DE19721113A1 - Diagnosekit - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Diagnosekit für Hepatitis C und Alkoholzirrhose.

Im Stand der Technik wurden bereits Enzymaktivitäten, wie beispielsweise GOT (Glutamatoxalacetattransaminase) GPT (Glutamatpyruvattransaminase) γ-GTP (γ-Glutamyltrans­ peptidase) und dergleichen als biologische Marker für menschliche Leberbeschwerden mit bestimmten Diagnosekits gemessen.

Diese Enzymaktivitäten waren jedoch nicht immer zufrie­ denstellend, um eine Erkrankung zu spezifizieren, da sie nicht zwischen einzelnen Lebererkrankungen unterschieden, wie beispielsweise den viralen Hepatitiden Hepatitis A, He­ patitis B, Non-A, Non-B Hepatitis, Alkohol induzierter Le­ berschädigung und drogeninduzierter Leberschädigung.

Daher war ein weiterer Marker oder ein entsprechender Kit hierfür wünschenswert, um gewisse Lebererkrankungen zu spezifizieren.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben herausge­ funden, daß die Konzentration an Human-Cytochrom P450, ei­ nem spezifischen Enzym, welches gewöhnlich in humanem Blut nicht auftritt, extrem in Patientenseren ansteigt, wenn er oder sie an einer Lebererkrankung leidet, wie beispielswei­ se einer Hepatitis C oder Alkoholzirrhose und daß ein neuer und nützlicher Kit zum Bestimmen der Konzentration des En­ zyms die Diagnose dieser Lebererkrankungen ermöglicht.

Daher stellt die vorliegende Erfindung folgendes zur Verfügung:

• 1. Ein Diagnosekit (im folgenden mit "erfindungsgemäßer Diagnosekit" bezeichnet) für He­ patitis C und Alkoholzirrhose, welcher an einer Hu­ manserumprobe angewendet wird, wobei der Kit einen Antikörper umfaßt, der in der Lage ist, menschli­ ches Cytochrom P450 zu erkennen;
• 2. einen Diagnosekit für Hepatitis C und Alkoholzirr­ hose, welcher an einer Humanserumprobe angewendet wird mit:
  • (a) einem festen Träger, an welchen ein Antikörper gebunden ist, der in der Lage ist, ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen und
  • (b) ein Reagenz, welches einen markierten Antikörper enthält, der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen; und
• 3. ein Verfahren (im folgenden mit "erfindungsgemäßem Verfahren" bezeichnet) zum Bestimmen der Konzen­ tration eines humanen Cytochrom P450 in Humanserum zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose, welches umfaßt:
  • (a) Durchführen einer Antigen- Antikörper-Reaktion durch Hinzufügung einer menschlichen Serumprobe zu einem festen Träger, an welchen ein Antikörper gebunden ist, der in der Lage ist, ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, Entfer­ nen von überschüssigem humanem Cytochrom P450 und nicht umgesetzten Materialien durch Waschen,
  • (b) Durchführen einer Antigen-Antikörper-Reaktion durch Hinzugeben eines markierten Antikörpers, der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, zu dem Reaktionsprodukt, anschlie­ ßendes Entfernen von überschüssigem markiertem Antikörper, der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, durch Waschen; und
  • (c) Bestimmen des Cytochroms P450 mittels des Markers an dem markierten Antikörper in dem Reaktions­ produkt.

Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung.

Es zeigt:

Fig. 1A-D die Kalibrationskurve der Konzentration an Cytochrom P450, die durch Verwendung von menschli­ chen Standardcytochrom P450-Lösungen als Probe mit dem erfindungsgemäßen Diagnosekit erhalten wird; und

Fig. 2A-D die Ergebnisse einer Bestimmung der Cytochrom P450-Konzentration in Patientenserenproben mit unterschiedlichen Lebererkrankungen, unter Verwen­ dung des erfindungsgemäßen Diagnosekits, wobei

Patient 1 an Alkoholzirrhose leidet;
Patient 2 an Hepatitis C leidet;
Patient 3 an Nichtalkoholzirrhose leidet;
Patient 4 an primärer biliärer Zirrhose leidet.

Aus Fig. 1A-D ist es erkennbar, daß die Antikörper, die in der Lage sind, die Cytochrom P450 1A2, 2C8, 2E1 beziehungsweise 3A4 Unterfamilien zu erkennen, mit den entsprechenden Unterfamilien reagierten und somit die Bestimmung der Cytochrom P450-Konzentration spezifisch und quantitativ bezüglich jeder der Unterfamilien erlaubte.

Es hat sich ergeben, - wie aus Fig. 2A-D ersichtlich - daß die Cytochrom P450-Konzentrationen in Seren von Patienten mit Lebererkrankungen wie Hepatitis C und Alkoholzirrhose extrem angestiegen sind.

Zunächst wird ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung beschrieben, der einen Diagnosekit für Hepatitis C und Alkoholzirrhose betrifft, welcher an einer Humanserumprobe angewendet wird, und welcher einen Antikör­ per umfaßt, der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann ein Antikörper verwendet werden, der menschliches P450 erkennen kann. Ein derartiger Antikörper schließt beispielsweise Antikörper ein, welche P450 Unterfamilien erkennen können, wie beispielsweise 1A1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1 oder 3A4.

Bevorzugte Antikörper sind diejenigen, welche im wesentlichen keine Kreuzreaktion mit anderen humanen Cytochrom P450 Unterfamilien als einer spezifischen menschlichen Cytochrom P450 Unterfamilie zeigen. Mit anderen Worten haben derartige Antikörper eine strenge Reaktionsspezifität mit 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 oder 3A4, oder sie sind in der Lage stark zwischen 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 beziehungsweise 3A4 zu unterscheiden.

Die Mittel zum Erhalten derartiger Antikörper sind nicht eingeschränkt, aber als ein Antigen zum Immunisieren von Säugetieren wird gewöhnlich menschliches Cytochrom P450 verwendet, welches nicht wesentlich mit anderen menschlichen Cytochrom P450 Unterfamilien als den spezifi­ zierten menschlichen Cytochrom P450 Unterfamilien kontami­ niert ist.

Da menschliches Cytochrom P450 aus menschlicher Leber gereinigt werden kann, kann das erhaltene menschliche Cytochrom P450 nicht immer frei sein von leichten Verunreinigungen durch ähnliche Cytochrom P450 Unterfa­ milien und kann nicht zu einem Zustand einer einzigen Komponente ohne extreme Schwierigkeiten gereinigt werden.

