DE19729211C2 - Humanes Semaphorin L (H-Sema-L) und korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung sind neue Semaphorine, die sich durch eine besondere Domänenstruktur auszeichnen und deren Derivate, Nukleinsäuren (DNA, RNA, cDNA), die für diese Semaphorine kodieren und deren Derivate sowie die Verwendung derselben.

Semaphorine wurden erstmals von Kolodkin {Kolodkin et al. (1993) Cell 75: 1389-­ 1399} als Mitglieder einer konservierten Genfamilie beschrieben.

Inzwischen wurden die Gene bzw. Teile der Gene weiterer Semaphorine kloniert und teilweise charakterisiert. Bisher waren insgesamt 5 humane (H-Sema-III, H-Sema-V, H-Sema-IV, H-Sema-B und H-Sema-E) {Kolodkin et al. (1993); Roche et al. (1996) Onkogene 12: 1289-1297; Sekido et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4120-4125; Xiang et al. (1996) Genomics 32: 39-48; Hall et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39: 11780-11785; Yamada et al. (1997) (GenBank Zuordnungs-Nr. AB000220)}, 8 murine (Gene der Maus; M-Sema A bis M-Sema-H) {Püschel et al. (1995) Neuron 14: 941-948; Messerschmidt et al. (1995) Neuron 14: 949-959; Inigaki et al. (1995) FEBS Letters 370: 269-272; Adams et al. (1996) Mech. Dev. 57: 33-45; Christensen et al. (1996) (Genbank Zuordnungs-Nr. Z80941, Z93948)}, 5 gallide (Huhn) (Collapsin-1 bis -5) {Luo et al. (1993); Luo et al. (1995) Neuron 14: 1131-1140}, und Gene von Ratte (R-Sema-III) {Giger et al. (1996) J. Comp. Neurol. 375: 378-392}, Zebrafisch, Insekten (Fruchtfliege (Drosophila melanogaster: D-Sema-I und D-Sema-II), Käfer (Tribolium confusum: T-Sema-I), Grashüpfer (Schistocerca americana: G-Sema-I)) {Kolodkin et al. (1993)}, und Nematoden (C.elegans: Ce-Sema) {Roy et al. (1994) (GenBank Zuordnungs-Nr. U15667)} bekannt. Weiterhin besitzen zwei Poxviren (Vaccinia (ORF-A39) und Variola (ORFA39-homolog)) {Kolodkin et al. (1993)} sowie der Aleclaphine Herpesvirus Typ 1 (AHV-1) (AHV-Sema) {Ensser und Fleckenstein (1995) Gen. Virol. 76: 1063-1067} zu Semaphorinen homologe Gene.

Einen Überblick über die bisher identifizierten Semaphorine in verschiedenen Spezies gibt Tabelle 1. In Tabelle 1 sind die Namen der Semaphorine, die verwendeten Synonyme, die Spezies aus dem das jeweilige Semaphorin isoliert wurde, sowie, soweit bekannt, Daten zur Domänenstruktur des kodierten Proteins (Spalten 4 und 5 in Tabelle 1), die Zuordnungsnummer unter der die Sequenz des Gens in Gendatenbanken, z. B. in einer EST (expressed sequence tags) Datenbank, EMBEL (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg) oder NCBI (National Center for Biotechnology Information, Maryland, USA) gespeichert ist und die entsprechende Referenz unter der diese Daten publiziert wurden, angegeben.

Alle Genprodukte der bisher bekannten Semaphorin Gene weisen ein N-terminales Signalpeptid auf, an dessen C-terminalem Ende sich eine charakteristische Sema-Domäne mit einer Länge von etwa 450 bis 500 Aminosäuren befindet. Innerhalb der Sema-Domäne finden sich stark konservierte Aminosäuremotive und eine Anzahl hochkonservierter Cysteinreste. Die Genprodukte unterscheiden sich in den auf die Sema-Domäne folgenden C-terminalen Sequenzen, die aus einer oder mehreren Domänen aufgebaut sind. Sie weisen beispielsweise in diesen C-terminalen Aminosäuresequenzen Transmembrandomänen (TM), Immunoglobulin-ähnliche Domänen (Ig) (konstanter Teil des Immunoglobulins), zytoplasmatische Sequenzen (CP), Prozessierungssignale (P) beispielsweise mit der Konsesussequenz (RXR), wobei R für die Aminosäure Arginin und X für eine beliebige Aminosäure steht und/oder hydrophile C-Termini (HPC) auf. Auf der Basis der unterschiedlichen Domänenstruktur im C-Terminus lassen sich die Semaphorine in 5 verschiedene Untergruppen einteilen (I bis V):

Ein Rezeptor oder extrazellulärer Ligand für Semaphorine wurde bisher nicht beschrieben. Im Zusammenhang mit Semaphorin-vermittelten Effekten wurden intrazelluläre, heterotrimere GTP-bindende Proteinkomplexe beschrieben. Als ein Bestandteil dieser Proteinkomplexe wurden bei Hühnern sogenannte CRMP-Proteine (Collapsin response mediator protein) identifiziert, welche vermutlich Bestandteil der Semaphorin-induzierten intrazellulären Signalkaskade sind {Goshima et al. (1995) Nature 376: 509-514}. Das CRMP62 beispielsweise besitzt Homologie zu unc-33, einem für das gerichtete Axonwachstum essentiellen Nematoden-Protein. Ein humanes Protein mit 98% Aminosäure-Identität zu CRMP62 ist ebenfalls bekannt {Hamajima et al. (1996) Gene 180: 157-163}. Von Ratten wurden ebenfalls mehrere CRMP-verwandte Gene beschrieben {Wang et al. (1996) Neurosci. 16: 6197-6207}.

Die sezernierten oder transmembranen Semaphorine vermitteln repulsive Signale für wachsende Nervenknospen. Sie spielen eine Rolle bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS) und werden vor allem in Muskel- und Nervengewebe exprimiert (Kolodkin et al. (1993); Luo et al. (1993) Cell 75: 217-227}.

Außer im ZNS konnte eine deutliche Expression von M-Sema-G auch auf Zellen des lymphatischen und hämatopoetischen Systems beobachtet werden, im Gegensatz zum nahe verwandten M-Sema-F {Furuyima et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 33376-33381}.

Kürzlich wurden zwei weitere humane Semaphorine identifiziert, H-Sema-IV und H-Sema-V und zwar in einer Region auf Chromosom 3p21.3, deren Deletion mit verschiedenen Formen von Bronchialkarzinomen assoziiert ist. H-Sema-IV {Roche et al. (1996), Xiang et al. (1996), Sekido et al. (1996)} ist auf Aminosäureebene etwa zu 50% identisch mit M-Sema-E, während H-Sema-V {Sekido et al. (1996)} das direkte Homolog zu M-Sema-A ist (86% Aminosäureidentität). Da diese Gene (H-Sema-IV und -V) im Rahmen von DNA-Sequenzierungs-Projekten der deletierten 3p21.3 Loci gefunden wurden, ist die komplexe Intron-Exon-Struktur dieser beiden Gene bekannt. Die beiden Gene werden in verschiedenen neuronalen und nicht neuronalen Geweben exprimiert.

Ebenfalls erst vor kurzem wurde das zelluläre Oberflächenmolekül CD100 (human), exprimiert und induziert auf aktivierten T-Zellen als Semaphorin identifiziert (ebenfalls in Tabelle 1 aufgeführt). Es unterstützt die Interaktion mit B-Zellen über den Rezeptor CD40 und den entsprechenden Liganden CD40L. CD100 ist ein membranverankertes Glykoprotein-Dimer von 150 kd (Kilodalton). Es wurde eine Assoziation des intrazytoplasmatischen C-Terminus von CD100 mit einer noch unbekannten Kinase beschrieben {Hall et al. (1996)}. Damit war CD100 das erste und bisher einzige Semaphorin, dem eine Rolle im Immunsystem zugeschrieben wird.

