DE19739940A1

DE19739940A1 - Protein mit Aminosäuresequenz der DELTA7-Sterolreduktase, isoliertes cDNA-Molekül, das für das Protein kodiert, rekombinanter DNA-Vektor und biologisch aktive Zusammensetzungen, die das Protein oder das cDNA-Molekül enthalten

Info

Publication number: DE19739940A1
Application number: DE1997139940
Authority: DE
Inventors: Hartmut Prof Dr Med Glossmann; Fabian Dr Med Moebius; Barbara Dr Rer Nat Fitzky
Original assignee: Glossmann Hartmut Prof Drmed 99880 Waltershausen De
Current assignee: Glossmann Hartmut Prof Drmed 99880 Waltershausen De
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 1999-03-18
Also published as: WO1999013086A1; EP1073752A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist die cDNA, das vom offenen Leserahmen kodierte Protein und das Gen für das Enzym Δ7-Sterolreduktase des Menschen, wobei vorhandene Polymorphismen und Mutationen eingeschlossen sind.

Bei Patienten mit dem angeborenen Smith-Lemli-Opitz Syndrom wurden im Blut erhöhte Mengen der Zwischenprodukte der Cholesterinbiosynthese 7-De hydrocholesterol und 8-Dehydrocholesterol gefunden. Diese Sterolmetaboliten eignen sich deshalb zur Diagnose des Smith-Lemli-Opitz Syndroms. Das Syndrom wird auf eine verminderte enzymatische Aktivität des Enzyms Δ7-Sterolreduktase zurückgeführt (S. Tint et al., (1994), N. Engl. J. Med. 330, Seite 107 bis 113).

Die Δ7-Sterolreduktase von Säugern, einschließlich von Menschen, katalysiert die Reaktion 7-Dehydrocholesterol + NADPH → Cholesterol + NADP + H

NADP = Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat
NADPH = Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat in reduzierter Form.

Stand der Technik

In US-A-5,525,496 ist ein Gen beschrieben, das für die Δ14-Ste rolreduktase von Saccharomyces cerevisiae kodiert. Die gereinigte und isolierte DNA-Sequenz, für die die Δ14-Sterolreduktase kodiert, kodiert für ein Polypeptid, das Homologie zu dem bei der Biosynthese von Ergosterol beteiligten Sterol-C24(28)-Reduktaseenzym von S. cerevisiae aufweist.

Aus WO/97/07219 sind isolierte Nukleinsäuresequenzen bekannt, die für eine Familie von HMG-CoA-Reduktase-Degradations(HRI)polypeptiden kodieren. Es werden Untersuchungen der Cholesterolbiosynthese beschrieben.

Aus EP-A-727 489 ist eine cDNA-Sequenz bekannt, die für ein Protein von Arabidopsis thaliana kodiert. Es sind auch mehrere Aminosäuresequenzen von Proteinen offenbart, die Aktivität im Zusammenhang mit Δ5,7-Sterolreduktase und Δ7-Sterolreduktase aufweisen.

In allen lebenden Organismen besteht eine fundamentale Beziehung zwischen genetischem Material (DNA, Desoxyribonukleinsäure) und den vom Organismus synthetisierten Proteinen. Diese Beziehung ist so, daß sich die Aminosäuresequenz des Proteins aus der Nukleotidsequenz der entsprechenden DNA, die für dieses Protein kodiert, ergibt. Jede der zwanzig Aminosäuren, die in Proteinen üblicherweise vorkommen, wird von jeweils einer oder mehreren Trinukleotidsequenzen kodiert. Die spezifische Beziehung zwischen jeder gegebenen Trinukleotidsequenz und ihrer entsprechenden Aminosäure bildet den genetischen Code. Es wird angenommen, daß der genetische Code für alle lebenden Organismen gleich oder zumindest ähnlich ist. Infolgedessen wird die Aminosäuresequenz jedes Proteins nach einer gut verstandenen Beziehung durch eine entsprechende Nukleotidsequenz vorgegeben. Weiterhin kann diese Nukleotidsequenz im Prinzip von jedem lebenden Organismus translatiert werden.

Die Trinukleotide der nachfolgenden Tabelle 1, Codons genannt, kommen im genetischen Material lebender Organismen vor. Die Expression dieser Codons in der Proteinbiosynthese erfordert die intermediäre Bildung von Boten-RNA (mRNA) (messenger RNA). Die Sequenz der Codons auf der mRNA entspricht der Nukleotidsequenz des zum kodierenden Strang des DNA-Dop pelstrangekomplementären Gegenstranges mit entgegengesetzter Strangpolarität. Ein wichtiges und gut bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist seine Redundanz, wodurch für die meisten der Aminosäuren, die bei der Biosynthese von Proteinen eine Rolle spielen, mehr als nur ein kodierendes Nukleotid-Triplett zur Verfügung steht. Es kann daher eine Anzahl verschiedener Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz kodieren. Diese Nukleotidsequenzen werden als funktional äquivalent angesehen, da sie im wesentlichen zur Erzeugung derselben Aminosäuresequenz in allen Organismen führen können, wobei bestimmte Stämme die mRNA wirksamer translatieren können als andere Stämme. Gelegentlich kann man eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in einer gegebenen Nukleotidsequenz finden. Derartige Methylierungen berühren jedoch nicht die Spezifität der Codons für die jeweilige Aminosäure.

