DE19636797C2

DE19636797C2 - Geometrie eines höchstauflösenden linearen Flugzeitmassenspektrometers

Info

Publication number: DE19636797C2
Application number: DE19636797A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 2003-04-10
Anticipated expiration: 2016-09-12
Also published as: GB2317266A; DE19636797A1; US5898174A; GB9719246D0; GB2317266B

Description

Die Erfindung betrifft ein lineares Flugzeitmassenspektrometer, das mit einer Ionisierung oberflächlich adsorbierter Analytsubstanzen und einer Verbesserung der Massenauflösung durch zeitlich verzögerten Einsatz der Ionenbeschleunigung im Raum vor dem Probenträger arbeitet. Im besonderen betrifft es die geometrische Ausbildung des Massenspektrometers für höchste Massenauflösung im Spektrum.

Die Erfindung besteht darin, die Flugzeit der Ionen dadurch in zweiter oder höherer Ordnung zu fokussieren, daß geometrische Bedingungen für die Längen von Beschleunigungsstrecken in der Ionenquelle und der feldfreien Flugstrecke untereinander eingehalten werden. In Com putersimulationen werden unter Voraussetzung einer Korrelation von Raum- und Geschwindigkeitsverteilung beim Einschalten der Beschleunigung selbst für sehr hohe Ionen massen Auflösungen der Flugzeit von über einer Million erhalten.

Allgemeiner Stand der Technik

Eine Fokussierung zweiter Ordnung in bezug auf variierende Anfangsgeschwindigkeiten ist für ein lineares Massenspektrometer mit zeitlich verzögerter Beschleunigung nicht explizit bekannt geworden. Es sind jedoch in der Veröffentlichung "Space-Velocity Correlation Focu sing" von S. M. Colby und J. P. Reilly, Anal. Chem. 1996, 68, 1419-1428, Kurven der Ab weichungen der Flugzeiten für variierende Anfangsgeschwindigkeiten dargestellt, die auf eine Fokussierung zweiter Ordnung hinweisen, ohne daß jedoch die Autoren sie als solche be zeichnet haben. Diese Kurven wurden durch Simulationsprogramme berechnet, deren Grund lagen jedoch nicht so ausführlich dargestellt wurden, daß sie sich ohne weitere Erläuterungen seitens der Autoren nachprüfen lassen. Basis der Simulationen ist eine strenge Korrelation von Raum- und Geschwindigkeitsverteilung der Ionen beim Einschalten der Beschleunigung, wie sie seit langem üblicherweise für den MALDI-Prozess der Ionisierung angenommen wird.

Da es sich in der Veröffentlichung um ein ungewöhnliches, sehr kurzes Massenspektrometer mit zwei weiteren Nachbeschleunigungsstrecken nach der feldfreien Flugstrecke handelt, liegt der Verdacht nahe, daß die Kombination von insgesamt vier Beschleunigungsstrecken, eine davon mit verzögert einschaltender Beschleunigung, diese Art der Fokussierung bewirkt. Die Spannungen wurden nach dem Einschalten der Beschleunigung nicht zeitlich verändert, außer einer Untersuchung eines Einschaltens mit endlicher Anstiegszeit, die jedoch nach Aussage der Autoren keine wesentliche Änderung der Fokussierung bewirkt. Aussagen über die Ursa chen der guten Fokussierung oder eine systematische Untersuchung der geometrischen und elektrischen Parameterbereiche für eine gute Fokussierung sind in der Veröffentlichung nicht enthalten.

Für die stationäre, ungeschaltete Beschleunigung in zwei aufeinanderfolgenden Beschleuni gungsstrecken mit anschließender feldfreier Flugstrecke ist das Auftreten einer Fokussierung zweiter Ordnung der Ionen in bezug auf eine Ortsverteilung der entstehenden Ionen bekannt, beispielseise in F. Chandezon et al., Rev, Sci. Instrum. 65 (1994) 3344-3353 "A new-regime Wiley-McLaren time-of-flight mass spectrometer" oder in P. Piseri et al., Int. J. of Mass Spec trom. And Ion Processes 153 (1994) 23-28 "Parameterization of a two-stage mass spec trometer performing second-order space focusing". Diese Fokussierung zweiter Ordnung tritt nur unter geometrisch eingeschränkten Bedingungen auf.

In der älteren Patentanmeldung, die zur DE 196 35 643 A1 geführt hat, wird die Fokussierung zweiter Ordnung durch ein zeitlich nach dem Einschalten variierendes Beschleunigungsfeld beschrieben, die praktisch für alle bekannt gewordenen geometrischen Ausbildungen von Flugzeitmassenspektrometern angewandt werden kann.

Unter den Verfahren zur Ionisierung von großmolekularen Substanzen auf Probenträgern hat die matrixunterstützte Desorption durch einen Laserblitz (MALDI = matrix assisted laser de sorption and ionization) weiteste Verbreitung gefunden. Die Ionen haben nach Verlassen der Oberfläche in der Regel eine nicht vernachlässigbare mittlere Geschwindigkeit, die weitge hend für Ionen aller Massen gleich ist, und eine starke Streuung um die mittlere Geschwin digkeit. Die mittlere Geschwindigkeit führt zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Flug zeit und Wurzel aus der Masse, also der Massenskala. Die Streuung führt zu einer Unschärfe beim Messen der Signale der einzelnen Ionenmassen, also zu einem schlechten Massenauflö sungsvermögen; es ist jedoch seit langem ein Verfahren bekannt, diese Unschärfe wieder zu fokussieren. Für normale lineare Flugzeitmassenspektrometer (einschließlich aller kommer ziell erhältlichen) ergibt sich dabei eine Fokussierung erster Ordnung.

Ähnliche Verhältnisse gelten aber auch für andere Verfahren der Ionisierung von Substanzen, die auf einer Oberfläche aufgebracht sind. Beispiele dafür sind die Sekundärelektronenmas senspektrometrie (SIMS), die normale Laserdesorption (LD) oder die sogenannte Plasmade sorption (PD), die durch hochenergetische Spaltungsprodukte an dünnen Folien erhalten wird.

