DE19712633A1 - Stimulation of interleukin, especially IL-6, production - Google Patents
Stimulation of interleukin, especially IL-6, productionInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von γ-Aminobuttersäure als Interleukinbildungsstimulans.The invention relates to the use of γ-aminobutyric acid as Interleukin formation stimulant.
Interleukine sind pleiotrope Cytokine, die im Immunsystem als Mediatorstoffe auftreten. Sie sind verantwortlich für die Induktion und Verlauf der T-Zell-vermittelten zytotoxischen Immunreaktion und der B-Zell- Aktivierung. Neben anderen Interleukinen spielt insbesondere Interleukin-6, im folgenden nur noch als IL-6 bezeichnet, eine zentrale Rolle bei der Proliferation und Differenzierung der T- und B-Zellen des Immunsystems.Interleukins are pleiotropic cytokines that act as immune systems Mediator substances occur. You are responsible for induction and Course of the T cell mediated cytotoxic immune response and the B cell Activation. In addition to other interleukins, interleukin-6, hereinafter referred to only as IL-6, a central role in the Proliferation and differentiation of the T and B cells of the immune system.
Interleukine sind auch ein wichtiger Bestandteil des Inflammationsgeschehens. Immunantwort und Entzündungsgeschehen stellen eng miteinander verwobene Prozesse im Organismus dar. Insbesondere IL-6 wird eine Stimulation von Akutphaseproteinen zur Regulation von Entzündungsprozessen zugerechnet (Heinrich et al., (1990), Biochem. J. 265: 621-636).Interleukins are also an important part of the Inflammation. Immune response and inflammation closely interwoven processes in the organism. Especially IL-6 is a stimulation of acute phase proteins for the regulation of Inflammatory processes attributed (Heinrich et al., (1990), Biochem. J. 265: 621-636).
Im Rahmen des Entzündungsgeschehens stellt die Akutphase-Reaktion die Antwort des Organismus auf Störungen der Homöostase durch Infektionen, Gewebeschädigungen, neoplastisches Wachstum oder immunologische Störungen dar. Die Wiederherstellung der gestörten Homöostase verläuft über eine lokale Reaktion am Ort der Verletzung, die mit der Feisetzung von Cytokinen, wie IL-6 einhergeht. Die Cytokine wirken über spezifische Rezeptoren auf verschiedenen Zielzellen und führen zu einer systemischen Reaktion charakterisiert durch Fieber, Leucozytose, Sekretion von Glycocorticoiden, Aktivierung von Complement und zu einer dramatischen Änderung der Konzentration der Akutphase-Proteine im Plasma, die eine die Entzündung regulierende und eindämmende Wirkung ausüben. Diese Akutphase-Proteine werden überwiegend in der Leber synthetisiert. Da aber meist Ort der Verletzung und Leber weit voneinander entfernt liegen, existieren hormonähnliche Mediatoren, die besonders von Leukozyten, Monozyten und Makrophagen produziert werden und unter denen Interleukin 6 eine zentrale Stellung einnimmt. Als Hauptfaktor für die Induzierung von Akutphase-Proteinen ist IL-6 somit ebenso wie alle Interleukine von großer Bedeutung für die Reaktion des Körpers auf Inflammationen.As part of the inflammatory process, the acute phase reaction is the Response of the organism to disorders of homeostasis due to infections, Tissue damage, neoplastic growth or immunological Disorders represents. The restoration of the disturbed homeostasis proceeds about a local reaction at the site of the injury, with the firing of Cytokines, such as IL-6. The cytokines act via specific Receptors on different target cells and lead to a systemic Response characterized by fever, leucocytosis, secretion of Glycocorticoids, activation of complement and to a dramatic Change in the concentration of acute phase proteins in plasma, which is the one Inflammation and containment effect. This Acute phase proteins are predominantly synthesized in the liver. Here but mostly the site of the injury and the liver are far apart, there are hormone-like mediators, especially those of leukocytes, Monocytes and macrophages are produced and among those Interleukin 6 occupies a central position. As the main factor for the Induction of acute phase proteins is IL-6 like all of them Interleukins of great importance for the body's response to Inflammations.