Tabelle 1

Genetischer Code

Schlüssel: Jedes Triplett aus 3 Buchstaben repräsentiert ein DNA-Trinukleotid mit einem 5'-Ende auf der linken und einem 3'-Ende auf der rechten Seite. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimi din-Basen, die die Nukleotidsequenzen bilden.
A = Adenin
C = Cytosin
G = Guanin
U = Uracil
T = Thymin
R = G oder A
Y = T oder C
H = A oder C oder T
N = A oder C oder G oder T

Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist

(1) Mittel zu schaffen, die es ermöglichen, fehlendes oder nur teilweise aktives Enzyms Δ7-Sterolreduktase des Menschen, im Menschen und anderen Tieren zu ersetzen bzw. Defekte in dem Gen der Δ7-Sterolreduktase des Menschen diagnostizieren zu können und mit denen defektes Gen im Menschen und anderen Tieren ersetzt werden kann. (2) Schaffen von Verfahren zur Herstellung des Enzyms und der funktionsfähigen Einbringung in eukaryonte Zellen, die das Enzym nicht oder nicht funktionsfähig haben. (3) Reindarstellung des Enzyms Δ7-Sterolreduktase des Menschen, um fehlende oder nur teilweise aktive Enzyme im Menschen und anderen Tieren zu ersetzen. (4) Verfahren zur Herstellung von Teilabschnitten des Gens und der cDNA, die den Nachweis der cDNA, des Gens oder des Gendefekts in Geweben, Gewebeextrakten, auf Chromosomen oder DNA-Teilstücken ermöglichen. (5) Testen von Medikamenten und Naturstoffen in Hinblick auf ihre Beeinflussung der Enzymaktivität. (6) Herstellen von Tiermodellen in denen das Gen nicht oder nur partiell funktionsfähig ist oder überfunktioniert. (7) Verfahren zum Einführen und Entfernen von Doppelbindungen in synthetischen und natürlich vorkommenden organischen polymeren Ringsystemen.

Diese Aufgabe wird unter anderem gelöst durch ein Protein im Ganzen oder in Teilen mit der Sequenz (SEQ ID Nr. 2):

Das erfindungsgemäße Protein schließt Proteine ein mit aus dieser Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) abgeleiteten mutierten Sequenzen, einschließlich alle natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen, sowie Proteine in denen die vorstehenden Sequenzen partiell oder trunkiert oder als Hybride mit anderen Proteinsequenzen enthalten sind.

Die erfindungsgemäßen Proteine mit abgeleiteten Sequenzen weisen die Aktivität von Δ7-Sterolreduktase auf und sind insbesondere in der Lage 7-Dehydrocholesterol in Anwesenheit von NADPH in Cholesterol umzuwandeln.

Das erfindungsgemäße Protein kann hergestellt werden, indem man entweder einen Vektor, der für ein solches Protein im Ganzen oder in Teilen kodiert, in einem Wirtsmikroorganismus, in Wirtszellen oder in Gewebe exprimiert oder die Proteinsequenz chemisch synthetisiert.

Das mittels heterologer Expression der für Δ7-Sterolreduktase spezifischen humanen DNA erhaltene Protein weist 475 Aminosäurereste und ein Mw von 54516 Dalton auf.

Das erfindungsgemäße Protein kann im Ganzen oder in Teilen in biologisch aktiven Zusammensetzungen verwendet werden, die das erfindungsgemäße Protein in einem üblichen pharmazeutisch verträglichen flüssigen, gasförmigen oder festen Trägermaterial enthalten, wobei die Zusammensetzungen diagnostischen oder pharmazeutischen Zwecken dienen. Diese Zusammensetzungen können gegebenenfalls weitere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten.

Die Lösung der Aufgabe schließt auch ein cDNA Molekül ein, im Ganzen oder Teilen desselben einschließlich aller natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für das erfindungsgemäße Protein als Ganzes oder in Teilen davon kodiert.

Das mittels bekannter Verfahren erhaltene, für Δ7-Sterolreduktase spezifische Gen Gen des Menschen besteht aus 7 Introns und 8 Exons.

Die Sequenz (SEQ ID Nr. 1) von Δ7-Sterolreductase cDNA ist:

Das erfindungsgemäße cDNA-Molekül kann auch ein gegenüber der SEQ ID Nr. 1 modifiziertes cDNA-Molekül sein, das entsprechend der Degeneration des genetischen Codes modifiziert wurde, soweit es für ein Protein mit s der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 kodiert, bzw. für ein Protein mit einer Sequenz gemäß einem der natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen von Δ7-Sterolreduktase.

Das erfindungsgemäße cDNA-Molekül kann auch gegenüber SEQ ID Nr. 1 so modifiziert sein, daß es für eines der weiteren erfindungsgemäßen Proteine kodiert, d. h. für Proteine deren Sequenzen von SEQ ID Nr. 2 durch weitere Mutationen abgeleitet sind oder dadurch, daß sie die Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder davon durch Mutation abgeleitet Sequenzen partiell oder trunkiert, oder in Form von Hybriden mit anderen kodierenden Sequenzen enthalten.

Die Lösung schließt auch einen rekombinanten DNA-Vektor ein, der vorzugsweise in Menschen oder Tieren, in Zellen oder Geweben oder in einem Mikroorganismus stabil integriert werden kann, oder darin replikationsfähig ist und die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) oder eine der vorstehend genannten cDNAs vollständig oder in Teilen enthält.

Eine erfindungsgemäße cDNA als Ganzes oder in Teilen kann man beispielsweise herstellen, indem man entweder einen rekombinanten Vektor, der die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) oder eine andere erfindungsgemäße cDNA-Sequenz vollständig oder in Teilen enthält in einem Wirtsorganismus vermehrt und die cDNA anschließend isoliert, oder indem man die cDNA-Sequenzen chemisch oder enzymatisch synthetisiert.

