DE19739940A1

DE19739940A1 - Protein with amino acid sequence of DELTA7 sterol reductase, isolated cDNA molecule which codes for the protein, recombinant DNA vector and biologically active compositions which contain the protein or the cDNA molecule

Info

Publication number: DE19739940A1
Application number: DE1997139940
Authority: DE
Inventors: Hartmut Prof Dr Med Glossmann; Fabian Dr Med Moebius; Barbara Dr Rer Nat Fitzky
Original assignee: Glossmann Hartmut Prof Drmed 99880 Waltershausen De
Current assignee: Glossmann Hartmut Prof Drmed 99880 Waltershausen De
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 1999-03-18
Also published as: WO1999013086A1; EP1073752A1

Abstract

The invention relates to the cDNA, the protein coded by the open reading frame and the gene for the human enzyme DELTA 7 sterol reductase, revealing the amino acid sequence of human DELTA 7 sterol reductase and of the gene of human DELTA 7 sterol reductase. The invention also provides methods for producing and isolating the human DELTA 7 sterol reductase enzyme and for producing sections of the gene and of the cDNA. Biologically active compositions containing the inventive protein, the isolated cDNA molecule or a recombinant DNA vector either as a whole or in sections in a suitable carrier material can be used for diagnostic and pharmaceutical purposes.

Description

Gegenstand der Erfindung ist die cDNA, das vom offenen Leserahmen kodierte Protein und das Gen für das Enzym Δ7-Sterolreduktase des Menschen, wobei vorhandene Polymorphismen und Mutationen eingeschlossen sind.The invention relates to the cDNA, that of the open reading frame encoded protein and the gene for the enzyme Δ7-sterol reductase des Humans, including existing polymorphisms and mutations are.

Bei Patienten mit dem angeborenen Smith-Lemli-Opitz Syndrom wurden im Blut erhöhte Mengen der Zwischenprodukte der Cholesterinbiosynthese 7-De hydrocholesterol und 8-Dehydrocholesterol gefunden. Diese Sterolmetaboliten eignen sich deshalb zur Diagnose des Smith-Lemli-Opitz Syndroms. Das Syndrom wird auf eine verminderte enzymatische Aktivität des Enzyms Δ7-Sterolreduktase zurückgeführt (S. Tint et al., (1994), N. Engl. J. Med. 330, Seite 107 bis 113).Patients with the congenital Smith-Lemli-Opitz syndrome were Blood increased levels of 7-De intermediate cholesterol biosynthesis hydrocholesterol and 8-dehydrocholesterol found. This Sterol metabolites are therefore suitable for the diagnosis of Smith-Lemli-Opitz Syndrome. The syndrome is due to decreased enzymatic activity of the enzyme Δ7-sterol reductase is attributed (S. Tint et al., (1994), N. Engl. J. Med. 330, pages 107 to 113).

Die Δ7-Sterolreduktase von Säugern, einschließlich von Menschen, katalysiert die Reaktion 7-Dehydrocholesterol + NADPH → Cholesterol + NADP + H
The Δ7 sterol reductase from mammals, including humans, catalyzes the reaction 7-dehydrocholesterol + NADPH → cholesterol + NADP + H

NADP = Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
NADPH = Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat in reduzierter Form. NADP = Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NADPH = nicotinamide adenine dinucleotide phosphate in reduced form.

State of the art

In US-A-5,525,496 ist ein Gen beschrieben, das für die Δ14-Ste rolreduktase von Saccharomyces cerevisiae kodiert. Die gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, für die die Δ14-Sterolreduktase kodiert, kodiert für ein Polypeptid, das Homologie zu dem bei der Biosynthese von Ergosterol beteiligten Sterol-C24(28)-Reduktaseenzym von S. cerevisiae aufweist.In US-A-5,525,496 a gene is described which for the Δ14-Ste Rolreductase encoded by Saccharomyces cerevisiae. The cleaned and isolated DNA sequence encoded by the Δ14 sterol reductase for a polypeptide that has homology to that in the biosynthesis of Ergosterol involved sterol C24 (28) reductase enzyme from S. cerevisiae having.

Aus WO/97/07219 sind isolierte Nukleinsäuresequenzen bekannt, die für eine Familie von HMG-CoA-Reduktase-Degradations(HRI)polypeptiden kodieren. Es werden Untersuchungen der Cholesterolbiosynthese beschrieben.Isolated nucleic acid sequences are known from WO / 97/07219 which are suitable for a family of HMG-CoA reductase degradation (HRI) polypeptides encode. There are studies of cholesterol biosynthesis described.

Aus EP-A-727 489 ist eine cDNA-Sequenz bekannt, die für ein Protein von Arabidopsis thaliana kodiert. Es sind auch mehrere Aminosäuresequenzen von Proteinen offenbart, die Aktivität im Zusammenhang mit Δ5,7-Sterolreduktase und Δ7-Sterolreduktase aufweisen.From EP-A-727 489 a cDNA sequence is known which is suitable for a protein of Arabidopsis thaliana encoded. There are also several amino acid sequences of proteins reveals activity-related activity Have Δ5.7 sterol reductase and Δ7 sterol reductase.

In allen lebenden Organismen besteht eine fundamentale Beziehung zwischen genetischem Material (DNA, Desoxyribonukleinsäure) und den vom Organismus synthetisierten Proteinen. Diese Beziehung ist so, daß sich die Aminosäuresequenz des Proteins aus der Nukleotidsequenz der entsprechenden DNA, die für dieses Protein kodiert, ergibt. Jede der zwanzig Aminosäuren, die in Proteinen üblicherweise vorkommen, wird von jeweils einer oder mehreren Trinukleotidsequenzen kodiert. Die spezifische Beziehung zwischen jeder gegebenen Trinukleotidsequenz und ihrer entsprechenden Aminosäure bildet den genetischen Code. Es wird angenommen, daß der genetische Code für alle lebenden Organismen gleich oder zumindest ähnlich ist. Infolgedessen wird die Aminosäuresequenz jedes Proteins nach einer gut verstandenen Beziehung durch eine entsprechende Nukleotidsequenz vorgegeben. Weiterhin kann diese Nukleotidsequenz im Prinzip von jedem lebenden Organismus translatiert werden. There is a fundamental relationship in all living organisms between genetic material (DNA, deoxyribonucleic acid) and that of Organism synthesized proteins. This relationship is such that the amino acid sequence of the protein from the nucleotide sequence of the corresponding DNA coding for this protein results. Each of the Twenty amino acids that are commonly found in proteins are made by each encoded one or more trinucleotide sequences. The specific relationship between any given trinucleotide sequence and their corresponding amino acid forms the genetic code. It will assumed that the genetic code is the same for all living organisms or at least is similar. As a result, the amino acid sequence each protein according to a well understood relationship by one corresponding nucleotide sequence specified. Furthermore, this can Nucleotide sequence in principle translated from any living organism become.

Die Trinukleotide der nachfolgenden Tabelle 1, Codons genannt, kommen im genetischen Material lebender Organismen vor. Die Expression dieser Codons in der Proteinbiosynthese erfordert die intermediäre Bildung von Boten-RNA (mRNA) (messenger RNA). Die Sequenz der Codons auf der mRNA entspricht der Nukleotidsequenz des zum kodierenden Strang des DNA-Dop pelstrangekomplementären Gegenstranges mit entgegengesetzter Strangpolarität. Ein wichtiges und gut bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist seine Redundanz, wodurch für die meisten der Aminosäuren, die bei der Biosynthese von Proteinen eine Rolle spielen, mehr als nur ein kodierendes Nukleotid-Triplett zur Verfügung steht. Es kann daher eine Anzahl verschiedener Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz kodieren. Diese Nukleotidsequenzen werden als funktional äquivalent angesehen, da sie im wesentlichen zur Erzeugung derselben Aminosäuresequenz in allen Organismen führen können, wobei bestimmte Stämme die mRNA wirksamer translatieren können als andere Stämme. Gelegentlich kann man eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in einer gegebenen Nukleotidsequenz finden. Derartige Methylierungen berühren jedoch nicht die Spezifität der Codons für die jeweilige Aminosäure.The trinucleotides of Table 1 below, called codons, come in the genetic material of living organisms. The expression of this Codons in protein biosynthesis require the intermediate formation of Messenger RNA (mRNA) (messenger RNA). The sequence of the codons on the mRNA corresponds to the nucleotide sequence of the strand of the DNA dop to be encoded complementary opposite strand with opposite Strand polarity. An important and well known feature of the genetic code is its redundancy, which makes for most of the Amino acids that play a role in protein biosynthesis, more than just a coding nucleotide triplet is available. It can therefore contain a number of different nucleotide sequences for one encode certain amino acid sequence. These nucleotide sequences will be regarded as functionally equivalent, since they are essentially used for Can produce the same amino acid sequence in all organisms, certain strains can translate the mRNA more effectively than other tribes. Occasionally you can get a methylated variant of one Find purins or pyrimidins in a given nucleotide sequence. However, such methylations do not affect the specificity of the codons for the respective amino acid.