Unter der Fragestellung "Transformierende Gene von Rhadinoviren" wurde das komplette Genom des Alcelaphinen Herpesvirus Typ 1 (AHV-1) kloniert und sequenziert {Ensser et al. (1995)}. AHV-1 ist der Erreger des bösartigen Katarrhalfiebers, einer mit einem lymphoproliferativen Syndrom einhergehenden, meist fatalen Erkrankung verschiedener Wiederkäuer. Bei der Analyse wurde an einem Ende des viralen Genoms ein offener Leserahmen mit entfernter, aber signifikanter Homologie zu einem Gen von Vacciniavirus (ORF-A39 ≘ VAC-A39 in Ensser et al. (1995)) J. Gen. Virol. 76: 1063-1067), welches der Genfamilie der Semaphorine zugerechnet wurde gefunden. Während das AHV-1 Semaphorin (AHV-Sema) eine gut konservierte Semaphorin-Struktur besitzt, sind die Poxvirus-Gene (ORF-A39 und ORF-A39-homolog, siehe Tabelle 1) C-terminal verkürzt, d. h. bei ihnen ist die konservierte Sema-Domäne nur unvollständig vorhanden.

Ein Datenbankvergleich des gefundenen AHV-Sema mit dbEST (Datenbank (db) von expressed sequence tags (EST)) 4 EST-Sequenzen (Zuordnungsnummern H02902, H03806 (Klon 151129), R33439 und R33537 (Klon 135941) von 2 unabhängigen cDNA-Klonen aus humaner Plazenta. Diese wiesen deutlich höhere Homologie zum AHV-1 Semaphorin auf, als zu den bis dahin beschriebenen neuronalen Semaphorinen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Semaphorine mit einer neuen, bisher nicht bekannten und nicht zu erwartenden Domänenstruktur, denen eine biochemische Funktion im Immunsystem zukommt (immunmodulierende Semaphorine). Die erfindungsgemäßen Semaphorine werden als Semaphorine vom Typ L (Sema-L) bezeichnet. Sie enthalten ein N-terminales Signalpeptid, eine charakteristische Sema-Domäne und im C-terminalen Bereich des Proteins eine Immunglobulin-ähnliche Domäne und eine hydrophobe Domäne, die eine potentielle Transmembrandomäne darstellt.

Die Aminosäure-Sequenz des Signalpeptids kann weniger als 70, vorzugsweise weniger als 60 Aminosäuren und mehr als 20, vorzugsweise mehr als 30 Aminosäuren aufweisen, besonders bevorzugt ist eine Länge von etwa 40 bis 50 Aminosäuren.

Die Sema-Domäne kann eine Länge von 300 bis 700 oder mehr, vorzugsweise von etwa 400 bis 600 Aminosäuren aufweisen. Bevorzugt sind Sema-Domänen mit einer Länge von 450 bis 550 Aminosäuren, vorzugsweise von etwa 500 Aminosäuren.

Die Immunglobulin-ähnliche Domäne kann eine Länge von etwa 30 bis 110 oder mehr Aminosäuren aufweisen, bevorzugt sind Längen zwischen 50 und 90, besonders bevorzugt etwa 70 Aminosäuren.

Die Transmembrandomäne kann eine Länge von etwa 10 bis 35, vorzugsweise von etwa 15 bis 30, besonders bevorzugt von etwa 20 bis 25 Aminosäuren aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind Semaphorine vom Typ L aus verschieden Spezies, insbesondere aus Wirbeltieren, beispielsweise aus Vögeln und/oder Fischen, vorzugsweise aus Säugetieren, beispielsweise aus Primaten, Ratte, Kaninchen, Hund, Katze, Schaf, Ziege, Kuh, Pferd, Schwein, besonders bevorzugt aus Mensch und Maus. Gegenstand der Erfindung sind auch entsprechende Semaphorine aus Mikroorganismen, insbesondere aus pathogenen Mikroorganismen, beispielsweise aus Bakterien, Hefen und/oder Viren, z. B. aus Retroviren, insbesondere aus humanpathogenen Mikroorganismen.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein entsprechendes humanes Semaphorin (H-Sema-L), das ein Signalpeptid, eine Sema-Domäne, eine Immunglobulin­ ähnliche Domäne und eine Transmembrandomäne aufweist. Eine spezielle Ausführungsform ist das Semaphorin, das durch die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 4 gegeben ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies, die im Bereich der Sema-Domäne eine Aminosäureidentität größer als 40%, vorzugsweise größer 50%, besonders bevorzugt größer 60% im Bezug auf die Sema-Domäne von H-Sema-L (Aminosäuren 45 bis 545 der Sequenz in Tabelle 4) aufweisen. Aus näher verwandten Spezies (z. B. Primaten, Maus) können die korrespondierenden Semphorine durchaus Aminosäureidentitäten größer als 70%, vorzugsweise größer als 80%, besonders bevorzugt größer als 90% aufweisen.

Eine derartige Ausführungsform der Erfindung ist ein korrespondierendes Semaphorin der Maus (murines Semaphorin (M-Sema-L)). Beispielsweise enthält dieses die partielle Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 5 (murines Semaphorin (M-Sema-L)).

Die Erfindung betrifft auch korrespondierende Semaphorine, die eine Aminosäureidentität (über die Gesamtlänge der Aminosäuresequenz des Protein betrachtet) von nur etwa 15 bis 20% bei wenig verwandten Spezies (phylogenetisch weit voneinander entfernt), vorzugsweise 25 bis 30%, besonders bevorzugt 35 bis 40% oder eine höhere Identität im Bezug auf die gesamte Aminosäuresequenz von H-Sema-L gemäß Tabelle 4 aufweisen.

Die Gene der erfindungsgemäßen Semaphorine, die für Semaphorine von Typ L kodieren weisen eine komplexe Exon-Intron-Struktur auf. Diese Gene können beispielsweise zwischen 10 und 20 Exons, vorzugsweise etwa 11 bis 18, besonders bevorzugt 12 bis 16 Exons und eine entsprechende Anzahl von Introns aufweisen. Sie können aber auch die gleiche Anzahl Exons und Introns aufweisen wie das Gen von H-Sema-L (13 bis 15, vorzugsweise 14 Exons).

Als eine Folge dieser komplexen Intron-Exon Struktur kann das Primärtranskript der mRNA unterschiedlich gespliced werden, wodurch unterschiedliche Splicevarianten dieser Semaphorine entstehen. Die aus diesen Splicevarianten translatierten Proteine sind Derivate der erfindungsgemäßen Semaphorine. Sie entsprechen in ihrer Aminosäuresequenz und auch weitgehend in ihrer Domänenstruktur den beschriebenen, erfindungsgemäßen Semaphorinen vom Typ L, sind jedoch gegenüber diesen verkürzt. Beispielsweise können Splicevarianten, denen die Transmembrandomäne ganz oder teilweise fehlt, gebildet werden. Semaphorin-Derivate, die keine oder keine vollständige Transmembrandomäne, aber ein Signalpeptid enthalten, können sezerniert werden und auf diese Weise außerhalb der Zelle lokal oder auch über größere Entfernungen wirken, beispielsweise auf andere Zellen. Weitere Splicevarianten können beispielsweise keine Sequenz mehr enthalten, die für ein Signalpeptid kodiert und gegebenenfalls auch keine Sequenz, die für eine für hydrophobe Aminosäuresequenz kodiert, die eine potentielle Transmembrandomäne darstellt. Eine Folge wäre, daß diese Semaphorin-Derivate weder in die Membran eingebaut, noch sezerniert werden würden (es sei denn über sekretorische Vesikel). Solche Semaphorin-Derivate könnten an intrazellulären Prozessen, beispielsweise an Signaltransduktionsprozessen beteiligt sein. Auf diese Weise könnte mit dem gleichen Grundmoleküle (beanspruchte Semaphorine) und den davon abgeleiteten Derivaten (beispielsweise Splicevarianten) vielfälltige intra- und extrazelluläre Prozesse reguliert und/oder aufeinander abgestimmt werden.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft Semaphorin-Derivate, die sich von den erfindungsgemäßen Semaphorinen ableiten, die aber keine oder keine vollständige Transmembrandomäne enthalten.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Semaphorin-Derivate, die sich von den erfindungsgemäßen Semaphorinen ableiten, die aber kein Signalpeptid enthalten.