Die Lösung schließt ferner DNA-Vektoren gemäß den vorstehenden Angaben ein, die zur Expression der in ihnen enthaltenen erfindungsgemäßen cDNA in einem Menschen oder in anderen Tieren, in Zellen, in Geweben oder in Mikroorganismen geeignet sind. Solche DNA-Vektoren (Expressionsvektoren) enthalten geeignete expressionsregulierende Signale, wie Promotoren, z. B. an- und abschaltbare Promotoren, Enhancer usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können auch die nachstehend erwähnten erfindungsgemäßen Gensequenzen für Δ7-Sterolreduktase enthalten und die Expression dieser Gensequenzen in einem Wirtsorganismus, wie einem Menschen oder in anderen Tieren, einem Mikroorganismus oder in Zellen oder Geweben steuern.

Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren sind vorzugsweise zur stabilen Integration in da Genom des Wirtsorganismus oder der Wirtszelle geeignet, oder können darin replizieren.

Expressionsvektoren, die nicht stabil in das Genom des Wirtsorganismus oder der Wirtszelle integrieren, oder im Wirtsorganismus oder in der Wirtszelle replizieren, jedoch zu einer vorübergehenden Expression der in ihnen enthaltenen Sequenzen geeignet sind (transiente Expression sind jedoch auch bevorzugt.

Die Erfindung schließt auch ein genomisches DNA-Molekül, im Ganzen oder in Teilen, einschließlich aller nicht für das Δ7-Sterolredukta se-Protein kodierenden Bereiche (Introns), soweit diese mit den kodierenden strukturell oder funktionell zusammenhängen, und alle vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen desselben ein, wobei die in diesem genomischen DNA-Molekül enthaltenen Intronsequenzen vorzugsweise ausgewählt sind aus den in den Tabellen 3-9 wiedergegebenen Sequenzen (SEQ ID Nr. 4-17).

Zur Lösung der Aufgabe gehört auch eine cDNA, die die folgende partielle Nukleotidsequenz der cDNA der Maus enthält (SEQ ID Nr. 18):

bzw. cDNA-Moleküle, die so modifiziert sind, daß sie eine von der vorstehenden Sequenz SEQ ID Nr. 18 abgeleitete Sequenz aufweisen. Solche modifizierten cDNA-Sequenzen schließen Sequenzen ein, die aufgrund der Degeneriertheit (Redundanz) des genetischen Codes für die von SEQ ID Nr. 18 kodierte Aminosäuresequenz der Maus-Δ7-Sterolreduktase kodieren, bzw. für Aminosäuresequenzen gemäß aller natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen dieser Aminosäuresequenz.

Solche erfindungsgemäßen cDNA-Moleküle können gegenüber SEQ ID Nr. 18 auch so modifiziert sein, daß sie für Aminosäuresequenzen kodieren, die von der durch SEQ ID Nr. 18 kodierten Aminosäuresequenz durch weitere Mutationen abgeleitet sind, oder daß sie die von SEQ ID Nr. 18 kodierte Aminosäuresequenz oder die davon durch Mutation abgeleiteten Sequenzen partiell, oder trunkiert, oder in Form von Hybriden mit anderen kodierenden Sequenzen enthalten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung (1) Klonierung der die Δ7-Sterolreduktase kodierenden cDNA

Mit Hilfe des TBLASTN Algorithmus und der Aminosäuresequenz der Δ7-Sterolreduktase von A. thaliana (Genbank-Hinterlegungsnummer U49398) wurden in der EST (Expressed Sequence Tag)-Datenbank partielle menschliche cDNAs identifiziert und sequenziert (Genbank-Hin terlegungsnummern H09710, M017568, H04989, R61101). Das 5'-Ende der cDNA wurde mit PCR unter Verwendung von Marathon-Ready cDNA aus menschlicher Leber und dem Antisense Oligonucleotid GCAGCGTGAAAGATAAGGC gewonnen. Der offene Leserahmen der 2.652 bp cDNA (SEQ ID Nr. 1) kodiert für ein Protein aus 475 Aminosäuren (MW 54.516 Dalton) mit der Sequenz (SEQ ID Nr. 2). Diese Sequenz weist 35% Identität und 60% Ähnlichkeit mit Δ7-Sterolreduktase aus A. thaliana auf. Abb. 1 zeigt die Hydrophobizitätsanalyse der Aminosäuresequenz aus der sich 6-9 putative transmembranäre α-Helices vorhersagen lassen. Sequenzvergleich und Hydrophobizitätsanalyse wurden mit dem Wisconsin Sequence Analysis Package mit dem Algorithmus von Smith & Waterman bzw. Kyte & Doolittle berechnet (Genetics computer group, Programe Bestfit und PepPlot).

(2) Aufklärung der Struktur des Gens der Δ7-Sterolreduktase des Menschen

Abb. 2 zeigt die Struktur des mit der cDNA als Sonde isolierten Gens der Δ7-Sterolreduktase. Das Gen des Menschen besteht aus 7 Introns und 8 Exons. Die Intron-Exon-Übergänge wurden mittels PCR-Amplifikation der Introns und DNA-Sequenzierung und Sequenzvergleich mit der cDNA-Sequenz identifiziert. Schnittstellen für Restriktionsenzyme wurden mittels Hybridisierung entsprechend geschnittener DNA-Fragmente mit geeigneten cDNA-Sonden bestimmt (Southern-Blot). In Tabelle 2 sind die Intron-Exon- Übergänge des Δ7-Reduktase-Gens wiedergegeben. Die zwischen den in der nachfolgenden Tabelle 2 wiedergegebenen Exon-Sequenzen liegenden partiellen Intronsequenzen sind in Tabelle 3-9 wiedergegeben.