Tabelle 1 Table 1

Genetischer Code Genetic code

Schlüssel: Jedes Triplett aus 3 Buchstaben repräsentiert ein DNA-Trinukleotid mit einem 5'-Ende auf der linken und einem 3'-Ende auf der rechten Seite. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimi din-Basen, die die Nukleotidsequenzen bilden.
A = Adenin
C = Cytosin
G = Guanin
U = Uracil
T = Thymin
R = G oder A
Y = T oder C
H = A oder C oder T
N = A oder C oder G oder TKey: Each 3-letter triplet represents a DNA trinucleotide with a 5 'end on the left and a 3' end on the right. The letters stand for the purine or pyrimidine bases that form the nucleotide sequences.
A = adenine
C = cytosine
G = guanine
U = uracil
T = thymine
R = G or A
Y = T or C
H = A or C or T
N = A or C or G or T

Description of the invention

Aufgabe der Erfindung ist
The object of the invention is

(1) To create means that allow missing or only partial active enzyme Δ7-sterol reductase of humans, humans and others To replace animals or defects in the gene of the Δ7-sterol reductase of Being able to diagnose people and with which defective gene in Humans and other animals can be replaced. (2) Creation of Process for the preparation of the enzyme and the functional ones Introduction into eukaryotic cells that the enzyme does not or does not have functioning. (3) Pure presentation of the enzyme Δ7-sterol reductase of humans to missing or only partially active enzymes in humans and to replace other animals. (4) Process for producing Portions of the gene and the cDNA, which are used to detect the cDNA, the Gene or the gene defect in tissues, tissue extracts, on chromosomes or enable DNA sections. (5) drug testing and Natural products in terms of influencing enzyme activity. (6) Manufacture of animal models in which the gene is not or only partially is functional or overfunctioning. (7) Procedure for insertion and removing double bonds in synthetic and natural occurring organic polymeric ring systems.

Diese Aufgabe wird unter anderem gelöst durch ein Protein im Ganzen oder in Teilen mit der Sequenz (SEQ ID Nr. 2):
This problem is solved, inter alia, by a protein in whole or in part with the sequence (SEQ ID No. 2):

Das erfindungsgemäße Protein schließt Proteine ein mit aus dieser Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) abgeleiteten mutierten Sequenzen, einschließlich alle natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen, sowie Proteine in denen die vorstehenden Sequenzen partiell oder trunkiert oder als Hybride mit anderen Proteinsequenzen enthalten sind.The protein according to the invention includes proteins from it Amino acid sequence (SEQ ID No. 2) derived mutant sequences, including all naturally occurring polymorphisms or Mutations, as well as proteins in which the above sequences are partial or truncated or contained as a hybrid with other protein sequences are.

Die erfindungsgemäßen Proteine mit abgeleiteten Sequenzen weisen die Aktivität von Δ7-Sterolreduktase auf und sind insbesondere in der Lage 7-Dehydrocholesterol in Anwesenheit von NADPH in Cholesterol umzuwandeln.The proteins according to the invention with derived sequences have the Activity of Δ7-sterol reductase and are particularly capable 7-dehydrocholesterol in the presence of NADPH in cholesterol convert.

Das erfindungsgemäße Protein kann hergestellt werden, indem man entweder einen Vektor, der für ein solches Protein im Ganzen oder in Teilen kodiert, in einem Wirtsmikroorganismus, in Wirtszellen oder in Gewebe exprimiert oder die Proteinsequenz chemisch synthetisiert.The protein of the invention can be produced by either a vector, in whole or in part, for such a protein encoded, in a host microorganism, in host cells or in tissue expressed or the protein sequence chemically synthesized.

Das mittels heterologer Expression der für Δ7-Sterolreduktase spezifischen humanen DNA erhaltene Protein weist 475 Aminosäurereste und ein Mw von 54516 Dalton auf.That by means of heterologous expression of the for Δ7-sterol reductase specific human DNA protein has 475 amino acid residues and Mw of 54516 daltons.

Das erfindungsgemäße Protein kann im Ganzen oder in Teilen in biologisch aktiven Zusammensetzungen verwendet werden, die das erfindungsgemäße Protein in einem üblichen pharmazeutisch verträglichen flüssigen, gasförmigen oder festen Trägermaterial enthalten, wobei die Zusammensetzungen diagnostischen oder pharmazeutischen Zwecken dienen. Diese Zusammensetzungen können gegebenenfalls weitere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten.The protein according to the invention can be whole or in part in biological active compositions are used which the invention Protein in a common pharmaceutically acceptable liquid, contain gaseous or solid support material, the Compositions are used for diagnostic or pharmaceutical purposes. These compositions can optionally be further pharmaceutical contain compatible auxiliary substances.

Die Lösung der Aufgabe schließt auch ein cDNA Molekül ein, im Ganzen oder Teilen desselben einschließlich aller natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für das erfindungsgemäße Protein als Ganzes oder in Teilen davon kodiert.The solution to the problem also includes a cDNA molecule as a whole or parts thereof, including all naturally occurring ones Polymorphisms or mutations that contain a nucleotide sequence that for the protein according to the invention as a whole or in parts thereof encoded.

Das mittels bekannter Verfahren erhaltene, für Δ7-Sterolreduktase spezifische Gen Gen des Menschen besteht aus 7 Introns und 8 Exons.That obtained by known methods for Δ7-sterol reductase Human specific gene gene consists of 7 introns and 8 exons.

Die Sequenz (SEQ ID Nr. 1) von Δ7-Sterolreductase cDNA ist:
The sequence (SEQ ID No. 1) of Δ7-sterol reductase cDNA is:

Das erfindungsgemäße cDNA-Molekül kann auch ein gegenüber der SEQ ID Nr. 1 modifiziertes cDNA-Molekül sein, das entsprechend der Degeneration des genetischen Codes modifiziert wurde, soweit es für ein Protein mit s der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, bzw. für ein Protein mit einer Sequenz gemäß einem der natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen von Δ7-Sterolreduktase. The cDNA molecule according to the invention can also be compared to SEQ ID No. 1 modified cDNA molecule, which corresponds to the degeneration of the genetic code was modified, insofar as it is for a protein with s the amino acid sequence according to SEQ ID No. 2, or for a protein with a sequence according to one of the naturally occurring polymorphisms or mutations of Δ7 sterol reductase.

Das erfindungsgemäße cDNA-Molekül kann auch gegenüber SEQ ID Nr. 1 so modifiziert sein, daß es für eines der weiteren erfindungsgemäßen Proteine kodiert, d. h. für Proteine deren Sequenzen von SEQ ID Nr. 2 durch weitere Mutationen abgeleitet sind oder dadurch, daß sie die Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder davon durch Mutation abgeleitet Sequenzen partiell oder trunkiert, oder in Form von Hybriden mit anderen kodierenden Sequenzen enthalten.The cDNA molecule according to the invention can also be compared to SEQ ID No. 1 be modified that it for one of the other invention Proteins encoded, d. H. for proteins whose sequences are from SEQ ID No. 2 are derived by further mutations or by the fact that they Sequence of SEQ ID No. 2 or sequences derived therefrom by mutation partially or truncated, or in the form of hybrids with others contain coding sequences.

Die Lösung schließt auch einen rekombinanten DNA-Vektor ein, der vorzugsweise in Menschen oder Tieren, in Zellen oder Geweben oder in einem Mikroorganismus stabil integriert werden kann, oder darin replikationsfähig ist und die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) oder eine der vorstehend genannten cDNAs vollständig oder in Teilen enthält.The solution also includes a recombinant DNA vector that preferably in humans or animals, in cells or tissues or in can be stably integrated into a microorganism, or in it is replicable and the nucleotide sequence (SEQ ID No. 1) or a contains all or part of the aforementioned cDNAs.