Insbesondere im Fall von Cytochrom P450 Unterfamilien, die zum Metabolismus von wichtigen pharmakologischen Molekülen beitragen, ist es meist, trotz ihres niedrigen Gehaltes, unmöglich, das Cytochrom P450 in dem Status einer einzigen Komponente durch Reinigung zu erhalten.

Wenn derartiges Material als das Antigen verwendet wird, kann ein Antikörper, der im wesentlichen keine Kreuzreaktivität zu anderen humanen Cytochrom P450 Unter­ familien als den spezifizierten Humancytochrom P450 Unterfamilien aufweist, nicht hergestellt werden.

Falls es jedoch nach alledem ferner möglich ist, ein humanes Cytochrom P450 im Zustand einer einzigen Komponente durch Reinigung zu erhalten, kann die Ausbeute zu gering sein, um ein Säugetier hinreichend immunisieren zu können oder es kann ein nur sehr geringer Antikörpertiter erhalten werden. Darüberhinaus ist das Erhalten einer großen Zahl von menschlichen Lebern meist aus ethischen und technischen Gesichtspunkten unmöglich und nicht praktizierbar.

Daher ist es bevorzugt, das Antigen zur Immunisierung eines Säugetieres durch ein Verfahren herzustellen, welches die Extraktion und Reinigung aus einer transformierten Hefe, erhalten durch rekombinante DNA-Technologie herzu­ stellen, wobei die Hefe lediglich eine spezifische Cytochrom P450 Unterfamilie exprimiert.

Insbesondere umfaßt die Herstellung des Antigens fol­ gende Verfahrensschritte:

• (1) Klonieren eines Genes, welches für eine Human­ cytochrom P450 Unterfamilie kodiert,
• (2) Konstruieren eines Expressionsplasmids zur Ex­ pression des klonierten Gens in Hefe,
• (3) Einführen des konstruierten Hefeexpressions­ plasmids in Hefe, um eine rekombinante Hefe herzustellen, welche die Humancytochrom P450 Unterfamilien exprimiert,
• (4) Kultivieren der erhaltenen rekombinanten Hefe, Aufbrechen derselben, Herstellen einer Hefemikro­ somenfraktion,
• (5) Löslichmachen der Fraktion unter Verwendung eines Tensids oder dergleichen, Reinigen des erhaltenen solubilisierten Überstandes durch geeignete Säulenchromatographie, wie beispielsweise Octyl­ aminocepharose-Säulenchromatographie, Anionenaus­ tauschsäulenchromatographie, Hydroxyl-apatit-Säu­ lenchromatographie oder dergleichen,
• (6) Immunisieren eines Säugetieres mit den gereinigten menschlichen P450 Unterfamilien als dem Antigen, und
• (7) Sammeln von Blut aus dem Säugetier und anschließendes Isolieren und Reinigen des Antikörpers aus dem erhaltenen Blut.

Die Nucleotidsequenz der "Gene, die für Humancytochrom P450 Unterfamilien kodieren" ist in der Literatur beschrieben und die Gene, welche für Humancytochrom P450 Unterfamilien kodieren, können isoliert werden aus einer kommerziell erhältlichen cDNA-Bibliothek, welche von humanen Leberzellen abgeleitet ist mittels eines konventionellen Verfahrens einschließlich PCR und derglei­ chen.

Der Promotor zum Exprimieren des Genes, welches für eine Humancytochrom P450 Unterfamilie in Hefe kodiert, kann jeder Promotor sein, der in einem konventionellen Hefe­ expressionssystem verwendet wird und ist nicht besonders eingeschränkt, schließt jedoch beispielsweise ein:
Hefealkoholdehydrogenasegenpromotor (im folgenden mit "ADH-Promotor" abgekürzt), Glycerinaldehydtriphosphatde­ hydrogenasegenpromotor (im folgenden mit "GAPDH-Promotor" abgekürzt), Phosphoglyceratkinasegenpromotor (im folgenden mit "PGK-Promotor" abgekürzt) und dergleichen.

Der ADH-Promotor kann beispielsweise hergestellt werden aus Hefeexpressionsvektor pAAH5 (erhältlich von Washington Research Foundation; siehe Ammerer et al. Method in Enzymology, 101 (p. 192-201)) welches den Hefe-ADHI- Promotor und Terminator trägt, mittels der bekannten Genmanipulationsverfahren. Der Hefe-ADHI-Promotor ist durch US Patent Nr. 299, 733 der Washington Research Foundation geschützt und eine Lizenz von dem Patentinhaber ist notwendig zu seiner industriellen oder kommerziellen Verwendung in den Vereinigten Staaten von Amerika.

Der oben beschriebene Promotor zur Expression in Hefe und das Hefeexpressionsplasmid, welches das Gen trägt, welches eine Nucleotidsequenz enthält, die für Humancytochrom P450 Unterfamilien kodiert, kann konstruiert werden durch ein konventionelles Genrekombinationsver­ fahren.

Dieses Verfahren schließt beispielsweise ein Verfahren ein, in welchem eine cDNA, die für Humancytochrom P450 Unterfamilien kodiert, in eine Hind III-Stelle des Hefe­ expressionsvektors pAAH5N, beschrieben in JP-A-2-211880, welcher den ADH-Promotor und Terminator oder dergleichen trägt, inseriert wird.

Die rekombinante Hefe, die Humancytochrom P450 Unter­ familien exprimiert, kann erhalten werden durch Einführen des konstruierten Hefeexpressionsplasmids in eine Hefe durch ein konventionelles Verfahren, zum Beispiel das Protoplastenverfahren.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können beispielsweise Hefestämme verwendet werden, welche Saccharomyces cerevisiae und dergleichen einschließen.

Ein bevorzugter Hefestamm schließt Saccharomyces cerevisiae AH.22 (ATCC 38626) ein.

Die Extraktion und Reinigung der Cytochrom P450 Unterfamilien aus der rekombinanten Hefe können durch­ geführt werden durch ein herkömmliches Verfahren, beispielsweise ein solches beschrieben in J. Biochem., Vol. 98, No. 1, p. 167-175 (1985) und dergleichen.

