DE19645601A1 - Verfahren zur schonenden Markierung von Geweben mit analytischen Sonden und Affinitätsliganden - Google Patents
Verfahren zur schonenden Markierung von Geweben mit analytischen Sonden und AffinitätsligandenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Boronsäure-Derivate, Boronsäureester-Derivate, die
Herstellung derselben und Verfahren zur schonenden Markierung von, vorzugsweise polyme
ren, Trägern mit einer Vielzahl von unterschiedlichen biospezifischen Verbindungen, wie bio
chemischen Sonden.
Unter Trägern wird auch im Sinne der Erfindung Träger oder Trägermaterialien wie poly
mere Verbindungen z. B. verschiedene Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, lebende
oder tote Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen verstanden. Unter Träger können auch
die Monomere der polymeren Träger verstanden werden.
Unter biospezifischen Verbindungen oder Sonden werden im Sinne der Erfindung bio
chemisch wirksame Verbindungen, pharmazeutisch wirksame Verbindungen, biologisch wirk
same Verbindungen und/oder diagnostisch wirksame Verbindungen verstanden.
Insbesondere versteht man unter biochemisch wirksamen Verbindungen im Sinne der Er
findung auch Proben oder Verbindungen zum qualitativen und quantitativen Nachweis, Anrei
cherung, Isolierung, Reindarstellung oder Erkennen von Konzentrationen, Mengen etc. eines
Stoffes, einer Komponente, insbesondere des biologischen Typs oder von Milieu in Organis
men oder Teilen derselben wie in Gewebe, in Organen, Zellen, Zellkompartimenten, Zell-, Ge
webeextrakten etc., z. B. Farbstoffe, physiologische Indikatoren, oder
ebenso pharmazeutisch wirksamen Verbindungen solche zur Behandlung von Krankheits
zuständen, wie Antibiotika, Antimykotika, Enzyminhibitoren, Chelate, oder
biologisch wirksamen Verbindungen, welche enzymatisch katalysierte Reaktionen in bei
spielsweise Zellen, Geweben, Organen, Organismen zu beeinflussen vermögen, wie Pestizide
oder Herbizide, oder
diagnostisch wirksamen Verbindung, welche Zellen oder Zellkompartimente eines be
stimmten Status wie entartete Zellen erkennen können bzw. an solche zu binden imstande sind,
verstanden. Sonden können sein Farbstoffe, physiologische Indikatoren, Antibiotika, Antimy
kotika, Enzyminhibitoren, Chelate, Lipide, Tracer, Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosac
charide oder dergleichen bzw. die entsprechenden monomeren Bausteine.
Unter Boronsäure ist die ältere Bezeichnung für organische Derivate der Borsäure zu ver
stehen, entsprechendes gilt für die Bezeichnung Boronat.
Im Stand der Technik sind cyclische Borsäureester als Schutzgruppen in der organischen
Synthesechemie bekannt. Aufgabe der Erfindung ist es, Borsäureester-Derivate unter schonen
der Kopplungsreaktionen an biospezifische Verbindungen zu binden und diese an Träger zu
koppeln, ohne daß die biologische, biochemische oder pharmazeutische Wirksamkeit der bio
spezifischen Verbindungen verloren, zumindest aber nicht nennenswert beeinträchtigt wird.
