppen chemisch modifizierbar, wobei aufgrund verschiedener Reaktions­ geschwindigkeiten oftmals eine nicht genau definierte Produktmischung entstehen kann. In Analysen können somit Ergebnisse in nicht akzeptabler Weise verfälscht werden. Andererseits ist die Qualitätskontrolle der markierten Reaktionsprodukte als solche schwierig und äußerst kostspielig.

Es ist daher wünschenswert, ein allgemein einsetzbares Markierungssystem zu entwickeln, welches auf die große Mehrzahl von Oligo- oder Polymeren, insbesondere biologischen Ursprungs, anwendbar ist. In bevorzugter Weise sollen die Substanzen hierbei keine oder nur eine geringe Veränderung ihrer biologischen Aktivität durch die Markierungsreaktion erfahren.

Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Markierungssystem auf Basis einer Affinitätsmarkierung bereit. Es handelt sich hierbei um ein Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren mit mindestens einem Liganden, der eine Affinität zum zu markierenden Oligo- oder Polymer und mindestens eine erfaßbare Eigenschaft aufweist, das Oligo- oder Polymer mindestens eine Affinitätsbindungsstelle für den mindestens einen oder mehrere Liganden besitzt und die mindestens eine Affinitätsbindungsstelle des Oligo- oder Polymeren durch rekombinante oder synthetische Methoden in dem Oligo- oder Polymer erzeugt worden ist, wobei das zu markierende Oligo- oder Polymer mit dem mindestens einen Liganden versetzt wird und nach Eingehen der Affinitätsbindung ein Affinitätskomplex entsteht, der durch die Bindung des mindestens einen Liganden eine auf den Liganden zurückführbare erfaßbare Eigenschaft erhält, die mittels eines Detektionssystems erfaßbar wird.

Das Oligo- oder Polymer ist insbesondere ein Oligo- oder Polypeptid, ein Protein, ein Oligonukleotid, eine Nukleinsäure oder ein Derivat hiervon.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die rekombinant oder synthetisch eingeführte Affinitätsbindungsstelle eine Abfolge von chemischen Gruppen oder das Oligo- oder Polymere aufbauenden Struktureinheiten, die eine Affinität zu Liganden aufweisen. Viele in Assays eingesetzte Reagenzien sind synthetischen oder rekombinanten Ursprungs, so daß sich beispielsweise kurze Aminosäuresequenzen, sog. Tags, in einer dem Fachmann bekannten Weise einbauen lassen.

So ist die N- oder C-terminale Verlängerung von Proteinen oder Peptiden um sechs Histidinbausteine vorbeschrieben. Sie wird jedoch nicht, wie erfindungsgemäß dargelegt, zur Affinitätsmarkierung dieser Biopolymere eingesetzt, sondern zur Reinigung der Substanzen an Metall-Chelat-Oberflächen in der Affinitätschromatographie. Die Effizienz dieses Verfahrens beruht wahrscheinlich auf der Tatsache, daß zwei von sechs Histidinresten zwei freie Koordinationsstellen an einem zweiwertigen Nickelion besetzen, dessen übrige vier Koordinationsstellen von Nitrilotriessigsäure-Seitengruppen (NTA) des Harzes belegt werden.

Erfindungsgemäß kann die zur Markierung verwendete Affinitätsbindungsstelle aus Histidinmolekülen aufgebaut sein. Insbesondere kann die Affinitätsbindungsstelle aus vier bis 10 Histidinmolekülen bestehen, die sequenzieil aufeinanderfolgen oder durch bevorzugt ein bis drei Struktureinheiten, insbesondere ein bis drei beliebige andere Aminosäuren, getrennt voneinander angeordnet sind.