Für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) werden die großen Probenmoleküle auf einem Probenträger in oder auf eine Schicht einer niedermolekularen Matrixsubstanz gelagert. Ein Lichtpuls von wenigen Nanosekunden Dauer aus einem Laser, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird, verdampft in einem quasi-explosiven Prozess eine geringe Menge der Matrixsubstanz, wobei auch die Probenmoleküle in die zunächst win zige Dampfwolke überführt werden.

Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdeh nung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Probensubstanz, die dabei höhere kinetische Energien erhal ten, als sie dem thermischen Gleichgewicht entsprächen. Selbst ohne ein beschleunigendes Feld erreichen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 500 bis 700 Metern pro Sekun de, abhängig von der Energiedichte des Laserstrahls; die Geschwindigkeiten sind dabei weitgehend unabhängig von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwin digkeitsstreuung, die von etwa 200 bis zu 1200 Metern pro Sekunde reicht.

Die Ionen werden in der Ionenquelle mit elektrischen Feldern auf Energien von rund 5 bis 30 keV beschleunigt, in die Flugstrecke des Massenspektrometers eingeschossen und am Ende der Flugstrecke zeitaufgelöst detektiert. Aus ihrer Flugzeit kann ihr Masse-zu- Ladungsverhältnis bestimmt werden. Um zu guten Meßbedinungen und guten Massenauflö sungen zu kommen, macht man die Flugstrecke möglichst lang; es sind Flugzeitmas senspektrometer mit Flugstrecken bis zu sechs Metern kommerziell erhältlich. Da die Art der Ionisierung praktisch nur einfach geladene Ionen liefert, wird im Folgenden meist nur von der Massenbestimmung gesprochen, nicht von der Bestimmung des Masse-zu- Ladungsverhältnisses.

Die Umrechnung der Flugzeiten in Massen wird über eine Kalibrierkurve vorgenommen, die als tabellarische Punktfolge im Speicher des Datenverarbeitungssystems abgelegt sein kann, sie kann aber auch in Form von Parameterwerten für eine mathematische Funktion der Masse in Abhängigkeit von der Flugzeit gespeichert werden. Bedingt durch die mittlere Anfangsge schwindigkeit der Ionen ist die Beziehung zwischen Masse und Flugzeitquadrat nichtlinear, die Bestimmung der Masse aus der Flugzeit ist daher nicht trivial. Alle Einflüsse auf die mitt lere Anfangsgeschwindigkeit, wie Laserenergie, Laserfokussierung, MALDI-Präparation, än dern zudem die Beziehung zwischen Flugzeit und Masse.

Für die Massenbestimmung muß die Flugzeit t auf Bruchteile einer Nanosekunde genau be stimmt werden. Da das Massensignal als Linienprofil vorliegt, wird üblicherweise eine Schwerpunktsbildung dieses Linienprofils für die genaue Bestimmung der Flugzeit herange zogen. Das Linienprofil wird nach heutiger Technik durch einen Transientenrekorder mit 1 oder 2 Gigahertz abgetastet. Transientenrekorder mit 4 und 10 Gigahertz Abtastrate befinden sich in der Entwicklung. In der Regel werden die Messungen aus mehreren Meßzyklen aufad diert, bevor die Schwerpunktsbildung vorgenommen wird.

Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der Probenmoleküle, ionisiert. Aber auch während der explosiven Ausdeh nung der Dampfwolke findet durch weitere Ionen-Molekül-Reaktionen eine fortlaufende Ioni sierung der großen Moleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt. Die große Streuung der Geschwindigkeiten und der zeitverschmierte Bildungsprozess der Ionen beeinträchtigen und begrenzen die Massenauflösung sowohl von linearen wie auch von energiefossierend re flektierenden Flugzeitmassenspektrometern, wenn keine besonderen Maßnahmen getroffen werden.

Es ist jedoch ein Verfahren für eine Erhöhung des Massenauflösungsvermögens unter diesen Bedingungen bekannt. Dieses Verfahren beruht darauf, daß bei allen Desorptionsverfahren eine Korrelation zwischen der Raum- und der Geschwindigkeitsverteilung gegeben ist, wenn sich die Ionen zunächst in einem feldfreien Raum ausbreiten konnten.

Die Ionen der Wolke werden daher zunächst für eine kurze Zeit τ in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleunigung fliegen gelassen. Die schnelleren Ionen entfernen sich dabei weiter von der Probenträgerelektrode als die langsamen, aus der Geschwindigkeitsver teilung der Ionen ergibt sich dabei eine Ortsverteilung. Erst dann wird die Beschleunigung der Ionen durch ein zeitlich konstantes homogenes Beschleunigungsfeld, also mit einem räumlich linear abfallenden Beschleunigungspotential, eingeschaltet. Die schnelleren Ionen befinden sich dann weiter von der Probenträger-Elektrode entfernt, somit auf einem etwas geringeren Beschleunigungspotential, das ihnen eine etwas geringere Endgeschwindigkeit für die Drift strecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu Beginn langsameren Ionen. Bei richti ger Wahl der Verzögerungszeit τ und des Potentialabfalls (also der Stärke des Beschleuni gungsfeldes) können die zu Beginn langsameren, aber nach Beschleunigung schnelleren Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung langsameren Ionen genau am Detektor wieder einholen. Es werden somit Ionen am Ort des Detektors in bezug auf die Masse disper giert, aber bei gleicher Masse in bezug auf die Flugzeit wieder fokussiert. Damit erreicht man eine relativ hohe Massenauflösung selbst in einem linearen Flugzeitmassenspektrometer. Es gibt ein analoges Verfahren für Flugzeitspektrometer mit Reflektoren.

Das verzögerte Einschalten der Beschleunigung ist nach heutiger Technik nicht mit einem Schalten der gesamten Beschleunigungsspannung U verbunden. Es ist nicht nur so, daß die Schaltung so hoher Spannungen in extrem kurzen Zeiten von wenigen Nanosekunden auch heute noch fast unerreichbar und mit hohen Kosten verbunden ist, sondern die Einführung einer Zwischenblende führt auch zu besseren Fokussierungen.