Tabelle 2

Übersicht Intron-Exon-Übergänge

In der in Abb. 2 wiedergegebenen Genstruktur des humanen Δ7-Reduktasegens, sind Exons schwarz eingerahmt. Dabei haben die Abkürzungen folgende Bedeutungen:
Ac = AccI
AccI = Restriktionsenzym aus Acinetobacter calcoaceticus spezifische DNA-Erkennungssequenz: GT (A/C)(T/G)AC
A = ApaI
ApaI = Restriktionsenzym aus Acetobacter pasteurianus spezifische DNA-Erkennungssequenz: GGGCC C
B = BamHI
BamHI = Restriktionsenzym aus Bacillus amyloliquefaciens spezifische DNA-Erkennungssequenz: G GATCC
H = HindIII
HindIII = Restriktionsenzym aus Haemophilus influenzae spezifische DNA-Erkennungsstelle: A AGCTT
S = SpeI
SpeI = Restriktionsenzym aus Sphaerotilus natans Spezifische DNA-Erkennungsstelle: A CTAGT
X = XhoI
XhoI = Restriktionsenzym aus Xanthomonas holcicola Spezifische DNA-Erkennungsstelle: C TCGAG
ATG = Startcodon
TAA = Stopcodon.

(3) Schaffen von Verfahren zur Herstellung des Enzyms und zur funktionsfähigen Einbringung des Enzyms in eukaryonte Zellen, die das Enzym nicht (oder nicht funktionsfähig) haben

Saccharomyces cerevisiae weist keine Δ7-Sterolreduktase-Aktivität auf. Das Enzym wurde wie beschrieben in Saccharomyces cerevisiae exprimiert (M. Hanner et. al. (1995) J. Biol. Chem. 270; Seite 7551 bis 7557 und F. F. Moebius et. al. (1996) Biochemistry 35: Seite 16871 bis 16878). Der 5' nicht kodierende Bereich wurde mit den Oligonukleotiden
ACGCGTCGACGTCATGGCTGCAAAAATGCAACCC und
ACGCGTCGACAGATCuGCTGCAAAATTGCMCCCAAC entfernt. Diese schaffen 5' SalI-(Δ7-ORF) und BglII-(mycΔ7-ORF)-Restriktionsenzymschnittstellen. Diese Schnittstellen wurden in Verbindung mit 3' NotI- bzw. Spei-Schnittstellen verwendet zum Subklonieren in Hefe-Expressionsvektoren Yep 351ADC1 oder c-myc-Yep351ADC1 (M. Hanner et. al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93; Seite 8072-8077). Die erhaltenen Vektoren mit der modifizierten cDNA werden bezeichnet als Δ7-ORf und mycΔ7-ORF. mycΔ7-ORf ist ein Hybridprotein, das an seinem N-Terminus die Aminosäuresequenz Met Glu Glu Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu trägt, die von dem Antikörper 9E10 c-myc erkannt wird (P. A. Kolodziej & R. A. Young (1991), Methods Enzymol. 194 Seite 508 bis 519). Lithiumacetat-Transformation von Hefe, Isolierung von mikrosomalen Proteinen und Immunoblotting mit dem 9E10 c-myc-Antikörper wurden ausgeführt, wie beschrieben (M. Hanner et. al. (1995) J. Biol. Chem. 270; Seite 7551 bis 7557 bzw. 1996 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93; Seite 8072 bis 8077). Proteinkonzentrationen wurden mit Bovinem Serumalbumin als Standard nach M. M. Bradford (1976) Anal. Biochem. 72; Seite 248 bis 254 bestimmt. Mikrosomen wurden hergestellt aus Stämmen, die transformiert wurden entweder mit Δ7-ORF oder mycΔ7-ORF. Diese Mikrosomen waren in der Lage 7-Dehydrocholesterol in Cholesterol nach der auf Seite 1 der Beschreibung angegebenen Gleichung umzuwandeln (Abb. 3). Die Aktivität der Δ7-Sterolreduktase wurde in Gegenwart von 20% (w/v) Glycerin, 0.1 M Tris-HCl pH 7.4 (37°C), 1 mM Glutathion, 0.5 mM EDTA, 2 mM NADPH, 140 mM Glucose and 20 U Glucoseoxidase, die mit N₂ Gas bei 37°C 4 Minuten vorinkubiert waren und 300 µM Substrat 7-dehydrocholesterol (gelöst in Tween 80) bei 37°C gemessen. Die Inkubation erfolgte anaerob und wurde durch Zugabe methanolischer KOH und 10 Minuten Inkubation unter Reflux beendet. Sterol wurde mit Petroleumether extrahiert, unter N₂ Gas getrocknet und mittels Gas-Flüssigkeitschromatographie nachgewiesen. Mikrosomen aus Stämmen, die nur mit dem Plasmid ohne cDNA transformiert wurden, wiesen diese Aktivität nicht auf.

(4) Reindarstellung des Enzyms Δ7-Sterolreduktase

Das Enzym wurde in eukaryonten Zellen von Saccharomyces cerevisiae mit Hilfe eines entsprechenden Vektors wie unter (3) beschrieben exprimiert. Nach Solubilisation mit Detergens wurde das Protein mittels Chromatographie auf Hydroxylapatit und Anionen- und Kationenaustauschern gereinigt. Als letzten Schritt wurde das Enzym mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers immunaffinitätsgereinigt.

(5) Verfahren zur Herstellung von Teilabschnitten des Gens und der cDNA, die den Nachweis der cDNA, des Gens oder des Gendefekts in Geweben, Gewebeextrakten, auf Chromosomen oder DNA-Teilstücken ermöglichen

Teilabschnitte der cDNA oder des Gens wurden durch Schneiden mit entsprechenden Restriktionsenzymen hergestellt und mit gängigen Verfahren enzymatisch mit ³²P oder Digoxigenin enthaltenden Nukleotiden markiert.