Signalpeptide können auch posttranslational abgespalten werden. Dadurch werden membranständige (mit TM-Domäne) oder sezernierte (Splicevariante ohne TM-Domäne) Semaphorin-Derivate mit verkürzter Domänenstruktur gebildet werden. Solche posttranslational prozessierten Semaphorin-Derivate enthalten nur noch Sema-Domäne, Ig-Domäne und gegebenenfalls Transmembrandomäne. Eine Signalpeptidschnittstelle kann beispielsweise direkt am Ende des Signalpeptids liegen, z. B. 40 bis 50 Aminosäuren oder weiter vom Aminoterminus entfernt lokalisiert sein.

"Verkürzte" (d. h. weniger Domänen enthaltende) Semaphorine-L-Derivate sind von anderen Semaphorinen dadurch zu unterscheiden, daß sie eine sehr große (< 90%) Aminosäureidentität oder eine identische Aminosäuresequenz mit den Semaphorinen vom Typ L in den vorhandenen Domänen aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Semaphorine können auch in anderer Weise posttranslational modifiziert sein. Beispielsweise können sie ein-, zwei-, drei-, vier­ fünf-, sechs-, sieben-, acht-, neun- zehn- oder mehrfach glykosyliert (N- und/oder O-glykosyliert) vorliegen. Die Aminosäuresequenzen der Semaphorine können dann ebenso viele oder mehr Konsensussequenzen für potentielle Glykosylierungsstellen aufweisen, vorzugsweise fünf derartige Stellen. Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft Semaphorine, bei denen die Glykosylierungsstellen an den Positionen lokalisiert sind, die den Positionen 105, 157, 258, 330 und 602 der H-Sema-L Aminosäuresequenz entsprechen (Tabelle 4).

Darüber hinaus können die Semaphorine in Form ihrer phosphorylierten Derivate vorliegen. Semaphorine können die Substrate unterschiedlicher Kinasen sein, beispielsweise können die Aminosäuresequenzen Konsensussequenzen für Protein Kinase C, Tyrosin Kinase und/oder Kreatin Kinasen aufweisen. Weiterhin können die Aminosäuresequenzen der Semaphorine Konsensussequenzen für potentielle Myristilierungsstellen aufweisen. An diesen Stellen können entsprechende Semaphorin-Derivate mit Myristinsäure verestert sein.

Die erfindungsgemäßen Semaphorine und deren Derivate können in Form von Monomeren, Dimeren und/oder Multimeren vorliegen, beispielsweise können zwei oder mehr Semaphorine bzw. deren Derivate über intermolekulare Disulfidbrücken miteinander verbunden sein.

Derivate der erfindungsgemäßen Semaphorine sind weiterhin Fusionsproteine, die Semaphorine vom Typ L oder Teile derselben enthalten und ein anderes Peptid oder Protein bzw. ein Teil desselben. Solche Peptide oder Proteine bzw. Teile derselben können z. B. Epitope-Tags (z. B. His-Tag (6×Histidin), Myc-Tag, flu-Tag), die z. B. zur Aufreinigung der Fusionsproteine verwendet werden können, oder solche, die zur Markierung der Fusionsproteine verwendet werden können, z. B. GFP (green fluoroscent protein).

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA- und RNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Semaphorine von Typ L und/oder deren Derivate kodieren, beispielsweise die entsprechenden Gene, die unterschiedlichen Splicevarianten der mRNA, die dazu korrespondierenden cDNAs sowie deren Derivate, z. B. Salze der DNA bzw. RNA. Derivate im Sinne der Erfindungen sind Sequenzen oder Teile davon, die z. B. mit molekularbiologischen Methoden verändert und an die jeweiligen Anforderungen angepaßt werden, beispielsweise verkürzte Gene, cDNAs oder Chimäre derselben, Konstrukte für Expressionen und klinierungen und deren Salze.

Eine Ausführungsform betrifft die genomischen Sequenzen (Gene) der Semaphorin (Typ L) kodierenden DNA. Das beinhaltet die Intron- und Exon-Sequenzen und genregulatorische Sequenzen, beispielsweise Promotor-, Enhancer- und Silencer-Sequenzen.

Ein Gegenstand dieser Ausführungsform ist das Gen von H-Sema-L bzw. dessen Derivate.

Ein weiterer Gegenstand dieser Ausführungsform ist das Gen von M-Sema-L bzw. dessen Derivate.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die cDNA von H-Sema-L oder deren Derivate. Eine besondere Ausführungsform ist die cDNA von H-Sema-L gemäß der Aminosäuresequenz in Tabelle 2.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die cDNA von M-Sema-L oder deren Derivate. Eine besondere Ausführungsform ist die partielle cDNA-Sequenz von M-Sema-L gemäß Tabelle 3 sowie cDNA-Sequenzen, die diese partielle cDNA-Sequenz enthalten.

Die Erfindung beinhaltet auch Allele und/oder individuelle Ausprägungsformen der Gene/mRNAs/cDNAs, die sich nur geringfügig von hier beschriebenen Semaphorin-Sequenzen unterscheiden und für ein identisches oder nur geringfügig verändertes Protein (Abweichung in der Aminosäure-Sequenz kleiner oder gleich 10%) kodieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Plasmide, die DNA, die für die Semaphorine des Typs L bzw. deren Derivate kodiert enthalten. Solche Plasmide können beispielsweise Plasmide mit hohen Replikationsraten sein, die für eine Amplifikation der DNA, z. B. in E. coli geeignet sind.

Eine spezielle Ausführungsform sind Expressionsplasmide, mit denen die Semaphorine bzw. Teile davon oder deren Derivate in prokarytischen und/oder eukaryotischen Expressions-Systemen exprimiert werden können. Es sind sowohl Expressionsplasmide die konstitutive als auch solche, die induzierbare Promotren enthalten, geeignet.

Darüber hinaus können die Semaphorine bzw. deren Derivate als Fusionsproteine exprimiert werden, beispielsweise mit Proteinen oder Peptiden, die einen Nachweis des exprimierten Fusionsproteins erlauben, z. B. als Fusionsprotein mit GFP (green fluorescent protein). Die Semaphorine können auch als Fusionsproteine mit einem, zwei, drei oder mehreren Epitope-Tags, beispielsweise mit Myc- und/oder His-(6×Histidin) und/oder flu-Tags exprimiert werden. Entsprechend können Plasmide verwendet oder hergestellt werden, die DNA-Sequenzen enthalten, die für diese Peptide/Proteine kodieren, beispielsweise Plasmide, die DNA-Sequenzen enthalten, die für GFP und/oder Epitope-Tags, z. B. Myc-Tag, His-Tag, flu-Tag kodieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper, die spezifisch die Semaphorine vom Typ L, deren Derivate oder Teile davon binden bzw. erkennen. Dies können beispielsweise polyklonale oder monoklonale Antikörper, die z. B. in Maus, Kaninchen, Ziege, Schaf, Huhn usw. hergestellt werden können, sein.

Eine besondere Ausführungsform dieses Gegenstandes sind Antikörper, die gegen die Epitope die den Aminosäuresequenzen von Position 179 bis 378 bzw. 480 bis 666 der H-Sema-L Sequenz gemäß Tabelle 4 entsprechen, gerichtet sind.

Diese Antikörper können beispielsweise zur Aufreinigung der entsprechenden Semaphorine, z. B. von H-Sema-L und dessen Derivaten z. B. über Affinitätssäulen oder zum immunologischen Nachweis der Proteine, z. B. im ELISA, im Western-Blot und/oder in der Immunhistochemie verwendet werden.