Eine erfindungsgemäße cDNA als Ganzes oder in Teilen kann man beispielsweise herstellen, indem man entweder einen rekombinanten Vektor, der die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) oder eine andere erfindungsgemäße cDNA-Sequenz vollständig oder in Teilen enthält in einem Wirtsorganismus vermehrt und die cDNA anschließend isoliert, oder indem man die cDNA-Sequenzen chemisch oder enzymatisch synthetisiert.A cDNA according to the invention as a whole or in parts can be for example, by making either a recombinant Vector representing the nucleotide sequence (SEQ ID No. 1) or another cDNA sequence according to the invention completely or partially contains in a host organism and then isolated the cDNA, or by chemically or enzymatically synthesizing the cDNA sequences.

Die Lösung schließt ferner DNA-Vektoren gemäß den vorstehenden Angaben ein, die zur Expression der in ihnen enthaltenen erfindungsgemäßen cDNA in einem Menschen oder in anderen Tieren, in Zellen, in Geweben oder in Mikroorganismen geeignet sind. Solche DNA-Vektoren (Expressionsvektoren) enthalten geeignete expressionsregulierende Signale, wie Promotoren, z. B. an- und abschaltbare Promotoren, Enhancer usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können auch die nachstehend erwähnten erfindungsgemäßen Gensequenzen für Δ7-Sterolreduktase enthalten und die Expression dieser Gensequenzen in einem Wirtsorganismus, wie einem Menschen oder in anderen Tieren, einem Mikroorganismus oder in Zellen oder Geweben steuern. The solution also includes DNA vectors as described above a, for the expression of the cDNA according to the invention contained therein in a human or in other animals, in cells, in tissues or in Microorganisms are suitable. Such DNA vectors (expression vectors) contain suitable expression-regulating signals, such as promoters, e.g. B. on and off promoters, enhancers, etc. The Expression vectors of the invention may also be those below mentioned gene sequences according to the invention for Δ7-sterol reductase contain and the expression of these gene sequences in one Host organism, such as a human or in other animals, one Control microorganism or in cells or tissues.

Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren sind vorzugsweise zur stabilen Integration in da Genom des Wirtsorganismus oder der Wirtszelle geeignet, oder können darin replizieren.The expression vectors according to the invention are preferably stable Integration in the genome of the host organism or the host cell suitable, or can replicate in it.

Expressionsvektoren, die nicht stabil in das Genom des Wirtsorganismus oder der Wirtszelle integrieren, oder im Wirtsorganismus oder in der Wirtszelle replizieren, jedoch zu einer vorübergehenden Expression der in ihnen enthaltenen Sequenzen geeignet sind (transiente Expression sind jedoch auch bevorzugt.Expression vectors that are not stable in the genome of the host organism or integrate the host cell, or in the host organism or in the Replicate host cell, but to a temporary expression of sequences contained in them are suitable (transient expression are however also preferred.

Die Erfindung schließt auch ein genomisches DNA-Molekül, im Ganzen oder in Teilen, einschließlich aller nicht für das Δ7-Sterolredukta se-Protein kodierenden Bereiche (Introns), soweit diese mit den kodierenden strukturell oder funktionell zusammenhängen, und alle vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen desselben ein, wobei die in diesem genomischen DNA-Molekül enthaltenen Intronsequenzen vorzugsweise ausgewählt sind aus den in den Tabellen 3-9 wiedergegebenen Sequenzen (SEQ ID Nr. 4-17).The invention also includes a genomic DNA molecule, whole or in parts, including all not for the Δ7 sterol reduct Areas coding for se protein (introns), insofar as these correspond to the coding structurally or functionally related, and all occurring Polymorphisms or mutations of the same, the ones in this genomic DNA molecule containing intron sequences preferably are selected from the sequences shown in Tables 3-9 (SEQ ID No. 4-17).

Zur Lösung der Aufgabe gehört auch eine cDNA, die die folgende partielle Nukleotidsequenz der cDNA der Maus enthält (SEQ ID Nr. 18):
A cDNA, which contains the following partial nucleotide sequence of the mouse cDNA (SEQ ID No. 18), also belongs to the solution of the task:

bzw. cDNA-Moleküle, die so modifiziert sind, daß sie eine von der vorstehenden Sequenz SEQ ID Nr. 18 abgeleitete Sequenz aufweisen. Solche modifizierten cDNA-Sequenzen schließen Sequenzen ein, die aufgrund der Degeneriertheit (Redundanz) des genetischen Codes für die von SEQ ID Nr. 18 kodierte Aminosäuresequenz der Maus-Δ7-Sterolreduktase kodieren, bzw. für Aminosäuresequenzen gemäß aller natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen dieser Aminosäuresequenz.or cDNA molecules that are modified so that they are one of the Sequence SEQ ID No. 18 above derived sequence. Such modified cDNA sequences include sequences that due to the degeneracy (redundancy) of the genetic code for the Amino acid sequence of mouse Δ7 sterol reductase encoded by SEQ ID No. 18 encode, or for amino acid sequences according to all natural occurring polymorphisms or mutations of this amino acid sequence.

Solche erfindungsgemäßen cDNA-Moleküle können gegenüber SEQ ID Nr. 18 auch so modifiziert sein, daß sie für Aminosäuresequenzen kodieren, die von der durch SEQ ID Nr. 18 kodierten Aminosäuresequenz durch weitere Mutationen abgeleitet sind, oder daß sie die von SEQ ID Nr. 18 kodierte Aminosäuresequenz oder die davon durch Mutation abgeleiteten Sequenzen partiell, oder trunkiert, oder in Form von Hybriden mit anderen kodierenden Sequenzen enthalten.Such cDNA molecules according to the invention can be compared to SEQ ID No. 18 also be modified so that they code for amino acid sequences that of the amino acid sequence encoded by SEQ ID No. 18 by others Mutations are derived, or that they encoded that of SEQ ID No. 18 Amino acid sequence or the sequences derived therefrom by mutation partial, or truncated, or in the form of hybrids with others contain coding sequences.

Detailed description of the invention (1) Cloning of the cDNA encoding the Δ7 sterol reductase

Mit Hilfe des TBLASTN Algorithmus und der Aminosäuresequenz der Δ7-Sterolreduktase von A. thaliana (Genbank-Hinterlegungsnummer U49398) wurden in der EST (Expressed Sequence Tag)-Datenbank partielle menschliche cDNAs identifiziert und sequenziert (Genbank-Hin terlegungsnummern H09710, M017568, H04989, R61101). Das 5'-Ende der cDNA wurde mit PCR unter Verwendung von Marathon-Ready cDNA aus menschlicher Leber und dem Antisense Oligonucleotid GCAGCGTGAAAGATAAGGC gewonnen. Der offene Leserahmen der 2.652 bp cDNA (SEQ ID Nr. 1) kodiert für ein Protein aus 475 Aminosäuren (MW 54.516 Dalton) mit der Sequenz (SEQ ID Nr. 2). Diese Sequenz weist 35% Identität und 60% Ähnlichkeit mit Δ7-Sterolreduktase aus A. thaliana auf. Abb. 1 zeigt die Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz aus der sich 6-9 putative transmembranäre α-Helices vorhersagen lassen. Sequenzvergleich und Hydrophobizitätsanalyse wurden mit dem Wisconsin Sequence Analysis Package mit dem Algorithmus von Smith & Waterman bzw. Kyte & Doolittle berechnet (Genetics computer group, Programe Bestfit und PepPlot). Using the TBLASTN algorithm and the amino acid sequence of A. thaliana Δ7 sterol reductase (Genbank accession number U49398), partial human cDNAs were identified and sequenced in the EST (Expressed Sequence Tag) database (Genbank accession numbers H09710, M017568, H04989, R61101). The 5 'end of the cDNA was obtained by PCR using marathon-ready cDNA from human liver and the antisense oligonucleotide GCAGCGTGAAAGATAAGGC. The open reading frame of the 2,652 bp cDNA (SEQ ID No. 1) codes for a protein of 475 amino acids (MW 54,516 daltons) with the sequence (SEQ ID No. 2). This sequence has 35% identity and 60% similarity to A. thaliana Δ7 sterol reductase. Fig. 1 shows the hydrophobicity analysis of the amino acid sequence from which 6-9 putative transmembrane α-helices can be predicted. Sequence comparison and hydrophobicity analysis were calculated with the Wisconsin Sequence Analysis Package using the algorithm from Smith & Waterman and Kyte & Doolittle (Genetics computer group, Programe Bestfit and PepPlot).