Die Erfindung betrifft Boronsäure-Derivate der Formel (Z)k Y-B(OH)2, die dadurch ge
kennzeichnet sind, daß
Y: ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, ist, sowie
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung ist, an welcher vorzugsweise ein oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2 oder -O-B(OH)2 oder
Y: ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, ist, sowie
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung ist, an welcher vorzugsweise ein oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2 oder -O-B(OH)2 oder
sind,
worin L gleich T oder Z, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH- Gruppen aufweist,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen sind, und
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
worin L gleich T oder Z, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH- Gruppen aufweist,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen sind, und
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf ein Boronsäureester-Derivate der
Formel [(Z)kY-B]m C, die dadurch gekennzeichnet sind, daß
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten
und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere ein Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere ein Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
sind,
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierten oder unsubstituierten OH- Gruppen aufweist,
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierten oder unsubstituierten OH- Gruppen aufweist,
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate, zur schonenden Markierung von, vorzugsweise po
lymeren, Trägern mit biospezifischen Verbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
- a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure- Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel, wie Dimethyl formamid, und einer Base, wie Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
- b) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung ein organisches Lösungsmittel als Fällungsmittel, insbesondere Ether, zu dem Ansatz gegeben wird,
- c) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung der erfin
dungsgemäßen Boronsäureester-Derivate gerichtet, zur schonenden Markierung von, vor
zugsweise polymeren, Trägern mit biospezifischen Verbindungen, wobei
- a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure- Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel, wie Dimethyl formamid, und einer Base, vorzugsweise Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
- c) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird,
- d) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird und
- e) anschließend mit einem, vorzugsweise polymeren, Träger mit benachbarten Hydroxyl- Gruppen, vorzugsweise bei Raumtemperatur, bei pH 6 bis 8, vorzugsweise pH 7, verestert wird. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate als biologisch wirksame Verbindung, als biochemisch wirksame Verbin dung, pharmazeutisch wirksame Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung ge richtet und auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate gerichtet als biologisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate können als Alkyliden
bivalente Gruppen wie Ethyliden, Propyliden, Tetramethylen, 2-Methyltrimethylen oder 2,
2-Dimethyltrimethylen sein. Diese können weiter substituiert sein. Als Arylen sind biva
lente aromatische Gruppen wie 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,4-Phenylen, oder auch
substituierte bivalent aromatische Gruppen wie 4-Methyl-1,3-Phenylen, 4-Amino -1,
3-Phenylen.
Im Falle der substituierten Boronat-Gruppe, wenn
E gleich
E gleich
ist, steht L beispielsweise für einen polymeren
Trägerrest oder für eine biospezifische Verbindung Z, wobei Sauerstoff an vicinalen Koh
lenstoffatomen des Trägerrestes bzw. der biospezifischen Verbindung, nicht an geminalen,
kovalent gebunden ist.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Borsäure-Derivate der Formel Z-Y-B
(OH)2 kann
Y: für 1,3-Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl,
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung stehen; weiterhin kann die biospe zifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise Isothiocyanato-Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino- Gruppe kovalent gekoppelt sein.
Y: für 1,3-Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl,
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung stehen; weiterhin kann die biospe zifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise Isothiocyanato-Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino- Gruppe kovalent gekoppelt sein.
Zudem ist es möglich bei den erfindungsmäßen Boronsäure-Derivate, daß die biospezifische
Verbindung mindestens ein Vertreter der eine biologisch wirksame Verbindung, eine
pharmazeutisch wirksame Verbindung, eine biochemisch wirksame Verbindung und eine
diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist. Die biologisch wirksamen
Verbindungen können Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide, die pharmazeutisch
wirksamen Verbindungen ein Antibiotikum oder Antimykotikum sein. Der polymere Trä
gerrest kann Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten
oder dergleichen sein.
Die erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate der Formel (Z)k Y-B C können dadurch
gekennzeichnet sein, daß
k eine ganze Zahl von 1 bis 5,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder
ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen,
wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen,
E -R(OH2 oder -O-B(OH)2 oder
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder
ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen,
wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen,
E -R(OH2 oder -O-B(OH)2 oder
sind,
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH-Gruppen aufweist.
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH-Gruppen aufweist.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate können als Alky
liden bivalente Gruppen wie Ethyliden, Propyliden, Tetramethylen, 2-Methyltrimethylen
oder 2,2-Dimethyltrimethylen sein. Diese können weiter substituiert sein. Als Arylen sind
bivalente aromatische Gruppen wie 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,4-Phenylen, oder
auch substituierte bivalent aromatische Gruppen wie 4-Methyl-1,3-Phenylen, 4-Amino-
1,3-Phenylen.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemaßen Borsäureester-Derivate können
Y für 1,3-Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl und Z für eine substituierte biospezifische Verbin dung stehen; weiterhin kann die biospezifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise mittels Isothiocyanato- Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino-Gruppe kovalent gekoppelt sein. Im Falle der substituierten Boronat-Gruppe, wenn C gleich
Y für 1,3-Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl und Z für eine substituierte biospezifische Verbin dung stehen; weiterhin kann die biospezifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise mittels Isothiocyanato- Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino-Gruppe kovalent gekoppelt sein. Im Falle der substituierten Boronat-Gruppe, wenn C gleich
ist, steht T beispielsweise für einen polymeren
Trägerrest, wobei Sauerstoff an vicinalen Kohlenstoffatomen des Trägerrestes, nicht an
geminalen, kovalent gebunden ist.