Genauer wird die erhaltene rekombinante Hefe kultiviert und die Hefemasse wird nach vorheriger Umwandlung zu Sphäroplasten durch Lyseenzym oder dergleichen ultraschall­ behandelt.

Eine Hefemikrosomenfraktion wird hergestellt durch Zentrifugation und nach Löslichmachen der Fraktion mit einem Tensid und Natriumcholat und so weiter (zusammen mit Präzipitation durch Ammoniumsulfat, Polyethylenglycol oder dergleichen, falls nötig) wird der erhaltene solubilisierte Überstand gereinigt durch irgendeine Art von Säulenchromatographie, welche Octylaminocepharose-Säulen­ chromatographie, Anionenaustausch-Säulenchromatographie, Hydroxylapatitsäulenchromatographie oder dergleichen, ein­ schließt. Eine bevorzugte Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung ist die Hochdruckflüssigchromatographie.

Die Herstellung des Antikörpers, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann beispielsweise durchgeführt werden durch Immunisieren eines Säugetieres mit P450 Unterfamilien humanen Ursprungs als dem Antigen oder den Antigenen, Sammeln von Blut aus dem Säugetier und anschließendes Isolieren und Reinigen des Antikörpers aus dem erhaltenen Blut.

Die Immunisierung von Säugetieren wie beispielsweise Maus, Hamster, Meerschweinchen, Huhn, Ratte, Kaninchen, Hund und dergleichen wird beispielsweise durchgeführt durch eine oder mehrerer Gaben des Antigens gemäß dem allgemeinen Immunisierungsverfahren, vorgeschlagen von W.H. Newsome et al. beschrieben in J. Assoc. Off. Anal. Chem., 70(6), 1025-1027 (1987).

Bevorzugt wird die Antigengabe zweimal oder dreimal in Intervallen von 7 bis 30 Tagen, insbesondere von 12 bis 16 Tagen, durchgeführt.

Eine Standardmenge für die Anwendung liegt beispielsweise zwischen ungefähr 0,05 bis 2 mg Antigen pro Gabe. Der Verabreichungsweg kann ausgewählt werden aus subkutanen, intrakutanen, intraperitonealen, intravenösen, intramuskulären Verabreichungen und anderen. Die bevorzugte Art der Verabreichung ist die Injektion, welche intravenös, intraperitoneal oder subkutan erfolgen kann.

Besonders bevorzugte Art ist eine Kombination von subkutaner Injektion und intraperitonealer Injektion. In diesem Falle wird das Antigen in Form einer Lösung in einem geeigneten Puffer verwendet, beispielsweise Natriumphos­ phatpuffer, physiologischer Kochsalzlösung oder derglei­ chen, welche eine der bekannten Adjuvantien wie beispiels­ weise Freund′s komplettes Adjuvans (eine Mischung aus Aracel A, Bayol F und abgetöteten Tuberkelbazillen), RAS [MPL(Monophosphoryllipid A) + TDM (synthetisches Trehalosedicorynomycolat) + CWS (Zellwandskelett) Adjuvans­ system], Aluminiumhydroxid und dergleichen, aber abhängig von dem Verabreichungsweg, Bedingung oder dergleichen wird das obige Adjunvans nicht verwendet.

Das Adjunvans, welches hierin verwendet werden soll, betrifft eine Substanz, welche unspezifisch die Immun­ reaktion eines Antigen verstärkt, wenn es zusammen mit dem Antigen verabreicht wird.

Nach 0,5 bis 4-monatigem Züchten der obigen Säugetiere ohne Behandlung wird eine kleine Menge einer Serumprobe des Tieres aus einer Ohrvene entnommen und dann auf Antikörpertiter untersucht.

Wenn der Antikörpertiter ansteigt, wird die Verabreichung des Antigens - abhängend von den Umständen - nach Bedarf wiederholt. Beispielsweise wird eine zusätzliche Gabe in einer Dosis von ca. 100 µg bis 1000 µg, insbesondere ca. 50 µg bis 500 µg an Antigen verabreicht. Nach ein bis zwei Monaten nach der letzten Verabreichung wird Blut aus den immunisierten Säugetieren gesammelt gemäß dem üblichen Verfahren und der Antikörper der vorliegenden Erfindung wird erhalten in Form eines polyklonalen Antiserums durch Behandeln des Serums mit konventionellen Mitteln, zum Beispiel Zentrifugation, Präzipitation mit Ammoniumsulfat oder Polyethylenglykol, Chromatographie einschließlich Gelfiltrationschromatographie, Ionenaus­ tauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder der­ gleichen. Das Serum kann beispielsweise bei 56°C für 30 Minuten behandelt werden um das Komplement zu inaktivieren.

Die Antikörper, welche im wesentlichen eine Kreuz­ reaktivität mit anderen menschlichen Cytochrom P450 Unterfamilien zeigen, als einer spezifischen menschlichen Cytochrom P450 Unterfamilie und eine hohe Spezifität und Affinität aufweisen, können hergestellt werden durch Isolieren von immunkompetenten B-Zellen aus den obigen immunisierten Säugetieren, Fusionieren der immunkompetenten B-Zellen mit malignen Zellen, welche sich permanent teilen, Isolieren der sich ergebenden Fusionszellen, Auswählen und Klonieren von Hybridomzellen, welche in der Lage sind, den erwünschten Antikörper herzustellen und Kultivieren der Hybridomzellen in vitro oder in vivo, um monoklonale Antikörper herzustellen.

Der Ausdruck "keine Kreuzreaktivität mit anderen Humancytochrom P450 Unterfamilien als einer spezifischen Humancytochrom P450 Unterfamilie" bedeutet hierin, daß eine selektive Erkennung, in welcher die Kreuzreaktivität mit anderen Humancytochrom P450 Unterfamilien als einer spezifischen Humancytochrom P450 Unterfamilie geringer als ungefähr 1/4 ist, vorzugsweise geringer als ungefähr 1/20 und besonders bevorzugt weniger als ca. 1/100 ist, im wesentlichen möglich ist.

Der Kreuzreaktivitätsgrad ist gegeben durch 1/C worin die Substratproteinkonzentration, bei welcher eine spezifische Humancytochrom P450 Unterfamilie durch ein Immunblotverfahren bestimmt werden kann, 1 gesetzt wird und die Konzentration von anderen Humancytochromunterfamilien, bestimmt durch das selbe Verfahren, C ist.

