DE19740092A1

DE19740092A1 - Liposomen und Verfahren zur Transfektion von Zellen

Info

Publication number: DE19740092A1
Application number: DE19740092A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dr Med Hengge
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 1999-03-18

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Liposomen umfassend eine eine Liposomenhülle ausbildende Lipidphase und eine von der Lipidphase umschlossene intraliposomale Phase, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie daraus herstellbare Liposomen, Verfahren zur Transfektion von Zellen, Mittel zur topischen Verabreichung sowie Verwendungen der Liposo men und Mittel.

Mit dem zunehmenden Verständnis biologischer Zusammenhänge auf molekularer Ebene etablierte sich in der jüngsten Ver gangenheit die molekulare Medizin, die die Entwicklung neuer Therapiekonzepte und Medikamente maßgeblich beein flußt. Dies gilt auch für die Haut, deren Funktion weit über die offensichtliche Barrierefunktion hinausgeht und deren Erkrankungen in ganz besonderem Maße in vielen Fäl len im wahrsten Sinne des Wortes offensichtlich sind.

Eine Möglichkeit der Behandlung von Erkrankungen der Haut wird in der Insertion und Expression von Genen in der Epi dermis gesehen, d. h. der Gentherapie der die Epidermis ausbildenden Zellen. Besonders bedeutsam sind hierbei die Keratinozyten.

In der Technik sind verschiedene Verfahren bekannt, Kera tinozyten in situ zu transfizieren. Eine Möglichkeit stellt die intradermale Injektion dar, bei es zur lokalen Transfektion, d. h. Expression des eingebrachten geneti schen Materials in einem sehr eng umgrenzten dermalen Areal kommt. Typischerweise ist die Expression transient für 2 bis 7 Tage und es erfolgt keine Integration des ap plizierten genetischen Materials in das Genom der Kerati nozyten. Ein entscheidender Nachteil dieser Technik be steht darin, daß eine entsprechende Transfektion auf den unmittelbaren Injektionsbereich beschränkt ist und es sich dabei um ein invasives Verfahren handelt, daß nur von qua lifiziertem Personal unter geeigneten Hygienebedingungen zur Anwendung gelangen kann.

Ebenfalls auf die lokale Applikation von Genmaterial be schränkt ist die Verwendung von Mikroprojektilen, die aus mit DNA beschichteten mikroskopischen Goldpartikeln beste hen und mittels einer sogenannten Genkanone direkt in die Zellen eingebracht werden. Auch dieses Verfahren ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden, die zum einen aus der Verwendung der vergleichsweise teuren Goldpartikel sowie dem erforderlichen Beschichtungsschritt resultieren, zum anderen jedoch auch in der Verwendung der Genkanone bestehen, die einen nicht unerheblichen apparativen Auf wand darstellt, ebenfalls qualifiziertes Personal zu sei ner Bedienung benötigt und darüber hinaus nicht den gewün schten Erfolg liefert.

Schließlich sind in der Technik noch topische Verfahren bekannt, bei denen komplexiert vorliegende DNA direkt in die die Epidermis aufbauenden Zellen eingebracht werden soll. So wurden beispielsweise kationische Lipide, die sich an die anionische DNA lagern, ebenso verwendet wie die Rezeptor-vermittelte Endozytose. Dabei blieb der erst genannte Ansatz in der praktischen Anwendung erfolglos. Der zweite Ansatz, beispielsweise in Form der Transferri nofektion, ist aufgrund der immunogenen Bestandteile (es werden Dissoziationsproteine von Adenovirus oder des hä magglutinierenden Virus von Japan verwendet) immunogen und kann somit nur einige Male erfolgreich appliziert werden.

Schließlich sind in der Technik noch die aus der Kosmeto logie bekannten Liposomen beschrieben, die in der wäßri gen Innenphase die Plasmid-DNA enthalten. Auch dieser An satz führte nur bei einem kleinen Prozentsatz der Zellen zur erfolgreichen Transfektion.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Liposomen bereitzustellen, die eine hohe Transfektionsrate von Hautzellen, und insbesondere Keratinozyten, erlauben.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung von derartigen Liposomen.

Schließlich liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Transfektion von Zellen, und insbesondere Keratinozyten, zur Verfügung zu stellen, wel ches eine hohe Transfektionsrate erlaubt.

Der Erfindung liegt auch die Aufgabe zugrunde, eine phar mazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die die ge genüber dem Stand der Technik verbesserte Applikation von Wirkstoffen, insbesondere die topische Applikation dersel ben, erlaubt.

Weiterhin liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Mittel zur topischen Verabreichung chemischer Verbindungen be reitzustellen.

Des weiteren sollen erfindungsgemäß Mittel zur Gentherapie von Hautzellen, zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen der Haut, einschließlich von Warzen, von sy stemischen Erkrankungen und von Alopezie sowie Mittel zur Immunisierung offenbart werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch Liposomen umfassend eine eine Liposomenhülle ausbildende Lipidphase und eine von der Lipidphase umschlossene intraliposomale Phase, wobei die chemische Zusammensetzung der Lipidphase der einer Hautschicht entspricht und die intraliposomale Phase mindestens eine Verbindung enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenhy drate, Lipide und niedermolekulare Verbindungen sowie aus diesen zusammengesetzte Moleküle oder Strukturen umfaßt.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch Liposomen umfaßend eine eine Liposomenhülle ausbildende Lipidphase und eine eine von der Lipidphase umschlossene intraliposomale Phase, wobei das Liposom betreffend der Lipidklassen folgende Komponenten umfaßt:

Phospholipide	< 2 Gew.-%
Cholesterolsulfat	2 Gew.-%
Freie Fettsäuren	20 Gew.-%
Ceramide	20 Gew.-%
Sterole	43 Gew.-%
Triacylglycerole (Neutralfette)	4 Gew.-%
Sterolester	9 Gew.-%

und die intraliposomale Phase mindestens eine Verbindung enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Nuklein säuren, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und niedermoleku lare Verbindungen sowie aus diesen zusammengesetzte Mole küle oder Strukturen umfaßt.