Man kommt also mit dem Schalten einer Teilbeschleunigungsspannung U₁ aus, indem man in die Beschleunigungsstrecke eine Zwischenelektrode einbaut. Es braucht dann nur der Raum zwischen Probenträgerelektrode und Zwischenelektrode, die einen relativ geringen Abstand d₁ voneinander haben, zunächst feldfrei sein und nach Zeitverzögerung in ein Beschleu nigungsfeld der Stärke U₁/d₁ umgeschaltet werden. Der Abstand d₁ des Probenträgers zur Zwischenelektrode soll möglichst klein sein, um möglichst geringe Spannungen U₁ schalten zu können. Es besteht eine Untergrenze für diesen Abstand bei etwa zwei Millimeter, der aber für praktische Konstruktionen von Ionenquellen kaum infrage kommt. In der Praxis beträgt dieser Abstand d₁ etwa drei Millimeter.

Eine Ionenquelle für verzögert einschaltende Beschleunigung besitzt also in der Regel min destens eine Zwischenblende zwischen dem Probenträger und der Grundelektrode, die sich auf dem Potential der feldfreien Flugstrecke befindet. Die Ionenquelle wird also mit mindes tens zwei Beschleunigungsspannungen betrieben, von denen die erste zwischen dem Proben träger und der ersten Zwischenelektrode, und die letzte zwischen der letzten Zwischenelektro de und der Grundelektrode angelegt ist. Normalerweise wird nur eine Zwischenelektrode ver wendet, dementsprechend gibt es dann zwei Beschleunigungsspannungen.

Das Verfahren der verzögert einsetzenden Beschleunigung hat jedoch auch Nachteile. So lie fert es das optimale Massenauflösungsvermögen nur in einem schmalen Massenbereich. In den anderen Teilen des gesamten Spektrums ist das Auflösungsvermögen zwar immer noch deutlich verbessert, doch nicht bis zum optimalen Grenzwert. Dieser Bereich optimaler Auflö sung kann aber durch Änderungen der Verzögerungszeit τ oder durch Änderungen der Teilbe schleunigungsspannung U₁ auf eine beliebige Stelle des Massenbereichs verschoben werden, so daß dieser Nachteil nicht zu schwer wiegt.

Das gilt nicht für einen weiteren, ganz entscheidenden Nachteil für genaue Massenbestim mungen im höheren Massenbereich: Das optimale Massenauflösungsvermögen nimmt zu hö heren Massen hin schnell ab. Aus Gründen der Fokussierung der Anfangsionengeschwindig keit in erster Ordnung ist das Massenauflösungsvermögen von der Geschwindigkeitsstreubrei te der Ionen vor dem Probenträger abhängig. Für eine Geschwindigkeitsverteilung zwischen 0 und 1200 Metern pro Sekunde ist die Massenauflösung bei Vorliegen einer Fokussierung ers ter Ordnung nach einer durch Simulationen ermittelten Faustregel auf maximale Werte von etwa R_m = 40000000 u/m beschränkt. Diese Regel ist im wesentlichen von der Länge der Flugstrecke, also von der Größe des Massenspektrometers, unabhängig.

Unter Massenauflösung wird hier, abweichend von der üblichen Definition, die Flugzeit der Ionen geteilt durch die volle Linienbreite am Fuß der Linie (gemessen in denselben Zeitein heiten) verstanden, nicht durch die übliche Breite in halber Höhe. Für Ionen der Masse m = 1000 u wird somit ein Auflösungvermögen von etwa R_m = 40000 erreicht, das aber für Ionen der Masse m = 8000 u schon auf R_m = 5000 abfällt. Das bedeutet, daß sich zwei Ionen der Massen m₁ = 8000 u und m₂ = 8001 u nicht mehr voneinander trennen lassen. Zu höheren Massen hin können also die bekannten Isotopenmuster organischer Ionen keinesfalls mehr aufgelöst werden. In der Praxis sehen diese Werte noch etwas schlechter aus.

Das schlechte Massenauflösungsvermögen für Ionen höherer Masse führt auch zu einem schlechteren Verhältnis des Signals zum Rauschen, und damit zu einer schlechteren Empfind lichkeit und zu einem schlechteren Nachweisvermögen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ausgehend vom bekannten linearen Massenspektrometer nach S. M. Colby und J. P. Reilly (Zitat oben) besonders im höheren Massenbereich das er zielbare Massenauflösungsvermögen linearer Flugzeitmassenspektrometer deutlich zu verbes sern.

Erfindungsgedanke

Die Aufgabe wird für ein lineares Flugzeitmassenspektrometer mit einer Probenträgerelektro de (1), einer Zwischenelektrode (2), einer Grundelektrode (3) und einem Detektor (10), die eine erste Ionenbeschleunigungsstrecke der Länge d₁ zwischen der Probenträgerelektrode (1) und der Zwischenelektrode (2), eine zweite Ionenbeschleunigungsstrecke der Länge d₂ zwi schen der Zwischenelektrode (2) und der Grundelektrode (3) und eine Flugstrecke der Länge d₃ zwischen der Grundelektrode (3) und dem Detektor (10) definieren, durch Einhaltung der Ungleichungen

½ < (d₁ + d₂)/d₃ < d₃/8 und

1/60 < d₁/d₂ < 1/10

für die Längen der Strecken d₁, d₂ und d₃ gelöst.

Eine systematische Untersuchung der Fokussierung durch verzögertes Einschalten der Be schleunigung hat ergeben, daß es innerhalb bestimmter geometrischer Bedingungen eine Fo kussierung zweiter oder sogar dritter Ordnung gibt. Die geometrischen Bedingungen sind für heutige Massenspektrometer ungewöhnlich. Diese Bedingungen lassen sich sehr schwer ana lytisch ableiten, daher ist es einfacher, sie anhand von Simulationsrechnungen zu erforschen. Untersucht wurde dabei ein sehr einfaches Flugzeitmassenspektrometer mit zwei homogenen Beschleunigungsstrecken und einer anschließenden feldfreien Flugstrecke. Praktisch alle kom merziellen Massenspektrometer haben im Prinzip diesen einfachen Aufbau, wenn sie auch nicht im geometrischen Parameterbereich für Fokussierungen höherer Ordnung liegen.

An die feldfreie Flugstrecke anschließende weitere Nachbeschleunigungen haben keinen Einfluß auf Auflösung und Fokussierung.