Die weitere Beschreibung enthält einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, die den Diagnosekit für Hepatitis C und Alkoholzirrhose betrifft, welche umfaßt

• (a) einen festen Träger, an welchen ein Antikörper (der erste Antikörper), der in der Lage ist ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, gebunden ist und
• (b) ein Reagenz, enthaltend einen markierten Antikörper (den zweiten Antikörper), der in der Lage ist ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen.

In diesem Aspekt der Erfindung wird der Antikörper (der erste Antikörper), der verwendet werden soll, nicht spezifisch beschränkt und ein Antikörper, welcher menschliches Cytochrom P450 erkennen kann, kann verwendet werden.

Der Antikörper (der erste Antikörper) schließt beispielsweise Antikörper ein, welche die P450 Unter­ familien erkennt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
1A1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1 oder 3A4.

Bevorzugt sind solche Antikörper, welche im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit anderen Hymancytochrom P450 Unterfamilien als einer der oben beschriebenen spezifischen Humancytochrom P450 Unterfami­ lie, aufweist.

Der Kit kann ferner umfassen:

• (c) eine Standardlösung aus menschlichem Cytochrom P450,
• (d) einem Puffer,
• (e) ein Polypeptid zum Inhibieren unspezifischer Adsorption und Bildung von Aggregaten und gegebenenfalls einem Additiv, wie beispielsweise einem Tensid, und
• (f) einer Pipette, einem Reaktionsgefäß, einer Kalibrationskurve und so weiter.

Der feste Träger kann unterschiedliche Ausgestaltungen und Formen, abhängend vom spezifischen Zweck, der für die Verwendung gewünscht ist, aufweisen. Beispielsweise kann er in Form einer Schale, Kugel, Platte, kleinem Stab, Zelle, kleiner Flasche, kleinem Röllchen, Faser, Netzwerk oder dergleichen vorliegen.

Spezifische Beispiele, welche verwendet werden sollen, schließen eine Mikrotiterplatte, hergestellt aus einem transparenten Kunststoffmaterial wie beispielsweise Polyvinylchlorid oder Polystyrol, kleine Kugeln, Röhren, Stäbe oder dergleichen, hergestellt aus Polystyrol und/oder Polystyrollatex, ein.

Zum Binden eines Antikörpers (des ersten Antikörpers), der in der Lage ist, ein menschliches Cytochrom P450 an einem solchen festen Träger zu erkennen, wird zum Beispiel der feste Träger gewöhnlich zuvor durch ein konventionelles Verfahren unter Verwendung von Glutaraldehyd, Bromcyan oder dergleichen aktiviert.

Eine verwendbare Antikörperbindungslösung schließt beispielsweise ein: ungefähr 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4) enthaltend 140 mM Natriumchlorid oder dergleichen. Die Antikörperbindungslösungen enthalten bevorzugt beispiels­ weise einen Antikörper bei einer Konzentration von ungefähr 0,05 µg/ml bis 1 µg/ml.

Die Behandlungsdauer kann beispielsweise etwa 6 Stunden bis 24 Stunden betragen. In einem speziellen Beispiel in der Beschreibung kann eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, hergestellt aus Polystyrol, verwendet werden.

Der Antikörper (der erste Antikörper), der in der Lage ist, ein menschliches Cytochrome P450 zu erkennen, kann indirekt oder direkt an einen derartigen festen Träger gebunden werden.

Wenn ein Antikörper (der erste Antikörper), der in der Lage, ist ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, indirekt an einen derartigen festen Träger gebunden ist, ist es bevorzugt, den Antikörper (den ersten Antikörper), der in der Lage ist, ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, an den Träger durch ein dazwischenliegendes Abstandshalter (Spacer)- und/oder Trägermolekül mit hohem Molekulargewicht, welches nicht durch den Antikörper erkannt wird, zu binden. Das Trägermolekül mit hohem Molekulargewicht, welches nicht durch den ersten Antikörper erkannt wird bedeutet, daß das Trägermolekül mit hohem Molekulargewicht bei der Herstellung des Antikörpers nicht verwendet wird. Ein solches wird gewöhnlich verwendet, wenn der erste Antikörper polyklonal ist.

Der markierte Antikörper (der zweite Antikörper) des Antikörpers (des ersten Antikörpers), der in der Lage ist, ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, kann erhalten werden durch Markieren mit einem Enzym wie beispielsweise Peroxidase, alkalischer Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glukoseoxidase, Glukoamylase, carbonische Anhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Maleatdehydrogenase, Gluko­ se-6-Phosphatdehydrogenase und dergleichen.

In diesem Falle, nach Inkubieren und Entfernen des zweiten Antikörpers in einem freien Zustand durch Waschen, kann der zweite Antikörper bestimmt werden durch Messen der Farbentwicklung, welche die Reaktion des markierenden Enzymes mit dessen Substrat begleitet.

Wenn beispielsweise Peroxidase als Marker verwendet wird, entwickelt sich eine braune oder gelbe Farbe durch Kombinieren von Wasserstoffperoxid als dem Substrat und Diaminobenzidin oder o-Phenylendiamin als dem Entwicklungs­ reagenz.

Wenn Glukoseoxidase als Marker verwendet wird kann das Substrat beispielsweise 2,2′-Azino-di-(3-ethylbenzothiazo­ lin-6-sulfonat) (ABTS) sein.

Der Antikörper (der erste Antikörper), der in der Lage ist, ein menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, kann ebenfalls mit Biotin markiert werden, beispielsweise unter Verwendung eines "Proteinbiotinylierungssystems", herge­ stellt von Amersham. In diesem Fall kann der zweite Antikörper, nach Inkubieren und Entfernen des zweiten Antikörpers in einem freien Zustand durch Waschen mit großer Empfindlichkeit bestimmt werden durch Messen der Farbentwicklung, die die Reaktion nach Behandlung des zweiten Antikörpers zum Binden mit einem Enzym beigleitet, zum Beispiel Peroxidase, alkalischer Phosphatase, β-D-Galactosidase, Glukoseoxidase, Glukoamylase, karbonische Anhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Maleatdehydro­ genase, Glukose-6-Phosphatdehydrogenase und dergleichen, markiert mit einer Substanz (Streptavidin), welche spezifisch an Biotin bindet.

Das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Cytochrom P450 in Humanserum zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose wird im folgenden detailliert beschrieben.