(6) Testen von Medikamenten und Naturstoffen in Hinblick auf ihre Beeinflussung der Enzymaktivität

Stämme, die mit einem Vektor, der die Δ7-Sterolreduktase cDNA enthält, transformiert waren, zeigten Δ7-Sterolreduktase-Aktivität. Die rekombinante menschliche Δ7-Reduktase wurde durch AY9944 (1,4-Bis-(2- chlorbenzylaminomethyl)cyclohexan; IC50 = 0.013 µM), Triparanol (4-Chlor α-[4-[2-(diethylamino)ethoxyjphenyl]-α-(4-methylphenyl)benzenethanol; IC50 = 14 µM) und BM15766 (4-(2-(4-(4-cinnamyl)piperazin-1-yl)ethyl)- benzoesäure; IC50 = 1.2 µM) gehemmt, jedoch nicht durch andere Substanzen, wie z. B. Clomiphen (2-[4-(2-Chlor-1,2-diphenylethenyl)phe noxyl]-N,N-diethylethanamin).

(7) Das Herstellen von Tiermodellen in denen das Gen nicht oder partiell funktionsfähig ist oder überfunktioniert

Mit Hilfe des TBLASTN Algorithmus und der Aminosäuresequenz der Δ7-Sterolreduktase des Menschen wurde in der EST (Expressed Sequence Tag) Datenbank eine partielle Maus cDNA identifiziert und sequenziert (Genbank-Hinterlegungsnummer AA475208, Sequenz ID Nr. 18). Mit dieser cDNA wurde ein genomischer Klon für die Δ7-Sterolreduktase der Maus isoliert. Entsprechend kann mit Standardtechniken (Homologiescreening von cDNA-Banken, PCR-Amplifikation mit der Aminosäuresequenz entsprechenden Oligonukleotiden unter Berücksichtung der Degeneration des genetischen Codes, Screening von genomischen Banken) mit Hilfe der Aminosäuresequenz und der cDNA-Sequenz der Δ7-Sterolreduktase aus jeder beliebigen Tierspezies eine entsprechende cDNA und genomische DNA isoliert werden. Mit dieser DNA können transgene Tiere, die die cDNA oder die genomische DNA überexprimieren, hergestellt werden. Außerdem kann mit der genomischen DNA eine gerichtete Genmutation in pluripotenten embryonalen Stammzellen erzeugt werden, die es ermöglicht, Tiere ohne oder mit nur partiell vorhandener Enzymaktivität zu züchten.

(8) Verfahren zum Einführen und Entfernen von Doppelbindungen in synthetischen und natürlich vorkommenden polymeren Ringsystemen

Das Enzym entfernt die Doppelbindung in 7-Dehydrocholesterol. Die Reaktion läuft auch in umgekehrter Richtung ab.

Da die DNA-Sequenz der cDNA und des Gens identifiziert worden ist, kann man das erfindungsgemäße DNA-Gen vollständig durch synthetische chemische oder durch biotechnologische Methoden erzeugen. Die cDNA oder das Gen im Ganzen oder in Teilen können in jeden beliebigen DNA-Vektor ohne oder mit an- oder abschaltbaren (d. h. regulierbaren) Promotoren nach bekannten Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie insertiert werden.

Erfindungsgemäße Proteine, cDNAs oder Gene können als homogene Präparation erzeugt werden, entweder durch direkte Synthese, enzymatisch oder biotechnologisch mit Hilfe eines klonierten Gens. Unter "homogen" wird im Zusammenhang mit einer Protein- oder DNA-Sequenz verstanden, daß die primäre molekulare Struktur, d. h. die Sequenzen der Aminosäuren oder der Nukleotide, im wesentlichen aller Moleküle einer in Betracht gezogenen Probe identisch sind. Der Ausdruck "im wesentlichen", wie er in dem vorhergehenden Satz gebraucht ist, bedeutet vorzugsweise mindestens 95 Gew.-%, vorteilhaft mindestens 99 Gew.-% und insbesondere mehr als 99,8 Gew.-%. Die Anwesenheit von Fragmenten von ganzen Molekülen des homogenen Proteins oder der DNA-Sequenz wird, sofern diese in Mengen von nicht mehr als 5 Gew.-%, vorzugsweise von nicht mehr als 1 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von nicht mehr als 0,2 Gew.-% vorhanden sind, bei der Bestimmung der Homogenität nicht in Betracht gezogen, da der Begriff "homogen" sich auf die Anwesenheit ganzer Moleküle (und Fragmenten solcher Moleküle) bezieht, die eine einzelne definierte Struktur aufweisen, im Gegensatz zu Gemischen, in denen mehrere Moleküle von ähnlichem Molekulargewicht vorliegen, die sich jedoch in ihrer primären Molekularstruktur unterscheiden. Der Ausdruck "isoliert", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf das reine Protein, reine DNA oder reine RNA, die von anderen Proteinen, DNAs oder RNAs abgetrennt sind und, falls überhaupt zusammen mit anderen Stoffen, nur zusammen mit einem Lösemittel, Puffer, Ion oder einem anderen normalerweise in einer biologischen Lösung des Proteins, der DNA oder der RNA vorkommendem Stoff vorliegt. "Isoliert" schließt nicht natürliche Stoffe in ihrem natürlichen Zustand oder natürliche Stoffe ein, die in Bestandteile zerlegt worden sind (beispielsweise in einem Polyacrylamidgel), aber nicht als reine Substanzen oder Lösungen erhalten wurden. Der Begriff "rein" hat im Sinne dieser Erfindung dieselben zahlenmäßigen Begrenzungen wie der unmittelbar zuvor diskutierte Begriff "im wesentlichen". Der Ausdruck "ersetzt durch" oder "Ersatz" bezieht sich im Zusammenhang mit dieser Erfindung nicht notwendigerweise auf irgendeine zu ergreifende Maßnahme, sondern auf das Protein, das existiert, wenn eine angegebene "Ersatz"-Aminosäure in derselben Position vorhanden ist, wie die Aminosäure, die in einer anderen Formel vorhanden sein soll (beispielsweise wenn Serin in der Position 5 anstelle von Prolin vorhanden ist).