Zunächst bedarf es dabei einer Charakterisierung der Ordnung einer Fokussierung. Diese ist von erster Ordnung, wenn die Abweichungen der Flugzeiten von Ionen verschiedener An fangsgeschwindigkeiten aufgetragen über der Anfangsgeschwindigkeit eine Parabel ergeben, deren Scheitelpunkt bei der mittleren Geschwindigkeit liegt. Sie ist von zweiter Ordnung, wenn diese Kurve eine Kurve dritter Ordnung ist, deren Wendepunkt bei der mittleren Ge schwindigkeit liegt. Analoges gilt für den Fokuspunkt dritter Ordnung. Diese Charakterisie rungen ergeben sich aus den Definitionen der Ordnungen als Nullstellen der entsprechenden Ableitungen.

In den Untersuchungen konnte zunächst ermittelt werden, daß eine Fokussierung zweiter Ord nung im wesentlichen nur dann möglich ist, wenn die Summe aus den beiden Beschleunigungsstrecken d₁ + d₂ größer ist als ein Achtel der feldfreien Flugstrecke d₃. Kein bis heute bekannt gewordenes Flugzeitspektrometer genügt dieser Bedingung.

Es gibt in Grenzbereichen der Verhältnisse d₁/d₂ Ausnahmen von der hier aufgestellten Regel (so auch in der oben zitierten Veröffentlichung), doch sind diese Lösungen anderweitig un günstig. Das Optimum der Fokussierung liegt im Bereich d₃/4 ≦ (d₁ + d₂) ≦ d₃/2. Ist die Be schleunigungsstrecke größer als die halbe feldfreie Flugstrecke, so ergeben sich keine Fokus sierungen zweiter Ordnung mehr.

Es ist nun der Grundanspruch der Erfindung, ein Flugzeitmassenspektrometer so zu bauen, daß es diesen Anforderungen genügt.

Damit wird aber die Beschleunigungsstrecke im allgemeinen sehr lang. Ihr Feld muß daher (wie es üblicherweise schon für Reflektoren getan wird) durch Homogenisierungsblenden gestützt werden. Die Homogenisierungsblenden werden über einen Spannungsteiler mit Span nungen so versorgt, daß ein möglichst konstantes Feld im Inneren entsteht.

Aus den Untersuchungen geht weiterhin hervor, daß die durch die Fokussierungen gegebenen Auflösungsvermögen besser sind, wenn die erste Beschleunigungsstrecke d₁ relativ klein ist gegenüber der zweiten Beschleunigungsstrecke d₂. Es gibt hier sogar - bei relativ kleinen Län gen d₁ der Beschleunigungsstrecke - ein Optimum mit einer Fokussierung dritter Ordnung, die jedoch massenabhängig ist.

Es ist damit ein weiterer Anspruch der Erfindung, das Massenspektrometer so zu bauen, daß die erste Beschleunigungsstrecke d₁ kleiner ist als ein Zehntel der Beschleunigungsstrecke d₂. Das Optimum liegt etwa im Bereich d₂/60 < d₁ < d₂/20.

Für bestimmte Verhältnisse der Längen d₁, d₂ und d₃ ergeben sich Fokussierungspunkte dritter Ordnung bei einer Masse. Diese schärfsten Massensignale höchster Flugzeitauflösung (und daher auch Massenauflösung) lassen sich durch leichte Variationen der Verhältnisse über den Massenbereich verschieben. Dabei ergibt es sich, daß unterhalb dieser Masse, für die eine Fokussierung dritter Ordnung geometrisch eingestellt wurde, auch die durch rein elektrische Veränderungen einstellbaren Fokuspunkte zweiter Ordnung ebenfalls ungewöhnlich hohe Auflösungen aufweisen.

Es ist daher ein weiterer Anspruch der Erfindung, die geometrischen Verhältnisse so zu wäh len, daß für die obere Grenze des interessierenden Massenbereichs eine Fokussierung dritter Ordnung erzielt wird. Reicht beipielsweise der interessierende Massenbereich bis 32000 u, so kann man mit dem Verhältnis d₁ : d₂ : d₃ = 9 : 200 : 550 (erstes Beispiel) den Fokuspunkt drit ter Ordnung auf die Masse 32000 u schieben, und erhält dort - bei etwa 30 Kilovolt gesamter Beschleunigungsspannung - eine theoretische Flugzeitauflösung von etwa R_t = 900000. Die ses Verhältnis ist jedoch nicht das einzige, das eine optimale Auflösung bei Masse 32000 u schafft. Mit dem Verhältnis d₁ : d₂ : d₃ = 5 : 244 : 550 (zweites Beispiel) erreicht man sogar eine Flugzeitauflösung von einer Million bei Masse 32000 u. Die Auflösungen sind für die sen theoretischen Fall einer streng erfüllten Korrelation zwischen Raumverteilung und Ge schwindigkeitsverteilung völlig unabhängig von der absoluten Größe des Spektrometers, es kommt nur auf die geometrischen Verhältnisse an.

Setzt man diese geometrischen Verhältnisse in einem massenspektrometrischen Apparat fest, so können für alle Massen unterhalb dieser Grenzmasse durch rein elektrische Einstellungen noch bessere Auflösungen durch Fokussierung zweiter Ordnung erzielt werden. Die elektri schen Einstellungen beziehen sich dabei auf die Verzögerungszeit τ und die erste Beschleuni gungsspannung U₁.

Reicht der interessierende Massenbereich nur bis 16000 u, so kann man mit den nur leicht veränderten Verhältnissen d₁ : d₂ : d₃ = 8 : 200 : 550 (für das erste Beispiel) oder d₁ : d₂ : d₃ = 4,45 : 244 : 550 (für das zweite Beispiel) den Fokuspunkt dritter Ordnung zu dieser Masse schieben, und erhält im ganzen interessierenden Massenbereich elektrisch einstellbare Zeitauf lösungen über 4 Millionen.