(2) Elucidation of the structure of the Δ7-sterol reductase gene People

Abb. 2 zeigt die Struktur des mit der cDNA als Sonde isolierten Gens der Δ7-Sterolreduktase. Das Gen des Menschen besteht aus 7 Introns und 8 Exons. Die Intron-Exon-Übergänge wurden mittels PCR-Amplifikation der Introns und DNA-Sequenzierung und Sequenzvergleich mit der cDNA-Sequenz identifiziert. Schnittstellen für Restriktionsenzyme wurden mittels Hybridisierung entsprechend geschnittener DNA-Fragmente mit geeigneten cDNA-Sonden bestimmt (Southern-Blot). In Tabelle 2 sind die Intron-Exon- Übergänge des Δ7-Reduktase-Gens wiedergegeben. Die zwischen den in der nachfolgenden Tabelle 2 wiedergegebenen Exon-Sequenzen liegenden partiellen Intronsequenzen sind in Tabelle 3-9 wiedergegeben. Fig. 2 shows the structure of the gene of the Δ7-sterol reductase isolated with the cDNA as a probe. The human gene consists of 7 introns and 8 exons. The intron-exon transitions were identified by PCR amplification of the introns and DNA sequencing and sequence comparison with the cDNA sequence. Interfaces for restriction enzymes were determined by hybridization of appropriately cut DNA fragments with suitable cDNA probes (Southern blot). Table 2 shows the intron-exon transitions of the Δ7 reductase gene. The partial intron sequences between the exon sequences shown in Table 2 below are shown in Table 3-9.

Tabelle 2 Table 2

Übersicht Intron-Exon-Übergänge Overview of intron-exon transitions

In der in Abb. 2 wiedergegebenen Genstruktur des humanen Δ7-Reduktasegens, sind Exons schwarz eingerahmt. Dabei haben die Abkürzungen folgende Bedeutungen:
Ac = AccI
AccI = Restriktionsenzym aus Acinetobacter calcoaceticus spezifische DNA-Erkennungssequenz: GT (A/C)(T/G)AC
A = ApaI
ApaI = Restriktionsenzym aus Acetobacter pasteurianus spezifische DNA-Erkennungssequenz: GGGCC C
B = BamHI
BamHI = Restriktionsenzym aus Bacillus amyloliquefaciens spezifische DNA-Erkennungssequenz: G GATCC
H = HindIII
HindIII = Restriktionsenzym aus Haemophilus influenzae spezifische DNA-Erkennungsstelle: A AGCTT
S = SpeI
SpeI = Restriktionsenzym aus Sphaerotilus natans Spezifische DNA-Erkennungsstelle: A CTAGT
X = XhoI
XhoI = Restriktionsenzym aus Xanthomonas holcicola Spezifische DNA-Erkennungsstelle: C TCGAG
ATG = Startcodon
TAA = Stopcodon.In the gene structure of the human Δ7 reductase gene shown in Fig. 2, exons are framed in black. The abbreviations have the following meanings:
Ac = AccI
AccI = restriction enzyme from Acinetobacter calcoaceticus specific DNA recognition sequence: GT (A / C) (T / G) AC
A = ApaI
ApaI = restriction enzyme from Acetobacter pasteurianus specific DNA recognition sequence: GGGCC C
B = BamHI
BamHI = restriction enzyme from Bacillus amyloliquefaciens specific DNA recognition sequence: G GATCC
H = Hind III
HindIII = restriction enzyme from Haemophilus influenzae specific DNA recognition site: A AGCTT
S = SpeI
SpeI = restriction enzyme from Sphaerotilus natans Specific DNA recognition site: A CTAGT
X = XhoI
XhoI = restriction enzyme from Xanthomonas holcicola Specific DNA recognition site: C TCGAG
ATG = start codon
TAA = stop codon.

(3) Creation of processes for the production of the enzyme and functional introduction of the enzyme into eukaryotic cells that the Do not have (or do not work) enzyme

Saccharomyces cerevisiae weist keine Δ7-Sterolreduktase-Aktivität auf. Das Enzym wurde wie beschrieben in Saccharomyces cerevisiae exprimiert (M. Hanner et. al. (1995) J. Biol. Chem. 270; Seite 7551 bis 7557 und F. F. Moebius et. al. (1996) Biochemistry 35: Seite 16871 bis 16878). Der 5' nicht kodierende Bereich wurde mit den Oligonukleotiden
ACGCGTCGACGTCATGGCTGCAAAAATGCAACCC und
ACGCGTCGACAGATCuGCTGCAAAATTGCMCCCAAC entfernt. Diese schaffen 5' SalI-(Δ7-ORF) und BglII-(mycΔ7-ORF)-Restriktionsenzymschnittstellen. Diese Schnittstellen wurden in Verbindung mit 3' NotI- bzw. Spei-Schnittstellen verwendet zum Subklonieren in Hefe-Expressionsvektoren Yep 351ADC1 oder c-myc-Yep351ADC1 (M. Hanner et. al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93; Seite 8072-8077). Die erhaltenen Vektoren mit der modifizierten cDNA werden bezeichnet als Δ7-ORf und mycΔ7-ORF. mycΔ7-ORf ist ein Hybridprotein, das an seinem N-Terminus die Aminosäuresequenz Met Glu Glu Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu trägt, die von dem Antikörper 9E10 c-myc erkannt wird (P. A. Kolodziej & R. A. Young (1991), Methods Enzymol. 194 Seite 508 bis 519). Lithiumacetat-Transformation von Hefe, Isolierung von mikrosomalen Proteinen und Immunoblotting mit dem 9E10 c-myc-Antikörper wurden ausgeführt, wie beschrieben (M. Hanner et. al. (1995) J. Biol. Chem. 270; Seite 7551 bis 7557 bzw. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93; Seite 8072 bis 8077). Proteinkonzentrationen wurden mit Bovinem Serumalbumin als Standard nach M. M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72; Seite 248 bis 254 bestimmt. Mikrosomen wurden hergestellt aus Stämmen, die transformiert wurden entweder mit Δ7-ORF oder mycΔ7-ORF. Diese Mikrosomen waren in der Lage 7-Dehydrocholesterol in Cholesterol nach der auf Seite 1 der Beschreibung angegebenen Gleichung umzuwandeln (Abb. 3). Die Aktivität der Δ7-Sterolreduktase wurde in Gegenwart von 20% (w/v) Glycerin, 0.1 M Tris-HCl pH 7.4 (37°C), 1 mM Glutathion, 0.5 mM EDTA, 2 mM NADPH, 140 mM Glucose and 20 U Glucoseoxidase, die mit N₂ Gas bei 37°C 4 Minuten vorinkubiert waren und 300 µM Substrat 7-dehydrocholesterol (gelöst in Tween 80) bei 37°C gemessen. Die Inkubation erfolgte anaerob und wurde durch Zugabe methanolischer KOH und 10 Minuten Inkubation unter Reflux beendet. Sterol wurde mit Petroleumether extrahiert, unter N₂ Gas getrocknet und mittels Gas-Flüssigkeitschromatographie nachgewiesen. Mikrosomen aus Stämmen, die nur mit dem Plasmid ohne cDNA transformiert wurden, wiesen diese Aktivität nicht auf. Saccharomyces cerevisiae has no Δ7 sterol reductase activity. The enzyme was expressed as described in Saccharomyces cerevisiae (M. Hanner et. Al. (1995) J. Biol. Chem. 270; pages 7551 to 7557 and FF Moebius et. Al. (1996) Biochemistry 35: pages 16871 to 16878) . The 5 'non-coding area was made with the oligonucleotides
ACGCGTCGACGTCATGGCTGCAAAAATGCAACCC and
ACGCGTCGACAGATCuGCTGCAAAATTGCMCCCAAC removed. These create 5 'SalI (Δ7-ORF) and BglII (mycΔ7-ORF) restriction enzyme interfaces. These interfaces were used in conjunction with 3 'NotI or Spei interfaces for subcloning in yeast expression vectors Yep 351ADC1 or c-myc-Yep351ADC1 (M. Hanner et. Al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93; page 8072-8077). The vectors obtained with the modified cDNA are referred to as Δ7-ORf and mycΔ7-ORF. mycΔ7-ORf is a hybrid protein that carries the amino acid sequence Met Glu Glu Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu at its N-terminus, which is recognized by the antibody 9E10 c-myc (PA Kolodziej & RA Young (1991), Methods Enzymol 194 pages 508 to 519). Lithium acetate transformation of yeast, isolation of microsomal proteins and immunoblotting with the 9E10 c-myc antibody were carried out as described (M. Hanner et. Al. (1995) J. Biol. Chem. 270; pages 7551 to 7557 and 1996 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93; pages 8072 to 8077). Protein concentrations were determined using bovine serum albumin as the standard according to MM Bradford (1976) Anal. Biochem. 72; Pages 248 to 254. Microsomes were made from strains transformed with either Δ7-ORF or mycΔ7-ORF. These microsomes were able to convert 7-dehydrocholesterol into cholesterol according to the equation given on page 1 of the description ( Fig. 3). The activity of the Δ7-sterol reductase was in the presence of 20% (w / v) glycerol, 0.1 M Tris-HCl pH 7.4 (37 ° C), 1 mM glutathione, 0.5 mM EDTA, 2 mM NADPH, 140 mM glucose and 20 U Glucose oxidase, which had been preincubated with N ₂ gas at 37 ° C. for 4 minutes and 300 μM substrate 7-dehydrocholesterol (dissolved in Tween 80) at 37 ° C. The incubation was anaerobic and was terminated by adding methanolic KOH and 10 minutes incubation under reflux. Sterol was extracted with petroleum ether, dried under N ₂ gas and detected by gas-liquid chromatography. Microsomes from strains that were only transformed with the plasmid without cDNA did not show this activity.