Weiterhin wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren, wobei vorgesehen ist, daß a) Stratum cor neum-Lipid gewonnen wird und b) aus dem Stratum corneum- Lipid unter Ultraschallbehandlung und/oder Detergenzdialy se Liposomen hergestellt werden.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch Liposomen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar sind.

Desweiteren wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Transfektion von Zellen gelöst, wobei die zu transfizierenden Zellen mit den erfindungsgemäßen Liposo men in Kontakt gebracht werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch durch eine pharma zeutische Zusammensetzung gelöst, die die erfindungsgemä ßen Liposomen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

Desweiteren wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Mittel zur topischen Verabreichung chemischer Verbindungen gelöst, wobei das Mittel einen Gehalt an erfindungsgemäßen Liposomen aufweist.

Schließlich wird die Aufgabe gelöst durch Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen, der erfindungsgemäßen pharma zeutischen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Mit tels zur Gentherapie von Hautzellen.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen, der erfindungsgemäßen pharma zeutischen Zusammensetzung oder des erfindungsgemäßen Mit tels zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen der Haut, einschließlich der Behandlung von Warzen, syste matischen Erkrankungen und von Alopezie sowie Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen, der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung oder des erfindungsgemä ßen Mittels zur Immunisierung eines Wirtsorganismus.

Auch wird die Aufgabe gelöst durch einen Impfstoff, der einen Gehalt an den erfindungsgemäßen Liposomen aufweist, wobei die Liposomen Nukleinsäure, die die genetische In formation für ein interessierendes Antigen umfaßt, oder Nukleinsäure umfassen, die die genetische Information für einen Antikörper oder ein Antikörperfragment umfaßt, wobei der Antikörper bzw. das Antikörperfragment spezifisch für das interessierende Antigen ist.

Bei dem eine eine Liposomenhülle ausbildende Lipidphase und eine von der Lipidphase umschlossene intraliposomale Phase umfassenden Liposom bei dem die chemische Zusammen setzung der Lipidphase der einer Hautschicht entspricht, kann vorgesehen sein, daß die Hautschicht humane Epidermis ist.

In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, daß die Hautschicht das Stratum corneum ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Liposomen kann vorgesehen sein, daß Stratum corneum-Li pid gewonnen wird, indem Stratum corneum enzymatisch und/oder mechanisch von der Haut abgetragen wird und an schließend in Methanol/Chloroform extrahiert wird.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Liposoms kann vorgesehen sein, daß die intraliposomale Phase eine wäßrige Phase ist.

Desweiteren kann vorgesehen sein, daß die intraliposomale Phase mindestens eine chemische Verbindung enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Nukleinsäuren, Protei ne, Kohlenhydrate, Lipide und niedermolekulare Verbindun gen sowie aus diesen zusammengesetzte Moleküle oder Struk turen umfaßt.

Darüber hinaus kann vorgesehen sein, daß die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Wachstumsfaktoren, An tibiotika, schmerzlindernde Agenzien, Agenzien, die die Zellteilung und/oder die Vaskularisierung beeinflussen, koagulierende und anti-koagulierende Agenzien, Cytokine, chemisches Attraktans, Enzyme, und Kombinationen davon um faßt.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist die chemische Verbindung eine Nukleinsäuresequenz.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Transfektion von Zellen kann vorgesehen sein, daß die zu transfizierenden Zellen Hautzellen sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Hautzellen ausgewählt aus der Gruppe, die Hautzellen des Stratum cor neum, Stratum granulosum und Stratum spinosum sowie Kera tinozyten umfaßt.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Zellen im erfindungsgemäßen Verfahren zur Transfektion Keratinozyten der Haarfollikel sind.

In anderen, ganz besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Tr ansfektion epidermale Langerhans-Zellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Mittel zur topischen Verabrei chung chemischer Verbindungen kann vorgesehen sein, daß das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die Cremes, Sal ben, Gele, Sprühpflaster und Tinkturen umfaßt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Mittels ist vorgesehen, daß das Mittel wei terhin einen Gehalt an mindestens einer Verbindung auf weist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Permeabili tätsverstärker und Quellmittel umfaßt.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der hierin offenbar ten Liposomen, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Mittels zur Gentherapie von Hautzellen kann vorgesehen sein, daß die Hautzellen in situ vorliegen.

In einer alternativen Ausführungsform der obigen erfin dungsgemäßen Verwendung kann vorgesehen sein, daß die Hautzellen ex vivo vorliegen.

Weiterhin kann bei der vorgenannten Verwendung vorgesehen sein, daß die Hautzellen ausgewählt sind aus der Gruppe, die Hautzellen des Stratum corneum, Stratum granulosum und Stratum spinosum sowie Keratinozyten umfaßt.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Hautzellen Keratinozyten der Haarfollikel sind.

Weiterhin kann in einer Ausführungsform der obigen erfin dungsgemäßen Verwendung vorgesehen sein, daß die Hautzel len epidermale Langerhans-Zellen sind.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der hierin offenbar ten Liposomen, der hierin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung oder des hierin offenbarten Mittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Erkrankungen der Haut ist in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, daß die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die geneti sche Hauterkrankungen, Psoriasis, Hauttumoren und Wunden umfaßt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorge sehen, daß die genetische Hauterkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Epidermolysis bullosa simplex, Epider molysis hyperkeratosis, palmoplantare Keratose, junktio nale Epidermolysis bullosa, dystrophe Epidermolysis bullo sa, lamellare Ichthyose und Xeroderma pigmentosum umfaßt.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der hierin offenbar ten Liposomen, der hierin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung oder des hierin offenbarten Mittels zur Behandlung systemischer Erkrankungen ist in einer beson ders bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, daß die sy stemische Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Hämophilie A und Hämophilie B sowie Kollagendegeneration umfaßt.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der hierin offenbar ten Liposomen, der hierin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung oder des hierin offenbarten Mittels zur Immunsierung eines Wirtsorganismus ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, daß der Wirtsorga nismus ein menschlicher Organismus ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Er kenntnis zugrunde, daß mit den erfindungsgemäßen Liposomen eine besonders hohe Transfektionsrate von Hautzellen, und insbesondere von Keratinozyten, erreicht werden kann. Die ser Effekt scheint durch den hohen Grad an Hydrophobizität der Liposomenhülle, d. h. deren Lipidzusammensetzung, be dingt zu sein. DNA, die in den erfindungsgemäßen Liposomen enkapsuliert vorliegt, kann die epidermale Barriere der Haut überwinden und in den tieferen Schichten der Epider mis aufgenommen und exprimiert werden.