Salze der hier beschriebenen Proteine kommen natürlich vor, wenn diese Proteine vorhanden sind in (oder isoliert werden) wäßrigen Lösungen mit unterschiedlichem pH. Alle Salze von Proteinen, die die angegebene biologische Aktivität zeigen, werden als zum Umfang der gegenwärtigen Erfindung gehörig angesehen. Zu den Beispielen zählen Alkali-, Erdalka li- und andere Metallsalze von Carbonsäure-Resten, Säureadditionssalze (beispielsweise von HCl) an Amino-Gruppen sowie Zwitterionen, die durch Umsetzungen zwischen Carbonsäure- und Amino-Resten innerhalb desselben Moleküls entstehen.

Es besteht die Möglichkeit, bei Menschen oder Tieren ein fehlendes oder fehlerhaftes Gen mittels gängiger Verfahren (künstliche Chromosomen, an- oder abschaltbare oder permanent exprimierende Transfektionsvektoren viralen oder anderen Ursprungs) durch das erfindungsgemäße Gen oder die cDNA zu ersetzen.

Ein fehlerhaftes oder fehlendes Protein kann ersetzt werden durch Einbringen des mittels heterologer Expression gewonnenen erfindungsgemäßen Proteins, auch in abgewandelter Form (z. B. -NH₂ oder -COOH-endständig trunkiert, durch Modifikation der Aminosäuresequenz gegen Proteasen resistenter gemacht oder mittels posttranslationaler Modifikation stabilisiert) soweit es noch die funktionelle Aktivität aufweist oder zu einem Protein mit funktioneller Aktivität im Gastorganismus umgewandelt werden kann.

Als Methoden zum Ersatz kommen liposomale Verabreichung, infektiöse, orale, parenterale, nasale, transkutane, intrathekale, peritoneale und enterale Verabreichung oder Implantation in Betracht.

Im Rahmen von Diagnosen kann das erfindungsgemäße Protein im Ganzen oder in Teilen zur Identifikation fehlerhafter Proteine verwendet werden. Dabei werden Strukturanalysen mittels Antikörpern und anderen üblichen Verfahren (Massenspektrometrie, Aminosäurezusammensetzung, Aminosäuresequenzanalyse) in Geweben, Zellstrukturen und Körperflüssigkeiten von Menschen oder Tieren angewendet.

Auf Genebene kann die erfindungsgemäße Gensequenz und Genstruktur mittels gängiger Verfahren zu Diagnosezwecken verwendet werden, um fehlende oder fehlerhafte Gene pränatal oder postnatal bei Menschen oder Tieren festzustellen. Dies kann bei gesunden, kranken, toten oder lebendigen Organismen erfolgen.

Im Gegensatz zu nativem Gewebe von Menschen und Tieren zeigt das rekombinante Enzym bei gängigen Verfahren zur Messung der enzymatischen Aktivität hohe katalytische Aktivität. Das Enzym kann aus Wirtsorganismen in reiner Form mit 500-1000-fach höherer spezifischer Aktivität dargestellt werden.

Das rekombinante Enzym zeigt hohe Empfindlichkeit gegenüber bekannten Hemmstoffen der Δ7-Sterolreduktase wie AY9944, BM15766 und Triparanol und keine Empfindlichkeit gegenüber Pharmaka, von denen bekannt ist, daß sie die Enzymaktivität nicht beeinflussen wie Clomiphen. Das rekombinante Enzym kann daher für die Untersuchung von organischen oder anorganischen synthetischen oder natürlich vorkommenden Verbindungen in Hinblick auf ihre Beeinflussung der Enzymaktivität verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Δ7-Sterolreduktase-Protein kann man entweder durch chemische Synthese der Proteinsequenz erhalten oder dadurch herstellen, daß man einen Vektor, der für ein solches Protein kodiert, in einem Wirtsmikroorganismus oder -gewebe exprimiert.

Für die vorstehend beschriebenen Verwendungsmöglichkeiten wird das Δ7-Sterolreduktase-Protein, ein erfindungsgemäßes cDNA-Molekül oder das Gen im Ganzen, in Teilen oder in Teilstück(en) in eine biologisch aktive Zusammensetzung zusammen mit einem üblichen festen, flüssigen oder gasförmigen Trägermaterial eingebracht. Diese biologisch aktive Zusammensetzung kann sowohl für diagnostische als auch für pharmazeutische Zwecke verwendet werden. Übliche Trägermaterialien für derartige biologisch aktive Zusammensetzungen sind gepufferte und nicht gepufferte Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen von organischen oder anorganischen Verbindungen wie sie synthetisch hergestellt werden können oder als Naturstoffe vorkommen z. B. liposomale Flüssigkeiten, physiologische Kochsalzlösung. Außerdem feste Träger aus organischen oder anorganischen Verbindungen wie sie synthetisch hergestellt werden können oder als Naturstoffe vorkommen wie z. B. Silikate, Sepharose, Polymere sowie lebende oder tote Wirtsorganismen, die das Enzym heterolog exprimieren.

Das erfindungsgemäße Enzym kann benutzt werden, um in synthetischen oder natürlicherweise vorkommenden Molekülen oder Polymeren mit Ringsystemen, Doppelbindungen einzuführen und zu entfernen. Das kann sowohl für die Synthese solcher Moleküle oder Polymere als auch für ihren Abbau verwendet werden. Das Enzym kann dabei in reiner Form oder in Form das Enzym exprimierender Mikroorganismen verwendet werden.

Anwendungsbeispiele

Verwendete Materialien und Verfahren:

- Bradford Proteinreagenz und Molekulargewichtsmarkierstoffe von Bio-Rad;
- Marathon-Ready cDNA,
- Multiple tissue Northern blots und
- menschliche RNA Master-blot von Clontech;

alle weiteren in der Beschreibung genannten Chemikalien wurden von Sigma, Wien, bezogen.