Es besteht immer noch ein Bedürfnis nach der Bereitstellung neuer wirksamer Interleukinbildungsstimulantien. Aufgabe der Erfindung war es daher, derartige Interleukinbildungsstimulantien zu entwickeln.There is still a need to provide new ones effective interleukin formation stimulants. The object of the invention was therefore, to develop such interleukin formation stimulants.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird die Verwendung von γ -Aminobuttersäure vorgeschlagen.To solve this problem, the use of γ-aminobutyric acid suggested.
γ-Aminobuttersäure, im folgenden als GABA bezeichnet, ist eine seit langem bekannte, nicht proteinogene Aminosäure mit endständiger Carboxylgruppe, die in tierischem und pflanzlichem Gewebe verbreitet vorkommt.γ-aminobutyric acid, hereinafter referred to as GABA, has long been one known, non-proteinogenic amino acid with a terminal carboxyl group, which is common in animal and vegetable tissues.
GABA wurde Ende der 50er Jahre in Hypothalamusgewebe des menschlichen Gehirnes nachgewiesen. Bald stellte sich heraus, daß GABA der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Zentralnervensystem und Vermittler der praesynaptischen Hemmung im Rückenmark ist. Der inhibitorische Transmitter GABA agiert über zwei verschiedene Arten von Rezeptoren, GABAA und GABAB. Die Substanz wird an einer praesynaptischen Membran freigesetzt und aktiviert im ZNS Ionenkanäle, insbesondere Chloridkanäle, die zu Hyperpolarisationen und damit zur Hemmung der Erregungsleitung, also zur postsynaptischen Hemmung führen. Eine Zusammenfassung der bisherigen Arbeiten über GABA als Neurotransmitter ist enthalten in Handbook of Psychopharmacology, Band 4, Amino Acid Neurotransmitters, herausgegeben von L.L. Iversen et al., Plenum, New York und London, 1975.GABA was detected in hypothalamic tissue in the human brain in the late 1950s. It soon emerged that GABA is the most important inhibitory neurotransmitter in the central nervous system and mediator of presynaptic inhibition in the spinal cord. The inhibitory transmitter GABA acts via two different types of receptors, GABA A and GABA B. The substance is released on a presynaptic membrane and activates ion channels in the CNS, in particular chloride channels, which lead to hyperpolarization and thus to inhibition of the conduction of the excitation, i.e. to post-synaptic inhibition. A summary of previous work on GABA as a neurotransmitter is contained in the Handbook of Psychopharmacology, Volume 4, Amino Acid Neurotransmitters, published by LL Iversen et al., Plenum, New York and London, 1975.
Bisher sind zwei Präparate bekannt, die GABA als Therapeutikum verwenden, AMINALON der russischen Firma Akrichin und GAMMALON der japanischen Firma Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd. GABA wirkt dabei auf das zentrale Nervensystem und wird beispielsweise zur Beschleunigung des zerebralen Metabolismus eingesetzt. Indikationen sind Gehirngefäßerkrankungen, chronische zerebro-vaskuläre Insuffizienz, posttraumatische Behandlung nach einem Insult, geistige Entwicklungsstörungen und Seekrankheit sowie allgemein bestimmte neurologische, psychische und narkologische Fälle nach Einschätzung des Arztes.So far, two preparations are known, GABA as a therapeutic agent use AMINALON from the Russian company Akrichin and GAMMALON the Japanese company Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd. GABA works here to the central nervous system and is used, for example, for acceleration of cerebral metabolism. Indications are Cerebral vascular disease, chronic cerebrovascular insufficiency, post-traumatic treatment after an insult, mental Developmental disorders and seasickness, as well as certain general ones neurological, psychological and narcological cases according to the Doctor.
Allgemein wird aber angenommen, daß GABA die Bluthirnschranke nicht überwinden kann. Daher sind Analoga zu der Substanz entwickelt worden, von denen insbesondere Baclofen, nämlich 4-Amino-3-p-chlorphenyl buttersäure als Antiepileptikum und als zentrales Muskelrelaxans bei multipler Sklerose eingesetzt wird. However, it is generally believed that GABA is not the blood-brain barrier can overcome. Therefore, analogs to the substance have been developed of which in particular baclofen, namely 4-amino-3-p-chlorophenyl butyric acid as an anti-epileptic and as a central muscle relaxant multiple sclerosis is used.
