DE19624802A1 - Verfahren zum direkten diagnostischen Nachweis von pathogenen, genetisch bedingten Punktmutationen in Proteinen bei Herzerkrankungen durch chemische und physikalische Methoden, besonders der direkten und indirekten Kopplung der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und der Massenspektrometrie - Google Patents

Description

Die Untersuchungen zum diagnostischen Nachweis von pathogenen, genetisch bedingten Punktmutationen in Proteinen des menschlichen und tierischen Organismus beinhalten Studien über die Analyse der schweren Kette der β-Isoform des Muskelmyosins mit chemischen und physikalischen Methoden. Mit diesen Studien wird belegt, daß die vorgestellten Methoden geeignet sind, den pathogenen Austausch einzelner Aminosäuren auch in sehr großen Proteinen eindeutig nachzuweisen.

Die erfinderische Grundlage ist ein Verfahren bei dem durch Biopsien gewonnene Proben, z. B. Muskelfaserbündel oder Gewebestücke aus Organen, besonders Herzen, so aufgearbeitet werden, daß durch massenspektrometrische, chromatographische und elektrophoretische Methoden der Austausch einer einzelnen Aminosäure eindeutig nachgewiesen und das Expressions- und Inkorporationsverhältnis zwischen Wildform und Mutante quantiativ bestimmt werden kann. Somit ist es durch direkte Proteinanalyse möglich Ursachen für eine genetisch bedingte Erkrankung in einem frühen Stadium zu diagnostizieren und durch vergleichende Analyse von Proben aus gesunden Menschen mit Proben aus erkrankten Menschen bisher unbekannte Mutationen zu identifizieren.

Durch den Einsatz der hochempfindlichen Matrixunterstützten, Laserinduzierten Desorptions- und Ionisations Flugzeit Massen­ spektrometrie (MALDI-MS) in Kombination mit der Flüssigchromatographie unter Verwendung von Säulen mit einem Innendurchmesser 1 mm (Mikrobore- und Kapillarsäulen) kann der Nachweis auch mit geringsten Probenmengen geführt werden.

Das Verfahren zeichnet sich gegenüber den bisher angewandten Analysen der für die Proteine codierenden DNA dadurch aus, daß der Nachweis der Mutation und die Bestimmung des Expressions- und Inkorporationsverhältnisses in deutlich kürzere Zeit erfolgt. Eine Analyse ist innerhalb von einer Woche durchzuführen, im Gegensatz zu den üblichen Analysenzeiten bei der DNA Analyse von mehreren Wochen bis zu einem halben Jahr.

Zur erfindungsgemäßen Neuheit gehört weiterhin, daß eine spezifische Spaltung des aus Biopsieproben gewonnen Proteins zu diagnostischen Zwecken mit selektiven Enzymen, Endoproteinasen, oder durch chemische Reagentien, erfolgt und die durch diese Spaltung erhaltenen Fragmente durch chromatographische Methoden aufgetrennt und direkt (LC/MS) oder indirekt (MALDI-MS) auf ihre Molekulargewichte hin charaktersiert werden. Die Verteilung in der Trennung und das Molekulargewicht, bestimmt durch die Massenspektrometrie, ist ein eindeutiger Nachweis für jedes Fragment des Proteins.

Bei kleinen Proteinen, d. h. bis zu einem Molekulargewicht von 100.000 Dalton können die mit dem beschriebenen Verfahren die Aminosäureaustausche direkt bestimmt werden, ohne vorherige Spaltung. Durch die Genauigkeit der Messung ist es möglich, Abweichungen im Molekulargewicht von < 5 Dalton genau zu bestimmen und damit Wildform neben Mutante nachzuweisen. Die genaue Lokalisierung des Aminosäureaustausches wird anschließend mit der oben beschriebenen Spaltung bestimmt.

Somit ist es möglich alle Proteine, die an einer physiologisch funktionellen Struktur, z. B. dem Muskel, beteiligt sind, auf pathogene und nichtpathogene genetisch bedingte Aminosäureaustausche hin zu charaktersieren.