Die durch die Verhältnisse des zweiten Beispiels vorgegebene kurze erste Beschleunigungs strecke d₁ ist sehr günstig:

- Zum einen braucht das Feld nicht durch Zusatzblenden homogenisiert zu werden. Das kommt vor allem dem Schalten der Beschleunigungsspannung zugute, das für einen schnellen Schaltvorgang eine geringe elektrische Kapazität braucht.
- Zum zweiten wird dadurch die zu schaltendende Beschleunigungsspannung geringer. Diese ist der Strecke d₁ proportional.
- Drittens aber wird auch die Verzögerungszeit τ proportional geringer. Damit wird die axia le und vor allem laterale Ausdehnung der Dampf- und Ionenwolke kleiner, und die räumli che Fokussierung der lateral wegfliegenden Ionen gelingt besser.

Es ist daher alles daranzusetzen, die erste Beschleunigungsstrecke so kurz wie nur möglich zu machen. Für die Beschleunigungsstrecke d₁ existiert aber auch eine untere Grenze. Wird sie zu klein (etwa bei d₁ : d₂ : d₃ = 4,3 : 250 : 550), so stößt die sich ausdehnende Ionenwolke innerhalb der optimal einzustellenden Verzögerungszeit für schwere Ionenmassen an die Zwi schenblende. Dieser Fall kann daher praktisch nicht benutzt werden.

Es ist daher ein weiterer Anspruch dieser Erfindung, ein Massenspektrometer mit den optima len Verhältnissen d₁ : d₂ : d₃ = 5 (±20%) : 244 (±10%) : 550 zu bauen.

Für das elektrische Einstellen der optimalen Fokuspunkte zweiter Ordnung über den Massen bereich genügen zwei Einstellparameter. Es hat sich als günstig herausgestellt, dabei nur die Verzögerungszeit τ und die erste Beschleunigungsspannung U₁ zu verändern. Dabei wird die Beschleunigungsspannung U₁ nur um etwa 3‰ verändert. Wird diese Beschleunigungs spannung U₁ auf dem optimalen Wert für Masse 32000 u festgehalten, und nur die Verzöge rungszeit τ geändert, so ergeben sich zwar keine Fokussierungen zweiter Ordnung über den ganzen Massenbereich mehr, aber immer noch Auflösungen, die diejenige bei Masse 32000 u übersteigen. Es ist damit also ein Betrieb möglich, in dem für die Verschiebung des Punktes optimaler Schärfe (optimaler Auflösung) nur ein einziger Einstellparameter benötigt wird.

Diese Betriebsweise hat den zusätzlichen Vorteil, daß nicht nur die einmal einkalibrierte Mas senbeziehung von der Einstellung ungestört bleibt, sondern daß die Flugzeit in diesem beson deren Fall praktisch streng proportional zur Wurzel aus der Masse ist. Die Abweichungen von der Proportionalität liegen unterhalb von einem Millionstel der Flugzeit. Damit werden Kalib rierungen der Beziehung von Masse zu Flugzeit außerordentlich einfach. Es ist daher ein weiterer Anspruch dieser Erfindung, den Bereich optimaler Schärfe nur über die Verzögerungszeit zu verschieben, und die Beschleunigungsspannungen (abgesehen vom Einschalten) konstant zu lassen.

Die große Länge der Beschleunigungsstrecken für die Ionen hat aber auch Nachteile. Da die Ionen in der sich explosiv ausbreitenden Dampfwolke erhebliche Lateralgeschwindigkeiten erhalten, divergiert der Ionenstrahl innerhalb der Beschleunigungsstrecken. Es ist daher ein weiterer Anspruch dieser Erfindung, in der zweiten Beschleunigungsstrecke eine ionenopti sche Linse für die Ionen zu integrieren. Diese Linse fokussiert den Ionenstrahl auf den Detek tor, oder parallelisiert den Ionenstrahl. Diese Linse ist bereits dann notwendig, wenn die Zwi schenblende als Gitter ausgebildet ist; bei gitterfreier Ausführung tritt am Eintritt in die zweite Beschleunigungsstrecke eine weitere Defokussierung auf, hier ist also die Linse besonders erforderlich. Da aber am Eintritt in die feldfreie Flugstrecke wiederum eine Defokussierung auftritt, ist hier eine zweite Linse günstig. Diese kann als Einzellinse ausgebildet sein.

Die hier geschilderten Ausführungsformen des Massenspektrometers wurden alle mit nur ei ner Zwischenblende geschildert. Diese Ausführungsform ist besonders einfach und führt be reits zu ausreichenden Auflösungen. Noch höhere Auflösungen werden mit der Einführung weiterer Zwischenblenden mit zugehörigen Potentialen erreicht. Insbesondere kann dadurch ein Massenspektrometer gebaut werden, das strenge Fokussierungen zweiter Ordnung nur durch die Einstellung der Verzögerungszeit τ erzeugt. Es ist daher ein weiterer Anspruch die ser Erfindung, mehr als nur eine Zwischenelektrode zu benutzen.

Beschreibung der Bilder

Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau eines Flugzeitmassenspektrometers mit seinen sche matisch angedeuteten Versorgungseinheiten, wobei hier im Gegensatz zum Stand der Tech nik, wie er in kommerziellen Massenspektrometern vorhanden ist, hier eine lange Beschleuni gungsstrecke mit Homogenisierungsblenden für das Beschleunigungsfeld gezeigt ist. Die Pro benträgerelektrode 1 befindet sich auf dem Beschleunigungspotential U = U₁ + U₂, die Zwi schenelektrode 2 auf dem Potential U₂, die Grundelektrode 3 auf Erdpotential. In der zweiten Beschleunigungsstrecke ist eine erste ionenoptische Linse 13 integriert, in der feldfreien Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10 findet sich eine zweite Linse 4, die als Ionenstrahleinzellinse ausgebildet ist, wobei sich beide Außenblenden auf dem Potential der Flugstreck befinden. Die zweite Beschleunigungsstrecke ist mit den genannten Homogeni sierungsblenden 11 für das Feld bestückt; diese sind über die Widerstände 12 des Spannungs teilers mit den entsprechenden Potentialen versehen.

Die Strecken sind wie folgt definiert:
erste Beschleunigungsstrecke d₁ zwischen Probenträgerelektrode 1 und Zwischenelektrode 2;
zweite Beschleunigungsstrecke d₂ zwischen Zwischenelektrode 2 und Grundelektrode 3;
Flugstrecke d₃ zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10.