Die cDNA von H-Sema-L hat eine Länge von 2636 Nukleotiden (Tabelle 2). Das Genprodukt der H-Sema-L-cDNA hat eine Länge von etwa 666 Aminosäuren (Tabelle 4) und weist die typische Domänenstruktur eines Semaphorin vom Typ-L Domänen mit N-terminalem Signalpeptid (Aminosäuren 1 bis 44), Sema-Domäne (Aminosäure 45 bis ungefähr Aminosäure 545) und Ig (Immunglobulin)-Domäne (etwa Aminosäuren 550 bis 620) sowie am C-terminalen Ende eine hydrophobe Aminosäuresequenz auf, die eine potentielle Transmembrandomäne darstellt. Diese Domänen-Struktur wurde bisher für Semaphorine noch nie beschrieben. Es handelt sich um ein membranassoziiertes, wahrscheinlich an der Zelloberfläche lokalisiertes Glykoprotein einer neuen Untergruppe. Aufgrund dieser bisher nicht bekannten Domänenstruktur können die Semaphorine nun in VI Untergruppen eingeteilt werden:

Die nichtglykosylierte, nichtprozessierte Form des H-Sema-L hat ein errechnetes Molekulargwicht von etwa 74,8 kD (74823.20 Dalton) (berechnet mit PeptideSort, GCG-Programm-Paket). Der Isoelektrische Punkt berechnet sich zu pH=7.56. Eine mögliche Signalpeptid-Schnittstelle liegt zwischen den Aminosäuren 44 und 45 (Tabelle 3; berechnet mit Signal P, einem auf neuronalen Netzwerken basierenden Programm zur Analyse von Signalsequenzen {Nielsen H. et. al. (1997) Protein Engineering 10: 1-6}). Dies ergibt für das prozessierte Protein (ohne Signalpeptid) ein Molekulargewicht (MW) von 70322.85 Dalton (703 KD) und einen Isoelektrischen Punkt von pH=7.01.

Die genomische Struktur ist ebenfalls weitgehend geklärt. Das H-Sema-L-Gen weist 13 bis 15, vorzugsweise 14 Exons und 12 bis 14 Introns, vorzugsweise 13 Introns auf. Aufgrund dieser komplexen Exon-Intron-Struktur sind unterschiedliche Splice-Varianten möglich. Die mRNA des trankribierten H-Sema-L-Gens findet sich im Northern-Blot vor allem in Placenta, Keimdrüsen, Thymus, Darm und Milz. Ein Hinweis auf eine spezifisch regulierte Expression in Endothelzellen liegt vor.

Durch alternatives Splicing können auch Formen von H-Sema-L mit intrazytoplasmatischen Sequenzen entstehen, die eine Rolle in der intrazellulären Signaltransduktion spielen, ähnlich wie z. B. bei CD100. Ebenfalls möglich wären durch alternatives Splicing entstehende, sezernierte Formen von H-Sema-L, analog zum viralen AHV-Sema.

Postranslationale Modifikationen wie Glykosylierung und Myristilierung von H-Sema-L sind ebenfalls möglich. Konsensus-Sequenzen für N-Glykosylierungsstellen wurden mit Hilfe des Programs Prosite (GCG Program-Paket) an den Positionen 105, 157, 258, 330, 602 der Aminosäuresequenz von H-Sema-L (gemäß Tabelle 4) gefunden, solche für Myristilierung an den Positionen 114, 139, 271, 498, 499, 502, 654 (Konsensus-Sequenz: G ∼ (E, D, R, K, H, P, F, Y, W)×(S, T, A,G, C, N) ∼ (P)). Darüber hinaus enthält die Aminosäuresequenz von H-Sema-L mehrere Konsensus-Sequenzen für potentielle Phosphorylierungsstellen durch unterschiedliche Kinasen. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß H-Sema-L das Substrat unterschiedlicher Kinase sein kann, z. B. Phosphorylierungsstellen für Kreatin-Kinase 2, Protein-Kinase C und Tyrosin-Kinase:

Vorausgesagte Kreatin-Kinase 2-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz Ck2: (S,T)×2(D,E)) (Prosite, GCG) an den Position 119, 131,173, 338, 419, 481 der Aminosäuresequenz.
Vorausgesagte Protein-Kinase-C-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz PkC: (S,T)×(R, K)) (Prosite, GCG) an den Position 107, 115,190, 296, 350, 431, 524, 576 der Aminosäuresequenz.
Vorausgesagte Tyrosin-Kinase-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz: (R,K)×{2,3}(D,E)×{2,3}Y) (Prosite, GCG) an Position 205 der Aminosäuresequenz.

Die Konsensusequenzen sind im Einbuchstabencode für Aminosäuren angegeben.

Ein für Integrine charakteristisches "RGD"-Motiv (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) findet sich an Position 267.

Die Glykosylierungsstellen sind gut konserviert zwischen viralem AHV-Sema, H-Sema-L und (soweit bekannt) M-Sema-L.

Eine Di- oder Multimerisierung von H-Sema-L ist möglich und wurde bei anderen Semaphorinen wie CD100 beschrieben {Hall et al. (1996)}. Das CD100 Molekül ist ebenfalls ein membranverankertes Glykoprotein-Dimer von 150 kd. CD100 ist jedoch nicht nahe verwandt mit dem erfindungsgemäßen humanen Semaphorin (H-Sema-L).

Die partielle cDNA-Sequenz von M-Sema-L hat eine Länge von 1195 Nukleotiden. Diese Sequenz kodiert für ein Protein mit 394 Aminosäuren. Diese 394 Aminosäuren entsprechen den Aminosäuren 1 bis 396 von H-Sema-L. Das Signalpeptid im M-Sema-L ersteckt sich über die Aminosäuren 1 bis 44 (genau wie im H-Sema-L). Die Sema-Domäne beginnt bei der Aminosäure 45 und erstreckt sich bis zum Ende bzw. wahrscheinlich über das Ende der Sequenz gemäß Tabelle 4 hinaus.

Ein Vergleich der Proteinsequenzen der bekannten und der neuen Semaphorine und eine phylogenetische Analyse dieser Sequenzen zeigt, daß sich die Gene entsprechend ihrer phylogenetischen Verwandtschaft einteilen lassen. Hier fließt natürlich die C-terminale Domänenstruktur der entsprechenden Semaphorin-Subtypen als entscheidender Faktor mit ein, weshalb Semaphorine der gleichen Untergruppen in der Regel auch phylogenetisch näher verwandt sind, als Semaphorine unterschiedlicher Untergruppen. Darüber hinaus ist ein Faktor die Spezies aus der das entsprechende Semaphorin isoliert wurde.

Eine phylogenetische Analyse der bekannten Semaphorin Aminosäuresequenzen (vollständige Sequenzen und/oder Teilsequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen für H-Sema-L und M-Sema-L gemäß den Tabellen 4 und 5 verwendet wurden, für alle anderen Sequenzen, die unter den Zugangsnummern gespeicherten Sequenzen bzw. die von diesen Sequenzen abgeleiteten kodierenden Aminosäuresequenzen)) mittels des Programms CLUSTALW {Thompson J.D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680} zeigte, daß die Aminosäuresequenzen von AHV-Sema, H-Sema-L und M-Sema-L phylogenetisch nahe miteinander verwandt sind und eine eigene phylogenetische Gruppe bilden. Sie sind untereinander deutlich näher verwandt, als mit irgendeinem anderen bisher bekannten Semaphorin. Die Analyse zeigt weiterhin, daß auch andere Semaphorine phylogenetisch nahe miteinander verwandt sind und eine eigene Gruppe innerhalb der Semaphorine bilden. Beispielsweise fallen die Semaphorine, die sezerniert werden, z. B. H-Sema-III-, IV, -V, und -E in eine phylogenetische Gruppe. Zu dieser Subfamilie gehören auch deren Homologe in anderen Spezies, während das humane (transmembrane) CD100 beispielsweise mit dem Collapsin-4 in eine phylogenetische Gruppe fällt. Die strukturell verschiedenen M-Sema-F und -G, sowie die Semaphorine der Nicht-Wirbeltiere bilden wiederum getrennte, phylogenetische nahe verwandte Gruppen.