Das Verfahren umfaßt:

• (1) Durchführen einer Antigen-Antikörper-Reaktion durch Zufügen einer Humansermumprobe zu einem festen Träger, an welchen ein Antikörper (der erste Antikörper) gebunden ist, welcher in der Lage ist, ein humanes Cytochrom P450 zu erkennen, dann Entfernen von überschüssigem menschlichem Cytochrom P450 und unumgesetzten Materialien durch Waschen;
• (2) Durchführen einer Anitgen-Antikörper-Reaktion durch Hinzufügen eines markierten Antikörpers (der zweite Antikörper), der in der Lage ist menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, zu dem Reaktionsprodukt, anschließendes Entfernen von überschüssigem markiertem Antikörper (dem zweiten Antikörper), der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, durch Waschen und
• (3) anschließendes Bestimmen des Cytochroms P450 mittels des Markers an dem markierten Antikörper (dem zweiten Antikörper) in dem Reaktionsprodukt.

Beispielsweise wird der Antikörper (der erste Antikörper), der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen, wie oben beschrieben gereinigt, in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen angeordnet, beispielsweise einer Nunc-Immuno Platte MaxiSorp (Marke) erhältlich von Nunc, so daß eine Proteinmenge von ca. 50 bis 500 ng, vorzugsweise ca. 200 bis 400 ng/Vertiefung beträgt und etwa zwei bis 24 Stunden bei ca. 4°C bis Raumtemperatur stehengelassen wurde.

Anschließend wurden die Vertiefungen zwei- bis fünfmal mit ungefähr 100 µl bis etwa 500 µl etwa 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend ungefähr 140 mM Natriumchlorid und ungefähr 0,1% Tween 20 gewaschen. Ferner wurden ungefähr 100 µl bis ungefähr 500 µl von etwa 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend ungefähr 140 mM Natriumchlorid und ungefähr 1% Rinderserumalbumin zu den Vertiefungen zugegeben, mit dem Zweck zu blockieren und bei etwa 4°C bis Raumtemperatur für ungefähr 30 Minuten bis 60 Minuten stehengelassen.

Anschließend wurden die Vertiefungen zwei- bis fünfmal mit ca. 100 µl bis ca. 500 µl etwa 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend ca. 140 mM Natriumchlorid und ca. 0,1% Tween 20 gewaschen.

Zu einem in dieser Art behandelten festen Träger wird Humanserum als Probe hinzugegeben, welche hergestellt wurde durch Verdünnen eines Serums mit destilliertem Wasser, einem Puffer, physiologischer Kochsalzlösung oder dergleichen, falls nötig (das Serum wird beispielsweise erhalten als ein Überstand nach Zentrifugation von etwa einem ml bis ungefähr 10 ml abgenommenem Blutes als der Probe bei ungefähr 4°C und 2000 g für 15 Minuten, um Präzipitate zu entfernen) in einer Menge von ca. 500 µl bis ca. 200 µl pro Vertiefung und bei Raumtemperatur für etwa ein bis zwei Stunden stehengelassen, um die Antigen- Antikörper-Reaktion zu bewirken.

Anschließend werden die Vertiefungen zwei- bis fünfmal gewaschen mit ca. 100 µl bis 500 µl ca. 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend ca. 140 mM Natriumchlorid und ca. 0,1% Tween 20.

Als nächstes wird das Reaktionsprodukt beispielsweise mit ca. 50 µl bis ca. 200 µl, vorzugsweise ca. 100 µl einer Lösung eines markierten Antikörpers behandelt, hergestellt durch ca. 250 bis 2000faches, vorzugsweise 500faches Verdünnen eines Biotin-markierten Antikörpers (dem zweiten Antikörper), der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen mit ca. 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4) (ca. 5 mM bis 50 mM), enthaltend ca. 140 mM Natriumchlorid und ca. 0,1% Tween 20 und bei Raumtemperatur für ca. 1 Stunde bis zwei Stunden stehengelassen, um die Antigen-Antikörper- Reaktion zu bewirken.

Anschließend werden die Vertiefungen zwei- bis fünfmal gewaschen mit ca. 100 µl bis ca. 500 µl ca. 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend ca. 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20, um überschüssigen markierten Antikörper (den zweiten Antikörper) zu ent­ fernen, der in der Lage ist, menschliches Cytochrom P450 zu erkennen.

Als nächstes wird das Reaktionsprodukt behandelt mit ca. 50 µl bis 200 µl, vorzugsweise ca. 100 µl streptavidinmarkierter Meerrettichperoxidase (HRP, bei­ spielsweise kommerziell erhältlich von Amersham), bei ca. 4°C bis Raumtemperatur für ca. 30 bis 60 Minuten stehengelassen, in ähnlicher Weise gewaschen wie zuvor beschrieben, mit einer Substratlösung behandelt (beispielsweise 4 mM o-Phenylendiamin, 0,004% Wasserstoff­ peroxid, 0,02 M Citrat, 0,05 M Na₂HPO₄/pH 5,0) und bei Raumtemperatur für ungefähr 10 Minuten bis ca. 60 Minuten stehengelassen, um eine braune Farbe, abhängend von der Antigenmenge (d. h. menschlichem Cytochrom P450) zu entwickeln.

Zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose kann die Cytochrom P450-Konzentration in dem Humanserum bestimmt werden durch Messung der Absorption der Vertiefungen bei einer substratspezifischen Wellenlänge (beispielsweise 492 nm für o-Phenylendiamin) mit einem Spektrophotometer, beispielsweise einem Mikrotiterplattenlesegerät für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen oder dergleichen.

Zur Bestimmung der Konzentration ist es bequem eine Kalibrationskurve herzustellen unter Verwendung von zuvor standardisierten Lösungen von menschlichem Cytochrom P450.

In dem erfindungsgemäßen Diagnosekit können auch andere Prinzipien verwendet werden, beispielsweise das Immun­ blotverfahren, ELISA-Verfahren (siehe "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience (1991)) und dergleichen.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die vorliegende Erfindung im Detail, werden jedoch nicht als Einschränkung verstanden.

Beispiele

Referenzbeispiel 1: Erhalten eines Gens mit einer Nucleotidsequenz, welche für ein menschliches Cytochrom P450 kodiert.