Die Beschleunigungsspannung U₁ zwischen Probenträger 1 und Zwischenblende 2 ist schalt bar. Ein Lichtblitz aus dem Laser 5 wird von der Linse 6 in einem konvergenten Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 fokussiert, die sich auf dem Probenträger 1 befindet. Zu dieser Zeit hat die Beschleunigungsspannung den Wert U₁ = 0. Der Lichtblitz erzeugt in einem MALDI-Prozess Ionen der Analytsubstanz mit einer mittleren Anfangsgeschwindigkeit v ≈ 600 Meter pro Se kunde und großer Geschwindigkeitsstreuung. Nach einer Verzögerungszeit τ wird die Be schleunigungsspannung U₁ eingeschaltet; ab dieser Zeit t = τ werden die Ionen beschleunigt. Sie bilden den Strahl 9 des Ionenstromes, der nach Durchlaufen der Flugstrecke zwischen Grundelektrode 3 und Detektor 10 vom Detektor 10 zeitaufgelöst gemessen wird.

Die hier gezeigte Anordnung hat gitterlose Blenden als Zwischenelektrode 2 und Grundelekt rode 3 und braucht daher Linsen 13 und 4 zur Parallelisierung des Ionenstrahls 9. Die Linse 13 fokussiert den wegen seiner lateralen Geschwindigkeitsanteile divergierenden Ionenstrahl, sie wird auch bei Ausführung der Zwischenblende mit einem Gitter gebraucht. In Fig. 1 wird durch die Linse 13 nur eine Teilfokussierung erzeugt. Die Einzellinse 4 fokussiert die Diver genz, die durch die Wirkung der gitterfreien Grundelektrode 3 erzeugt wird; bei Einführung eines Gitters in Grundelektrode 3 kann die Einzellinse 4 entfallen. Allerdings verringern die Zwischengitter wegen ihrer unvermeidlichen Kleinwinkelstreuung die erzielbare Auflösung.

Fig. 2 zeigt ein Diagramm der Flugzeitabweichungen (in ppm der Flugzeit, vertikale Ach sen) aufgetragen über den Anfangsgeschwindigkeiten (in Metern pro Sekunde, horizontale Achse) für eine optimale Einstellung, mit der Ionen im Massenbereich bis 32000 u gemessen werden sollen. Bei der Masse 32000 u ist durch Justierung des Abstandes d₁ eine Fokussie rung dritter Ordnung eingestellt, kenntlich an der Kurve vierter Ordnung. Die zweite Be schleunigungsspannung ist fest auf 27 Kilovolt gesetzt. Die Abstände d₁ : d₂ : d₃ verhalten sich wie 9 : 200 : 550. Die zugehörigen Zeitauflösungen und elektrischen Einstellungen sind wie folgt:

Tabelle 1 (zur Fig. 2 gehörig)

Fokuspunkt dritter Ordnung bei Masse 32000 u

Fig. 3 zeigt ein Diagramm der Flugzeitabweichungen für den Fall, daß nur bis zur Masse 16000 u gemessen werden soll. Es ist daher durch Justierung des Abstands d₁ der Fokuspunkt dritter Ordnung auf die Masse 16000 u gelegt. Die Abstände d₁ : d₂ : d₃ sind nur leicht ver schieden von denen zur Fig. 1, sie verhalten sich wie 8 : 200 : 550. Die zugehörigen Zeitauf lösungen und elektrischen Einstellungen sind wie folgt:

Tabelle 2 (zur Fig. 3 gehörig)

Fokuspunkt dritter Ordnung bei Masse 16000 u

Jenseits der optimalen Masse 16000 u fällt die optimal einstellbare Zeitauflösung schnell ab, obwohl sie immer noch sehr hoch ist.

Fig. 4 zeigt ein Diagramm der Flugzeitabweichungen für den Fall eines sehr kurzen Abstan des d₁. Die Abstände d₁ : d₂ : d₃ verhalten sich wie 5 : 244 : 550. Die zweite Beschleunigungsspannung ist wieder fest auf 27 Kilovolt eingestellt. Die zugehörigen Zeitauflösungen und elektrischen Einstellungen sind wie folgt:

Tabelle 3 (zur Fig. 4 gehörig)

Zeitauflösungen bei minimal kurzem Abstand d₁

Fig. 5 zeigt die Flugzeitabweichungen bei Einstellungen, die nur durch die Zeitverzögerung τ vorgenommen wurden. Die erste Beschleunigungsspannung wurde exakt auf 1086 Volt ein gestellt. Alle Einstellungen sonst wie in Fig. 4. Diese Einstellungen führen nicht mehr über all zu Fokussierungen zweiter Ordnung, jedoch sind die Auflösungen mehr als ausreichend. Es werden für alle Massen Zeitauflösungen über eine Million, Massenauflösungen über 500000 erreicht. In diesem Fall ist die Masse sehr präzise proportional zum Quadrat der Flugzeit, damit wird die Kalibrierung der Massenskala sehr einfach:

Besonders günstige Ausführungsformen

Eine Ausführung eines linearen Flugzeitmassenspektrometer mit Hochauflösung nach dieser Erfindung wird im Prinzip in Fig. 1 gezeigt. Probenträger 1 und Zwischenelektrode 2 haben einen relativ kleinen Abstand d₁ zueinander; das schaltbare Feld braucht keine Homogenisie rungselektroden. Der lange Abstand d₂ zwischen Zwischenelektrode 2 und Grundelektrode 3 dagegen erfordert eine Homogenisierung des Feldes, das durch die Homogenisierungselektro den 11 bewerkstelligt wird. Diese werden in üblicher Weise über den Spannungsteiler mit Widerständen 12 mit Spannung versorgt.