(4) Pure presentation of the enzyme Δ7-sterol reductase

Das Enzym wurde in eukaryonten Zellen von Saccharomyces cerevisiae mit Hilfe eines entsprechenden Vektors wie unter (3) beschrieben exprimiert. Nach Solubilisation mit Detergens wurde das Protein mittels Chromatographie auf Hydroxylapatit und Anionen- und Kationenaustauschern gereinigt. Als letzten Schritt wurde das Enzym mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers immunaffinitätsgereinigt.The enzyme was found in eukaryotic cells from Saccharomyces cerevisiae Expressed with the help of a corresponding vector as described under (3). After solubilization with detergent, the protein was removed using Chromatography on hydroxylapatite and anion and cation exchangers cleaned. The final step was to use a specific antibody immunoaffinity purified.

(5) method of producing portions of the gene and the cDNA, the detection of the cDNA, the gene or the gene defect in tissues, Enable tissue extracts, on chromosomes or DNA fragments

Teilabschnitte der cDNA oder des Gens wurden durch Schneiden mit entsprechenden Restriktionsenzymen hergestellt und mit gängigen Verfahren enzymatisch mit ³²P oder Digoxigenin enthaltenden Nukleotiden markiert.Portions of the cDNA or the gene were produced by cutting with appropriate restriction enzymes and labeled with enzymes containing ³² P or digoxigenin using standard methods.

(6) Testing drugs and natural products for their Influencing enzyme activity

Stämme, die mit einem Vektor, der die Δ7-Sterolreduktase cDNA enthält, transformiert waren, zeigten Δ7-Sterolreduktase-Aktivität. Die rekombinante menschliche Δ7-Reduktase wurde durch AY9944 (1,4-Bis-(2- chlorbenzylaminomethyl)cyclohexan; IC50 = 0.013 µM), Triparanol (4-Chlor α-[4-[2-(diethylamino)ethoxyjphenyl]-α-(4-methylphenyl)benzenethanol; IC50 = 14 µM) und BM15766 (4-(2-(4-(4-cinnamyl)piperazin-1-yl)ethyl)- benzoesäure; IC50 = 1.2 µM) gehemmt, jedoch nicht durch andere Substanzen, wie z. B. Clomiphen (2-[4-(2-Chlor-1,2-diphenylethenyl)phe noxyl]-N,N-diethylethanamin).Strains containing a vector containing the Δ7 sterol reductase cDNA Δ7 sterol reductase activity were transformed. The recombinant human Δ7 reductase was synthesized by AY9944 (1,4-bis- (2- chlorobenzylaminomethyl) cyclohexane; IC50 = 0.013 µM), triparanol (4-chlorine α- [4- [2- (diethylamino) ethoxyjphenyl] -α- (4-methylphenyl) benzene ethanol; IC50 = 14 µM) and BM15766 (4- (2- (4- (4-cinnamyl) piperazin-1-yl) ethyl) - benzoic acid; IC50 = 1.2 µM) inhibited, but not by others Substances such as B. Clomiphene (2- [4- (2-chloro-1,2-diphenylethenyl) phe noxyl] -N, N-diethylethanamine).

(7) The production of animal models in which the gene is not or partially is functional or overfunctioning

Mit Hilfe des TBLASTN Algorithmus und der Aminosäuresequenz der Δ7-Sterolreduktase des Menschen wurde in der EST (Expressed Sequence Tag) Datenbank eine partielle Maus cDNA identifiziert und sequenziert (Genbank-Hinterlegungsnummer AA475208, Sequenz ID Nr. 18). Mit dieser cDNA wurde ein genomischer Klon für die Δ7-Sterolreduktase der Maus isoliert. Entsprechend kann mit Standardtechniken (Homologiescreening von cDNA-Banken, PCR-Amplifikation mit der Aminosäuresequenz entsprechenden Oligonukleotiden unter Berücksichtung der Degeneration des genetischen Codes, Screening von genomischen Banken) mit Hilfe der Aminosäuresequenz und der cDNA-Sequenz der Δ7-Sterolreduktase aus jeder beliebigen Tierspezies eine entsprechende cDNA und genomische DNA isoliert werden. Mit dieser DNA können transgene Tiere, die die cDNA oder die genomische DNA überexprimieren, hergestellt werden. Außerdem kann mit der genomischen DNA eine gerichtete Genmutation in pluripotenten embryonalen Stammzellen erzeugt werden, die es ermöglicht, Tiere ohne oder mit nur partiell vorhandener Enzymaktivität zu züchten.Using the TBLASTN algorithm and the amino acid sequence of the Human Δ7-sterol reductase was used in EST (Expressed Sequence Tag) Database identified and sequenced a partial mouse cDNA (Genbank accession number AA475208, Sequence ID No. 18). With this cDNA became a genomic clone for mouse Δ7 sterol reductase isolated. Accordingly, standard techniques (homology screening from cDNA libraries, PCR amplification with the amino acid sequence corresponding Oligonucleotides taking into account the degeneration of the genetic Codes, screening of genomic libraries) using the amino acid sequence and the cDNA sequence of the Δ7 sterol reductase from any one Animal species a corresponding cDNA and genomic DNA can be isolated. With this DNA transgenic animals, the cDNA or the genomic Overexpress DNA. You can also use the genomic DNA a directed gene mutation in pluripotent embryonic Stem cells are generated, which allows animals with or without to breed partially existing enzyme activity.

(8) Procedure for inserting and removing double bonds in synthetic and naturally occurring polymeric ring systems

Das Enzym entfernt die Doppelbindung in 7-Dehydrocholesterol. Die Reaktion läuft auch in umgekehrter Richtung ab.The enzyme removes the double bond in 7-dehydrocholesterol. The The reaction also takes place in the opposite direction.

Da die DNA-Sequenz der cDNA und des Gens identifiziert worden ist, kann man das erfindungsgemäße DNA-Gen vollständig durch synthetische chemische oder durch biotechnologische Methoden erzeugen. Die cDNA oder das Gen im Ganzen oder in Teilen können in jeden beliebigen DNA-Vektor ohne oder mit an- oder abschaltbaren (d. h. regulierbaren) Promotoren nach bekannten Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie insertiert werden.Since the DNA sequence of the cDNA and the gene has been identified, to complete the DNA gene of the invention by synthetic chemical or generate by biotechnological methods. The cDNA or the gene in Whole or in part can be in any DNA vector with or without on or off (i.e. adjustable) promoters according to known Methods of recombinant DNA technology can be inserted.