Eine cDNA, welche für menschliches Cytochrom P450 kodiert, wurde erhalten aus einer kommerziell erhältlichen cDNA-Bibliothek (Clontech), welche abgeleitet ist von menschlicher Leber, durch PCR-Verfahren unter Verwendung eines Klonierungsstarters (primer), ausgelegt auf der Basis der bekannten Nucleotidsequenz des Humancytochrom P450 Gens.

Referenzbeispiel 2: Konstruktion eines Hefeexpres­ sionsplasmids.

Eine Proteinkodierungsregion eines Humancytochroin P450- Gens wurde verstärkt durch PCR-Verfahren unter Verwendung eines Klonierungsstarters. Das erhaltene Fragment wurde in einen pUCA- Vektor, einem Plasmid zum Subklonieren, hergestellt durch Ändern der Eco RI Stelle des pUC19 zu einer Hind III Stelle und Wechseln der Klonierungsstelle zwischen den gebildeten Hind III und Hind III an den folgenden Klonierungsstellen:

Ausschneiden mit Hind III und Inserieren in pAAH5N, um ein Hefeexpressionsplasmid für Humancytochrom P450 zu konstruieren.

Referenzbeispiel 3: Herstellung von transformierten Hefezellen.

Saccharomyces cerevisiae AH 22 wurde inokuliert in YPD- Medium (1% Hefeextrakt, 2% Polypepton und 2% Glukose) und die Kultur wurde bei 30°C 18 Stunden geschüttelt. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (5000 × g, 10 Minuten).

Die erhaltenen Zellen wurden in 0,2 M LiCl-Lösung suspendiert und die Suspension wurde wiederum zentrifugiert (500 x g, 10 Minuten). Die erhaltenen Pellets wurden zu 20 µl 1 M LiCl-Lösung, 30 µl 70%ige Polyethylenglykol 4000-Lösung und 10 µl einer Lösung, enthaltend ca. 1,0 µg des Hefeexpressionsplasmids pro ng Humancytochrom P450, zugegeben.

Sie wurden hinreichend gemischt, bei 30°C 1 Stunde inkubiert und unter Rühren mit 140 µl sterilem Wasser gemischt. Die erhaltene Lösung wurde auf einer Platte aus SD-synthetischem Medium ausgebreitet (2,0% Glukose, 0,67% Aminosäuren-freie Stickstoffquelle (Stickstoffbasis w/o-Aminosäuren, hergestellt von Difco), 20 µg/ml Histidin und 2,0% Agar) und inkubierte 3 Tage bei 20°C, um transformierte Hefezellen auszuwählen,welche den oben beschriebenen Hefeexpressionsplasmid tragen.

Referenzbeispiel 4: Messung von menschlichem, in Hefe exprimiertem Cytochrom P450.

Die Zellen wurden geerntet aus 200 ml Kulturlösung (SD- synthetisches Medium, Dichte der Zellen: ca. 1,5 × 10⁷ Zellen/ml), enthaltend die transformierten Hefezellen, die in der Lage sind, das Humancytochrom P450 in Hefe, hergestellt in Referenzbeispiel 3, zu exprimieren.

Diese Zellen wurden in 10 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) suspendiert und die Suspension wurde zentrifugiert (5000 × g, 10 Minuten). Die erhaltenen Pellets wurden in 2,0 ml frischem 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) suspendiert und die Sus­ pension wurde in 1,0 ml Portionen in zwei Küvetten geteilt. Kohlenmonoxid wurde in eine Probenküvette geblasen und 5 bis 10 mg Dithionit wurden hinzugegeben.

Nach Rühren wurden Differenzspektren bei 400 bis 500 nm gemessen und die Konzentrationen von Humancytochrom P450 in Hefe wurden berechnet. Die Menge an exprimiertem Humancytochrom P450 in den transformierten Hefezellen lag bei einem Niveau von etwa 10⁷ bis 106 Molekülen pro Zelle.

Referenzbeispiel 5: Herstellung einer Mikrosomen­ fraktion aus den transformierten Hefezellen.

Die Zellen wurden geerntet aus 3,8 1 Kulturflüssigkeit (SD-synthetisches Medium, Dichte der Zellen: ca. 1,0 × 10⁸ Zellen/ml), enthaltend die transformierten Hefezellen, die in der Lage sind, das Humancytochrom P450 in Hefe, wie im Referenzbeispiel 3 hergestellt, zu exprimieren. Die Zellen wurden in 400 ml Puffer A (10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 2M Sorbitol, 0,1 mM DTT und 0,2 mM EDTA) suspendiert. Zu der Suspension wurden 160 mg Zymolase (Zymolase 100T, hergestellt von Wako Pure Chemical Ind.) zugegeben und die Mischung wurde 60 Minuten bei 30°C inkubiert.

Sphäroplasten, erhalten durch Zentrifugation (5000 × g, 10 Minuten) wurden in Puffer A suspendiert und wiederum zentrifugiert (5000 × g, 10 Minuten). Nach erneuter Wiederholung der selben Zentrifugation zum Waschen, wurden die Sphäroplasten in 200 ml eines Puffers (10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 0,65M Sorbitol und 0,1 mM DTT) suspendiert und einer Ultraschallbehandlung unterworfen (50 W, 5 Minuten). Das aufgebrochene Produkt wurde zentrifugiert (9000 × g, 20 Minuten), um einen Überstand zu sammeln, der weiter zentrifugiert wurde (125 000 × g, 70 Minuten), um Präzipitate zu sammeln. Die gesammelten Präzipitate wurden in 10 ml 0,1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,4) resuspendiert, um eine Mikrosomenfraktion zu ergeben.

Referenzbeispiel 6: Reinigung des Humancytochrom P450 aus der Mikrosomenfraktion.