Erst sehr viel später wurde entdeckt, daß GABA auch im peripheren Bereich eine Rolle spielt. So sind beispielsweise die GABA-Konzentrationen im Plexus myentericus oder den Inselzellen des Pankreas so hoch wie im Gehirn und es gibt Hinweise darauf, daß GABA auch peripher ein Neurotransmitter ist.It was only much later that GABA was discovered in the peripheral area matters. For example, the GABA concentrations in the Plexus myentericus or the islet cells of the pancreas as high as in the brain and there is evidence that GABA is also a peripheral neurotransmitter is.
Völlig überraschend wurde jetzt festgestellt, daß GABA ein hervorragendes Interleukinbildungsstimulans ist.Quite surprisingly, GABA has now been found to be an excellent one Interleukin formation stimulant is.
So stimulierte GABA die Bildung von IL-6 in erheblichem Umfang.GABA stimulated the formation of IL-6 to a considerable extent.
Bei Untersuchung reiner GABA-Lösungen und einer GABA-haltigen Fraktion eines eiweiß- und zellfreiem Extraktes aus E.coli wurde in einem Interleukinbildungsassy mit 7TD1-Zellen nach Van Snick et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683) und Thomsen und Loppnow (Drug Res. 1995, 45 (I), 5, 657-661) die IL-6-induzierende Aktivität von GABA über den Einbau von radioaktivem 3H-Thymidin nachgewiesen.When examining pure GABA solutions and a GABA-containing fraction of a protein and cell-free extract from E. coli, an interleukin formation assay with 7TD1 cells according to Van Snick et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683) and Thomsen and Loppnow (Drug Res. 1995, 45 (I), 5, 657-661) the IL-6 inducing activity of GABA via the Incorporation of radioactive 3 H-thymidine demonstrated.
Im gleichen Testsystem induzierte eine Kombination aus Lipopolysacchariden (LPS), potenten IL-1- und IL-6-Aktivatoren, - in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation - und einer GABA-haltigen Fraktion eines Extraktes aus E.coli die Bildung von Interleukin-6 in synergistischer Weise.In the same test system, a combination of Lipopolysaccharides (LPS), potent IL-1 and IL-6 activators, - in Concentrations below the lowest concentration with maximum Stimulation - and a GABA-containing fraction of an extract from E.coli die Formation of interleukin-6 in a synergistic manner.
Der genaue Mechanismus, der hinter diesen Wirkungen steht, ist noch nicht geklärt. GABA wirkt außerhalb des zentralen Nervensystems zwar überwiegend über seine Rezeptoren, zeigt aber auch in einigen Fällen intrazelluläre Effekte ohne Beteiligung spezifischer membranständiger Rezeptoren, so beispielsweise bei der Stimulation der Glukose-Aufnahme, des Glycogen-Abbaus sowie der Protein-Biosynthese. Soweit wird auf den zusammenfassenden Artikel von Erdö und Wolff in J. Neurochem. 54, (1990), S. 363-372 verwiesen.The exact mechanism behind these effects is not yet clarified. GABA works outside the central nervous system predominantly via its receptors, but also shows in some cases intracellular effects without the involvement of specific membrane-bound Receptors, for example when stimulating glucose uptake, of glycogen breakdown and protein biosynthesis. As far as the summary article by Erdö and Wolff in J. Neurochem. 54, (1990), pp. 363-372.