Der lange Beschleunigungsweg würde ohne ein frühzeitige Fokussierung des Ionenstrahls zu einer erheblichen Strahlaufweitung führen, da die Ionen in der explodierenden Substanzwolke Beschleunigungen auch in lateraler Richtung erhalten. Die Anfangsgeschwindigkeiten sind Vektoren, die vom Ursprung der Wolke weg zeigen. Es ist daher günstig, den trotz axialer Beschleunigung divergieren Ionenstrahl so frühzeitig wie möglich zu fokussieren. Diese Fokussierung wird durch die Linse 13 erzeugt, die in die zweite Beschleunigungsstrecke integriert ist. Die Linse beseitigt Divergenzen, die vom Durchgriff des Feldes der zweiten Be schleunigungsstrecke in die feldfreie Flugstrecke erzeugt werden.

Wie oben ausgeführt, liegt die günstigste geometrische Ausformung bei einem Verhältnis der Beschleunigungs- und Flugstrecken von etwa d₁ : d₂ : d₂ : d₃ = 5 : 244 : 550.

Bei Benutzung der oben bereits geschilderten verzögerten dynamischen Beschleunigung be finden sich Probenträgers 1 und Zwischenelektrode 2 zunächst auf dem Potential U₂. Der Pro benträger wird nach der Verzögerungszeit τ von einigen hundert bis tausend Nanosekunden nach ionisierendem Laserblitz auf das Potential U₁ + U₂ heraufgeschaltet.

Bei richtiger Wahl der Verzögerungszeit τ und der Spannungen U₁ und U₂ erzielt man jeweils an einer Masse im Spektrum Hochauflösung durch Fokussierung zweiter Ordnung, bei einer Masse läßt sich sogar Fokussierung dritter Ordnung erreichen. Dabei kann einer der drei Ein stellparameter fest gewählt werden, für die Einstellung der jeweils höchsten Auflösung genü gen zwei der Einstellparameter.

Beim Betrieb mit τ und U₁ ändert sich die Beschleunigungsspannung U₁ nur minimal, man kommt daher mit einer Variation allein der Verzögerungszeit τ aus. Dieser Betrieb, der nicht die sowieso in der Praxis unerreichbaren Höchstauflösungen bringt, hat dennoch unschätzbare Vorteile, da die Beziehung von Masse zu Flugzeit sehr einfach wird: die Masse ist praktisch proportional zum Quadrat der Flugzeit (für die Ionen der Anfangsgeschwindigkeit Null ist diese Bedingung streng erfüllt, für die Ionen mittlerer Anfangsgeschwindigkeit sind geringfü gige Abweichungen unterhalb von einem Millionstel der Masse vorhanden).

Mit dieser Anordnung eines Flugzeitmassenspektrometers können wie gewöhnlich Spektren der Analytsubstanzen aufgenommen werden. Die Spektrenaufnahme beginnt mit der Ionisie rung der Probensubstanzen 8 auf dem Probenträger 1, wobei hier das MALDI-Verfahren zur Ionisierung beschrieben wird. Die Ionen werden durch einen Lichtblitz von etwa 3 bis 5 Na nosekunden Dauer aus dem Laser 5 erzeugt. Gewöhnlich wird UV-Licht mit einer Wellenlän ge von 337 Nanometer aus einem preiswerten Stickstoff-Laser benutzt. Der Lichtblitz ist durch die Linse 6 als konvergenter Lichtstrahl 7 auf die Probe 8 auf der Oberfläche des Pro benträgers 1 fokussiert. Die in der Dampfwolke, die durch den Laserfokus erzeugt wird, ge bildeten Ionen werden nach der Verzögerungszeit τ zunächst im elektrischen Feld U₁/d₁ zwi schen Probenträger 1 und Zwischenelektrode 2 beschleunigt, und dann im elektrischen Feld U₂/d₂ zwischen Zwischenelektrode 2 und Grundelektrode 3. Das zweite Beschleunigungsfeld ist nur etwa halb so stark wie das erste. Der in der gitterfreien Elektrodenanordnung leicht defokussierte Ionenstrahl wird zu Beginn der zweiten Beschleunigungstrecke durch Linse 13, und zu Beginne der Flugstrecke in der Einzellinse 4 auf den Detektor 10 fokussiert. Die flie genden Ionen bilden einen zeitlich stark variierenden Ionenstrom 9, der am Ende der Flugstre cke vom Ionendetektor 10 mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen wird.

Durch den besonderen MALDI-Prozess können Massensignale am Detektor erzeugt werden, die eine zeitliche Breite haben, die weit unter einer Nanosekunde liegen, obwohl der Licht blitz des Lasers eine zeitliche Dauer von 3 bis 5 Nanosekunden hat. (Es existiert eine "virtuel le", sehr scharf definierte Anfangszeit für die adiabatische Expansion).

Der durch den Ionenstrahl gegebene zeitvariable Ionenstrom wird am Detektor gewöhnlich mit einer Abtastrate von 1 oder 2 Gigahertz gemessen und digitalisiert. Transientenrekorder mit noch wesentlich höherer zeitlicher Auflösung werden in Kürze eingesetzt werden können. Üblicherweise werden die zeitgleichen Meßwerte aus mehreren Spektrenaufnahmen addiert, bevor die Massenlinien in den gespeicherten Daten gesucht und über die Datenauswertung von der Zeitskala über die Massenkalibrierkurve in die Massenwerte transformiert werden.

Die Polarität der verwendeten Hochspannung für die Ionenbeschleunigung muß gleich der Polarität der untersuchten Ionen sein: Positive Ionen werden durch einen positiv geladenen Probenträger abgestoßen und beschleunigt, negative Ionen durch einen negativ geladenen Probenträger.

Selbstverständlich kann man das Flugzeitmassenspektrometer auch so betreiben, daß sich die Flugstrecke in einem (nicht in Fig. 1 gezeigten) Rohr befindet, das sich auf dem Beschleuni gungspotential U₁ + U₂ befindet, während der Probenträger 1 auf Erdpotential liegt. In diesem besonderen Fall liegt das Flugrohr auf positivem Potential, wenn negativ geladene Ionen un tersucht werden sollen, und umgekehrt. Dieser Betrieb vereinfacht die Konstruktion der Io nenquelle, da die Isolatoren für den Halter des auswechselbaren Probenträgers 1 entfallen können. In diesem Fall ist es günstig, das Potential der Zwischenelektrode zu schalten und zu variieren.

