DE19626830A1 - Konditionales Immortalisationsverfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine - Google Patents
Konditionales Immortalisationsverfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer VakzineInfo
- Publication number
- DE19626830A1 DE19626830A1 DE19626830A DE19626830A DE19626830A1 DE 19626830 A1 DE19626830 A1 DE 19626830A1 DE 19626830 A DE19626830 A DE 19626830A DE 19626830 A DE19626830 A DE 19626830A DE 19626830 A1 DE19626830 A1 DE 19626830A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- construct
- retrovirus
- tumor cells
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 101150072261 large T gene Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 101710200251 Recombinase cre Proteins 0.000 claims description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 5
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 4
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 18
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 abstract description 9
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 description 14
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 208000003362 bronchogenic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 206010006417 Bronchial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229940030547 autologous tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein konditionales Immortalisierungs
verfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine.
Es betrifft ferner ein generelles Verfahren zur Herstellung von
Zellinien aus primären Zellkulturen, z. B. von T-Zellen oder von
dendritischen Zellen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die
Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Internationaler Stand der Wissenschaft und Technik.
Es gibt bereits einige Vorschläge für gentechnisch hergestellte
Tumorzellvakzine (OS DE 44 31 401), ihre Entwicklung basiert auf
der Annahme, daß das Immunsystem gegen Tumorzellen aktiviert
werden kann. Die Etablierung tumorspezifischer T-Zellen, die
Klonierung erster tumorassoziierter Antigene und der Befund, daß
die Sekretion eines einzelnen Zytokins durch Tumorzellen
ausreicht, deren selektive Zerstörung zu induzieren, sprechen
für die Möglichkeit einer tumorspezifischen Immunaktivierung. Da
die molekulare Struktur der meisten Tumorantigene noch unbekannt
ist und "gemeinsame" Tumorantigene bislang eher eine Seltenheit
sind, muß eine spezifische Vakzine auf autologen Tumorzellen
basieren. Für die Durchführung klinischer Vakzinierungsstudien
ist die Transfektion autologer Tumorzellen daher ein kritischer
Parameter. In den USA sind bereits mehrere klinische Studien
angelaufen, die genetisch modifizierte autologe Tumorzellen als
Vakzine überprüfen. Jaffee et al. (Cancer Res. 1993, 53:
2221-2226) und Yannelli et al. (J. Immunother. 1993, 161: 77-90)
haben gezeigt, daß es bei ca. 30% der Patienten möglich war,
Zellkulturen aus operativ gewonnenem Tumormaterial für einen
ausreichenden Zeitraum zu etablieren, um in diesen Zellen
Zytokine (GM-CSF, TNF bzw. IL2) zu exprimieren. Dies wurde für
Nierenzell-, Ovarial-, Pankreas-, Kolon-, Mamma- und Bronchial
karzinome und für Melanome gezeigt.
Einschränkend ist hierzu zu sagen, daß 30% Erfolgsrate immer
noch unbefriedigend ist. Das "Nadelöhr" bei dem Versuch, eine
autologe Tumorzellvakzine gentechnisch zu konstruieren, besteht
also nach wie vor in der geringen Reproduzierbarkeit,
Zellkulturen aus Tumorbiopsaten anzulegen.
Die Erfindung hat das Ziel, die Herstellung von Zellinien aus
primären Zellkulturen, z. B. von T-Zellen, von dendritischen
Zellen oder von Tumorzellen, zu ermöglichen. Die spezielle
Aufgabe besteht darin, gentechnisch eine autologe
Tumorzellvakzine zu konstruieren und dazu reproduzierbare
Zellkulturen aus Tumorbiopsaten herzustellen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Das
konditionale Immortalisationsverfahren für Zellinien aus
primären Zellkulturen ist dadurch gekennzeichnet, daß T-Zellen,
dendritische Zellen oder Tumorzellen mit einem Retrovirus
konstrukt, das die Immortalisierung der Zellen bewirkt,
behandelt werden, danach eine Kultivierung erfolgt und die
erhaltenen Zellen vor ihrer Verwendung mit einem zweiten
Retroviruskonstrukt, mit dem das inserierte erste
Retroviruskonstrukt herausgeschnitten wird, behandelt werden.
Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung liegt darin, daß
Tumorzellen aus Patientenmaterial mit einem Retroviruskonstrukt,
das die Immortalisierung der Tumorzellen bewirkt, behandelt
werden, danach eine Kultivierung erfolgt und die erhaltenen
Zellen vor ihrer Verwendung zur Herstellung einer Vakzine mit
einem zweiten Retroviruskonstrukt, mit dem das inserierte erste
Retroviruskonstrukt herausgeschnitten wird, behandelt werden.