Ebenso wenn
E gleich
ist, steht L beispielsweise für einen polymeren
Trägerrest T oder für eine biospezifische Verbindung Z, wobei Sauerstoff an vicinalen
Kohlenstoffatomen des Trägerrestes bzw. der biospezifischen Verbindung, nicht an gemi
nalen, kovalent gebunden ist.
Ebenso ist es möglich, daß
T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten substituierten
und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: 1,3-Phenylen und
Z eine substituierte biospezifische Verbindung sind.
Y: 1,3-Phenylen und
Z eine substituierte biospezifische Verbindung sind.
Weiterhin kann in einer besonderen Ausführungsform die biospezifische Verbindung minde
stens ein Vertreter der eine biologisch wirksame Verbindung, eine pharmazeutisch wirk
same Verbindung, eine biochemisch wirksame Verbindung und eine diagnostisch wirksa
me Verbindung umfassenden Gruppe sein. Als biologisch wirksame Verbindungen eignen
Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide, als pharmazeutisch wirksame Verbindungen
ein Antibiotikum oder Antimykotikum und als polymere Trägerrest Pflanzenzellen, Zel
lorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen. Vorzugsweise
ist die biospezifische Verbindung mindestens ein Farbstoff, vorzugsweise substituiertes
Fluorescein.
In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate
kann die biospezifische Verbindung mindestens ein Vertreter der biochemisch, wie ein Farb
stoff, ein physiologischer Indikator, eine biologisch, diagnostisch und/oder pharmazeutisch
wirksame Verbindung, Chelate, Lipide, Tracer, Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosacchari
de oder dergleichen umfassenden Gruppe sein, wobei beispielsweise die biologisch, insbeson
dere Enzyminhibitoren, oder pharmazeutisch wirksame Verbindung, insbesondere ein Antibio
tikum, Antimykotikum, sein können. Hinzukommend kann der polymere Träger Pflanzenzel
len, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen oder substitu
ierte Lectine, Nukleinsäure-Derivate oder dergleichen sein. Jedoch kann der Träger auch ein
Monomer des polymeren Trägers oder die biospezifische vicinale Hydroxyl-Gruppen aufwei
sende Verbindung sein.
Die chemischen Bindungen zwischen den Trägern und den Sonden sind cyclische Borsäu
reester mit einer überraschend hohen Stabilität unter physiologischen Bedingungen. Eine Vor
aussetzung für diese Verknüpfung kann sein, daß der polymere Träger benachbarte Hydroxyl-
Gruppen (vicinale Diolgruppen) enthält und der Ligand mindestens eine Boronsäure-Gruppe
mit einem organischen Rest, welcher z. B. aus der Acyclen, Aromaten, Alicyclen, wie Cycloal
kane, Cycloalkene, Cycloalkine, und Heterocyclen wie 5- oder 6- Ringheterocyclen umfassen
den Gruppe ausgewählt ist umfaßt. Vorzugsweise kann die substituierte Boronsäure-Gruppe
als organischen Rest ein Alkyl des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder unge
sättigten-unverzweigten oder ungesättigt-verzweigten Typs, ein cyclischer Rest des gesättigten
oder aromatischen Typs wie Phenylboronsäure-Gruppen sein.
Da Zellen, wie z. B. Pflanzenzellen eine Vielzahl von polymeren Kohlenhydraten mit freien,
vicinalen Diolgruppen enthalten, ist eine gezielte Markierung mit Borsäurederivaten möglich.
Ein weiterer, neben der unerwartet hohen Stabilität der Bindung, hervorzuhebender Vorteil
gegenüber gängigen Immobilisierungsmethoden ist die sehr schonende Kopplungschemie, die
es überraschenderweise erlaubt, z. B. bei pH 7.0 und in physiologischen Puffersystemen Mar
kierungen durchzuführen.