Die Mikrosomenfraktion (ca. 300 mg), welche das Humancytochrom P450 enthält, welches in Referenzbeispiel 5 erhalten wurde, wurde verdünnt mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,22, Puffer B), enthaltend 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,25 mM PMSF und 20% Glycerin auf 3 mg/ml. Zu der Verdünnung wurde tropfenweise Natriumcholat zu einer Endkonzentration von 0,6% gegeben und 30 Minuten bei 4°C stehengelassen, um das Humancytochrom P450 aufzulösen. Nach Zentrifugation der Lösung (200 000 × g, 30 Minuten) wurde der Überstand auf eine Säule gegeben, welche mit 15 ml Octylaminocepharose 4B (Pharmacia) gepackt war, äquilibriert mit Puffer B, enthaltend 0,5% Natriumcholat, um das Humancytochrom P450 an den Träger zu binden. Die Säule wurde mit hinreichend Puffer B gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen und das Humancytochrom P450 wurde mit einem Puffer eluiert, hergestellt durch Zugeben von 0,2% Polyoxyethylennonylphenylether (hergestellt von Kao Corp., Handelsname: Emulgen 911) zu Puffer B. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und über Nacht gegen 0,02 M Tris-Acetatpuffer (pH = 7,2, Puffer C), enthaltend 20% Glycerin dialysiert. Dann, nach Zugeben der Fraktionen auf DEAE-5PW (hergestellt von Toso) HPLC-Säule, äquilibriert mit einem Puffer, hergestellt durch Zugeben von 0,4% Polyoxyethylennonylphenylether (hergestellt von Kao Corp., Handelsname: Emulgen 911) zu Puffer C, wurde das Humancytochrom P450 in nicht gebundenen Fraktionen eluiert.

Anschließend wurden die Fraktionen auf eine Hydroxylapatit (hergestellt von Koken) -HPLC-Säule gegeben, die mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH = 7,2, Puffer D), enthaltend 0,2% Polyoxyethylennonylphenylether (hergestellt von Kao Corp., Handelsname: Emulgen 911), 0,2% Natriumcholat und 20% Glycerin äquilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer D hinreichend gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen und das Humancytochrom P450 wurde mit einem linearem Natriumphosphat-Konzen­ trationsgradienten eluiert.

Anschließend wurden aktive Fraktionen gesammelt und die Fraktionen wurden auf eine Hydroxylapatit (hergestellt von Biorad) -HPLC-Säule gegeben, welche mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH = 7,2, Puffer E), enthaltend 20% Glycerin äquilibriert war. Die Säule wurde mit hinreichend Puffer E gewaschen und das Humancytochrom P450 wurde mit 0,35 M Natriumphosphat, enthaltend 0,05% Natriumcholat und 20% Glycerin eluiert. Aktive Fraktionen wurden gesammelt, um gereinigtes Humancytochrom P450 zu ergeben.

Herstellungsbeispiel 1: Herstellung eines Antikörpers (des ersten Antikörpers), der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen.

Das gereinigte Humancytochrom P450, welches in Referenzbeispiel 6 erhalten wurde, wurde in physiologischer Kochsalzlösung zu einer Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst. Zu 2 ml der Lösung wurden 40 ml RAS [MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetisches Trehalose Dicorynomycolat) + CWS (Zellwandskelett) Adjuvans System] (hergestellt von Sigma), zuvor inkubiert bei 42°C bis 43°C und es wurde hinreichend gemischt.

Die erhaltene Mischung wurde weißen Neuseeländer- Kaninchen (weiblich, 14 Wochen alt, durchschnittlich 2,4 kg) mit einer Dosis von 1 µl pro Kaninchen verabreicht. Genaugenommen wurde die Mischung subkutan an zehn dorsalen Stellen mit einer Dosis von 100 µl gegeben. Nach 3 Wochen und 5 Wochen wurde die halbe Menge gegeben.

Während dieser Zeit wurden Blutproben aus Ohrvenen gesammelt und auf Antikörpertiter getestet. Wenn der Antikörpertiter nach der zweiten Musterung angestiegen war, wurden die immunisierten Kaninchen aus ihren Carotisarterien entblutet. Das erhaltene Blut wurde in ein Separapit-Rohr (hergestellt von Sekisui Chemical) gebracht, bei 27°C für 2 Stunden inkubiert, zentrifugiert (3000 UPM, 20 Minuten, Raumtemperatur) und der Überstand wurde gewonnen, um ein Antiserum zu ergeben. Das erhaltene Antiserum wurde bei 56°C für 30 Minuten zur Komplement­ inaktivierung behandelt.

Dann wurde die Lösung, nach Zugabe von 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20 und 1 ml gesättigtes Ammoniumsulfat auf 1 ml Antiserum, 30 Minuten gerührt und bei 4°C und 10000 UPM 10 Minuten zentrifugiert, um Präzipitate abzutrennen. Zu den erhaltenen Präzipitaten wurde 1 ml PBS und 1 ml gesättigtes Ammoniumsulfat gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten gerührt und wiederum bei 4°C und 10 000 UPM 10 Minuten zentrifugiert, um Präzipitate abzutrennen. Die erhaltenen Präzipitate wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20 und 1 ml gesättigtes Ammoniumsulfat aufgelöst und über Nacht gegen 1 l PBS dialysiert, um Ammoniumsulfat zu entfernen, um eine IgG-Fraktion zu ergeben, welche als der (erste) Antikörper in dem folgenden Test verwendet wurde.

Herstellungsbeispiel 2: Herstellung eines markierten Antikörpers (der zweite Antikörper), der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen.

Ein markierter Antikörper (der zweite Antikörper), der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen, wurde erhalten durch Biotin-Markierung des (ersten) Antikörpers, der in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, mit einem Proteinbiotinylierungssystem, erhältlich von Amersham.

Herstellungsbeispiel 3: Herstellung eines festen Trägers, an welchem ein Antikörper gebunden ist, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen.

Der Antikörper (der erste Antikörper), der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450, welches in Her­ stellungsbeispiel 1 hergestellt wurde, zu erkennen, wurde in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben [Nunc- Immuno Plate MaxiSorp (Marke), hergestellt von Nunc], so daß die Proteinmenge 250 ng/Vertiefung beträgt und 16 Stunden bei 4°C stehengelassen.

Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 µl 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20 gewaschen. Ferner wurden 150 µl 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 1% Rinderserumalbumin zu den Vertie­ fungen für Blockierungszwecke zugegeben und bei Raumtem­ peratur 60 Minuten stehengelassen.

Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 µl ca. 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20, gewaschen, um den erwünschten festen Träger zu erhalten.

Testbeispiel 1: Bestimmung der Konzentration eines Cytochrom P450 in einem Humanserum zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose (Teil 1).

Zu einem festen Träger, erhalten im Herstellungsbeispiel 3, wurden 100 µl pro Vertiefung standardiesierte Humancytochrom P450-Lösungen gegeben (eingestellt auf 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 und 0,16 pmol P450/ml) und bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken.