Das erste Retroviruskonstrukt besteht aus den Genen für die
004Herpes Simplex-Thymidinkinase, dem large T-Gen aus SV 40 als
immortalisierendem Agens, dem CMV-Promotor, Gancyclovir als
negativem Selektionsmarker und dem Hygromycin-Gen als positivem
Selektionsmarker, flankiert von Signal-Sequenzen (LOX) für die
Rekombinase CRE.
Das zweite Retroviruskonstrukt zum Herausschneiden des
inserierten Konstrukts enthält die Bakteriophagen-Rekombinase
CRE unter LTR-Kontrolle und das Puromycingen unter SV
40-Promotor-Kontrolle.
Beide Konstrukte sind in Abb. 1 dargestellt.
Beide Vektoren tragen unterschiedliche Selektionsmarker. Durch
Infektion mit dem large T-Virus werden die Tumorzellen durch die
"Krise" der Adaptation an Zellkulturbedingungen geführt. Mit dem
zweiten Viruskonstrukt können diese Zellen zwecks Entfernung des
ersten Konstrukts zu jedem beliebigen Zeitpunkt infiziert
werden. Gegen Zellen, die keine erfolgreiche Entfernung des 1.
Konstrukts gelingt (bei der TK- und und large T-Gene deletiert
werden), kann mit Gancyclovir selektioniert werden. Damit werden
alle Zellen abgetötet, die noch das Hygromycin-Gen in sich
tragen.
Mit der Erfindung wird erreicht, daß reproduzierbar Zellkulturen
aus Tumorbiopsaten angelegt werden können und daß die "Krise"
humaner Tumorzellen in Kultur überwunden werden kann. Man
erreicht damit, in ihrer Antigenität unveränderte Tumorzellen
als Basis für die Konstruktion genmodifizierter autologer
Tumorzellen in die Hand zu bekommen. Als Zelltypen sind u. a.
geeignet: das Oesophagus- und Bronchialkarzinom, Magen- und
Kolonkarzinom sowie Weichgewebstumoren.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher
erläutert werden.
Die beiden aufzubauenden Retroviruskonstrukte sind in Abb. 1
dargestellt. Das erste basiert auf dem Vektor HyTK-CMV. Der
Vektor enthält ein Fusionsgen aus Hygromycin- und Herpes-
Simplex-Thymidinkinase (HyTK)-Gen unter "long terminal repeat"
(LTR)-Promotorkontrolle. Mit dem Virus infizierte Zellen haben
daher einen positiven (Hygromycin) und einen negativen
(Gancyclovir) Selektionsmarker. 3 vom HyTK-Gen liegt ein
vergleichsweise starker Promotor aus dem Cytomegalovirus. Hinter
diesen wird das large T-Gen aus SV40 kloniert. Das large T-Gen
wird durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert,
wobei der 3′Primer und eine 34-Basenpaar-lange Sequenz
verlängert ist, die der LOX-Erkennungssequenz für die
CRE-Rekombinase entspricht und während der PCR-Reaktion aufgefüllt
wird. In einem zweiten Schritt wird eine zweite LOX-Sequenz als
doppelsträngiges Primerpaar 5′ vom HyTK-Gen aus gesehen
kloniert. Das Ergebnis ist ein Vektor, der links und rechts vom
HyTK- und large T-Gen je eine LOX-Sequenz als Substrat für die
CRE-Rekombinase aufweist. Das zweite Retroviruskonstrukt basiert
auf der pBABE-Puro. In diesen Vektor wird in eine
Klonierungsschnittstelle das Gen für Bakteriophagen-Rekombinase
CRE hinter das 5 LTR kloniert. Die CRE-Rekombinase kann in einer
LOX-Sequenz-spezifischen Weise die Deletion der Sequenz zwischen
zwei LOX-Erkennungssequenzen durchführen. Der Vektor enthält
zusätzlich das Puromycin-Gen unter SV40-Promotorkontrolle als
Selektionsmarker. Beide Vektoren werden durch Transfektion in
geeignete Verpackungszellinien in Viruspartikel konvertiert. Die
Sequenzen des large T-Bereichs und der LOX-Regionen werden durch
Sequenzanalyse verifiziert.