Es ist insbesondere bevorzugt, mehrzähnige Liganden zu verwenden. So kann z. B. ein Ligand verwendet werden, der mindestens zwei Nitrilotriessigsäure- Seitenketten aufweist, die entsprechend über Metallionen einen Affinitätskomplex mit dem zu markierenden Oligo- oder Polymer eingehen. Durch in geeigneter sterischer Konformation angeordnete, mehrere NTA-Seitenketten, die über sogenannte Linker miteinander und insbesondere mit einem Fluoreszenzfarbstoff verbunden sind, läßt sich die Affinität des Liganden zum zu markierenden Oligo- oder Polymer erhöhen. Geeignete Fluoreszenzfarbstoffe (wie z. B. Rhodamine, Texas Red, TAMRA, Fluorescein, Resorufine) sind dem Fachmann aus der Literatur bekannt.

Erfindungsgemäß ist es ebenfalls möglich, das Oligo- oder Polymer wie z. B. ein Protein um die Sequenz von Proteinen oder Peptiddomänen zu erweitern, die ihrerseits hochaffine Wechselwirkungen zu niedermolekularen lumineszenten Liganden ausbilden können. So lassen sich auch Peptide oder Proteine generieren, deren N- oder C-terminale Leserahmen z. B. durch Streptavidin oder Avidin erweitert sind. Die Markierungsreaktion kann durch Bindung lumineszenter Biotinmoleküle erfolgen.

Die spektroskopisch erfaßbaren Eigenschaften sind insbesondere die molekulare Helligkeit, Fluoreszenzlebensdauer, Polarisation und/oder Winkelabhängigkeit gestreuter und/oder emittierter elektromagnetischer Strahlung. Es ist besonders bevorzugt, diese Eigenschaften auf der Basis der konfokalen Fluoreszenzspektros­ kopie und/oder der Nahfeldspektroskopie zu detektieren. Geeignete Detektions­ methoden sind in WO 94/16313 (EVOTEC BioSystems GmbH), der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 (EVOTEC BioSystems GmbH) sowie in DE 44 38 391 (EVOTEC BioSystems GmbH) detailliert beschrieben.

Die Kombination des erfindungsgemäßen Markierungsverfahrens mit Methoden zum Nachweis von Einzelmolekülen läßt sich - neben Assays zur Auffindung neuer biologisch aktiver Substanzen für weitere wirtschaftlich und wissenschaftlich äußerst bedeutende Fragestellungen einsetzen. Die Methoden der Genomforschung bemühen sich zur Zeit um die Aufklärung der genetischen Erbinformation bei verschiedenen Organismen inklusive des Menschen, um die biologischen Regulations- und Differenzierungsvorgänge kausal zu verstehen. Daraus erhofft man sich neue Ansätze zur Bekämpfung menschlicher Erbkrankheiten und Infektionserkrankungen. Die Ergebnisse der Aufklärung der genetischen Sequenzen ergeben jedoch häufig keine Hinweise auf die Information und die funktionale Bedeutung der entsprechenden Sequenzabschnitte. Wichtig ist jedoch die Kenntnis der biologischen Funktion, insbesondere jedoch der Wechsel­ wirkungseigenschaften von Molekülen mit anderen Molekülen, wie z. B. zwischen Proteinen untereinander oder zwischen regulativen Gensegmenten und Proteinen, sowie die Störung dieser Eigenschaften im Falle pathologischer Zustände.