Erfindungsgemäße Proteine, cDNAs oder Gene können als homogene Präparation erzeugt werden, entweder durch direkte Synthese, enzymatisch oder biotechnologisch mit Hilfe eines klonierten Gens. Unter "homogen" wird im Zusammenhang mit einer Protein- oder DNA-Sequenz verstanden, daß die primäre molekulare Struktur, d. h. die Sequenzen der Aminosäuren oder der Nukleotide, im wesentlichen aller Moleküle einer in Betracht gezogenen Probe identisch sind. Der Ausdruck "im wesentlichen", wie er in dem vorhergehenden Satz gebraucht ist, bedeutet vorzugsweise mindestens 95 Gew.-%, vorteilhaft mindestens 99 Gew.-% und insbesondere mehr als 99,8 Gew.-%. Die Anwesenheit von Fragmenten von ganzen Molekülen des homogenen Proteins oder der DNA-Sequenz wird, sofern diese in Mengen von nicht mehr als 5 Gew.-%, vorzugsweise von nicht mehr als 1 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von nicht mehr als 0,2 Gew.-% vorhanden sind, bei der Bestimmung der Homogenität nicht in Betracht gezogen, da der Begriff "homogen" sich auf die Anwesenheit ganzer Moleküle (und Fragmenten solcher Moleküle) bezieht, die eine einzelne definierte Struktur aufweisen, im Gegensatz zu Gemischen, in denen mehrere Moleküle von ähnlichem Molekulargewicht vorliegen, die sich jedoch in ihrer primären Molekularstruktur unterscheiden. Der Ausdruck "isoliert", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf das reine Protein, reine DNA oder reine RNA, die von anderen Proteinen, DNAs oder RNAs abgetrennt sind und, falls überhaupt zusammen mit anderen Stoffen, nur zusammen mit einem Lösemittel, Puffer, Ion oder einem anderen normalerweise in einer biologischen Lösung des Proteins, der DNA oder der RNA vorkommendem Stoff vorliegt. "Isoliert" schließt nicht natürliche Stoffe in ihrem natürlichen Zustand oder natürliche Stoffe ein, die in Bestandteile zerlegt worden sind (beispielsweise in einem Polyacrylamidgel), aber nicht als reine Substanzen oder Lösungen erhalten wurden. Der Begriff "rein" hat im Sinne dieser Erfindung dieselben zahlenmäßigen Begrenzungen wie der unmittelbar zuvor diskutierte Begriff "im wesentlichen". Der Ausdruck "ersetzt durch" oder "Ersatz" bezieht sich im Zusammenhang mit dieser Erfindung nicht notwendigerweise auf irgendeine zu ergreifende Maßnahme, sondern auf das Protein, das existiert, wenn eine angegebene "Ersatz"-Aminosäure in derselben Position vorhanden ist, wie die Aminosäure, die in einer anderen Formel vorhanden sein soll (beispielsweise wenn Serin in der Position 5 anstelle von Prolin vorhanden ist).Proteins, cDNAs or genes according to the invention can be regarded as homogeneous Preparation can be generated, either by direct synthesis, enzymatically or biotechnologically using a cloned gene. Under "homogeneous" is understood in connection with a protein or DNA sequence that the primary molecular structure, d. H. the sequences of the amino acids or the nucleotides, essentially all of the molecules drawn sample are identical. The expression "essentially" as used in the preceding sentence is used preferably means at least 95% by weight, advantageously at least 99% by weight and in particular more than 99.8% % By weight. The presence of fragments of whole molecules of the homogeneous Protein or the DNA sequence will be provided in quantities of no more than 5% by weight, preferably not more than 1% by weight and very particularly preferably not more than 0.2% by weight are present in the determination of homogeneity is not taken into account because the term "homogeneous" itself the presence of whole molecules (and fragments of such molecules) that have a single defined structure, as opposed to Mixtures in which several molecules of similar molecular weight are present, however, in their primary molecular structure differentiate. The term "isolated" as used here refers to the pure protein, pure DNA, or pure RNA that are derived from other proteins, DNAs or RNAs are separated and, if at all together with other substances, only together with a solvent, buffer, Ion or another normally in a biological solution of the Protein, DNA or RNA occurring substance. "Isolated" does not include natural substances in their natural state or natural substances that have been broken down into components (for example in a polyacrylamide gel), but not as pure Substances or solutions were obtained. The term "pure" has in mind this invention has the same numerical limitations as the immediate one previously discussed term "essentially". The expression "replaced by" or "replacement" does not refer to this invention necessarily on some measure to be taken, but on the Protein that exists when a given "replacement" amino acid is in the same position as the amino acid present in a other formula should be present (for example if serine in the Position 5 is present instead of proline).

Salze der hier beschriebenen Proteine kommen natürlich vor, wenn diese Proteine vorhanden sind in (oder isoliert werden) wäßrigen Lösungen mit unterschiedlichem pH. Alle Salze von Proteinen, die die angegebene biologische Aktivität zeigen, werden als zum Umfang der gegenwärtigen Erfindung gehörig angesehen. Zu den Beispielen zählen Alkali-, Erdalka li- und andere Metallsalze von Carbonsäure-Resten, Säureadditionssalze (beispielsweise von HCl) an Amino-Gruppen sowie Zwitterionen, die durch Umsetzungen zwischen Carbonsäure- und Amino-Resten innerhalb desselben Moleküls entstehen.Salts of the proteins described here naturally occur when these Proteins are present in (or can be isolated) using aqueous solutions different pH. All salts of proteins that are specified showing biological activity are considered to be the scope of the current Invention viewed properly. Examples include alkali, alkaline earth Li and other metal salts of carboxylic acid residues, acid addition salts (for example, of HCl) on amino groups and zwitterions that pass through Reactions between carboxylic acid and amino residues within the same Molecule.

Es besteht die Möglichkeit, bei Menschen oder Tieren ein fehlendes oder fehlerhaftes Gen mittels gängiger Verfahren (künstliche Chromosomen, an- oder abschaltbare oder permanent exprimierende Transfektionsvektoren viralen oder anderen Ursprungs) durch das erfindungsgemäße Gen oder die cDNA zu ersetzen.There is a possibility of a missing or in humans or animals defective gene using common methods (artificial chromosomes, or or switchable or permanently expressing transfection vectors viral or other origin) by the gene according to the invention or the to replace cDNA.

Ein fehlerhaftes oder fehlendes Protein kann ersetzt werden durch Einbringen des mittels heterologer Expression gewonnenen erfindungsgemäßen Proteins, auch in abgewandelter Form (z. B. -NH₂ oder -COOH-endständig trunkiert, durch Modifikation der Aminosäuresequenz gegen Proteasen resistenter gemacht oder mittels posttranslationaler Modifikation stabilisiert) soweit es noch die funktionelle Aktivität aufweist oder zu einem Protein mit funktioneller Aktivität im Gastorganismus umgewandelt werden kann.A defective or missing protein can be replaced by introducing the protein according to the invention obtained by means of heterologous expression, also in a modified form (e.g. -NH ₂ or -COOH terminally truncated, made more resistant to proteases by modification of the amino acid sequence or stabilized by means of post-translational modification ) as far as it still has the functional activity or can be converted into a protein with functional activity in the host organism.

Als Methoden zum Ersatz kommen liposomale Verabreichung, infektiöse, orale, parenterale, nasale, transkutane, intrathekale, peritoneale und enterale Verabreichung oder Implantation in Betracht. Liposomal, infectious, oral, parenteral, nasal, transcutaneous, intrathecal, peritoneal and enteral administration or implantation into consideration.

Im Rahmen von Diagnosen kann das erfindungsgemäße Protein im Ganzen oder in Teilen zur Identifikation fehlerhafter Proteine verwendet werden. Dabei werden Strukturanalysen mittels Antikörpern und anderen üblichen Verfahren (Massenspektrometrie, Aminosäurezusammensetzung, Aminosäuresequenzanalyse) in Geweben, Zellstrukturen und Körperflüssigkeiten von Menschen oder Tieren angewendet.In the context of diagnoses, the protein according to the invention can be whole or can be used in parts to identify defective proteins. Structural analysis using antibodies and other common ones Methods (mass spectrometry, amino acid composition, Amino acid sequence analysis) in tissues, cell structures and Body fluids used by humans or animals.

Auf Genebene kann die erfindungsgemäße Gensequenz und Genstruktur mittels gängiger Verfahren zu Diagnosezwecken verwendet werden, um fehlende oder fehlerhafte Gene pränatal oder postnatal bei Menschen oder Tieren festzustellen. Dies kann bei gesunden, kranken, toten oder lebendigen Organismen erfolgen.At the gene level, the gene sequence and gene structure according to the invention can be Common diagnostic procedures are used to identify missing or defective genes prenatally or postnatally in humans or animals ascertain. This can affect healthy, sick, dead, or alive Organisms occur.

Im Gegensatz zu nativem Gewebe von Menschen und Tieren zeigt das rekombinante Enzym bei gängigen Verfahren zur Messung der enzymatischen Aktivität hohe katalytische Aktivität. Das Enzym kann aus Wirtsorganismen in reiner Form mit 500-1000-fach höherer spezifischer Aktivität dargestellt werden.In contrast to human and animal native tissue, this shows recombinant enzyme in common methods for measuring the enzymatic Activity high catalytic activity. The enzyme can come from host organisms in pure form with 500-1000 times higher specific activity being represented.