Im Bezug auf die gesamten Aminosäuresequenzen liegen die beobachteten Homologien innerhalb der phylogenetischen Gruppen zwischen etwa 90% Aminosäureidentität im Bezug auf sehr nahe verwandte Gene wie z. B. H- und M-Sema-E oder -III/D und etwas weniger als 40% bei wenig verwandten Genen der Semaphorine. Innerhalb der Sema-Domäne liegt die beobachtete Aminosäureidentität um einige Prozent höher, und durch ihren großen Anteil am Gesamtprotein (50-80% des Proteins gehören zur Sema-Domäne) der Aminosäuresequenz beeinflußt diese wesentlich die Gesamtidentität. H-Sema-L ist, über das Gesamtprotein berechnet, zu 46% identisch mit AHV-Sema, wird dagegen die Sema-Domäne allein betrachtet, dann beträgt die Aminosäureidentität 53%. Dies ist höher als z. B. zwischen den verwandten M-Sema-B und -C (37% Identität im Bezug auf das Gesamtprotein, 43% Identität im Bezug auf die Sema-Domäne), ähnlich wie M-Sema-A und -E (43% Gesamtprotein, 53% Sema-Domäne). Die Aminosäureidentität zwischen der partiellen M-Sema-L Sequenz (Tabelle 6) und H-Sema-L (Tabelle 5) liegt im Bereich der Sema-Domäne bei 93%, so daß davon ausgegangen werden kann, daß es sich um das entsprechend homologe Gen der Maus handelt.

Korrespondierende Semaphorine zu H-Sema-L und M-Sema-L in anderen Spezies können innerhalb der Sema-Domäne eine Aminosäureidentität größer als 40% im Bezug auf H-Sema-L aufweisen. Bei den nahe verwandten Wirbeltieren (Säuger, Vögel) können sogar Aminosäureidentitäten über 70% angetroffen werden.

Es handelt sich um eine neue Subfamilie von Semaphorinen mit größerer Aminosäureidentität zu dem viralen AHV-Sema als zu den bisher bekannten humanen bzw. murinen Semaphorinen, und mit einer für humane Semaphorine bisher nicht bekannten C-terminalen Struktur. Diese neuen Semaphorine (Mitglieder der Subfamilie) zeichnen sich dadurch aus, daß sie aufgrund ihrer Domänen­ struktur in die Untergruppe IV fallen und/oder die gleiche phylogenetische Gruppe fallen wie H-Sema-L und M-Sema-L und/oder im Bezug auf die gesamte Aminosäuresequenz zu H-Sema-L eine Aminosäureidentität von mindestens 15 bis 20%, vorzugsweise 25 bis 30%, besonders bevorzugt 35 bis 40% oder eine größere Identität aufweisen und/oder im Bezug auf die Sema-Domäne eine Aminsäureidentität mit H-Sema-L von mindestens 40%, vorzugsweise größer 50%, besonders bevorzugt größer 60% aufweisen.

Den Semaphorinen dieser Subfamilie kommt auch eine andersartige biochemische Funktion zu. Eine neue Funktion dieser Semaphorine liegt in der Modulation des Immunsystems.

Das nächste Verwandte von H-Sema-L ist das virale AHV-Semaphorin (AHV-Sema). Dieses ist von ähnlicher Größe, besitzt aber im Gegensatz zum H-Sema-L keine Transmembrandomäne. Das AHV-Sema wird vermutlich von virusinfizierten Zellen sezerniert, um den H-Sema-L äquivalenten Rezeptor (Semaphorin von Typ L im Streifengnu) im natürlichen Wirt (Streifengnu) zu blockieren, und so dem Angriff des Immunsystems zu entgehen. Ferner ist eine Funktion als repulsives Agens (Chemorepellent) für Zellen des Immunsystems denkbar.

Die biochemische Funktion der neuen Semaphorine vom Typ L und deren Derivate ist als generell immunmodulierend und/oder entzündungsmodulierend anzusehen. Einerseits können sie

• A) als die Immunantwort hemmende Moleküle entweder lokal, z. B. als Transmembranprotein an der Oberfläche von Zellen oder auch über größere Entfernungen, z. B. wenn sie durch Prozessierung (z. B. Proteasen) oder alternatives Splicing sezerniert werden, z. B. durch Diffusion im Gewebe, ihre Wirkung als Chemorepellent und/oder Immunsuppressivum entfalten. Beispielsweise kann die Expression dieser neuen Semaphorine vom Typ L z. B. an der Oberfläche der Zellen der Gefäßendothelien das Leukozyten-Attachment und deren Migration durch die Gefäßwand verhindern. Den neuen Semaphorinen kann eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Schrankenwirkungen, z. B. zur Verhindung von Infektionen in besonders "wichtigen" oder exponierten Organen, beispielsweise zur Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke, des Plazentarkreislaufs und/oder anderen immunologisch privilegierten Orten (z. B. Pancreas-Inseln) und/oder beim Schutz vor Autoimmunerkrankungen zukommen.
  Darüber hinaus können die neuen Semaphorine und/oder ihre Derivate in verschiedenen Geweben auch an repulsiven Signalen, beispielsweise für Zellen des Immunsystems (z. B. Leukozyten) als Schutz gegen versehentliche Aktivierung von Abwehrmechanismen beteiligt sein.
• B) Weiterhin können den neuen Semaphorinen und/oder deren Derivaten Funktionen als akzessorische Moleküle, zukommen. An der Zelloberfläche exprimiert kann sie beispielsweise an der Interaktion mit Zellen des Immunsystems im Rahmen der Aktivierung von Abwehrmechanismen beteiligt sein.

Dadurch ergeben sich mehrere Verwendungsmöglichkeiten für die neuen Sempahorine vom Typ L und deren Derivaten, sowie den für diese Proteine kodierenden Nukleinsäuren.

Funktion A)

Es handelt sich um ein immunsuppressives und/oder entzündungshemmendes Prinzip: Zahlreiche potentielle Anwendungsmöglichkeiten liegen in den Bereichen Organtransplantation, Entzündungstherapie, Immuntherapie und Gentherapie.

Beispielsweise können mit Hilfe der Semaphorin-kodierenden DNA oder Derivaten derselben nicht-humane, transgene Tiere hergestellt werden. Eine Anwendungsmöglichkeit dieser Tiere liegt in der Hemmung der Transplantatabstoßung in transgenen Modellen für Organtransplantationen. Beispielsweise können transgene, gegen Abstoßung geschützte tierische Organe für Xenotransplantationen hergestellt werden. Dies sollte z. B. auch zusammen mit anderen Transgenen (z. B. Komplementregulatoren wie DAF oder CD59) möglich sein. Eine weitere Anwendung liegt in der Herstellung von nicht-humanen Knock-out Tieren, beispielsweise von Knock-out Mäusen: Durch Knock-out des Mausgens M-Sema-L können z. B. weitere Funktionen des Gens aufgefunden werden. Sie stellen auch potentielle Modellsysteme für entzündliche Erkrankungen dar, falls die Mäuse ohne Semaphorin-Gen lebensfähig sind. Sollte M-Sema-L wichtig für die Immunmodulation sein, so sind vermehrt solche Mäuse zu erwarten.

Weiterhin können nicht-humane Knock-in-Tiere, beispielsweise Mäuse, hergestellt werden. Dabei wird z. B. M-Sema-L durch normales/verändertes H-Sema-L oder verändertes M-Sema-L (z. B. Integration der neuen Semaphorin-Subtypen unter der Kontrolle von konstitutiven und/oder induzierbaren Promotoren) ersetzt. Solche Tiere können z. B. für die Suche nach weiteren Funktionen der neuen Semaphorine, z. B. Funktionen des humanen Gens oder Derivaten dieser Gene dienen oder zum Auffinden von immunmodulierenden Wirkstoffen benutzt werden.