Die vorgehend beschriebene Passagefähigkeit der erfin dungsgemäßen Liposomen erlaubt darüberhinaus auch eine Freisetzung von in den Liposomen enthaltenen Verbindungen oder Wirkstoffen, einschließlich Nukleinsäuren, in tiefe ren Schichten der Epidermis bzw. der Haut, was sowohl un ter dem Aspekt der Verabreichung pharmazeutisch wirksamer Verbindungen wie auch unter dem Aspekt der kosmetischen Behandlung der Haut von Vorteil ist.

Dabei ist ganz besonders beachtlich, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen bzw. der hierin offenbar ten Mittel und Verfahren die Nukleinsäure-Applikation mehrmals wiederholbar ist und es nicht zum Auftreten einer Immunantwort, insbesonders einer solchen gegen nackte Nu kleinsäure gerichtete kommt, was gegenüber anderen Trans fektionstechniken einen erheblichen Vorteil darstellt.

Infolge der hohen Transfektionsrate wird es erstmalig mög lich, einfach und zuverlässig viele Hautzellen zu trans fizieren und somit die Grundlage dafür zu legen, die der Gentherapie der Haut inhärenten Vorteile tatsächlich zu realisieren.

Diese Vorteile bestehen unter anderem darin, daß, neben einer in der Regel kausalen Therapie, das die therapierten Zellen aufweisende Gewebe im Falle unerwünschter Nebenwir kungen leicht entfernt werden kann und weiterhin infolge der Tatsache, daß eine ektope Expression der mittels der erfindungsgemäßen Liposomen eingeschleusten Nukleinsäure ausgeschlossen werden kann, die Therapie als solche jeder zeit unterbrochen werden kann.

Darüber hinaus sind insbesondere die Keratinozyten ver gleichsweise leicht zu gewinnen sowie in Kultur zu expan dieren und es sind in der Technik auch Verfahren und Mit tel bekannt zur Modulation der Expression einer in Kerati nozyten vorhandenen Nukleinsäuresequenz.

Die intraliposomale Phase kann eine wäßrige Phase sein, wobei vorgesehen sein kann, daß diese ein spezielles Mi lieu, gestaltet durch den Zusatz bestimmter Verbindungen, aufweist. Die wäßrige Phase kann so beispielsweise einen distinkten pH-Wert, einen bestimmten Puffer, oder Ionen konzentrationen aufweisen, die die Stabilität, Konforma tion und biologische Wirksamkeit der darin ent haltenen - chemischen - Verbindung(en) beeinflußt und somit für den Fall, daß in der intraliposomalen Phase ein zur Transfek tion geeignetes Nukleinsäurekonstrukt vorhanden ist, auf die Transfektionsrate der mit den erfindungsgemäßen Lipo somen behandelten Zellen einwirken. Die Gestaltung eines entsprechenden Milieus, um die genannten Effekte zu errei chen, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.

Bei den in der intraliposomalen Phase enthaltenen chemi schen Verbindungen handelt es sich um solche, bei denen eine chemische Bindung zwischen mindestens zwei Atomen besteht und umfassen entsprechend auch biochemische bzw. biologische Verbindungen.

Unter niedermolekulare Verbindungen sollen hierin solche verstanden werden, die ein Molekulargewicht von weniger als 10 000 aufweisen und insbesondere solche, die Kohlen stoff enthalten. Derartige Verbindungen sollen auch Car bonsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydratmonomere, Lipide, ein schließlich Steroide, Lactame, Lactone und andere ein schließen. Unter Proteinen sollen hierin auch Peptide und allgemein Polymere von mindestens zwei peptidisch mitein ander verbundenen Aminosäuren verstanden werden.

Unter Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuresequenz sollen hierin sowohl DNA als auch RNA verstanden werden. Die Nukleinsäu re(-Sequenz) kann sowohl nackt als auch komplexiert/asso ziiert vorliegen. Desweiteren ist möglich, daß die Nu kleinsäure(-Sequenz) als Einzelstrang, Doppelstrang oder als Triplett vorliegt. Die Nukleinsäuresequenz kann auch ein Ribozym sein oder eine antisense Nukleinsäure. Deswei teren kann sie sowohl natürlich vorkommend sein als auch rekombinant. Die Nukleinsäure(-Sequenz) kann weitergehende Elemente umfassen, die sowohl ihre Transkription als auch Translation und ihre Stabilität beeinflussen. So kann sie beispielsweise Promotoren, zellspezifische ebenso wie in duzierbare, Terminatoren und weitergehende regulatorische Elemente wie beispielsweise Enhancer umfassen. Schließlich kann die Nukleinsäure(-Sequenz) auch Elemente umfassen, die die Insertion der Nukleinsäure(-Sequenz) in das Chro mosom einer transfizierten Zelle erlauben, oder aber auch Elemente, die verhindern, daß es zu einer Insertion der Nukleinsäure(-Sequenz) in das zelluläre Genom kommt. Letzteres kann beispielsweise dann besonders erwünscht sein, wenn lediglich eine transiente Expression der trans fizierten Nukleinsäure(-Sequenz) erwünscht ist.

Grundsätzlich kann die Nukleinsäure(-Sequenz) so gestaltet vorliegen, daß sowohl auf der RNA-Ebene als auch der Translations- und Transfektions-Ebene die erwünschte Wir kung erzielt wird. Die hierzu in der Nukleinsäure(-Se quenz) selbst vorzunehmenden Maßnahmen bzw. die Gestaltung eines Milieus, innerhalb dessen die Nukleinsäure(-Sequenz) die entsprechenden Eigenschaften oder Wirkungen aufweist, wie beispielsweise eine spezielle Konfiguration wie die Z-Konfiguration, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.