(1) Identifizierung von Δ7-Reduktase-Transkripten in menschlichen Geweben

Es wurde die Verteilung der beiden 2800 und 2200 bp Δ7-Sterolreduktase-Tran skripte in Poly A⁺-RNA von Menschen mittels Hybridisierung mit der ³²P-markierten cDNA nachgewiesen (Abb. 5, Gewebsverteilung der Δ7-Sterolreduktase mRNA mit Multiple tissue Northern blots, Clontech). Insbesondere wurden die Transkripte häufig in Lebergewebe und Hirngewebe gefunden. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe der cDNA-Sequenz interpretiert werden, da zwei Polyadenylierungsstellen in Position 2073 (AAATAAAA) und 2616 (ATATTAAA) vorhanden sind. Eine quantitative Analyse des RNA-Mas ter-Blot, auf den Poly A⁺-RNA von Menschen punktförmig aufgebracht war, (Abb. 6) erfolgte mit dem Phosphoranalysegerät FujiX-Bas 1000. Sie ergab, daß die Δ7-Reduktase in Gewebe von Erwachsenen und Feten allgegenwärtig ist, wobei die höchste Dichte in Nebennierendrüsen von Erwachsenen gefunden wurde.

(2) Funktionsfähige Einbringung des Enzyms in eukaryonte Zellen

Die cDNA wurde in einen Expressionsvektor (pCI-Neo, Invitrogen) kloniert. Mit diesem wurden Säugetierzellen (COS-7) mittels Calciumphosphattransfektion transfiziert. Mikrosomen die von diesen Zellen gewonnen wurden zeigten deutlich höhere Aktivität als Mikrosomen von Zellen, die mit dem leeren Vektor (d. h. ohne die erfindungsgemäße cDNA) transfiziert wurden.

(3) Nachweis des Vorhandenseins des Gens durch Hybridisierung mit Chromosomen

Der das Gen für die Δ7-Sterolreduktase enthaltende rekombinante DNA-Vek tor wurde mit Biotin markiert, mit Metaphasenchromosomen hybridisiert und mittels fluoreszenzmarkierter Anti-Biotin-Antikörper durch Fluoreszenzmikroskopie auf Chromosom 11q13.3 nachgewiesen.

(4) Nachweis von Mutationen des Gens bei Patienten mit Smith-Lemli-Opitz Syndrom

Die Untersuchung von cDNA (aus Fibroblasten von Patienten mit Smith-Lem li-Opitz Syndrom) und von genomischer DNA (aus Blut von Patienten mit Smith-Lemli-Opitz Syndrom) erfolgte mittels PCR, SSCP (DNA-Ein zelstrangpolymorphismusanalyse) und DNA-Sequenzierung wie beschrieben in M. van Slegtenhorst (1997), Science 227, Seite 805 bis 808. Die entsprechenden cDNA-Abschnitte des offenen Leserahmens wurden mit Hilfe spezifischer Primer analog der cDNA-Sequenz oder die entsprechenden Exons 1-8 mit Hilfe spezifischer Primer analog der entsprechenden Intronsequenzen amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in Hinblick auf ihr elektrophoretisches Laufhalten analysiert, ihre DNA-Sequenz bestimmt und auf Mutationen analysiert. Tabelle 10 zeigt Beispiele der so entdeckten Mutationen. Mit diesem und ähnlichen Verfahren, die auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen der erfindungsgemäßen Proteinsequenz, cDNA-Se quenz oder Gensequenz beruhen, können Mutationen in Patienten, ihren Angehörigen und anderen Personen, bei denen der Verdacht auf eine erhöhte oder verminderte Enzymaktivität besteht, diagnostiziert werden.

(5) Nachweis der Auswirkung der Mutation auf die Enzymaktivität

Die bei Patienten in der cDNA oder in der genomischen DNA gefundenen Mutationen wurden in die cDNA eingeführt. Die mutierte cDNA wurde in Saccharomyces cerevisiae transformiert und Mikrosomen wurden in Hinblick auf ihre Δ7-Sterolreduktase-Aktivität analysiert. Die Aktivität der cDNA mit Mutationen, wie sie auch bei Patienten gefunden wird, war im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert (Patient 1-3) oder nicht nachweisbar (Patient 4).

(6) Herstellen von Tiermodellen, in denen das Gen nicht oder nur partiell funktionsfähig ist

Tiere, die homo- oder heterozygot für Mutationen sind, die zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen, können benutzt werden, um Medikamente und Naturstoffe in Hinblick auf ihre Wirkung auf das Enzym zu testen. Mit einem solchen Tiermodell der angeboren Erkrankung Smith-Lemli-Opitz Syndrom oder einer durch Aufnahme von synthetischen oder natürlich vorkommenden Stoffen erworbenen entsprechenden Erkrankung können geeignete therapeutische Verfahren für die Behandlung von Menschen und anderen Tieren entdeckt, überprüft und validiert werden. Geeignete therapeutische Verfahren sind zum Beispiel synthetische oder natürlich vorkommende organische oder anorganische Verbindungen oder vollständige oder partielle cDNAs und Gene, die die Enzymaktivität erhöhen oder wiederherstellen oder die Funktion anderer zellulärer Strukturen, die auf die Produkte des Enzyms angewiesen sind, erhöhen, erniedrigen oder wiederherstellen.