Unterschiedliches Tumormaterial wird operativ gewonnen,
mechanisch/enzymatisch zu Einzelzell-suspensionen aufgearbeitet,
mit dem HyTK-LOX-CMV-IT-Virus bzw. Kontrollvirus infiziert, plus
und minus Selektionsmarker (Hygromycin) kultiviert und die
Wachstumskinetik bestimmt. Ggf. wird der Infektion eine
Anreicherung der Tumorzellen, z. B. durch Separation mit
Antikörpern, die spezifisch für tumorassoziierte Antigene sind,
vorangestellt, um zu verhindern, daß virusinfizierte Zellen (z. B.
Fibroblasten), die das Tumor-material kontaminieren, die
Tumorzellen überwachsen. Der Nachweis, daß wirklich Tumorzellen
immortalisiert wurden, kann durch Färbung mit Antikörpern, die
tumorassoziierte Antigene erkennen, und durch PCR für bestimmte
Onkogene geführt werden. Außerdem wird die Frequenz, mit der in
large T-abhängiger Weise Langzeitkulturen gewonnen werden, in
Abhängigkeit vom Tumorzelltyp bestimmt. Nach unterschiedlich
vielen Passagen werden die Zellinien mit dem Virus BABE-CRE-Puro
infiziert und auf Puromycinresistenz selektioniert. In den mit
beiden Viren infizierten Zellen führt die CRE-Rekombinase eine
LOX-spezifische Rekombination des HyTK-LOX-CMV-IT-Virus durch,
bei der das HyTK-Fusionsgen und das large T-Gen deletiert
werden. Der Phänotyp der Tumorzellen sollte in der Abfolge des
Experiments wie folgt sein: PuroS, HygroS, GCVR, G418S 1.Virus
RuroS, HygroR, GCVS, G418S 2.Virus PuroR, HygroS, GCRR, G418S.
Entsprechend diesem Schema wird anhand der Bestimmung der
Wachstumskinetik und der sequentiellen Selektion der Zellen mit
Puromycin, Gancyclovir und Hygromycin annäherungsweise bestimmt,
mit welcher Frequenz nach Infektion mit dem 2. Virus spezifische
Rekombination durchgeführt wird (RoroR vs. GCVR). Die Frequenz
wird zusätzlich genau dadurch bestimmt, daß die Zellen nach
Infektion direkt in Gegenwart von Puromycin kloniert werden und
anschließend prozentual GCVRR-Zellen bestimmt werden. Ferner wird
sichergestellt, daß alle Zellen, die keine spezifische
Rekombination durchgeführt haben, eliminiert sind (GCVR und
Gegenkontrolle HygroS), d. h. nur large T-negative Zellen in der
Kultur übrigbleiben. Dies wird molekular durch PCR mit large
T-spezifischen Primern analysiert.
Tumorzellen, von denen aus einem Tumorbiopsat eine Zellkultur
angelegt wird, haben in der Regel eine begrenzte Lebensspanne
von 10-20 Passagen. Aus einem Mammakarzinombiopsat wird eine
Zellkultur angelegt, und die Zellen entweder mit dem large
T-Retrovirus infiziert oder unbehandelt gelassen. Wie aus Abb. 2 zu
sehen ist, führt die Infektion mit den large T-Retrovirus zu
einer kontinuierlichen Proliferation der Zellen über mehrere
Zellkulturpassagen. Die nicht-infizierten Zellen nahmen an Zahl
sukzessive in Kultur ab, und es ließ sich keine Zellkultur
etablieren. Dies beweist, daß sich mit Hilfe des large T-Virus
Zellinien aus dem Tumorbiopsat isolieren lassen.
NIH3T3-Zellen werden zunächst mit dem large T-Retrovirus
infiziert und die HygroR-Zellen selektioniert. Anschließend
werden die Zellen mit dem CRE-Rekombinase-Retrovirus infiziert,
und die PuroR-Zellen selektioniert. Dann wird mit GCV gegen alle
Zellen selektioniert, bei denen keine Rekombination, bei der
large T- und Thymidinkinase-Gene deletiert wurden, stattgefunden
hat. Daraufhin werden die Zellen mit einem large T-spezifischen
Antikörper angefärbt. Die Tabelle zeigt, daß nach Infektion mit
dem large T-Virus quasi alle Zellen eine starke Kernfärbung
aufweisen. Nach Infektion mit dem CRE-Rekombinase-Virus und
GCV-Selektion war keine Färbung mit dem large T-Antikörper mehr
nachweisbar.