Unter Nukleinsäure sollen hierin auch Oligonukleotide ver standen werden, einschließlich antisense-Oligonukleotide zur Steuerung der Transkription und/oder Translation von in Zellen vorhandenen Nukleinsäuresequenzen.

Die Transfektion von Zellen mittels Liposomen ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Transfektion von Zellen ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen sowohl für den Fall von Vorteil, daß die Zellen, ausge wählt aus der Gruppe, die Hautzellen des Stratum corneum, Stratum granulosum und Stratum spinosum sowie Keratinozy ten umfaßt, bzw. Keratinozyten der Haarfollikel bzw. epi dermale Langerhans-Zellen, in vivo als auch für den Fall, daß die vorgenannten Zellen ex vivo transfiziert werden.

Aus dem oben Gesagten ergibt sich, daß die den erfindungs gemäßen Liposomen inhärenten Vorteile auch und besonders dann realisiert werden können, wenn diese in einer pharma zeutischen Zusammensetzung enthalten sind.

Es wurde überraschend gefunden, daß unter Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen sich allgemein pharmazeutische Zusammensetzungen und insbesondere Mittel zur topischen Verabreichung chemischer Verbindungen herstellen lassen, die in besonders effektiver Weise eine Freisetzung der in der intraliposomalen Phase enthaltenen chemischen Verbin dungen in die Zelle bzw. die tieferen Schichten der Epi dermis und der Dermis ermöglichen. In einem weiteren Aspekt wird darüber hinaus auch möglich, eine spezielle Form der Depotverabreichung der in den Liposomen enthalte nen chemischen Verbindungen zu realisieren.

Unter pharmazeutisch akzeptablem Träger werden, unter an derem, Wasser, Pufferlösungen und dergleichen verstanden. Dies schließt hierin insbesondere auch jene den Fachleuten bekannten Träger ein, die bei der Herstellung topischer Applikationsformen wie Cremes, Salben, Gele, Sprühpflaster und Tinkturen verwendet werden.

Unter chemischen Verbindungen sollen die hierin oben defi nierten Verbindungen verstanden werden und schließen ins besondere die dort, wenngleich nicht abschließend, be schriebenen Nukleinsäuren ein.

Die hierin offenbarten Mittel stellen letztendlich Ausfüh rungsformen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusam mensetzung dar.

Sowohl die hierin beschriebene pharmazeutische Zusammen setzung als auch die Mittel zur topischen Verabreichung können darüber hinaus noch mindestens einen Wirkstoff ent halten, der nicht in den darin enthaltenen Liposomen vor liegt.

Das Mittel zur topischen Verabreichung selbst kann dabei ausgebildet sein als Creme, Salbe, Gel, Sprühpflaster oder Tinktur. Diese Mittel erlauben die Aufnahme der er findungsgemäßen Liposomen in eine Matrix, die dann, typi scherweise auf die Haut, aufgetragen wird und - ggf. nach einer Einwirkzeit - den Kontakt zwischen Zelle und Liposom ermöglicht. Durch die Verteilung der Liposomen in besagter Matrix läßt sich somit - statistisch - auch die Transfek tionshäufigkeit einer einzelnen Zelle regulieren.

Die obengenannten topischen Verabreichungsformen erlauben darüber hinaus, daß ein vergleichsweise großes Areal der Haut entsprechend behandelt wird, d. h. wenn in der intra liposomalen Phase Nukleinsäuresequenzen vorhanden sind, ein großes Areal von Hautzellen transfiziert werden kann. Die Transfektion, insbesondere in ihrer klinischen Anwen dung, ist dann besonders einfach durchführbar, ohne daß hierfür besonders qualifiziertes Personal oder besondere hygienische Bedingungen erforderlich wären.

Die erfindungsgemäßen Mittel können hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, Handhabbarkeit und Stabilität durch Modifika tion der die Matrix derselben ausbildenden Verbindungen in für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Art und Weise ausgebildet werden. Dies schließt den Zusatz weiterer, für die Ausbildung von Cremes, Salben, Gelen, Sprühpflastern und Tinkturen üblichen Zusätzen ein.

Sowohl die Liposomen als solche als auch die sie enthal tenden erfindungsgemäßen Mittel sind besonders vorteilhaft in der Gentherapie von Hautzellen aufgrund der durch sie erreichbaren Transfektionsraten zu verwenden. Dabei ist es möglich, daß die entsprechenden Hautzellen, und insbeson dere die humanen Keratinozyten, einschließlich derjenigen der Haarfollikel, sowie die epidermalen Langerhans-Zellen, in situ, d. h. als Teil der Hautoberfläche des Patienten, vorliegen, aber es ist auch eine ex vivo Gentherapie mög lich, wenn die Hautzellen oder Hautgewebe, und auch hier wiederum speziell die humanen Keratinozyten, einschließli ch derjenigen der Haarfollikel, sowie die epidermalen Lan gerhans-Zellen, in Kultur vorliegen. Es ist offensicht lich, daß bei der in situ Situation das erfindungsgemäße Mittel mit einem Gehalt an Nukleinsäure in der intralipo somalen Phase mit besonderen Vorteilen verbunden ist, wo hingegen im Falle der ex vivo Gentherapie insbesondere die erfindungsgemäßen Liposomen die hierin offenbarten Vortei le im besonderen Maße aufweisen.

Insbesondere bei transienter Genexpression der mittels der erfindungsgemäßen Liposomen in die Hautzellen eingebrach ten Nukleinsäure(-Sequenzen) ist eine einfache Wiederho lung der Therapie sowie leichte Steuerung des Therapieum fanges durch eine entsprechende breitflächige topische Applikation des erfindungsgemäßen Mittels problemlos mög lich. Insbesondere unter dem Aspekt der wiederholten Be handlung ist dabei beachtlich, daß gegen die solchermaßen in das biologische System, beispielsweise die menschliche Haut, eingebrachte Nukleinsäure keine gegen diese gerich tete Immunreaktion festgestellt wird.

Bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Liposomen, des er findungsgemäßen Mittels oder der erfindungsgemäßen pharma zeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie von Hautzellen, und speziell von Keratinozyten, einschließlich derjenigen der Haarfolikel, sowie von Langerhans-Zellen, ist dabei grundsätzlich möglich, durch die eingeschleusten Nuklein säuresequenzen eine einen Defekt der transfizierten Zelle komplementierende Wirkung zu erzielen, oder aber die un erwünschte Expression einer in der Zelle vorhandenen gene tischen Information mittels der durch die Liposomen einge führten Nukleinsäuresequenz zu unterdrücken.

Die letztgenannte Möglichkeit gilt auch für den Fall, daß die erfindungsgemäßen Liposomen bzw. das erfindungsgemäße Mittel bei der Behandlung systemischer Erkrankungen ver wendet wird. Dabei kommt es infolge der Liposomen-vermit telten Transfektion der Hautzellen zur Produktion des durch die in die Zelle eingeschleusten Nukleinsequenz kodierten Genproduktes, das dann seinerseits seine biologische Wir kung entfalten kann. Dabei ist es möglich, daß das ent sprechende Genprodukt aus der gefäßlosen Epidermis an den Blutkreislauf abgegeben und somit systemisch zur Verfügung steht. Gegenüber der Verabreichung entsprechender Proteine oder Peptide erlaubt die Gentherapie von Hautzellen, daß die entsprechende Information transient, typischerweise über einen Bereich von 2 bis 7 Tagen, kontinuierlich in hoher lokaler Gewebekonzentration exprimiert wird und ge währleistet somit gegenüber der Verabreichung des Peptids bzw. Proteins als solchem einen länger anhaltenden kon stanten Titer, da das Protein als solches nur eine geringe biologische Halbwertszeit aufweist.

Neben der Behandlung echter systemischer Erkrankungen wie beispielsweise Hämophilie A und Hämophilie B sind auch Kollagendegenerationen unter Verwendung der erfindungsge mäßen Liposomen oder des erfindungsgemäßen Mittels, ggf. kosmetisch, behandelbar.

Unter Kollagendegenerationen sollen hierin auch Lichtder matosen verstanden werden, bei denen es unter UV-Exposi tion zur Degeneration von Kollagen (und Elastin) und somit zur Faltenbildung kommt. Hier ermöglicht die hierin offen barte Gentherapie von Hautzellen bzw. die erfindungsgemä ßen Liposomen oder das erfindungsgemäße Mittel vorteilhaf te Wirkungen, da infolge des transienten Charakters der Gentherapie der Keratinozyten eine Reversibilität der vor genommenen Maßnahmen gegeben ist. Die sich daraus ergeben den Vorteile, insbesondere in der Kosmetik, sind offen sichtlich. So ist beispielsweise an eine erneute Kollagen- und Elastinproduktion durch die gentherapierten Hautzellen denkbar, mit der Folge, daß diese für die Haut, insbeson dere deren Aussehen, so wichtigen Strukturstoffe endogen gebildet werden können.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen zur Behandlung von Warzen liegt das Prinzip wiederum in der gentherapeutischen Behandlung der die Warze ausbildenden Hautzellen, welche typischerweise mit viraler DNA infi ziert sind. Entsprechend können durch die Liposomen die vorgenannten Zellen transfiziert werden und auf molekula rer Ebene das zur Warzenbildung führende Geschehen letzt endlich unterdrückt werden. Besonders bewährt hat sich hierbei die Interferon-α-Plasmid-Expression in Warzen, die durch hohe intraläsionale Spiegel an Interferon-α-Protein zum kompletten Rückgang der Papillom führt.

Der Behandlung von Alopezie unter Verwendung der erfin dungsgemäßen Liposomen liegt ebenfalls das Prinzip zugrun de, daß letztendlich durch gentherapeutische Veränderung des Geno- und Phänotyps der Haarfollikelzellen bzw. der entsprechenden Keratinozyten das Krankheitsbild abge stellt, zumindest aber vermindert werden kann. Entspre chende Expression von Antagonisten der Androgen-Rezeptoren sowie von im Haarwachstumszyklus relevanten Cytokinen (z. B. : TGF, Transforming Growth Factor; EGF - Epidermal Growth Factor) stellen wesentliche Ansatzpunkte einer sol chen Technologie dar.

Von ganz besonderer Bedeutung ist die Verwendung der er findungsgemäßen Liposomen bei der Immunisierung eines Wirtsorganismus, wobei hierin unter Wirtsorganismus ins besondere Säugetiere, darunter Nutz- und Haustiere sowie Zootiere, wie Rind, Schwein, Pferde, Hunde, Katzen, Rat ten, Mäuse, Affen und Geflügel verstanden werden sollen. Letztendlich können die erfindungsgemäßen Liposomen in all jenen animalischen Systemen zur Anwendung gelangen, in denen Langerhans-Zellen vorhanden sind, insbesondere jene in der Haut vorhandenen, die in der Lage sind, Antigen zu präsentieren. So kann, beispielsweise bei topischer Auf tragung einer die erfindungsgemäßen Liposomen enthaltenden topischen Applikationsform, wie beispielsweise einer Cre me, eine Transfektion der Langerhans-Zellen mit in der intraliposomalen Phase enthaltenen Nukleinsäure erfolgen, mit der Wirkung, daß das durch die besagte Nukleinsäure kodierte Antigen in den Langerhans-Zellen exprimiert sowie von diesen zur Stimulierung der Immunantwort an der Zell oberfläche präsentiert wird.

Somit besteht eine wirksame Möglichkeit, einen Wirtsorga nismus gegen ein jegliches Antigen zu immunisieren, das durch eine Nukleinsäure direkt oder indirekt kodiert und durch Langerhans-Zellen an der Zelloberfläche präsentiert werden kann.

Ein solches Antigen, gegen das im Wirtsorganismus eine Immunantwort erzeugt werden soll, wird hierin als inter essierendes Antigen bezeichnet.