GABA kann unproblematisch vollsynthetisch mit guten Ausbeuten hergestellt werden; wir verweisen insoweit zusammenfassend auf die Monographie in "The Merck Index", 11. Aufl. Merck & Co., Inc., Rahway, N. J., USA 1989, S. 70. Da GABA aber fast ubiquitär in Pflanzen und Tieren vorkommt, ist es auch möglich, anstelle der synthetischen Verbindung geeignete Extrakte oder deren Fraktionen aus Pro- oder Eukaryonten einzusetzen. Insbesondere Prokaryonten, und hier wiederum Bakterien, produzieren relativ große Mengen an GABA, so daß es möglich ist, die Substanz entweder aus deren eiweiß- und zellfreien Extrakten zu gewinnen oder diese Extrakte und Fraktionen selbst in standardisierter Form einzusetzen. Derartige Extrakte/Fraktionen können insbesondere aus Streptococcen, Staphylococcen, Escherichia, Proteus, Klebsiella, Gaffkya oder Mykobakterien hergestellt werden. Zur Herstellung wird aus technischen Gründen meist das leicht zugängliche E.coli verwendet.GABA can be produced fully synthetically with good yields without any problems will; we refer to the monograph in "The Merck Index", 11th ed. Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., USA 1989, p. 70. But since GABA occurs almost ubiquitously in plants and animals, it is also possible, instead of the synthetic compound, suitable extracts or to use their fractions from pro or eukaryotes. Especially Prokaryotes, and here again bacteria, produce relatively large ones Amounts of GABA so that it is possible to extract the substance from either of them protein-free and cell-free extracts or these extracts and To use fractions in a standardized form. Such Extracts / fractions can be obtained from streptococci, Staphylococci, Escherichia, Proteus, Klebsiella, Gaffkya or Mycobacteria are produced. To manufacture, technical For the most part, the easily accessible E.coli is used.
Die wirksame Dosis der Substanz liegt im Bereich von etwa 0,1 µg/kg/d bis ca. 60 mg/kg/d, die bevorzugte Dosierung bei parenteraler Gabe bei etwa 1 µg/kg/d bis 1 mg/kg/d, bei oraler Gabe bei etwa 3 µg/kg/d bis 3 mg/kg/d. Da GABA sich durch eine geringe Toxizität auszeichnet und bei zentralnervöser Indikation Dosierungen bis zu 3 g/Tag verabreicht werden, ist eine große therapeutische Breite gegeben. Daher sind auch bei höheren Dosierungen keine Nebenwirkungen zu erwarten.The effective dose of the substance is in the range of approximately 0.1 µg / kg / d to approx. 60 mg / kg / d, the preferred dosage for parenteral administration at approx. 1 µg / kg / d to 1 mg / kg / d, with oral administration at about 3 µg / kg / d to 3 mg / kg / d. There GABA is characterized by a low toxicity and central nervous system Indication dosages administered up to 3 g / day is a large one given therapeutic breadth. Therefore, even at higher dosages no side effects expected.
Die Verwendung von GABA kann vorzugsweise parenteral oder oral erfol gen, z. B. in Form von Injektionslösungen, Pulver, Granulaten, Tabletten, Kapseln oder Dragees. Da die Substanz gut durch die intakte Haut resorbiert wird, sind auch topische Zubereitungen möglich.GABA can preferably be used parenterally or orally gene, e.g. B. in the form of injection solutions, powders, granules, tablets, Capsules or dragees. Because the substance is well absorbed by the intact skin topical preparations are also possible.
Die Herstellung der pharmazeutischen Darreichungsform erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise und ist unproblematisch.The pharmaceutical dosage form is produced in one familiar to the expert and is unproblematic.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispielenäher erläutert:The invention is explained in more detail below with the aid of examples:
Die vorgestellte Methode entspricht der von Tafel und Stern (1900, Ber. 33, 2224). 135 g Succinimid wird in 450 ml Schwefelsäure (50%) gelöst und elektrolytisch bei 54A 7 Std. reduziert. Die Kathodenflüssigkeit wird anschließend mit Wasser verdünnt und durch Fällung mit zunächst Bariumcarbonat, dann Barythydratlösung aufgereinigt. Die baryt- und schwefelsäure freie, schwach saure Flüssigkeit wird dann im Vakuum mehrfach - zuletzt im Wasserstoffstrom - abdestilliert. Die Ausbeute beträgt etwa 60% der theoretisch möglichen. Das gewonnene Pyrrolidon wird dann zusammen mit der 2,5-fachen Menge kristallisierten Bariumhydroxids und der 10-fachen Menge Wasser 2 Stunden am Rückflußkühler gekocht und so hydrolysiert. Die entstehende GABA-Lösung wird zunächst mit Kohlensäure von Verunreinigungen befreit und dann der Rest des Baryts mit Schwefelsäure ausgefällt. Die baryt- und schwefelsäurefreie Lösung wird eingedampft. Die verbleibende Rohsäure, deren Ausbeute der theoretisch möglichen sehr nahe kommt, wird in der 4-fachen Menge Wasser gelöst und mit der 25-fachen Menge absoluten Alkohols versetzt. Nach Abfiltration der ersten Trübung und nochmaliger Zugabe einer gleichen Menge Alkohols kristallisiert die Hauptmenge der Säure aus.The method presented corresponds to that of Tafel and Stern (1900, Ber. 33, 2224). 135 g succinimide comes in 450 ml Sulfuric acid (50%) dissolved and electrolytically at 54A for 7 hours reduced. The cathode liquid is then washed with water diluted and then precipitated with barium carbonate, then Barite hydrate solution purified. The barytic and sulfuric acid Free, weakly acidic liquid is then repeated several times in a vacuum - finally distilled off in a stream of hydrogen. The yield is about 60% of the theoretically possible. The won Pyrrolidone is then combined with 2.5 times the amount crystallized barium hydroxide and 10 times the amount Water boiled for 2 hours on a reflux condenser and such hydrolyzed. The resulting GABA solution is initially included Carbon dioxide freed of impurities and then the rest of the barite precipitated with sulfuric acid. The barite and sulfuric acid-free solution is evaporated. The remaining one Crude acid, the yield of which is very close to what is theoretically possible comes, is dissolved in 4 times the amount of water and with the 25 times the amount of absolute alcohol added. After filtration the first turbidity and adding the same again The amount of alcohol crystallizes out the majority of the acid.
Hier wird auf eine Methode von Schotten (1883, Ber. 16, 643) zurückgegriffen. 300 ml rauchende Salpetersäure werden unter Kühlung zu 157,216 g Piperylurethan getropft. Die entstehende salpetersaure Lösung wird in 0,5 l Wasser aufgenommen und eine aus einer öligen Säure bestehende Phase abgetrennt. Die wäßrige Phase wird mit zweimal 100 ml Äther extrahiert und die Ätherphasen mit der zuvor abgetrennten öligen Phase vereinigt. Diese wird mit der gleichen Menge konzentrierter Salzsäure in einem geschlossenen Behälter über 100°C erhitzt. Die zurückbleibende salzsaure Lösung wird eingedampft und der Rückstand in wenig Wasser (10 ml) aufgenommen. Nach Filtration und Versetzung mit 5 ml Ethylalkohol und 100 mg Platinchlorid bildet sich nach einem Tag ein Niederschlag. Das Filtrat des Niederschlags wird mit H2S von Platin befreit und eingedampft. GABA kristallisiert dann als salzsaures Salz mit einer Ausbeute von ca. 90 g (87%) aus. Here, a method by Schotten (1883, Ber. 16, 643) is used. 300 ml of fuming nitric acid are added dropwise to 157.216 g of piperyl urethane with cooling. The resulting nitric acid solution is taken up in 0.5 l of water and a phase consisting of an oily acid is separated off. The aqueous phase is extracted twice with 100 ml of ether and the ether phases are combined with the previously separated oily phase. This is heated with the same amount of concentrated hydrochloric acid in a closed container above 100 ° C. The remaining hydrochloric acid solution is evaporated and the residue is taken up in a little water (10 ml). After filtration and treatment with 5 ml of ethyl alcohol and 100 mg of platinum chloride, a precipitate forms after one day. The filtrate of the precipitate is freed from platinum with H 2 S and evaporated. GABA then crystallizes out as a hydrochloric acid salt with a yield of approx. 90 g (87%).