Das rekombinante Enzym zeigt hohe Empfindlichkeit gegenüber bekannten Hemmstoffen der Δ7-Sterolreduktase wie AY9944, BM15766 und Triparanol und keine Empfindlichkeit gegenüber Pharmaka, von denen bekannt ist, daß sie die Enzymaktivität nicht beeinflussen wie Clomiphen. Das rekombinante Enzym kann daher für die Untersuchung von organischen oder anorganischen synthetischen oder natürlich vorkommenden Verbindungen in Hinblick auf ihre Beeinflussung der Enzymaktivität verwendet werden.The recombinant enzyme shows high sensitivity to known ones Inhibitors of Δ7 sterol reductase such as AY9944, BM15766 and triparanol and no sensitivity to drugs known to be do not affect enzyme activity like clomiphene. The recombinant Enzyme can therefore be used for the study of organic or inorganic synthetic or naturally occurring compounds with regard to their influence on enzyme activity can be used.

Das erfindungsgemäße Δ7-Sterolreduktase-Protein kann man entweder durch chemische Synthese der Proteinsequenz erhalten oder dadurch herstellen, daß man einen Vektor, der für ein solches Protein kodiert, in einem Wirtsmikroorganismus oder -gewebe exprimiert. The Δ7-sterol reductase protein according to the invention can either be obtained by obtain or produce chemical synthesis of the protein sequence, that a vector that codes for such a protein in a Host microorganism or tissue expressed.

Für die vorstehend beschriebenen Verwendungsmöglichkeiten wird das Δ7-Sterolreduktase-Protein, ein erfindungsgemäßes cDNA-Molekül oder das Gen im Ganzen, in Teilen oder in Teilstück(en) in eine biologisch aktive Zusammensetzung zusammen mit einem üblichen festen, flüssigen oder gasförmigen Trägermaterial eingebracht. Diese biologisch aktive Zusammensetzung kann sowohl für diagnostische als auch für pharmazeutische Zwecke verwendet werden. Übliche Trägermaterialien für derartige biologisch aktive Zusammensetzungen sind gepufferte und nicht gepufferte Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen von organischen oder anorganischen Verbindungen wie sie synthetisch hergestellt werden können oder als Naturstoffe vorkommen z. B. liposomale Flüssigkeiten, physiologische Kochsalzlösung. Außerdem feste Träger aus organischen oder anorganischen Verbindungen wie sie synthetisch hergestellt werden können oder als Naturstoffe vorkommen wie z. B. Silikate, Sepharose, Polymere sowie lebende oder tote Wirtsorganismen, die das Enzym heterolog exprimieren.For the uses described above, the Δ7-sterol reductase protein, a cDNA molecule according to the invention or the gene in whole, in part or in part (s) in a biologically active Composition together with a usual solid, liquid or introduced gaseous carrier material. This biologically active Composition can be used for both diagnostic and pharmaceutical purposes. Usual carrier materials for such biologically active compositions are buffered and not buffered solutions, emulsions or suspensions of organic or inorganic compounds as they can be produced synthetically or occur as natural substances e.g. B. liposomal liquids, physiological saline. In addition, solid carriers made of organic or inorganic compounds as they can be produced synthetically or occur as natural substances such as B. silicates, Sepharose, polymers as well as living or dead host organisms that heterologous to the enzyme express.

Das erfindungsgemäße Enzym kann benutzt werden, um in synthetischen oder natürlicherweise vorkommenden Molekülen oder Polymeren mit Ringsystemen, Doppelbindungen einzuführen und zu entfernen. Das kann sowohl für die Synthese solcher Moleküle oder Polymere als auch für ihren Abbau verwendet werden. Das Enzym kann dabei in reiner Form oder in Form das Enzym exprimierender Mikroorganismen verwendet werden.The enzyme of the invention can be used to synthesize or naturally occurring molecules or polymers with ring systems, Introduce and remove double bonds. That can be for both Synthesis of such molecules or polymers as well as for their degradation be used. The enzyme can be in pure form or in the form of Enzyme-expressing microorganisms can be used.

Examples of use

Verwendete Materialien und Verfahren:
Materials and processes used:

- Bradford protein reagent and molecular weight markers from Bio-Rad;
- marathon-ready cDNA,
- Multiple tissue Northern blots and
- Clontech human RNA master blot;

alle weiteren in der Beschreibung genannten Chemikalien wurden von Sigma, Wien, bezogen.all other chemicals mentioned in the description were from Sigma, Vienna, related.

(1) Identification of Δ7 reductase transcripts in human tissues

Es wurde die Verteilung der beiden 2800 und 2200 bp Δ7-Sterolreduktase-Tran skripte in Poly A⁺-RNA von Menschen mittels Hybridisierung mit der ³²P-markierten cDNA nachgewiesen (Abb. 5, Gewebsverteilung der Δ7-Sterolreduktase mRNA mit Multiple tissue Northern blots, Clontech). Insbesondere wurden die Transkripte häufig in Lebergewebe und Hirngewebe gefunden. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe der cDNA-Sequenz interpretiert werden, da zwei Polyadenylierungsstellen in Position 2073 (AAATAAAA) und 2616 (ATATTAAA) vorhanden sind. Eine quantitative Analyse des RNA-Mas ter-Blot, auf den Poly A⁺-RNA von Menschen punktförmig aufgebracht war, (Abb. 6) erfolgte mit dem Phosphoranalysegerät FujiX-Bas 1000. Sie ergab, daß die Δ7-Reduktase in Gewebe von Erwachsenen und Feten allgegenwärtig ist, wobei die höchste Dichte in Nebennierendrüsen von Erwachsenen gefunden wurde.The distribution of the two 2800 and 2200 bp Δ7-sterol reductase transcripts in poly A⁺-RNA from humans was verified by hybridization with the ³² P-labeled cDNA ( Fig. 5, tissue distribution of the Δ7-sterol reductase mRNA with multiple tissue Northern blots , Clontech). In particular, the transcripts were frequently found in liver tissue and brain tissue. This result could be interpreted with the help of the cDNA sequence, since there are two polyadenylation sites in position 2073 (AAATAAAA) and 2616 (ATATTAAA). A quantitative analysis of the RNA master blot, onto which poly A⁺-RNA was applied in spots by humans, ( Fig. 6) was carried out with the phosphorus analyzer FujiX-Bas 1000. It showed that the Δ7-reductase in adult tissue and fetuses are ubiquitous, with the highest density found in adrenal glands of adults.

(2) Functional introduction of the enzyme into eukaryotic cells

Die cDNA wurde in einen Expressionsvektor (pCI-Neo, Invitrogen) kloniert. Mit diesem wurden Säugetierzellen (COS-7) mittels Calciumphosphattransfektion transfiziert. Mikrosomen die von diesen Zellen gewonnen wurden zeigten deutlich höhere Aktivität als Mikrosomen von Zellen, die mit dem leeren Vektor (d. h. ohne die erfindungsgemäße cDNA) transfiziert wurden.The cDNA was cloned into an expression vector (pCI-Neo, Invitrogen). This was used to identify mammalian cells (COS-7) Calcium phosphate transfection transfected. Microsomes those of these Cells obtained showed significantly higher activity than microsomes of cells with the empty vector (i.e. without the invention cDNA) were transfected.

(3) Evidence of the presence of the gene by hybridization with Chromosomes

Der das Gen für die Δ7-Sterolreduktase enthaltende rekombinante DNA-Vek tor wurde mit Biotin markiert, mit Metaphasenchromosomen hybridisiert und mittels fluoreszenzmarkierter Anti-Biotin-Antikörper durch Fluoreszenzmikroskopie auf Chromosom 11q13.3 nachgewiesen.The recombinant DNA vek containing the gene for Δ7 sterol reductase Tor was labeled with biotin and hybridized with metaphase chromosomes and by means of fluorescence-labeled anti-biotin antibodies Fluorescence microscopy detected on chromosome 11q13.3.