Herstellung z. B. rekombinant von Immunsuppressiven, anderen löslichen Proteinen oder Peptiden die sich von der Aminosäuresequenz der Semaphorine vom Typ L, z. B. von H-Sema-L oder den entsprechenden Nukleinsäuren, z. B. Genen ableiten; auch Agonisten mit struktureller Ähnlichkeit sind möglich. Diese immunsuppressiven Wirkstoffe/Agonisten können bei Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen und/oder Organtransplantationen eingesetzt werden.

Gentherapie mit Semaphorinen vom Typ L, z. B. mit Sequenzen, die für H-Sema-L oder deren Derivate kodieren mittels viraler oder nichtviraler Methoden. Einsatz bei Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen, der Transduktion von Organen sowie vor/während/nach Transplantationen zur Verhinderung der Transplantatabstoßung.

Eine Ausführungsform ist ein Verfahren, bei dem die neuen Semaphorine, für diese Semaphorine kodierende DNA und Derivate derselben, insbesondere H-Sema-L, für H-Sema-L kodierende DNA und Derivate derselben in einem Verfahren zum Screening Wirkstoffen, insbesondere immunmodulierenden Wirkstoffen, eingesetzt werden.

Funktion B)

H-Sema-L ist ein akzessorisches Molekül, das an der Zelloberfläche exprimiert wird und an der Interaktion mit Zellen, z. B. des Immunsystems, z. B. als akzessorisches Molekül in der Aktivierung von Signalwegen, beteiligt ist. Ein virales Gen bzw. das Genprodukt eines viralen oder anderen pathogenen Gens/Genproduktes z. B. mikrobilogischen Ursprunges könnte z. B. als kompetitiver Inhibitor dieses akzessorischen Moleküls wirken. Eine Anwendung für die neuen Semaphorine liegt bei dieser Funktion ebenfalls im Bereich der Organtransplantation, Entzündungstherapie, Immuntherapie und/oder Gentherapie.

Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Semaphorine in einem Verfahren zum Screening von antagonistischen Wirkstoffen/Inhibitoren verwendet werden, die dann z. B. zur Blockade des Rezeptors eingesetzt werden können. Lösliche und/oder sezernierte H-Sema-L Antagonisten/Inhibitoren können beispielsweise chemische Substanzen sein oder die neuen Semaphorine bzw. Derivate derselben (z. B. Teile/verkürzte Formen derselben, beispielsweise ohne Membrandomäne oder als Ig-Fusionsproteine oder von ihnen abgeleitete Peptide, die geeignet sind den korrespondierenden Rezeptor zu blockieren). Auf diese Weise identifizierte, spezifische Antagonisten und/oder Inhibitoren können beispielsweise kompetitiv wirken und bei der Hemmung der Abstoßung z. B. in transgenen Modellen für Organtransplantationen und bei Autoimmunerkrankungen, entzündlichen Erkrankungen und Organtransplantationen eingesetzt werden.

DNA, die für die erfindungsgemäßen Semaphorine kodiert bzw. deren mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden erzeugten Derivate können beispielsweise für die Herstellung nicht-humaner, transgener Tiere verwendet werden. Eine Überexpression von H-Sema-L kann in diesen transgenen Tieren zu vermehrter Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen und/oder entzündlichen Erkrankungen führen. Die transgenen Tiere eignen sich damit zum Screening von neuen, spezifischen, immunmodulierenden Wirkstoffe.

Diese DNA kann ebenso für die Herstellung von nicht-humanen Knock-out Tieren, beispielsweise Knock-out Mäusen, bei denen das Mausgen M-Sema-L ausgeschaltet wird, verwendet werden. Solche Knock-out Tiere können für die Suche nach weiteren biochemischen Funktionen des Gens eingesetzt werden. Sie stellen auch potentielle Modellsysteme für entzündliche Erkrankungen dar, falls die Mäuse ohne das M-Sema-L Gen lebensfähig sind.

Diese DNA kann ebenso zur Herstellung von nicht-humanen Knock-in-Tieren beispielsweise Mäusen verwendet werden. Dabei wird das M-Sema-L-Gen durch ein verändertes M-Sema-L Gen/cDNA oder ein gegebenenfalls verändertes, z. B. mutiertes Semaphorin Typ L Gen/cDNA einer anderen Spezies, z. B. von H-Sema-L ersetzt. Solche transgenen Tiere können für die Suche nach weiteren Funktionen der erfindungsgemäßen Semaphorine verwendet werden.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Semaphorinen vom Typ L und deren Derivaten, sowie der für diese Proteine kodierenden Gene/cDNAs und deren Derivaten und/oder mit Hilfe dieser Semaphorine identifizierter Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln. Beispielsweise können Arzneimittel hergestellt werden, die in der Gentherapie angewendet werden können und die Agonisten und/oder Antagonisten der Expression von Semaphorinen vom Typ L, beispielsweise von H-Sema-L, enthalten. Dazu können virale und/oder nichtvirale Methoden verwendet werden. Diese Arzneimittel können z. B. bei Autoimmunerkrankungen und entzündliche Erkrankungen, Organtransplantationen vor und/oder während und/oder nach der Transplantation zur Verhinderung der Abstoßung eingesetzt werden.

Verwendung der neuen Semaphorine, insbesondere von H-Sema-L und von Genen/cDNAs derselben in Verfahren zum Screening von neuen Wirkstoffen. Modifizierte Proteine und/oder Peptide, die sich von H-Sema-L und/oder M-Sema-L ableiten, können zur Suche nach dem entsprechenden Rezeptor und/oder dessen Antagonisten bzw. Agonist in funktionellen Tests, beispielsweise mittels Expressionskonstrukten von H-Sema-L und Homologen eingesetzt werden. Die für die neuen Semaphorine kodierenden Gene, cDNAs und deren Derivate können auch als Hilfsmittel in der Molekularbiologie eingesetzt werden.

Versuchsbedingungen, die in den Beispielen Anwendung finden Verwendete PCR-Programme

Taq52-60 (mit Ampli-Taq®-Polymerase, Perkin Elmer,)
96°C/60 s: 1 Zyklus
96°C/15 s-52°C/20 s-70°C/60 s: 40 Zyklen
70°C/60 s: 1 Zyklus

Taq60-30
96°C/60 s: 1 Zyklus
96°C/15 s-60°C/20 s-70°C/30 s: 35 Zyklen
70°C/60 s: 1 Zyklus

Taq60-60
96°C/60 s: 1 Zyklus
96°C/15 s-60°C/20 s-70°C/60 s: 35 Zyklen
70°C/60 s: 1 Zyklus

Taq62-40
96°C/60 s: 1 Zyklus
96°C/15 s-62°C/20 s-70°C/40 s: 35 Zyklen
70°C/60 s: 1 Zyklus

Verwendete Reaktionsbedingungen für PCR mit Taq-Polymerase:
50 µl Reaktionsansätze mit 100-200 ng Template, 200 µM dNTP, 0,2-0,4 µM je Primer, 2.5 U Ampli-Taq®, 5 µl des mitgelieferten 10×Reaktionspuffers.

Verwendete Programme für:

• 1. XL62-6 (mit Expand-Long Template PCR System®, Boehringer Mannheim)
  94°C/60 s: 1 Zyklus
  94°C/15 s-62°C/30 s-68°C/6 min: 10 Zyklen
  94°C/15 s-62°C/30 s-68°C/(6 min+15 s/Zyklus): 25 Zyklen
  68°C/7 min: 1 Zyklus
• 2. XL62-12 (mit Expand-Long Template PCR System, Boehringer Mannheim)
  94°C/60 s: 1 Zyklus
  94°C/15 s-62°C/30 s-68°C/12 min: 10 Zyklen
  94°C/15 s-62°C/30 s-68°C/(12 min+15 s/Zyklus): 25 Zyklen
  68°C/7 min: 1 Zyklus

Reaktionsbedingungen für PCR mit Expand-Long Template PCR System 50 µl Reaktionsansätze mit 100-200 ng Template, 500 µM dNTP, 0,2-0,4 µM je Primer, 0,75 µl Enzym-Mix, 5 µl des mitgelieferten 10×Reaktionspuffers Nr. 2.