Cyclische Borsäureester sind als Schutzgruppen in der Organischen Synthesechemie be
kannt (Th. W. Greene; P.G.M. Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition,
John Wiley & Sons, 1991, S. 141 ff). Völlig neu aber ist der Einsatz von Borsäure-Derivaten
zur gezielten Immobilisierung von analytischen Sonden an z. B. Zellkompartimente. Die überra
schenderweise sehr selektive Kopplungschemie eröffnet ein nicht vorhersehbares, außerordent
lich breites Anwendungsspektrum. Das chemoselektive Reaktionsverhalten dieser Borsäure-
Derivate erlaubt es, neuartige Verbindungen herzustellen, die z. B. für die kompartimentspezifi
sche Markierung von Pflanzenzellwänden bedeutsam werden können. Es ist literaturbekannt,
daß die Molekülgröße maßgeblich die Eindringtiefe in Geweben bestimmt. Darüberhinaus ist
bekannt, daß viele Zellkompartimente von Membranen umgeben sind, die nur Moleküle bis zu
einen bestimmten Molekulargewicht wie z. B. 10 kD passieren lassen. Maßgeschneiderte Son
den mit unterschiedlichen Molekulargewichten machen so eine kompartimentspezifische Mar
kierung möglich, die zum Studium von Membraneigenschaften, wie z. B. pH-Messung und/
oder auch Messung von Ionenströmen, wie z. B. Fe2+/Fe3+-Transport geeignet sind. Außerdem
ist es möglich, verschiedene analytische Sonden miteinander zu kombinieren, um verschiedenen
Parameter wie z. B. pH-Wert und Fe3+-Konzentration gleichzeitig zu quantifizieren.
Abb. 1 zeigen beispielhaft: das Reaktionsverhalten einer maßgeschneiderten Sonde
in
Fig. 1a) die substituierte biospezifische Verbindung hier Fluorescein-Boronsäure-
Derivat (hier Addukt 1)
b) das stabile Fluorescein-Boronsäureester-Derivat (hier Addukt 2).
b) das stabile Fluorescein-Boronsäureester-Derivat (hier Addukt 2).
Das Fluorescein-Boronsäure Addukt 1 (Abb. 1a) kann mit benachbarten Hydroxyl
gruppen von z. B. Zellwänden unter physiologischen Bedingungen zum stabilen cyclischen Bo
ronsäureester-Derivat 2 (Abb. 1b) unter Wasserabspaltung regieren. Das so gebundene
Fluorescein stellt eine analytische Sonde für die H⁺-Ionen Konzentration dar, da diese Verbin
dung eine pH-abhängige Fluoreszens aufweist.
Das nachfolgende Ausführungsbeispiel zeigt lediglich eine Ausgestaltung der Erfindung.
0.173 g (0.001 Mol) Aminobenzolboronsäure-Hydrochlorid (Fa. Aldrich) und 0.389 g
(0.001 Mol) Fluoresceinisothiocyanat (=FITC) (Fa. Aldrich) werden in 20 ml Dimethylforma
mid eingerührt und 1 Äquivalent Triethylamin hinzugefügt. Nach 5 h wird das Addukt 1 in
Ether gefallt, mit Ether gewaschen und anschließend getrocknet. Ausbeute: 0.5 g (93%).
HPLC: Rt: = 27.5 min; 0.01 M Ammoniumformiat pH 5, Methanol; 100 bis 0% (30 min).
HPLC: Rt: = 27.5 min; 0.01 M Ammoniumformiat pH 5, Methanol; 100 bis 0% (30 min).
Herstellung des Adduktes 2 (Abb. 1b; FITC-Markierung von Pflanzenzellen): Ausgesuch
te Wurzeln von 2 Wochen alten prekultivierten Weizenkeimen wurden auf Objektträger pla
ziert und anschließend sofort mit 2% Agarnährlösung (PBS= Phosphat gepufferte Kochsalz-
Lösung) bedeckt. Proben dieser Zellen wurden bei verschiedenen Temperaturen mit unter
schiedlich konzentrierten Lösungen vom Addukt 1 (10-100 Mmolar in PBS) und als Kontrolle
mit dem entsprechenden nicht derivatisiertem Fluorescein für 1 bis 12 h im dunkeln inkubiert.
Danach wurden die Proben nach ausgiebigem Waschen mit einem konfokalen Lasermikroskop
(Anregung 490 nm, Fluoreszens bei 600 nm) miteinander verglichen. Die Proben, die mit dem
Addukt 1 inkubiert wurden, zeigten ein stabiles Fluoreszenssignal. Im Gegensatz dazu wiesen
die Proben, die mit nicht markiertem FITC behandelt wurden keine stabile Fluoreszens auf
Abb. 1 zeigt beispielhaft das Reaktionsverhalten einer maßgeschneiderten Sonde.
Claims (21)
1. Boronsäure-Derivate der Formel (Z)k Y-B (OH)2, dadurch gekennzeichnet, daß
Y: ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, ist, sowie
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung ist, an welcher vorzugsweise ein oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
sind, worin L gleich T oder Z, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH- Gruppen aufweist,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen sind, und
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Y: ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, ist, sowie
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung ist, an welcher vorzugsweise ein oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
sind, worin L gleich T oder Z, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH- Gruppen aufweist,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen sind, und
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
2. Boronsäure-Derivate der Formel Z-Y-B (OH)2 nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß
Y: 1,3-Phenylen sowie
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung sind.