Eine derartige Immunisierung ist dabei nicht nur auf die Präsentation von Antigen durch die Langerhans-Zellen be schränkt, was einer aktiven Immunisierung gleichkommt, sondern ermöglicht auch eine passive Immunisierung der Gestalt, daß entsprechende Antikörper bzw. Fragmente da von, die für ein interessierendes Antigen spezifisch sind, durch mit den erfindungsgemäßen Liposomen, die eine für den Antikörper bzw. ein Fragment davon kodierende Nuklein säure enthalten, transfizierte Hautzellen exprimiert und an den Blutkreislauf gegeben werden können, ähnlich wie bei der oben beschriebenen Therapie systemischer Erkran kungen.

Unter Antikörper sollen hierin auch Antikörperderivate verstanden werden, so z. B. auch solche nur aus einer Ket te bestehende, trunkierte oder aufgrund der Spezifität des interessierenden Antigens speziell hinsichtlich ihrer Bin dungsstelle konstruierte entsprechende Moleküle. Derartige Antikörper sowie deren Derivate und andere sind dem Fach mann auf diesem Gebiet bekannt.

Die vorgenannte Immunisierung, insbesondere wenn diese durch Verwendung einer topischen Applikationsform bedingt wird, weist ganz besondere Vorteile der Gestalt auf, daß sie ausgesprochen leicht durchführbar ist in dem Sinne, daß kein qualifiziertes Personal benötigt wird und insbe sondere hygienisch in bestimmten Lagen bedenkliche Injek tionen vermieden werden. Darüber hinaus ergeben sich Vor teile hinsichtlich der Haltbarkeit eines die erfindungs gemäße Liposomen umfassenden Impfstoffes, welcher durch die erfindungsgemäßen Liposomen, die pharmazeutische Zu sammensetzung oder die erfindungsgemäßen Mittel dargest ellt wird. Diese erhöhte Haltbarkeit wird im wesentlichen dadurch bedingt, daß nicht irgendwelches proteinhaltiges Material, sei es nun das Antigen bei der aktiven Immuni sierung oder der Antikörper oder das Antikörperfragment bei der passiven Immunisierung, noch dazu in für die In jektion geeigneter Weise, vorliegen muß.

Aus der Tatsache, daß der Impfstoff im engeren Sinne erst durch die Langerhans-Zellen gebildet und letztendlich prä sentiert wird, bedingt auch einen erheblichen Kostenvor teil, da auf eine Produktion von proteinhaltigem Material mit anschließender Aufreinigung verzichtet werden kann.

Aus dem im folgenden angeführten Beispiel betreffend die Herstellung der erfindungsgemäßen Liposomen werden weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung offenbart, wobei

Fig. 1 eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Gefrierbruchs (FFEM) von menschlichen Stratum corneum-Lipid-Liposomen bei Präparation durch Detergenzdialyse zeigt,

Fig. 2 eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Gefrierbruchs (FFEM) von menschlichen Stratum corneum-Lipid-Liposomen, hergestellt durch Ultraschallbehandlung, zeigt,

Fig. 3 eine Nicomp Größenverteilungsanalyse von Stratum corneum-Lipid-Liposomen, hergestellt durch Ultraschallbehandlung, mit inverser La place-Transformation (bimodale Verteilung) zeigt,

Fig. 4 eine Nicomp Größenverteilungsanalyse von Stratum corneum-Lipid-Liposomen, hergestellt durch Detergenzdialyse, mit inverser Laplace- Transformation (bimodale Verteilung) zeigt

Fig. 5 die Zeta-Potentialverteilung der durch Ultra beschallung hergestellten Stratum corneum- Lipid-Liposomen darstellt und

Fig. 6 das Ergebnis der Transfektion humaner Haut mittels Plasmid-DNA enthaltenden erfindungs gemäßen Liposomen zeigt.

Beispiel 1 Herstellen der erfindungsgemäßen Liposomen Gewinnung des stratum corneum-Lipids

Aus kleinen, bei chirurgischen Eingriffen anfallenden Hautstücken wurde die Hornschicht enzymatisch mittels Trypsinierung gewonnen und das Gesamtlipid nach einer mo difizierten Bligh & Dyer-Methode extrahiert [Lasch, J.; J. Liposome Res. 4 (1), 93-106 (1994)]. Alternativ wurde abge schabte plantare Hornhaut verwendet.

Die Proben wurden im Dunkeln mit Chloroform/Methanol (1 : 1) bei kräftigem Schütteln in einer Stickstoffatmosphä re extrahiert. Ein Drittel des Volumens wurde als PBS-Puf fer zugesetzt, um Cholesterolsulfat in die organische Pha se durch NaCl "auszusalzen". Die Mischung wurde gevortext und die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Die untere organische Phase wurde gesammelt und unter N₂ getrocknet.

Die Lipidzusammensetzung des plantaren Stratum corneum wurde durch Messung der Flächen unter den Reflexionsab sorptionskurven nach Trennung durch HPTLC [(Automated Mul tiple Development HPTLC von CAMAG; Muttenz, Schweiz); Zel lmer, S.; Journal of Chromatography B, 691 (1997), 321-329] und Kalibrierung mit dem jeweiligen Lipid an mehr als 100 Probanden quantifiziert. Die Anfärbung erfolgt mittels CuSO₄/H₃PO₄ in 5%igem Methanol.

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die verschiedenen Li pidklassen entsprechend ihrem prozentualen Anteil (Mittel werte) angegeben:

Tabelle 1

Mittelwerte der verschiedenen das Stratum corneum- Lipid ausbildenden Lipidklasse, angegeben in Gewichtspro zenten

Herstellung von menschlichen Stratum corneum-Lipid-Liposo men (hSCLLs)

HSCLLs wurden zum einen durch Ultraschall hergestellt, indem eine Lipiddispersion in PBS, pH 7,4, im Branson So nifier bis zur Transparenz beschallt wurde, wobei die Be schallung in Intervallen von 0,5 min unter Eiswasserküh lung erfolgte.