Beispiel 1

Ausgehend von Sequenzen des AHV-Sema (Ensser u. Fleckenstein (1995), J. General Virol. 76: 1063-1067) wurden PCRs und RACE-PCRs durchgeführt. Als Ausgangsmaterial hierfür diente humane cDNA aus Plazenta-Gewebe, an welche Adapter zur RACE-Amplifikation ligiert wurden (Marathon^TM-cDNA Amplification Kit, Clontech Laboratories GmbH, Tullastraße 4, 69126 Heidelberg). Zunächst wurde mittels spezifischer Primer (Nr. 121234 + Nr. 121236, Tabelle 6) ein PCR-Fragment mit einer Länge von etwa 800 bp (Basenpaaren) amplifiziert (PCR-Programm: (Taq60-60)). Dieses wurde kloniert und sequenziert (Dye-Deoxy-Terminator Sequenzierungs-Kit, Applied Biosystems, Brunnenweg 13, Weilderstadt). Die Sequenzierung des PCR-Produkts ergab eine Sequenz, die eine hohe Homologie zu der DNA-Sequenz von AHV-Sema aufweist, identisch zu der Sequenz der beiden ESTs.

Ein PCR-Fragment von 600 bp wurde mit dem Primerpaar (Nr. 121237 + Nr. 121239, Tabelle 6) identifiziert. Es zeigte sich, das es sich um Klone mit DNA-Sequenzen des selben Gens handelte.

Beispiel 2

Das 800 bp PCR-Fragment aus Beispiel 1 wurde radioaktiv markiert (Random-Priming nach der Methode von {Feinberg (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13}, mit ³²P-α-dCTP) und als Sonde für einen Multi-Tissue Northern-Blot (Human Multiple Tissue Northern Blot II, Clontech), der mRNA-Proben aus den Geweben Milz, Thymus, Prostata, Testis, Ovarien, Dünndarm, Dickdarm und Leukozyten (PBL) enthält, verwendet. Dabei zeigte sich deutlich die Expression einer mRNA mit einer Länge von etwa 3.3 kb in Milz und Keimdrüsen (Hoden, Eierstöcken), sowie schwächer in Thymus und Darm. Eine Hybridisierung eines Master-Blots (Dotblot mit RNA aus zahlreichen Geweben (Human RNA Master Blot^TM, Clontech) bestätigte dieses Ergebnis und zeigte auch eine starke Expression in Plazenta-Gewebe.

Beispiel 3

Eine cDNA-Bibliothek aus humaner Milz, kloniert in dem Bakteriophagen Lambda gt10 (Human Spleen 5' STRETCH PLUS cDNA, Clontech) wurde mit dieser Sonde durchsucht und ein Lambda-Klon identifiziert. Die in diesem Klon inserierte cDNA mit einer Länge von 1.6 kb wurde mittels PCR (Expand^TM Long Template PCR System, Boehringer Mannheim GmbH, Sandhofer Straße 116, 68305 Mannheim) amplifiziert wobei die vektorspezifischen Primer Nr. 207608 + Nr. 207609 (Tabelle 6) verwendet wurden (flankierend der EcoRI-Klonierungsstelle) und das erhaltene PCR-Fragment sequenziert. Dieser Klon enthielt das 5' Ende der cDNA und erweiterte die bekannte cDNA Sequenz auch nach 3'. Ausgehend von den neuen Teilsequenzen der cDNA wurden neue Primer für die RACE-PCR entwickelt (Nr. 232643, Nr. 232644, Nr. 233084, Tabelle 6). Zusammen mit einer verbesserten Thermocyclertechnik (PTC-200 von MJ-Research, Biozym Diagnostik GmbH, 31833 Hess. Oldendorf) mit deutlich besseren Leistungsdaten (Heiz- und Kühlrate) wurde ein 3'-RACE PCR-Produkt amplifiziert wobei die Primer Nr. 232644 bzw. Nr. 232643 und AP1 verwendet wurden und in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen, De Schelp 12, 9351 NV Leek, Niederlande) kloniert. Das 3'-RACE PCR-Produkt wurde sequenziert und auf diese Weise das 3'Ende der cDNA identifiziert. Eine RACE-Amplifikation nach 5' (Primer Nr. 131990 bzw. Nr. 233084 und AP1) erweiterte das 5' Ende der cDNA um wenige Nukleotide und bestätigte den im identifizierten Lambda-Klon gefundenen Aminoterminus des H-Sema-L.

Beispiel 4

Ausgehend von einem kurzen murinen EST (Zuordnungs-Nr. AA260340) und einem daraus abgeleiteten Primer Nr. 260813 (Tabelle 6) und dem H-Sema-L spezifischen Primern Nr. 121234 (Tabelle 6) wurde mittels PCR (Bedingungen: Taq52-60) ein DNA-Fragment mit einer Länge von ca. 840 bp muriner cDNA amplifiziert und in den Vektor pCR2.1 kloniert. Das dieses DNA-Fragment enthaltende Gen wurde M-Sema-L genannt. Mit dem erhaltenen M-Sema-L DNA-Fragment eine cDNA-Bank aus Mäuse-Milz (Mouse Spleen 5' STRETCH cDNA, Clontech) untersucht, wobei bereits mehrere Klone identifiziert werden konnten.

PCR (Taq60-30) mit den Primern Nr. 260812, Nr. 260813 aus muriner, endothelialer cDNA lieferte ein PCR-Fragment mit einer Länge von 244 Basenpaaren. Die PCR-Ergebnisse zeigten, daß eine deutliche basale Expression in murinen Endothelzellen vorhanden ist, welche nach Stimulation mit dem Zytokin Interferon-γ und Lipopolysacchariden zurückgeht.

Beispiel 5

Untersuchungen zur Chromosomalen Lokalisation mittels Fluoreszenz in-situ Hybridisierung zeigten, daß H-Sema-L auf Chromosom 15q23 lokalisiert ist. Chromosomal benachbart liegen der Locus für das Bardet-Biedl-Sydrom und Tay-Sachs Erkrankung (Hexosaminidase A).

Beispiel 6

Die genomische Intron-Exon Struktur des H-Sema-L Gens ist zum größten Teil aufgeklärt.

Durch PCR-Amplifikation konnte bisher fast der vollständige genomische Locus des H-Sema-L kloniert und charakterisiert werden. Insgesamt konnten bereits mehr als 9100 bp der genomischen Sequenz bestimmt werden und so die Intron-Exon-Struktur des Gens weitgehend aufgeklärt werden.