| % der Zellen, die sich mit einem large T-spezifischen Ak anfärben lassen | |
| NIH3T3 infiziert mit Retrovirus 1|100% | |
| NIH3T3-Zellen infiziert mit Rv 1+2 nach GCV-Selektion | 0% |
Zwei-Schritt konditionales Immortalisationssystem für primäre
humane Tumorzellen. Retrovirusvektor HyTK-LOX-CMV-IT enthält die
Erkennungssequenzen der Bakteriophagen-Rekombinase CRE (LOX),
ein Fusionsgen, welches für Hygromycin und die Herpes Virus
Thymidinkinase kodiert (HyTK) und den large T-Bereich aus SV40
(IT) unter CMV-Promotorkontrolle (CMV). Retrovirusvektor BABE-
CRE-Puro enthält die CRE-Rekombinase unter LTR-Kontrolle und das
Puromycingen unter SV40-Promotorkontrolle. Nicht maßstabsgerecht
gezeichnet.
Eine Zellsuspension aus einem Mammakarzinombiopsat wurde
angelegt und entweder mit dem Retrovirus HyTK-LOX-CMV-IT
infiziert (∎) oder unbehandelt gelassen (⚫). Die Infektion
erfolgte in der zweiten Woche. Die Pfeile geben die Zeitpunkte
an, an denen die konfluente Zellkultur 1:10 ausgedünnt wurde.
Claims (4)
1. Konditionales Immortalisationsverfahren für Zellinien aus
primären Zellkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß T-Zellen,
dendritische Zellen oder Tumorzellen mit einem Retrovirus
konstrukt, das die Immortalisierung der Zellen bewirkt,
behandelt werden, danach eine Kultivierung erfolgt und die
erhaltenen Zellen vor ihrer Verwendung mit einem zweiten
Retroviruskonstrukt, mit dem das inserierte erste
Retroviruskonstrukt herausgeschnitten wird, behandelt werden.
2. Konditionales Immortalisationsverfahren nach Anspruch 1 für
humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine, dadurch
gekennzeichnet, daß Tumorzellen aus Patientenmaterial mit einem
Retroviruskonstrukt, das die Immortalisierung der Tumorzellen
bewirkt, behandelt werden, danach eine Kultivierung erfolgt und
die erhaltenen Zellen vor ihrer Verwendung zur Herstellung einer
Vakzine mit einem zweiten Retroviruskonstrukt, mit dem das
inserierte erste Retroviruskonstrukt herausgeschnitten wird,
behandelt werden.
3. Retroviruskonstrukt zur Immortalisierung von Tumorzellen nach
Anspruch 1 und 2, bestehend aus den Genen für die Herpes
Simplex-Thymidinkinase, dem large T-Gen aus SV40 als
immortalisierendes Agens, dem CMV-Promotor, Gancyclovir als
negativem Selektionsmarker und dem Hygromycin-Gen als positivem
Selektionsmarker, flankiert von Signal-Sequenzen (LOX) für die
Rekombinase CRE.
4. Retroviruskonstrukt zum Herausschneiden des inserierten
Konstrukts nach Anspruch 1 und 2, enthaltend die Bakteriophagen-Re
kombinase CRE unter LTR-Kontrolle und das Puromycingen unter
SV 40-Promotor-Kontrolle.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19626830A DE19626830A1 (de) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Konditionales Immortalisationsverfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine |
| EP97932733A EP0910626A1 (de) | 1996-07-04 | 1997-07-03 | Konditionales immortalisationsverfahren für humane tumorzellen zur herstellung einer vakzine |
| PCT/DE1997/001406 WO1998001539A1 (de) | 1996-07-04 | 1997-07-03 | Konditionales immortalisationsverfahren für humane tumorzellen zur herstellung einer vakzine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19626830A DE19626830A1 (de) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Konditionales Immortalisationsverfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19626830A1 true DE19626830A1 (de) | 1998-01-08 |
Family
ID=7798830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19626830A Withdrawn DE19626830A1 (de) | 1996-07-04 | 1996-07-04 | Konditionales Immortalisationsverfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0910626A1 (de) |
| DE (1) | DE19626830A1 (de) |
| WO (1) | WO1998001539A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19816116A1 (de) * | 1998-04-09 | 1999-10-14 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Immortalisation von Zellen mit Hilfe konditional transformierter Helferzellen |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10039856A1 (de) * | 1999-08-10 | 2001-05-03 | Hepavec Ag Fuer Gentherapie | Verfahren und Mittel zur Induktion von Zell-Vermehrung ruhender Zellen |