Fig. 1 zeigt in schematischer Weise die Wechselwirkung zweier Peptide bzw. Proteine, weiche jeweils am N- bzw. C-Terminus mit einer aus 6 Histidinmolekülen versehenen Affinitätsbindungsstelle versehen sind. Diese Peptide bzw. Proteine sind jeweils durch mehrzähnige Liganden, welche einen Farbstoffanteil (F) aufweisen, markiert. Durch die Komplexierung von vier Histidinseitenketten im Falle eines zweizähnigen Liganden bzw. von sechs Histidinseitenketten im Falle eines dreizähnigen Liganden bleiben pro Histidin-Tag keine zweiten Bindungsplätze hoher Affinität für weitere NTA-Komplexbildung verfügbar. Das einzelne Molekül besitzt somit eine molekulare Helligkeit oder Leuchtkraft der Stärke 1. Bei Interaktion der beiden Moleküle entsteht ein Molekülkomplex, der eine molekulare Helligkeit oder Leuchtkraft der Stärke 2 aufweist. Die molekularen Helligkeiten der Einzelmoleküle bzw. des Molekülkomplexes können mittels des in der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 (EVOTEG BioSystems GmbH) dargelegten Verfahren nachgewiesen werden. Hier zeigt sich der besondere Vorteil der spezifischen Markierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bei herkömmlichen Markierungsreaktionen besteht die Gefahr, daß die beiden Moleküle nicht nur einen, sondern gegebenenfalls mehrere Farbstoffanteile aufweisen, so daß eine zuverlässige Detektion möglicherweise entstandener Molekülkomplexe erschwert wird.

Fig. 2 zeigt in schematischer Weise eine über dritte Moleküle vermittelte Wechsel­ wirkung zweier nach dem erfindungsgemäßen Verfahren markierter Oligo- bzw. Polymere.

In Fig. 3 ist schematisch eine zweidimensionale Matrix dargestellt, die die Analyse der Wechselwirkung zwischen hochexprimierten, vorzugsweise sezernierten offenen Leserahmen als Funktion der molekularen Helligkeit oder Leuchtkraft wiedergibt. Es wurden jeweils die molekularen Helligkeiten der am stärksten fluoreszierenden Partikelpopulationen mit der molekularen Helligkeit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren markierten Einzelmoleküle (Leuchtkraft der Stärke 1) verglichen. Die Matrixverteilung legt bezüglich der Analyse der Wechselwirkungen von Molekülen M2 und M5 untereinander bzw. mit sich selbst nahe, daß M2-Moleküle im Gegensatz zu M5-Molekülen mit sich selbst Dimere ausbilden können. Ein aus drei Komponenten bestehender Komplex sollte eine molekulare Helligkeit der Stärke 3 aufweisen. Die Matrixverteilung legt einen derartigen Komplex aus zwei M2-Molekülen und einem M5-Molekül nahe. Das Paar M5/M6 legt eine Heteroduplexbildung nahe. Eine derartige Matrix ist geeignet, funktionale Wechselwirkungen zwischen Molekülen aufzufinden, die beide den Orphan-Status haben. Die miteinander in Wechselwirkung tretenden Moleküle können jeweils aus verschiedenen rekombinanten Zellen sezerniert werden, wobei auch Mischungen von Zellen oder kokultivierte Zellen eingesetzt werden können, die jeweils unterschiedliche Moleküle exprimieren. Die Proteine müssen nicht notwendigerweise sezerniert werden. Die Komplexe können auch in Zellen oder in Lysaten analysiert werden. Auch der Einsatz von in vitro Expressionssystemen ist möglich.

In einer analogen Problemstellung ist einer der Partner bereits funktional zugeordnet, gesucht wird aber ein unbekannter Ligand oder interagierender Gofaktor aus einer Expressionsbank. Für diesen Fall würde die Matrix eindimensional.

Für den Fall, daß ein spezifisches Wechselwirkungssystem identifiziert ist, kann unmittelbar nach neuen Wirkstoffen (Agonisten, Antagonisten) gescreent werden.

Fig. 4 zeigt einen Signaltransduktions-Zellassay anhand sezernierter Botenstoffe. Es ist ein zelluläres Assay-System beschrieben, das sich insbesondere für die Miniaturisierung und hohe Parallelisierung eignet. In Probeträgerstrukturen, wie sie beispielsweise in DE 41 32 379 (Kernforschungszentrum Karlsruhe GmbH) beschrieben sind, lassen sich Zellpopulationen kultivieren, die anschließend anhand spezifisch sezernierter Produkte auf ihre Reaktion gegenüber potentiellen pharmakologischen Wirkstoffen analysiert werden können. Die Methode ist beispielsweise geeignet um die Produktion von Proteinen oder Peptiden zu verfolgen, die mindestens zwei Erkennungsstellen für markierte Antikörper aufweisen.