Als nächstes wurde das Reaktionsprodukt mit 100 µl einer Lösung eines markierten Antikörpers, hergestellt in Herstellungsbeispiel 3, behandelt durch 500faches Verdünnen eines Biotin-markierten Antikörpers (der zweite Anti­ körper), der in der Lage ist, Humancytochrom P450 zu erkennen, mit 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20 und bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen, um die Antigen- Antikörper-Reaktion zu bewirken.

Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit ca. 200 µl 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20 gewaschen, um überschüssigen markierten Antikörper (den zweiten Antikörper) zu entfernen, der in der Lage ist, Humancyto­ chrom P450 zu erkennen.

Als nächstes wurde das Reaktionsprodukt mit 100 µl Streptavidin-markierter Meerrettich-Peroxidase (HRP), z. B. kommerziell erhältlich von Amersham) behandelt, bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen, ähnlich gewaschen wie zuvor beschrieben, behandelt mit einer Substratlösung (4 mM o-Phenylendiamin, 0,004% Wasserstoffperoxid, 0,02 M Citrat, 0,05 M Na₂HPO₄/pH 5.0) und bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen, um eine braune Farbe zu entwickeln, welche die Antigenmenge (d. h. Humancytochrom P450) widerspiegelt.

Die Cytochrom P450-Konzentration zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose wurde bestimmt durch Messung der Absorption der Vertiefung bei einer substratspezi­ fischen Wellenlänge (492 nm) mit einem Spektrophotometer, beispielsweise einem Mikrotiterplattenleser für Mikrotiter­ platten mit 96 Vertiefungen oder dergleichen.

Die Meßergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.

Testbeispiel 2: Bestimmung der Konzentration eines Cytochrom P450 in Humanserum zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose (Teil 2).

Zu einem festen Träger, erhalten in Herstellungsbeispiel 3, wurden 100 µl pro Vertiefung eines Humanserums als Probe gegeben (erhalten als ein Überstand gebildet durch Zentrifugation von 1 ml abgenommenem Blut als Probe bei 4°C und 2000 g für 15 Minuten, um Präzipitate zu entfernen) und bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen, um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu be­ wirken.

Als nächstes wurde das Reaktionsprodukt mit 100 µl einer Lösung eines markierten Antikörpers behandelt, hergestellt in Herstellungsbeispiel 3 durch 500faches Verdünnen eines Biotin-markierten Antikörpers (der zweite Antikörper), der in der Lage ist, Humancytochrom P450 zu erkennen, mit 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20 und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Antigen-Antikörper- Reaktion zu bewirken.

Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 µl 10 mM Phosphatpuffer (pH = 7,4), enthaltend 140 mM Natriumchlorid und 0,1% Tween 20, gewaschen, um überschüssigen markierten Antikörper (den zweiten Antikörper) zu entfernen, der in der Lage ist Humancytochrom P450 zu erkennen.

Als nächstes wurde das Reaktionsprodukt mit 100 µl Streptavidin-markierter Meerrettich-Peroxidase behandelt (HRP, z. B. kommerziell erhältlich von Amersham), bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen, in ähnlicher Weise wie zuvor beschrieben gewaschen, mit einer Substratlösung (4 mM o-Phenylendiamin, 0,004% Wasserstoff­ peroxid, 0,02 M Citrat, 0,05 M Na₂HPO₄/pH 5,0) behandelt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um eine braune Farbe zu entwickeln, die die Antigenmenge (d. h. Humancytochrom P450) widerspiegelt.

Die Cytochrom P450-Konzentration in Humanserum zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose wurde bestimmt durch Messung der Absorption der Vertiefungen bei einer substratspezifischen Wellenlänge (492 nm) mit einem Spektrophotometer, beispielsweise einem Mikrotiterplatten­ leser für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen oder dergleichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

Claims (9)

1. Diagnosekit für Hepatitis C und Alkoholzirrhose, welcher auf eine Humanserumprobe angewendet wird und welcher einen Antikörper umfaßt, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen.

2. Diagnosekit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen, ein Antikörper ist, der in der Lage ist, Cytochrom P450-Unterfamilien zu erkennen, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus:
Humancytochrom P450 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 und 3A4.

3. Diagnosekit nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, der in der Lage ist Humancytochrom P450-Unterfamilien zu erkennen ein Antikörper ist, welcher im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit anderen Cytochrom P450-Unter­ familien aufweist.

4. Diagnosekit für Hepatitis C und Alkoholzirrhose, welcher an einer Humanserumprobe angewendet wird mit:

• (a) einem festen Träger, an welchen ein Antikörper gebunden ist, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen; und
• (b) einem Reagenz, enthaltend einen markierten Antikörper, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen.

5. Diagnosekit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen, ein solcher ist, der in der Lage ist, Cytochrom P450-Unterfamilien zu erkennen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Humancytochrom P450 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 und 3A4.

6. Diagnosekit nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, der in der Lage ist, Humancytochrom P450-Unterfamilien zu erkennen ein solcher ist, welcher im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit anderen Cytochrom P450-Unter­ familien aufweist.

7. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Cytochrom P450 in Humanserum zur Diagnose von Hepatitis C und Alkoholzirrhose, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• (a) Durchführen einer Antigen-Antikörper-Reaktion durch Zugeben einer Humanserumprobe zu einem festen Träger, an welchen ein Antikörper gebunden ist, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen, gefolgt von Entfernen von überschüssigem Humancytochrom P450 und unumgesetzten Materialien durch Waschen;
• (b) Durchführen einer Antigen-Antikörper-Reaktion durch Hinzufügen eines markierten Antikörpers, der in der Lage ist, ein Humancytochrom P450 zu erkennen, zu dem Reaktionsprodukt, gefolgt von Entfernen des überschüssigen markierten Antikörpers durch Waschen; und
• (c) Anschließendes Erfassen des Cytochrom P450 mittels des Markers des markierten Antikörpers im Reaktionsprodukt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, der in der Lage ist Humancytochrom P450-Unterfamilien zu erkennen, ein solcher ist, der in der Lage ist, Cytochrom P450-Unterfamilien zu erkennen, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus:
Humancytochrom P450 1A1/2, 2C8/9/18, 2E1 und 3A4.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, der in der Lage ist, Humancytochrom P450-Unterfamilien zu erkennen ein solcher ist, der im wesentlichen keine Kreuzreaktivität mit anderen Cytochrom P450-Unterfamilien aufweist.