Alternativ wurden mit der sogenannten Detergenzverdün nungsmethode hSCLLs hergestellt. Speziell wurden Cholat/- Lipid-Mischmizellen in einem speziellen Rotationsdialysa tor (Diachem AG, Lagnau/Zürich) in Lipidvesikel überführt.

Die Ergebnisse beider Verfahren sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt, wobei Fig. 1 eine elektronenmikroskopische Aufnahme (FFEM) eines Gefrierbruches von hSCLLs zeigt, die durch Detergenzdialyse hergestellt wurden, und in Fig. 2 eine elektronenmikroskopische Aufnahme (FFEM) eines Ge frierbruches von hSCLLs zeigt, die durch Ultrabeschallung hergestellt wurden.

In beiden Fällen repräsentiert der dargestellte Balken 100 nm und die eingekreisten Pfeile die Bedampfungsrichtung.

Die hSCLLs wurden weitergehend hinsichtlich ihrer Größen verteilung durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) mit einem Nicomp Submicron Particle Sizer, Model 370, cha rakterisiert. Die entsprechenden Ergebnisse sind in den Fig. 3 und 4 dargestellt, wobei Fig. 3 die Ergebnisse der durch Beschallung hergestellten Liposomen und Fig. 4 die durch Detergenzdialyse hergestellte Liposomen zeigt.

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß 74,62% der Liposomen einen Durchmesser von 160,6 nm aufweisen, wobei eine zwei te, bedeutend kleinere Fraktion, die 25,38% der Liposomen ausmacht, einen Durchmesser von 416,7 nm aufweist.

Bei der Herstellung der Liposomen mittels Detergenzdialyse sind, wie aus Fig. 4 ersichtlich, ebenfalls zwei Popula tionen von Liposomen hervorgegangen, wobei 87,3% der Li posomen einen Durchmesser von 183,5 nm aufweisen, gegen über einer zweiten, wenngleich mit 12,7% deutlich gerin geren Population, die einen Durchmesser von 979,7 nm auf weist.

In beiden Fällen wurden die vorgenannten Daten aus den Primärdaten unter den folgenden Bedingungen erhalten:
Glättungsfaktor 3, minimaler Durchmesser 80 nm, plot size 39, gesammelte Impulse 8000 K in 30 Min., Zählrate 300 Hz.

In Fig. 5 ist die Bestimmung des Zeta-Potentials der hSC- LLs dargestellt, die mit der Zeta Master Version PCS: v1.2 (Malvern Instruments, England) im Zelltyp ZEMO10 Cross Beam Mode bestimmt wurde (Lasch, J.; J. Liposome Res. 5(1), 99-108 (1995).

Wie aus Fig. 5 ersichtlich, beträgt das Zeta-Potential der hSCLLs -64 bis -66 mV. Dieser relativ hohe negative Wert kann auf den Gehalt an Cholesterolsulfat zurückgeführt werden.

Die einzelnen, verschiedenen Zetapotentialen entsprechen den Intensitäten sind nochmals in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Zetapotentialverteilung (mV) von durch Beschal lung hergestellten hSCLLs

Andere Verfahren zur Kennzeichnung der die Liposomenhülle ausbildenden Lipidschicht, wie beispielsweise die Messung der Phasenübergangstemperatur (T_m) ergab keine Ergebnisse, was durch den hohen Gehalt an Cholesterol im Stratum cor neum-Lipid bedingt wird.

Beispiel 2 Transfektion humaner Haut mittels der erfindungsgemäßen Plasmid-DNA-enthaltenden Liposomen

50 µg Plasmid-DNA wurden mit einem entsprechenden Anteil an lyophilisiertem Lipidgemisch versetzt, wobei das Lipid gemisch in der unter Beispiel 1 erläuterten Weise herge stellt wurde. Unter intensivem Schütteln wurden Plasmid- DNA enthaltende humane Stratum corneum-Liposomen gebildet.

Nach entsprechender Vorbehandlung (Menk) bzw. Hydrierung des Stratum corneums mit Urea MENK (50 mM MOPS, 50 mM ED TA, 50 mM NaCl, 50 mM K₃PO₄) erfolgte die Applikation des oben genannten Plasmid-DNA-haltigen Liposomengemisches. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die entspre chenden Hautproben in ihre epidermalen und dermalen Antei le getrennt. Der epidermale Anteil wurde in einem quanti tativen Test auf β-Galactosidase-Proteinaktivität unter sucht. Nach Lyse der Epidermis in Lysepuffer mit mechani scher Zerkleinerung wurden 2 ml des Zellextraktes mit Re aktionspuffer (0,035 mmol Galacton) Chemilumineszenz-Sub strakt (Tropix Bedford, Massachusetts) gemischt. Nach der Inkubation für eine Stunde wurde Emerald Lumineszenzver stärker (Tropix Bedford, Massachusetts) hinzugegeben und die Chemilumineszenz in einem Chemiluminometer (z. B. Mo nolight 1005, Analytical Lumineszenz, San Diego, Califor nien) gemessen. Die β-Galactosidase-spezifische Aktivität in den epidermalen Extrakten wurde als Verhältnis der Lichteinheiten geteilt durch den Proteingehalt ermittelt. Die Negativkontrolle wurde durch nicht-β-Galactosidase exprimierende Plasmide (z. B. Vektorkontroll-DNA) unter identischen Bedingungen erhalten. Jegliche Messungen wur den in Duplikaten durchgeführt. Die Anzahl der unabhängi gen Versuche ist in Fig. 6 für jede der Behandlungsgrup pen dargestellt. Die absoluten Mengen an β-Galactosidase- Enzym kann ermittelt werden, indem die erhaltenen Werte der Lichteinheiten mit einer Eichkurve verglichen werden, die durch Hinzufügen bekannter Mengen an gereinigtem β-Galactosidaseenzym zu β-Galactosidase-negativen epidermalen Zellextrakten konstruiert wurde. Zusammenfassend zeigt sich, wie in Fig. 6 dargestellt, in Abhängigkeit entspre chend der Vorbehandlung eine hochsignifikante Steigerung der in der Epidermis hergestellten Menge an β-Galactosi dase-Markerprotein.