Y: 1,3-Phenylen sowie
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung sind.
3. Boronsäure-Derivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die biospezi
fische Verbindung mindestens ein Vertreter der eine biologisch wirksame Verbindung, eine
pharmazeutisch wirksame Verbindung, eine biochemisch wirksame Verbindung und eine
diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist.
4. Boronsäure-Derivate nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch wirk
same Verbindung Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide ist.
5. Boronsäure-Derivate nach Anspruch 3 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die pharma
zeutisch wirksame Verbindung ein Antibiotikum oder Antimykotikum ist.
6. Boronsäure-Derivate nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der
polymere Trägerrest Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebe
schnitten oder dergleichen ist.
7. Boronsäureester-Derivate der Formel [(Z)kY-B]mC, dadurch gekennzeichnet, daß
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere ein Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
sind, worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierten oder unsubstituierten OH- Gruppen aufweist,
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2- Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere ein Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
sind, worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierten oder unsubstituierten OH- Gruppen aufweist,
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
8. Boronsäureester-Derivate der Formel (Z)k Y-B C nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
k eine ganze Zahl von 1 bis 5,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen,
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
sind, worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH- Gruppen aufweist,
k eine ganze Zahl von 1 bis 5,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen,
E: -B(OH)2oder-O-B(OH)2 oder
sind, worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH- Gruppen aufweist,
9. Boronsäureester-Derivate der Formel Z-Y-B C nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß
T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen, 1,3-Phenylen und
Z eine substituierte biospezifische Verbindung sind.
T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen, 1,3-Phenylen und
Z eine substituierte biospezifische Verbindung sind.
10. Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die biospezifische Verbindung mindestens ein Vertreter der eine biologisch wirksame
Verbindung, eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, eine biochemisch wirksame Ver
bindung und eine diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist.
11. Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
daß die biologisch wirksame Verbindung Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide ist.
12. Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß die pharmazeutisch wirksame Verbindung ein Antibiotikum oder Antimykotikum ist.
13. Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet,
daß der polymere Trägerrest Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe,
Gewebeschnitten oder dergleichen ist.
14. Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
daß die biospezifische Verbindung mindestens ein Farbstoff, vorzugsweise substituiertes
Fluorescein, ist.
15. Verfahren zur Herstellung der Boronsäure-Derivate nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zur
schonenden Markierung von, vorzugsweise polymeren, Trägern mit biospezifischen Ver
bindungen, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure-Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel und einer Base, vor zugsweise Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
- b) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird und
- c) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird.
16. Verfahren zur Herstellung der Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 7 bis
14, zur schonenden Markierung von, vorzugsweise polymeren, Trägern mit biospezifi
schen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure-Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel und einer Base, vor zugsweise Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
- c) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird,
- d) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird und
- e) anschließend mit einem, vorzugsweise polymeren, Träger mit benachbarten Hydroxyl- Gruppen, vorzugsweise bei Raumtemperatur, bei pH 6 bis 8, vorzugsweise pH 7, verestert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß 0.1 bis 40 mMol,
vorzugsweise 1 bis 20 mMol, am bevorzugtesten 0.5 bis 5 mMol, biospezifische Verbin
dung in einem Ansatz mit 0.1 bis 40 mMol, vorzugsweise 1 bis 20 mMol, am bevorzugte
sten 0.5 bis 5 mMol, substituiertes Boronsäure-Derivat in 5 bis 40 ml polarem Lösungs
mittel und 0.1 bis 10, bevorzugterweise 1 bis 5, Äquivalent Triethylamin 1 bis 5 Stunden
lang inkubiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß 1 mMol biospezifische Ver
bindung in einem Ansatz mit 1 mMol substituiertes Boronsäure-Derivat in 20 ml polarem
Lösungsmittel und 1 Äquivalent Triethylamin 5 Stunden lang inkubiert wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als polares
Lösungsmittel Dimethylformamid verwendet wird.
20. Verwendung der Boronsäure-Derivate nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als biologisch
wirksame Verbindung, als biochemisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame
Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung.
21. Verwendung der Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 7 bis 14 als biolo
gisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksa
me Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung.
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