Der Schärfebereich kann durch Steuerung zweier Einstellparameter, beispielsweise durch die Verzögerungszeit τ und die Beschleunigungsspannung U₁ beliebig verschoben werden. Es ist dabei möglich, die Verschiebung so durchzuführen, daß die einkalibrierte Massenskala gültig bleibt. Dazu ist allerdings die Beschleunigungspannung U₂ in geeigneter Weise ganz schwach mit zu verändern. Wird diese Art der Verschiebung des Schärfebereichs fest in die Rechner steuerung des Massenspektrometers eingebaut und keine andere Steuerung der Verschiebung zugelassen, so schadet diese Verschiebung der Schärfebereichs einer Massenbestimmung nicht, da die Massenskala unter diesen Verhältnissen gültig bleibt.

Günstiger und einfacher ist es jedoch, die oben geschilderte Methode der Schärfeverschiebung allein durch die Verzögerungszeit zu benutzen, da dann die Massenbestimmung aus der Flug zeit besonders einfach wird. Der lineare Zusammenhang zwischen Masse und Flugzeitquadrat führt zu einer Ein-Punkt-Kalibrierung, wenn der Einstazpunkt τ der Beschleunigung genügend gut bekannt ist. Da jedoch in der Praxis ein endlich ausgedehnter Spannungsanstieg vorliegt, die den faktischen Einsatz der Beschleunigung gegenüber dem Einsatz der Steuerung leicht verschiebt, wird in der Praxis eine Zwei-Punkt-Kalibrierung zum Einsatz kommen.

Wird das Massenspektrometer für Zwecke benutzt, bei denen sich der interessierende Mas senbereich extrem verschieben kann, so kann man den Abstand d₁ des Probenträgers von der Zwischenblende variabel justierbar machen, nach Möglichkeit sogar von außerhalb des Vakuumsystems aus. Es ist damit eine Anpassung an extreme Bedingungen möglich.

Die Erfindung ist weniger gur geeignet für Massenspektrometer, die Fragmentionen durch MALDI-erzeugten metastabilen Zerfall messen sollen (PSD = post source decay). Die lange Beschleunigungsstrecke steht dieser Aufgabe entgegen.

Die hier vorgestellte Erfindung ist aber die beste Grundlage für ein Massenspektrometer, das routinemäßig Molekulargewichtsbestimmungen an großen Zahlen von Proben ermöglichen soll. Der Einsatz ist besonders für Produktionskontrollen an Polymeren oder gentechnisch hergestellten Pharmaka, für Genotypisierung, für DNA-Mutationsscreening oder für geneti sche Fingerabdrücke verschiedener Zielrichtungen geeignet. Allen diesen Aufgaben ist ge meinsam, daß die erwarteten Molekulargewichte bekannt sind; das Massenspektrometer kann also für jede Probe so eingestellt werden, daß der Bereich größter Schärfe beim erwarteten Molekulargewicht liegt. Damit ist in diesem Bereich nicht nur die gräßte Massenauflösung gegeben, sondern durch schmale Massensignalprofile auch ein besonders gutes Verhältnis des Signals zum Untergrundrauschen, und dadurch eine besonders tiefe Nachweisgrenze. Die ein fache Bestimmung der Masse aus der Flugzeit kommt extrem hohen Probendurchsätzen ent gegen. Die hohe Auflösung mag im praktischen Betrieb nicht erreicht werden können, doch ist die dadurch erreichte Unabhängigkeit der Flugzeit und damit der Massenbestimmung von der mittleren Geschwindigkeit der Ionen, die sie bei wechselnden Bedingungen für den MALDI- Prozesses bekommen können, außerordentlich wertvoll. Änderungen der Laserenergie oder der Fokussierungsbedingungen des Lasers, Variationen in der Präparation der MALDI- Schichten mit Einflüssen auf die mittlere Geschwindigkeit der Ionen spielen keine Rolle mehr.

Die vorstehenden Aufgaben können besonders gut gemeistert werden, wenn am Ende der feld freien Flugstrecke die interessierenden Molekülionen von Neutralteilchen und Fragmentionen abgetrennt gemessen werden, wie es im Patent DE 196 35 643 C2 beschrieben ist.

Bei der Beschreibung dieser Erfindung wurde das MALDI-Verfahren zur Ionisierung der Sub stanzen auf dem Probenträger angenommen. Ähnliche Verhältnisse ergeben sich aber auch für andere Verfahren der Ionisierung von Substanzen, die auf einer Oberfläche aufgebracht sind. Beispiele dafür sind die Sekundärelektronenmassenspektrometrie (SIMS), die normale Laser desorption (LD) oder die sogenannte Plasmadesorption (PD), die durch hochenergetische Spaltungsprodukte an dünnen Folien erhalten wird. Wenn auch das MALDI-Verfahren in den Mittelpunkt gestellt wurde, ist die Erfindung nicht auf dieses Verfahren allein beschränkt, sondern bezieht sich auf alle Verfahren, mit denen Ionen erzeugt werden, die eine Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten besitzen, auch wenn sie in der Regel nicht so groß ist wie beim MALDI-Prozess.

Claims

1. Lineares Flugzeitmassenspektrometer mit einer Probenträgerelektrode (1), einer Zwi schenelektrode (2), einer Grundelektrode (3) und einem Detektor (10), die eine erste Io nenbeschleunigungsstrecke der Länge d₁ zwischen der Probenträgerelektrode (1) und der Zwischenelektrode (2), eine zweite Ionenbeschleunigungsstrecke der Länge d₂ zwischen der Zwischenelektrode (2) und der Grundelektrode (3) und eine Flugstrecke der Länge d₃ zwischen der Grundelektrode (3) und dem Detektor (10) definieren, dadurch gekennzeichnet, dass für die Längen der Strecken d₁, d₂ und d₃ der Strecken die Ungleichungen
½ < (d₁ + d₂)/d₃ < d₃/8 und
1/60 < d₁/d₂ < 1/10
erfüllt sind.

2. Lineares Flugzeitmassenspektrometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Längen der genannten Strecken d₁ : d₂ : d₃ wie die Zahlen 5 (±20%) : 244 (±10%) : 550 verhalten.

3. Lineares Flugzeitmassenspektrometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in die Flugstrecke der Länge d₃ eine ionenoptische Linse (4) integriert ist.