Eine Steigerung der Transfektionseffizienz bzw. der Menge an erhaltenen Genprodukten ist im Rahmen der üblichen Fä higkeiten eines Fachmanns auf diesem Gebiet beispielsweise durch weitergehende Optimierung bzw. Vorbehandlung mit anderen Penetrationsverstärkern bzw. Zurverfügungstellung von geeigneten Nukleinsäurekonstrukten möglich.

Die in der vorstehenden Beschreibung sowie in den Ansprü chen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl ein zeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirkli chung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsfor men wesentlich sein.

Claims

1. Liposom umfassend eine eine Liposomenhülle ausbildende Lipidphase und eine von der Lipidphase umschlossene intra liposomale Phase, dadurch gekennzeichnet, daß die chemi sche Zusammensetzung der Lipidphase der einer Hautschicht entspricht und die intraliposomale Phase mindestens eine Verbindung enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und nieder molekulare Verbindungen sowie aus diesen zusammengesetzte Moleküle oder Strukturen umfaßt.

2. Liposom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautschicht humane Epidermis ist.

3. Liposom nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautschicht das Stratum corneum ist.

4. Liposom umfassend eine eine Liposomenhülle ausbildende Lipidphase und eine von der Lipidphase umschlossene intra liposomale Phase, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom betreffend die Lipidklassen folgende Komponenten erfaßt:
Phospholipide: < 2 Gew.-% Cholesterolsulfat: 2 Gew.-% Freie Fettsäuren: 20 Gew.-% Ceramide: 20 Gew.-% Sterole: 43 Gew.-% Triacylglycerole (Neutralfette): 4 Gew.-% Sterolester: 9 Gew.-%

5. Verfahren zur Herstellung von Liposomen, dadurch geken nzeichnet, daß

a) Stratum corneum-Lipid gewonnen wird und
b) aus dem Stratum corneum-Lipid unter Ultraschallbehand lung und/oder Detergenzdialyse Liposomen hergestellt wer den.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Stratum corneum-Lipid gewonnen wird, indem Stratum corneum enzymatisch und/oder mechanisch von der Haut abge tragen wird und anschließend in Methanol-Chloroform extra hiert wird.

7. Liposom, herstellbar gemäß einem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.

8. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die intraliposomale Phase eine wäß rige Phase ist.

9. Liposom nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekenn zeichnet, daß die Verbindung ausgewählt ist aus der Grup pe, die Wachstumsfaktoren, Antibiotika, schmerzlindernde Agenzien, Agenzien, die die Zellteilung und/oder die Vas kularisierung beeinflussen, koagulierende und anti-koagu lierende Agenzien, Cytokine, chemisches Attraktans, Enzy me, und Kombinationen davon umfaßt.

10. Liposom nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekenn zeichnet, daß die Verbindung eine Nukleinsäuresequenz ist.

11. Verfahren zur Transfektion von Zellen, dadurch gekenn zeichnet, daß die zu transfizierenden Zellen mit einem Liposom gemäß einem der vorangehenden Ansprüche in Kontakt gebracht werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zu transfizierenden Zellen Hautzellen sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautzellen ausgewählt sind aus der Gruppe, die Hautzellen des Stratum corneum, Stratum granulosum und Stratum spinosum sowie Keratinozyten umfaßt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch ge kennzeichnet, daß die Zellen Keratinozyten der Haarfollikel sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch ge kennzeichnet, daß die Zellen epidermale Langerhans-Zellen sind.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche sowie einen pharma zeutisch akzeptablen Träger.

17. Mittel zur topischen Verabreichung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Liposomen nach einem der vorangehen den Ansprüche.

18. Mittel nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die Cremes, Sal ben, Gele, Sprühverbände und Tinkturen umfaßt.

19. Mittel nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeich net, daß es weiterhin einen Gehalt an mindestens einer Verbindung aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Permeabilitätsverstärker und Quellmittel umfaßt.

20. Verwendung der Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Mittels nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Genthe rapie von Hautzellen.

21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautzellen in situ vorliegen.

22. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautzellen ex vivo vorliegen.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 20-22, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautzellen ausgewählt sind aus der Gruppe, die Hautzellen des Stratum corneum, Stratum granu losum und Stratum spinosum sowie Keratinozyten umfaßt.

24. Verwendung nach einem der Ansprüche 20-23, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautzellen Keratinozyten der Haar follikel sind.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 20-24, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautzellen epidermale Langerhans- Zellen sind.

26. Verwendung der Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Mittels nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Prophy laxe und/oder Behandlung von Erkrankungen der Haut.

27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die ge netische Hauterkrankungen, Psoriasis, Hauttumoren und Wun den umfaßt.

28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Hauterkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Epidermolysis bullosa simplex, Epidermolysis hyperkeratosis, palmoplantare Keratose, junktionale Epi dermolysis bullosa, dystrophe Epidermolysis bullosa, la mellare Ichthyose und Xeroderma pigmentosum umfaßt.

29. Verwendung der Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Mittels nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Behand lung von Warzen.

30. Verwendung der Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Mittels nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Behand lung systemischer Erkrankungen.

31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die systemische Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Hämophilie A und Hämophilie B sowie Kollagen degenerationen umfaßt.

32. Verwendung der Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Mittels nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Behand lung von Alopezie.

33. Verwendung der Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Mittels nach einen der vorangehenden Ansprüche zur Immuni sierung eines Wirtsorganismus.

34. Verwendung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus ein menschlicher Organismus ist.

35. Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff einen Gehalt an Liposomen nach einem der vorangehenden Ansprüche aufweist, wobei die Liposomen Nukleinsäure, die die genetische Information für ein interessierendes Anti gen umfaßt, oder Nukleinsäure umfassen, die die genetische Information für einen Antikörper oder ein Antikörperfrag ment umfaßt, wobei der Antikörper bzw. das Antikörperfrag ment spezifisch für das interessierende Antigen ist.