Zur Gewinnung der GABA-haltigen Wirkstoff-Fraktion aus E.coli wird bevorzugt E.coli des Serotyps 02 : K1 : H6 fünf Tage bei 37°C bis zu einer Wachstumsdichte von 2 × 1012 koloniebildenden Einheiten/ml auf einem Nährmedium auf Fleischpeptonbasis bebrütet. Aus der gewachsenen Kultur wird in an sich bekannter Weise durch Mehrfachfiltration ein eiweiß- und zellfreier Extrakt mit den Stoffwechselprodukten gewonnen. Dieser Extrakt wird auf 2,3 mg Peptid/ml standardisiert und daraus GABA isoliert. Dazu werden beispielsweise 1,5 ml des Extrakts an einer, speziell für die Trennung von Aminosäuren geeigneten Kationenaustauschsäule mit einem Stufengradienten bei 58°C getrennt, wobei GABA mit dem Wechsel von Puffer A (1,7% Natriumcitrat-dihydrat, 0,5% NaCl in Wasser, pH 4 mit HCl) zu Puffer B (1,9% Natriumcitrat-dihydrat, 5% NaCl in Wasser, pH 6) nach einer Retentionszeit von ca. 43 Minuten eluiert und in Fraktionen aufgefangen wird. Die Detektion und Quantifizierung von GABA erfolgt durch Untersuchung der Fraktionen an einem kommerziellen Aminosäureanalysator (Beckmann 6300), im Prinzip nach dem Verfahren von Spackmann, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190). Die GABA-haltigen Fraktionen der Ionenaustauschchromatographie werden gepoolt (1,2 ml) und entsalzt (z. B. 100 µl an Sephadex G10-Gelchromatographie (Säulendimensionen 1 m × 2 cm, Fluß 300 µl) in 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser). Der GABA enthaltende Peak, der - wie oben beschrieben - durch Aminosäureanalyse detektiert wird, wird eingetrocknet und in Wasser (z. B. 200 µl) aufgenommen. GABA kann so in einer Menge von mindestens 500 nmol/ml eiweiß- und zellfreiem Peptidextrakt aus E.coli, standardisiert auf 2,3 mg Peptid/ml, gewonnen werden.To obtain the GABA-containing active ingredient fraction from E. coli, E.coli of the serotype 02: K1: H6 is preferably incubated for five days at 37 ° C. to a growth density of 2 × 10 12 colony-forming units / ml on a nutrient medium based on meat peptone . A protein-free and cell-free extract with the metabolic products is obtained from the grown culture in a manner known per se by multiple filtration. This extract is standardized to 2.3 mg peptide / ml and GABA is isolated therefrom. For this purpose, for example, 1.5 ml of the extract are separated on a cation exchange column, which is particularly suitable for the separation of amino acids, with a step gradient at 58 ° C., GABA with the change of buffer A (1.7% sodium citrate dihydrate, 0.5% NaCl in water, pH 4 with HCl) to buffer B (1.9% sodium citrate dihydrate, 5% NaCl in water, pH 6) after a retention time of approx. 43 minutes, eluted and collected in fractions. GABA is detected and quantified by examining the fractions on a commercial amino acid analyzer (Beckmann 6300), in principle using the method of Spackmann, Stein and Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190). The GABA-containing fractions of the ion exchange chromatography are pooled (1.2 ml) and desalted (e.g. 100 μl of Sephadex G10 gel chromatography (column dimensions 1 m × 2 cm, flow 300 μl) in 0.1% trifluoroacetic acid in water). The peak containing GABA, which - as described above - is detected by amino acid analysis, is dried and taken up in water (for example 200 μl). GABA can thus be obtained in an amount of at least 500 nmol / ml protein and cell-free peptide extract from E. coli, standardized to 2.3 mg peptide / ml.
Ein Vorteil der Verwendung von GABA in Form eines Extraktes oder einer Wirkstoff-Fraktion aus E.coli gegenüber der Applikation reinen GABAs dürfte in einer längeren Bioverfügbarkeit des im Extrakt oder der Fraktion vorliegenden GABAs liegen. So wird appliziertes reines GABA wahrscheinlich sehr rasch metabolisiert, während GABA in Form eines Extraktes oder einer Fraktion langsamer abgebaut wird und länger am Organ wirken könnte. Verantwortlich dafür ist möglicherweise eine Einbettung in andere molekulare Strukturen, eine Konformationsänderung (Umklappen) des GABA-Moleküls oder Dimerbildung.An advantage of using GABA in the form of an extract or an active ingredient fraction from E. coli versus the Application of pure GABAs should take a long time Bioavailability of the extract or fraction present GABAs lie. Applied pure GABA is likely Metabolized very quickly, while GABA in the form of an extract or a fraction is broken down more slowly and longer on Organ could work. This may be responsible embedding in other molecular structures, one Conformational change (flipping) of the GABA molecule or Dimer formation.