(4) Detection of mutations in the gene in patients with Smith-Lemli-Opitz syndrome

Die Untersuchung von cDNA (aus Fibroblasten von Patienten mit Smith-Lem li-Opitz Syndrom) und von genomischer DNA (aus Blut von Patienten mit Smith-Lemli-Opitz Syndrom) erfolgte mittels PCR, SSCP (DNA-Ein zelstrangpolymorphismusanalyse) und DNA-Sequenzierung wie beschrieben in M. van Slegtenhorst (1997), Science 227, Seite 805 bis 808. Die entsprechenden cDNA-Abschnitte des offenen Leserahmens wurden mit Hilfe spezifischer Primer analog der cDNA-Sequenz oder die entsprechenden Exons 1-8 mit Hilfe spezifischer Primer analog der entsprechenden Intronsequenzen amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in Hinblick auf ihr elektrophoretisches Laufhalten analysiert, ihre DNA-Sequenz bestimmt und auf Mutationen analysiert. Tabelle 10 zeigt Beispiele der so entdeckten Mutationen. Mit diesem und ähnlichen Verfahren, die auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen der erfindungsgemäßen Proteinsequenz, cDNA-Se quenz oder Gensequenz beruhen, können Mutationen in Patienten, ihren Angehörigen und anderen Personen, bei denen der Verdacht auf eine erhöhte oder verminderte Enzymaktivität besteht, diagnostiziert werden.
The analysis of cDNA (from fibroblasts from patients with Smith-Lem li-Opitz syndrome) and genomic DNA (from blood from patients with Smith-Lemli-Opitz syndrome) was carried out using PCR, SSCP (DNA single-strand polymorphism analysis) and DNA sequencing as described in M. van Slegtenhorst (1997), Science 227, pages 805 to 808. The corresponding cDNA sections of the open reading frame were analyzed using specific primers analogous to the cDNA sequence or the corresponding exons 1-8 using specific primers analogous to corresponding intron sequences amplified. The PCR products were analyzed for electrophoretic running, their DNA sequence determined and analyzed for mutations. Table 10 shows examples of the mutations thus discovered. This and similar methods, which are based on the specific interaction between the protein sequence according to the invention, cDNA sequence or gene sequence, can be used to diagnose mutations in patients, their relatives and other persons who are suspected of having increased or decreased enzyme activity.

(5) Evidence of the effect of the mutation on enzyme activity

Die bei Patienten in der cDNA oder in der genomischen DNA gefundenen Mutationen wurden in die cDNA eingeführt. Die mutierte cDNA wurde in Saccharomyces cerevisiae transformiert und Mikrosomen wurden in Hinblick auf ihre Δ7-Sterolreduktase-Aktivität analysiert. Die Aktivität der cDNA mit Mutationen, wie sie auch bei Patienten gefunden wird, war im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert (Patient 1-3) oder nicht nachweisbar (Patient 4).Those found in patients in the cDNA or in the genomic DNA Mutations were introduced into the cDNA. The mutated cDNA was in Saccharomyces cerevisiae were transformed and microsomes were considered analyzed for their Δ7 sterol reductase activity. The activity of the cDNA with mutations, as is also found in patients, was in the Reduced compared to the wild-type enzyme (patient 1-3) or not detectable (patient 4).

(6) Manufacture of animal models in which the gene is not or only partially is functional

Tiere, die homo- oder heterozygot für Mutationen sind, die zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen, können benutzt werden, um Medikamente und Naturstoffe in Hinblick auf ihre Wirkung auf das Enzym zu testen. Mit einem solchen Tiermodell der angeboren Erkrankung Smith-Lemli-Opitz Syndrom oder einer durch Aufnahme von synthetischen oder natürlich vorkommenden Stoffen erworbenen entsprechenden Erkrankung können geeignete therapeutische Verfahren für die Behandlung von Menschen und anderen Tieren entdeckt, überprüft und validiert werden. Geeignete therapeutische Verfahren sind zum Beispiel synthetische oder natürlich vorkommende organische oder anorganische Verbindungen oder vollständige oder partielle cDNAs und Gene, die die Enzymaktivität erhöhen oder wiederherstellen oder die Funktion anderer zellulärer Strukturen, die auf die Produkte des Enzyms angewiesen sind, erhöhen, erniedrigen oder wiederherstellen.Animals that are homo- or heterozygous for mutations lead to loss The enzymatic activity can lead to medication and to test natural products with regard to their effect on the enzyme. With such an animal model of the congenital disease Smith-Lemli-Opitz Syndrome or one by incorporating synthetic or natural occurring illnesses acquired corresponding disease appropriate therapeutic procedures for the treatment of humans and other animals are discovered, checked and validated. Suitable Therapeutic procedures are, for example, synthetic or natural occurring organic or inorganic compounds or complete or partial cDNAs and genes that increase enzyme activity or restore or restore the function of other cellular structures the products of the enzyme are instructed to increase, decrease or restore.

(7) Finding further DNA and DNA required for the activity of the gene Protein structures

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenz wurde der 5' Promotorbereich des Gens sequenziert. In analoger Weise können weitere für die Funktion des Gens benötigte Genstrukturen sowohl in Form von DNA als auch in Form von Proteinen, die für die Transkription des Gens benötigt werden, aufgrund ihrer Wechselwirkung mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz identifiziert werden. With the help of the cDNA sequence according to the invention, the 5 'promoter region of the gene sequenced. In an analogous manner, further functions can be used gene structures required of the gene both in the form of DNA and in the form of proteins that are required for the transcription of the gene due to their interaction with the DNA sequence according to the invention be identified.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Proteins in whole or in part with the amino acid sequence of the Δ7 sterol reductase, the sequence (SEQ ID No. 2) being:
and proteins with mutated sequences derived from this amino acid sequence (SEQ ID No. 2), including all naturally occurring polymorphisms or mutations and proteins in which the above sequences are partially or truncated or contained as a hybrid with other protein sequences.

2. A method for producing a protein according to claim 1, characterized, that either a vector that is whole for such a protein or encoded in parts, in a host microorganism or in Host cells or expressed in tissue or the protein sequence chemically synthesized.

3. cDNA molecule in whole or in part including all natural occurring polymorphisms or mutations containing a nucleotide Se quenz for the protein according to claim 1 as a whole or in parts encoded.

4. cDNA molecule according to claim 3 in whole or in part, wherein the sequence (SEQ ID No. 1) is:

5. cDNA molecule according to claim 4, characterized in that it is a cDNA molecule modified from SEQ ID No. 1, which modified according to the degeneration of the genetic code that it codes for a protein with an amino acid sequence according to SEQ ID No. 2, or for a protein with a sequence according to one of the natural occurring polymorphisms or mutations of Δ7 sterol reductase.

6. cDNA molecule according to claim 4, characterized in that it is a cDNA molecule modified from SEQ ID No. 1, which for Proteins encoded, their sequences from SEQ ID No. 2 by further mutation or derived from the sequence of SEQ ID No. 2 or sequences thereof partially or truncated by mutation, or contained in the form of hybrids with other coding sequences.

7. cDNA molecule according to claim 4, characterized in that it is a modified cDNA molecule which contains the partial nucleotide sequence of the cDNA of the mouse (SEQ ID No. 18):
or a sequence derived from the above sequence (SEQ ID No. 18).

8. Recombinant DNA vector found in humans or animals, in cells or Tissues or in a microorganism capable of replication and the Nucleotide sequence (SEQ ID No. 1) according to claim 4 or one of the cDNAs according to claims 3 to 7 completely or in parts, which for the Protein in whole or in part with or without the naturally occurring polymorphisms and mutations according to claim 1.

9. DNA vector according to claim 8, characterized, that it has an expression of a cDNA contained therein according to one of the Claims 3-7 in humans or animals, in cells, in tissues or in Is capable of microorganisms and suitable expression regulators Contains promoters, enhancers, or gene sequences for Δ7 sterol reductase.

10. A method for producing the cDNA according to claim 4 in whole or in Share wherein either the recombinant vector of claim 8, the contains the nucleotide sequence (SEQ ID No. 1) in whole or in part, propagated in a host microorganism or tissue and the cDNA then isolated, or chemically or the cDNA sequences synthesized enzymatically.

11. Genomic DNA molecule in whole or in part including all regions (introns) not coding for the Δ7-sterol reductase protein insofar as these are structurally or functionally related to the coding regions including all naturally occurring polymorphisms or mutations thereof, the intron sequences contained being selected are made:

12. Recombinant DNA vector found in a microorganism or tissue is replicable and according to one or more nucleotide sequences Claim 11 contains all or part of the protein completely or partially with or without the natural polymorphisms and encoding mutations according to claim 1.

13. A method for producing the genomic DNA molecule according to claim 11 in whole or in part with either a recombinant Vector encoding the DNA in a host microorganism or tissue expressed, or the DNA sequence chemically or enzymatically synthesized.

14. Biologically active compositions which are used in a conventional, pharmaceutically acceptable, liquid, gaseous or solid A protein as claimed in claim 1, or a cDNA molecule according to one of claims 3-7, or a DNA molecule according to claim 11 in Included in whole or in part for diagnostic or pharmaceutical Purposes.

15. Use of a cDNA or a fragment thereof according to one of the Claims 3-7, 11 as a probe for isolating Δ7 sterol reductase genes from other organisms.

16. host organism, characterized, that it transforms with vectors according to one of claims 8, 9, 12 has been.

17. A method of screening for the recombinant enzyme according to one of the preceding claims inhibitory substances.

18. Procedure for the detection of mutations that lead to a genetic defect using protein or cDNA molecules the one of the sequences SEQ ID No. 1-18 included.