(7) Auffinden von weiteren für die Aktivität des Gens benötigten DNA- und Proteinstrukturen

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenz wurde der 5' Promotorbereich des Gens sequenziert. In analoger Weise können weitere für die Funktion des Gens benötigte Genstrukturen sowohl in Form von DNA als auch in Form von Proteinen, die für die Transkription des Gens benötigt werden, aufgrund ihrer Wechselwirkung mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz identifiziert werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Proteine im Ganzen oder in Teilen mit der Aminosäuresequenz der Δ7-Sterolreduktase, wobei die Sequenz (SEQ ID Nr. 2) ist:
und Proteine mit aus dieser Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) abgeleiteten, mutierten Sequenzen, einschließlich aller natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen und Proteine, in denen die vorstehenden Sequenzen partiell oder trunkiert oder als Hybride mit anderen Proteinsequenzen enthalten sind.

2. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder einen Vektor, der für ein solches Protein im Ganzen oder in Teilen kodiert, in einem Wirtsmikroorganismus oder in Wirtszellen oder in Gewebe exprimiert oder die Proteinsequenz chemisch synthetisiert.

3. cDNA Molekül im Ganzen oder in Teilen einschließlich aller natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen, enthaltend eine Nukleotid-Se quenz, die für das Protein nach Anspruch 1 als Ganzes oder in Teilen kodiert.

4. cDNA-Molekül nach Anspruch 3 im Ganzen oder in Teilen, worin die Sequenz (SEQ ID Nr. 1) ist:

5. cDNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein gegenüber SEQ ID Nr. 1 modifiziertes cDNA-Molekül ist, das entsprechend der Degeneration des genetischen Codes modifiziert wurde so daß es für ein Protein mit Aminosäuresequenz gemaß SEQ ID Nr. 2 kodiert, bzw. für ein Protein mit einer Sequenz gemäß einem der natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen von Δ7-Sterolreduktase.

6. cDNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein gegenüber SEQ ID Nr. 1 modifiziertes cDNA-Molekül ist, das für Proteine kodiert, deren Sequenzen von SEQ ID Nr. 2 durch weitere Mutation abgeleitet sind oder dadurch, daß sie die Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder davon durch Mutation abgeleitete Sequenzen partiell oder trunkiert, oder in Form von Hybriden mit anderen kodierenden Sequenzen enthalten.

7. cDNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein modifiziertes cDNA-Molekül ist, das die partielle Nukleotidsequenz der cDNA der Maus enthält (SEQ ID Nr. 18):
oder eine von der vorstehenden Sequenz (SEQ ID Nr. 18) abgeleitete Sequenz.

8. Rekombinanter DNA-Vektor, der in Menschen oder Tieren, in Zellen oder Geweben oder in einem Mikroorganismus replikationsfähig ist und die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) gemäß Anspruch 4 oder eine der cDNAs gemäß Ansprüchen 3 bis 7 vollständig oder in Teilen enthält, die für das Protein vollständig oder in Teilen mit oder ohne die natürlicherweise vorkommenden Polymorphismen und Mutationen nach Anspruch 1 codiert.

9. DNA-Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er ein zur Expression einer in ihm enthaltenen cDNA gemäß einem der Ansprüche 3-7 in Menschen oder Tieren, in Zellen, in Geweben oder in Mikroorganismen befähigt ist und dafür geeignete expressionsregulierende Promotoren, Enhancer, oder Gensequenzen für Δ7-Sterolreduktase enthält.

10. Verfahren zum Herstellen der cDNA nach Anspruch 4 im Ganzen oder in Teilen wobei man entweder den rekombinanten Vektor nach Anspruch 8, der die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) vollständig oder in Teilen enthält, in einem Wirtsmikroorganismus oder Gewebe vermehrt und die cDNA anschließend isoliert, oder man die cDNA-Sequenzen chemisch oder enzymatisch synthetisiert.

11. Genomisches DNA-Molekül im Ganzen oder in Teilen einschließlich aller nicht für das Δ7-Sterolreduktase-Protein kodierenden Bereiche (Introns) soweit diese mit den kodierenden Bereichen strukturell oder funktionell zusammenhängen einschließlich aller natürlich vorkommenden Polymorphismen oder Mutationen desselben, wobei die enthaltenen Intronsequenzen ausgewählt sind aus:

12. Rekombinanter DNA-Vektor, der in einem Mikroorganismus oder Gewebe replikationsfähig ist und ein oder mehrere Nukleotid-Sequenzen gemäß Anspruch 11 vollständig oder in Teilen enthält, die für das Protein vollständig oder in Teilen mit oder ohne die natürlichen Polymorphismen und Mutationen nach Anspruch 1 codiert.

13. Verfahren zum Herstellen des genomischen DNA-Moleküls nach Anspruch 11 im Ganzen oder in Teilen wobei man entweder einen rekombinanten Vektor, der die DNA kodiert, in einem Wirtsmikroorganismus oder Gewebe exprimiert, oder die DNA-Sequenz chemisch oder enzymatisch synthetisiert.

14. Biologisch aktive Zusammensetzungen, die in einem üblichen, pharmazeutisch verträglichen, flüssigen, gasförmigen oder festen Trägermaterial ein Protein nach Anspruch 1, oder ein cDNA-Molekül nach einem der Ansprüche 3-7, oder ein DNA-Molekül nach Anspruch 11 im Ganzen oder in Teilen enthalten für diagnostische oder pharmazeutische Zwecke.

15. Verwendung einer cDNA oder eines Fragmentes derselben nach einem der Ansprüche 3-7, 11 als Sonde zum Isolieren von Δ7-Sterolreduktase-Genen aus anderen Organismen.

16. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit Vektoren gemäß einem der Ansprüche 8, 9, 12 transformiert wurde.

17. Verfahren zum Screenen von für das rekombinante Enzym nach einem der vorstehenden Ansprüche inhibitorischen Substanzen.

18. Verfahren zum Nachweis von Mutationen, die zu einem Gendefekt führen unter Verwendung von Protein oder cDNA-Molekülen die eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1-18 enthalten.