Mononukleare Zellen werden aus heparinisiertem Blut gesunder Spender mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation über Ficoll® isoliert (Loppnow et al., Infect. Immun. 1990, 58, 3743-3750), mehrere Male gewaschen und in serumfreiem RPMI 1640 nach Loppnow et al (J. Immunol. 1989, 142, 3229-3238) mit L- Glutamin und Antibiotika inkubiert. 50 µl der Zellsuspension (entspricht 2 × 105 Zellen) werden vorgelegt. Hierzu werden jeweils 50 µl der zu testenden Substanzen und Kontrollen gegeben und der Ansatz mit den Zellen für 24 Stunden inkubiert. Die Überstände werden abgenommen, mit Schutzprotein versehen, bei -20°C aufbewahrt und anschließend in einem Cytokin-Test untersucht.Mononuclear cells are isolated from heparinized blood from healthy donors using gradient centrifugation over Ficoll® (Loppnow et al., Infect. Immun. 1990, 58, 3743-3750), washed several times and in serum-free RPMI 1640 according to Loppnow et al (J. Immunol. 1989, 142, 3229-3238) with L-glutamine and antibiotics. 50 µl of the cell suspension (corresponds to 2 × 10 5 cells) are presented. For this, 50 µl of the substances to be tested and controls are added and the mixture is incubated with the cells for 24 hours. The supernatants are removed, provided with protective protein, stored at -20 ° C. and then examined in a cytokine test.
Im 7TD1-Assay nach van Snik et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683) wird die IL-6-induzierte Aktivität über den Einbau von radioaktivem 3H-Thymidin nachgewiesen.In the 7TD1 assay according to van Snik et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683) the IL-6-induced activity is demonstrated by the incorporation of radioactive 3 H-thymidine.
Die erhaltenen Überstände der mononuklearen Zellen werden in 96 Loch Kulturplatten in 8 Stufen verdünnt. Zu diesen Verdünnungsreihen werden 2000 Zellen/Loch der IL-6- abhängigen murinen B-Zell-Linie 7TD1 hinzugefügt, ähnlich wie für B9-Zellen bei Loppnow und Libby beschrieben (Exp. Cell. Res. 1992, 198, 283-290). Die Kulturen werden 72 Stunden inkubiert, für weitere 6 Stunden mit radioaktivem Thymidin versehen und die Proliferation der Zellen durch Messung der eingebauten Radioaktivität ermittelt. Die Bestimmung der Aktivität der Überstände erfolgt durch Vergleich der Proben mit einem definierten Standard mit Hilfe der Probit-Analyse nach Gillis et al. (J. Immunmol. 1978, 120, 2027-2032).The mononuclear cell supernatants obtained diluted in 96-well culture plates in 8 steps. To this Dilution series become 2000 cells / well of IL-6 dependent murine B cell line 7TD1 added, similar to for B9 cells in Loppnow and Libby (Exp. Cell. Res. 1992, 198, 283-290). The cultures are 72 hours incubated for another 6 hours with radioactive thymidine provided and the proliferation of the cells by measuring the built-in radioactivity determined. The determination of The supernatants are active by comparing the samples with a defined standard with the help of probit analysis Gillis et al. (J. Immunmol. 1978, 120, 2027-2032).
Reine GABA-Lösungen zeigen eine spezifische IL-6- induzierende Aktivität von durchschnittlich 5,7 × 106 pg IL- 6/nmol auf, während eine GABA-haltige Wirkstoff-Fraktion nach Beispiel 3 eine spezifische Aktivität von 10,3 × 106 pg IL-6/nmol aufweist.Pure GABA solutions show a specific IL-6-inducing activity of an average of 5.7 × 10 6 pg IL-6 / nmol, while a GABA-containing active ingredient fraction according to Example 3 has a specific activity of 10.3 × 10 6 pg IL-6 / nmol.
In einem Testsystem gemäß Beispiel 4 wird die Wirkung einer GABA-haltigen Wirkstoff-Fraktion nach Beispiel 3 auf die IL-6- Bildung in Kombination mit LPS getestet. LPS wird in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation, in diesem Fall 5 pg/nmolAminosäure eingesetzt.In a test system according to Example 4, the effect of an active ingredient fraction containing GABA according to Example 3 on IL-6 formation in combination with LPS is tested. LPS is used in concentrations below the lowest concentration with maximum stimulation, in this case 5 pg / nmol amino acid .