| JP4867012B2 (ja) * | 2007-03-22 | 2012-02-01 | 国立大学法人群馬大学 | レトロウイルス産生用ベクター |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5610043A (en) * | 1994-04-28 | 1997-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Human prostatic cell lines immortalized by adenovirus 12-simian virus 40 (AD12/SV40) hybrid virus |
| DE4431401A1 (de) * | 1994-08-24 | 1996-02-29 | Max Delbrueck Centrum | Lebendvakzine gegen Tumorerkrankungen |
| GB2294946A (en) * | 1994-11-08 | 1996-05-15 | Bradley Michael John Stringer | Preparation of human cell-lines of fully-differentiated cells of specific tissue type |
-
1996
- 1996-07-04 DE DE19626830A patent/DE19626830A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-07-03 EP EP97932733A patent/EP0910626A1/de not_active Withdrawn
- 1997-07-03 WO PCT/DE1997/001406 patent/WO1998001539A1/de not_active Ceased
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19816116A1 (de) * | 1998-04-09 | 1999-10-14 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Immortalisation von Zellen mit Hilfe konditional transformierter Helferzellen |
| DE19816116C2 (de) * | 1998-04-09 | 2000-06-29 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Immortalisation von Zellen mit Hilfe konditional transformierter Helferzellen |
| US6174726B1 (en) | 1998-04-09 | 2001-01-16 | Gsf-Forschungszentrum Fuer Umwelt Und Gesundheit Gmbh | Method for the immortalization of cells using conditionally transformed helper cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0910626A1 (de) | 1999-04-28 |
| WO1998001539A1 (de) | 1998-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69123981T2 (de) | Nützliche retrovirale vektoren für die gentherapie | |
| DE102017127984B4 (de) | Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen | |
| DE19833476B4 (de) | Genetisch modifizierte CD34-Negative, adhärent wachsende hämatopoetische Stammzellen und deren Verwendung in der Gentherapie | |
| DE2651685C2 (de) | Züchtung von Keratinozyten | |
| DE68926892T3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Zellen, die stabil integrierte fremde DNS mit hoher Kopiezahl enthalten, durch dieses Verfahren hergestellte Zellen und Verwendung dieser Zellen zur Herstellung von durch diese fremde DNS kodierten Polypeptiden | |
| DE69735643T2 (de) | IL12 zur Gentherapie der Tumoren | |
| DE69034053T2 (de) | Transformation von tierischen somatischen zellen mittels partikeln | |
| DE69431295T2 (de) | Biokompatibles implantat zur in vivo expression und sekretion von therapeutischer verbindung | |
| DE69533334T2 (de) | Impfstoff zum Auflösen einer Immunreaktion auf ein tumorspezifisches Antigen | |
| DE69232782T2 (de) | Zielgerichtetes Einbringen eines Virus-Vektors in Säugetierzellen. | |
| DE69839215T2 (de) | Dendritische zellhybride | |
| DE69230506T2 (de) | Lymphokine gentherapie bei krebs in kombination mit tumorantigenen | |
| DE202015010019U1 (de) | Stabilisierung von für Poly (A) -Sequenzen kodierende DNA-Sequenzen | |
| DE69934690T2 (de) | Gentransfermethoden | |
| DE69225489T2 (de) | Methode zur genetischen veränderung von knochenmarkzellen von primaten und dafür brauchbare zellen, die rekombinante retrovirale vektoren produzieren | |
| EP3363892A1 (de) | Verfahren zur erhöhung der immunreaktivität | |
| DE69034100T2 (de) | Verktorvermittelte genominsertion und expression von dna in bcg | |
| DE69414572T2 (de) | Immortalisierung von dendritischen zellen mit dem v-myc onkogen | |
| DE69432500T2 (de) | Rekombinante Foamy-Virus-Vektoren zur medizinischen und diagnostischen Verwendung und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Foamy-Virus-Vektoren | |
| JPH05500601A (ja) | ヒト筋肉細胞の単離、増殖および分化 | |
| DE69736858T2 (de) | Unsterbliche vogelzellen | |
| DE60038555T2 (de) | Verpackungszelle | |
| DE69530440T2 (de) | Verfahren zur Induktionskultur von zytotoxischen T Lymphozyten mit tumorzelltötender Aktivität | |
| DE69721731T2 (de) | Immortalisierte menschliche prostata-epithelzellen und klone und ihre verwendungen zur untersuchung und therapie von prostata-krebs | |
| DE19626830A1 (de) | Konditionales Immortalisationsverfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8141 | Disposal/no request for examination |