Beispiel 7 Expressionsklonierungen

Da kein kompletter Klon des Semaphoringens aus der Lambda-gt10 cDNA-Bank isoliert werden konnte, und auch mittels PCR ein vollständiger Klon nicht zu erhalten war, wurde der kodierende Bereich der cDNA in 2 überlappenden Subfragmenten mittels PCR (XL62-6) mit Hilfe der Primer Nr. 240655 und Nr. 121339 für das N-terminale DNA-Fragment, sowie den Primern Nr. 240656 (enthält HindIII und PmeI Schnittstellen) und Nr. 121234 für das C-terminale DNA-Fragment amplifiziert. Die erhaltenen DNA-Fragmente (Subfragmente) wurden in den Vektor pCR21 kloniert. Die beiden Subfragmente wurden komplett sequenziert und schließlich die vollständige H-Sema-L CDNA durch Insertion eines 0.6 kb C-terminalen SstI-HindIII Restriktions-Fragments in das mit den Restriktionsenzymen SstI und HindIII geschnittene, das N-terminale DNA-Fragment enthaltende Plasmid, hergestellt. Aus diesem Plasmid pCR2.1-H-Sema-L (gemäß Sequenz in Tabelle 7) wurde das komplette Gen mittels der EcoRI-Schnittstelle (in pCR2.1) und HindIII-Schnittstelle (in Primer Nr. 240656, Tabelle 6) herausgeschnitten und in einen entsprechend geschnittenen, konstitutiven Expressionsvektor pCDNA3.1 (-)MycHisA (Invitrogen) ligiert. Aus dem resultierenden rekombinanten Plasmid pCDNA3.1(-) H-Sema-L-MycHisA (gemäß Sequenz in Tabelle 8) wurde das EcoRI-Apal Fragment (ohne Myc-His-Tag) herausgeschnitten und in den induzierbaren Vektor pIND ligiert (Ecdyson-Inducible Mammalian Expression System, Invitrogen), der zuvor ebenfalls mit EcoRI-Apal geschnitten worden war. Das rekombinante Plasmid wurde mit pIND-H-Sema-L-EA (Sequenz gemäß Tabelle 9) bezeichnet. Ein EcoRI-Pmel-Fragment (mit Myc-His-Tag) aus pCDNA3.1(-)H-Sema-L-Myc-HisA (Sequenz gemäß Tabelle 9) wurde in einen mit EcoRI-EcoRV geschnittenen Vektor pIND eingesetzt. Das rekombinante Plasmid wurde mit pIND-H-Sema-L-EE (Sequenz gemäß Tabelle 10) bezeichnet.

Ein Fusionsgen von H-Sema-L mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) wurde hergestellt durch Ligation des mit PCR amplifizierten EGFP-Leserahmens (aus dem Vektor pEGFP-C1 (Clontech), mit Hilfe der Primer Nr. 243068 + Nr. 243069, Taq52-60) in die PmeI-Schnittstelle des Plasmids pCDNA3.1 (-)H-Sema-L-MycHisA wodurch das Plasmid pCDNA3.1(-)H-Sema-L-GFP-MycHisA (Sequenz gemäß Tabelle 11) erhalten wurde.

Beispiel 8

Zur Herstellung von H-Sema-L spezifischen Antikörpern wurden cDNA-Fragmente von H-Sema-L in prokaryotische Expressionsvektoren integriert, in E. coli exrimiert und die Semaphorin-Derivate aufgereinigt. Die Semaphorin-Derivate wurden als Fusionsproteine mit einem His-Taq exprimiert. Dementsprechend wurden Vektoren verwendet, die die Sequenz für ein His-Taq enthalten und eine Integration des Semaphorin cDNA-Fragments im Leserahmen ermöglichten. Ein N-terminales 6×Histidin-Tag ermöglicht z. B. eine Aufreinigung mittels Nickel-Chelat-Affinitätschromatographie (Q)iagen GmbH, Max-Volmer Straße 4, 40724 Hilden):

• 1. Der für die Aminosäuren 179-378 kodierende Teil der H-Sema-L cDNA wurde mittels PCR mit den Primern Nr. 150788 und Nr. 150789 amplifiziert und dieses DNA-Fragment in den Vektor pQE30 (Qiagen), der zuvor mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII geschnitten worden war, ligiert (Konstrukt pQE30-H-Sema-L-BH (Sequenz gemäß Tabelle 12)).
• 2. Der für die C-terminalen Aminosäuren 480-566 kodierende Abschnitt der H-Semal-L cDNA wurde mit den Restriktionsenzymen SstI und HindIII aus dem Plasmid pCR 2.1 geschnitten und in den Vektor pQE31 (Qiagen), der zuvor mit SstI und HindIII geschnitten worden war ligiert (Konstrukt pQE31-H-Sema-L-SH (Sequenz gemäß Tabelle 13)).

Die korrekte Integration der Sequenzen im richtigen Leserahmen wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die Fusionsproteine, bestehend aus einem N-terminalen 6×Histidin-Taq und einem Teil des Semaphorins H-Sema-L wurden mittels Ni²⁺-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die aufgereinigten Fusionsproteine wurden zur Immunisierung von verschiedenen Tieren (Hase, Huhn, Maus) benutzt.

Tabelle 2

cDNA-Sequenz von H-Sema-L (2636 Nukleotide) (SEQ ID NO.: 1)

Tabelle 3

Sequenz der cDNA von M-Sema-L (partiell, 1195 Nukleotide) (SEQ ID NO.: 2)

Tabelle 4

Aminosäuresequenz von H-Sema-L (666 Aminosäuren) (SEQ ID NO.: 3)

Tabelle 5

(Partielle) Aminosäuresequenz von M-Sema-L (394 Aminosäuren, entspricht Position 1-396 von H-Sema-L) (SEQ ID NO.: 4)

Tabelle 6

Synthetische Oligonukleotide, (Eurogentec, Seraing, Belgien)

Tabelle 7

Sequenz des rekombinanten Plasmids pCR2.1-H-Sema-L (SEQ ID NO.: 34)

Tabelle 8

Sequenz des rekombinanten Expressionsplasmids pCDNA3.1)H-Sema-L-MycHisA (SEQ ID NO.: 35)

Tabelle 9

Sequenz des rekombinanten Plasmids pIND-H-Sema-L-EA (SEQ ID NO.: 36)

Tabelle 10

Sequenz des rekombinanten Plasmids pIND-H-Sema-L-EE (SEQ ID NO.: 37)

Tabelle 11

Sequenz des rekombinanten Plasmids pCDNA3.1(-)­ H-Sema-L-GFP-MycHisA (SEQ ID NO.: 38)

Tabelle 12

Sequenz des rekombinanten Plasmids pQE30-H-Sema-L-BH (SEQ ID NO.: 39)

Tabelle 13

Sequenz des rekombinanten Plasmids pQE31-H-Sema-L-SH (SEQ ID NO.: 40)

Claims (14)

1. Semaphorine vom Typ L (Sema-L) enthaltend N-terminales Signalpeptid und eine charakteristische Sema-Domäne, dadurch gekennzeichnet, daß diese Proteine im C-terminalen Bereich eine Immunglobulin-ähnliche Domäne und eine Transmembrandomäne aufweisen und Derivate der Semaphorine vom Typ L.

2. Semaphorine nach Anspruch 1, wobei die Proteine im Bereich der Sema-Domäne eine Aminosäureidentität von mindestens 40% im Bezug auf die Sema-Domäne von H-Sema-L aufweisen.

3. Semaphorin nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 und 2, wobei das Protein die partielle Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 5 enthält (murines Semaphorin (M-Sema-L)), wobei Tabelle 5 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

4. Semaphorin nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 und 2, wobei das Protein die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 4 enthält (humanes Semaphorin (H-Sema-L)), wobei Tabelle 4 Bestandteil diese Anspruchs ist.

5. Splicevariante eines Semaphorins nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4.

6. Splicevariante eines Semaphorins nach Anspruch 5, wobei das Protein keine oder keine vollständige Transmembrandomäne enthält.

7. Semaphorin nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein posttranslational prozessiert ist.

8. Semaphorin nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Protein glykosyliert ist.

9. Semaphorin nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Protein kein Signalpeptid enthält.

10. DNA kodierend für Semaphorine vom Typ L gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9.

11. DNA nach Anspruch 10, enthaltend das Gen von H-Sema-L oder dessen Derivate.

12. DNA nach Anspruch 10, enthaltend das Gen von M-Sema-L oder dessen Derivate.

13. DNA nach Anspruch 10, enthaltend die cDNA von H-Sema-L oder deren Derivate, wobei die cDNA von H-Sema-L die in Tabelle 2 angegebene Sequenz hat, wobei Tabelle 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist

14. DNA nach Anspruch 10, enthaltend die cDNA von M-Sema-L oder deren Derivate, wobei die cDNA von M-Sema-L die in Tabelle 3 angegebene Sequenz enthält, wobei Tabelle 3 Bestandteil dieses Anspruchs ist.