Fig. 5 zeigt schematisch einen zweizähnigen NTA-Liganden mit einem Fluoreszenzfarbstoff F.

Fig. 6 zeigt schematisch die funktionale Genomanalyse von sezernierten orphan- Expressionsprodukten aus kokultivierten Klonen.

Fig. 7 zeigt die Wechselwirkung eines mit dem Farbstoff TAMRA markierten zweizähnigen Liganden auf Ni-NTA-Basis mit einem Protein, das einen aus acht Histidinen bestehenden Tag aufweist.

Fig. 8 zeigt schematisch die Wechselwirkung eines mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens markierten Protein A, das an einen Antikörper bindet.

Fig. 9 zeigt einen mit dem Farbstoff TAMRA markierten zweizähnigen Liganden auf NTA-Basis.

Fig. 10 zeigt einen mit dem Farbstoff TAMRA markierten dreizähnigen Liganden auf NTA-Basis.

Claims (12)

1. Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren mit mindestens einem Liganden, der eine Affinität zum zu markierenden Oligo- oder Polymer und mindestens eine erfaßbare Eigenschaft aufweist das Oligo- oder Polymer mindestens eine Affinitätsbindungsstelle für den mindestens einen oder mehrere Liganden besitzt und die mindestens eine Affinitätsbindungsstelle des Oligo- oder Polymeren durch rekombinante oder synthetische Methoden in dem Oligo- oder Polymer erzeugt worden ist, wobei das zu markierende Oligo- oder Polymer mit dem mindestens einen Liganden versetzt wird und nach Eingehen der Affinitäts­ bindung ein Affinitätskomplex entsteht, der durch die Bindung des mindestens einen Liganden eine auf den Liganden zurückführbare erfaßbare Eigenschaft erhält, die mittels eines Detektionssystems erfaßbar wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligo- oder Polymer ein Oligo- oder Polypeptid, ein Protein, ein Oligonukleotid, eine Nukleinsäure oder Derivate hiervon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinant oder synthetisch eingeführte Affinitätsbindungsstelle eine Abfolge von chemischen Gruppen oder das Oligo- oder Polymere aufbauenden Struktureinheiten besitzt, die eine Affinität zu Liganden aufweisen.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsbindungsstelle durch eine Abfolge von Aminosäuren bestimmt wird, die mit Chelatbildnern über Metallionenkomplexe oder mit Biotin einen Affinitätskomplex eingehen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsbindungsstelle aus Histidinmolekülen aufgebaut wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsbindungsstelle aus insbesondere 4 bis 10 Histinmolekülen besteht, die sequenziell aufeinanderfolgen oder durch bevorzugt 1 bis 3 Struktureinheiten, insbesondere 1 bis 3 beliebige andere Aminosäuren, getrennt voneinander angeordnet sind.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsbindungsstelle aus Avidin, Streptavidin oder Fragmenten hiervon besteht.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprache 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand eine spektroskopisch, insbesondere luminometrisch, erfaßbare Eigenschaft aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand einen Farbstoffanteil aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die spektroskopisch erfaßbare Eigenschaft molekulare Helligkeit, Fluoreszenzlebensdauer, Polarisation und/oder Winkelabhängigkeit gestreuter und/oder emittierter elektromagnetischer Strahlung ist.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion auf Basis konfokaler Fluoreszenzspektroskopie oder Nahfeldspektroskopie erfolgt.

12. Verbindung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 mit einem Strukturelement, daß durch Chelati­ sierung an ein andere Molekül bindet und ein weiteres Struktur­ element aufweist, das spektroskopisch detektierbar ist.