Die auf den Aminosäuregehalt standardisierte GABA-haltige Wirkstoff-Fraktion nach Beispiel 3 weist mit LPS eine spezifischen IL-6-induzierende Aktivität von 17,8 × 106 pg IL- 6/nmolAminosäure auf.The GABA-containing active ingredient fraction according to Example 3, standardized to the amino acid content, has a specific IL-6-inducing activity of 17.8 × 10 6 pg IL-6 / nmol amino acid with LPS.
Für eine rasche und von der Zuverlässigkeit des Patienten unabhängige Therapie kann sich eine parenterale Applikation des Medikaments empfehlen. Der Magen-Darmtrakt wird bei der Aufnahme zunächst umgangen. GABA ist hervorragend wasserlöslich. Es ist daher möglich eine reine GABA-Lösung in Wasser als Injektionslösung zu verwenden, ebenso wie einen zell- und proteinfreien Extrakt aus Pro- bzw. Eukaryonten oder Fraktionen davon, wie exemplarisch in Beispiel 3 beschrieben. Die Injektionslösung könnte bei gewünschter rascher Wirkung intravenös (i.v.) oder für eine langanhaltendere Depot-Wirkung subcutan (s.c.) appliziert werden. Eine bevorzugte Dosierung sind etwa 1 µg/kg/d-1 mg/kg/d. Die Injektionslösungen werden in an sich bekannter Weise hergestellt.For a quick and dependable patient Independent therapy can be a parenteral application recommend the drug. The gastrointestinal tract is used in the Bypassed recording first. GABA is excellent water soluble. It is therefore possible to use a pure GABA solution in Use water as a solution for injection, as well as one cell and protein free extract from pro or eukaryotes or Fractions thereof as exemplified in Example 3. The solution for injection could, if desired, work quickly intravenously (IV) or for a longer-lasting depot effect can be applied subcutaneously (s.c.). A preferred dosage are about 1 µg / kg / d-1 mg / kg / d. The injection solutions are produced in a manner known per se.
515 mg GABA werden in 10 l isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, sterilisiert und mit einer Wirkstoffkonzentration von 51,5 µg/ml in Ampullen zu 10 ml portioniert.515 mg GABA are in 10 l isotonic saline diluted, sterilized and with an active ingredient concentration of Portioned 51.5 µg / ml in ampoules of 10 ml.
Für die Selbstapplikation des Patienten empfiehlt sich im allgemeinen eine orale Gabe des Wirkstoffes. Sowohl GABA in reiner Form als auch GABA-haltige Extrakt oder Fraktionen können in getrockneter oder gelöster Form appliziert werden. Möglich wäre dabei eine Gabe als Lösung, Pulver, Granulat, Dragee, Tablette oder Kapsel. Eine bevorzugte Dosierung sind etwa 3 µg/kg/d-3 mg/kg/d. Die oralen Präparate werden in an sich bekannter Weise hergestellt.For the patient's self-application, we recommend generally oral administration of the active ingredient. Both GABA in pure form as well as extract or fractions containing GABA can be applied in dried or dissolved form. It could be administered as a solution, powder, granules, Dragee, tablet or capsule. A preferred dosage are about 3 µg / kg / d-3 mg / kg / d. The oral preparations are in manufactured in a known manner.
500 mg GABA werden unter sterilen Bedingungen mit 99,5 g Trägersubstanzen (Magnesiumstearat, Polyvidon, Lactose oder Stärke) gemischt und zu Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulat und Dragees mit Wirkstoffmengen von 0,5 mg verarbeitet. 500 mg GABA are mixed under sterile conditions with 99.5 g Carrier substances (magnesium stearate, polyvidone, lactose or Starch) and mixed into tablets, capsules, powder, granules and coated tablets processed with active ingredient amounts of 0.5 mg.
Möglich ist auch die Herstellung einer Lösung. Dazu werden 515 mg GABA in 10 l isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, sterilisiert und mit einer Wirkstoffkonzentration von 51,5 µg/ml in Ampullen zu 10 ml portioniert. A solution can also be prepared. To do this Dilute 515 mg GABA in 10 l isotonic saline, sterilized and with an active ingredient concentration of 51.5 µg / ml portioned in ampoules of 10 ml.
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