Da durch die Sequenzierung des menschlichen Genoms bereits jetzt sehr viele Proteine in ihrer Aminosäuresequenz bekannt sind und in wenigen Jahren alle menschlichen Proteine aufgeklärt sein werden, kann mit Hilfe des hier beschriebenen Verfahrens durch die Auswahl der geeigneten Spaltung eine Analyse des Proteins in Bezug auf Mutationen durchgeführt werden.

Von großer Bedeutung ist es, daß diese Methode auch in den klinisch-diagnostischen Einsatz bei der Erkennung der Ursache für Erkrankungen und, durch Optimierung der Trenn- und Nachweisbedingungen, auch zum systematischen Screenen von Patientenproben auf bestimmte, definierte Mutationen angepaßt werden kann.

Die beschriebene Methode kann unter Verwendung von geeigneten Geräten auch weitgehend automatisiert werden.

Die Analysendauer liegt bei dem beschrieben Vorgehen im Bereich von wenigen Tagen, während die DNA Analyse mehrere Wochen bis Monate benötigt. Gleichzeitig können alle an einer physiologisch funktionellen Struktur beteiligten Proteine damit analysiert werden.

Im Gegensatz zu den üblichen Verfahren des Nachweises von Punktmutationen durch Analyse der genomischen DNA oder der cDNA gestattet dieses Verfahren auch die Quantifizierung der Expression und die Inkorporation der Mutante in die physiologisch funktionelle Struktur, besonders wenn bedingt durch den im Zellkern vorhandenen doppelten Chromosomensatz, beide Formen des betreffenden Proteins exprimiert werden und in der funktionellen Form nicht bekannt ist, in welchem Verhältnis die beiden Formen vorliegen.

Die Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Identität des Wildtypes und der Mutante durch chemische Sequenzanalyse oder durch Aminosäurenanalyse belegt wird.

Erfinderische Grundlage zur Durchführung ist die Durchführung der diagnostischen Analyse durch die Spaltung des zu untersuchenden Proteins mit geeigneten Enzymen oder chemischen Reagentien, die Kombination von chromato­ graphischen Methoden, besonders der Hochdruck-Flüssig­ chromatographie mit Kapillarsäulen (MB-HPLC) und der Massenspektrometrie.

In der Arbeit wird belegt, daß am Beispiel der schweren Kette der β-Isoform des Myosins, dessen Punktmutationen, z. B. der Austausch der Aminosäure Valin an Position 606 gegen die Aminosäure Methionin, zu der hypertrophen Kardiomyopathie führen kann, einer genetisch bedingten Verdickung bestimmter Herzwände, die zu dem plötzlichen Tod führen kann, der Nachweis der Mutation durch die Kombination einer enzymatischen Spaltung mit der LC/MS möglich ist.

Beispiel 1 LC/MS Analyse der durch Endoproteinase Lys-C erhaltenen Fragmente der schweren Kette der β-Isoform des Myosins (β-MHC)

Grundlage der selektiven Spaltung ist die Isolierung der β-MHC aus Muskelfasern des Muskel soleus, die im Rahmen von Biopsien gewonnen werden, durch Losen in einem Puffer mit hoher Salzkonzentration und Fällung der β-MHC durch Erniedrigung der Salzkonzentration. Die vorliegende β-MHC kann zum Entfernen von störenden löslichen Bestandteilen mit Wasser gewaschen werden.

Zur Darstellung der zu analysierenden Fragmente wird die gefällte β-MHC in 200 µl Puffer von 100 mM Ammo­ niumbicarbonat, pH 8.2, aufsuspendiert und über 24 Stunden bei 37°C mit der Endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim) inkubiert. Die Lösung wird anschließend einer Gefriertrocknung unterzogen und in 100 µl 0.1 Trifluor­ essigsäure in Wasser gelöst.

Zum Entfernen von nicht gelösten Bestandteilen wird die Probe durch ein 0.2 µm Celluloseacetat Filter bei maximal 10.000×g filtriert und 20 bis 50 µl Ailiquots auf die MB-HPLC aufgetragen. Die Trennung erfolgt über eine reverse-phase C18 Säule mit einem Innendurchmesser von 1 mm und einer Länge von 100 mm bei einer Flußrate von 20 µl/min. Die Elution der Peptide erfolgt durch einen linearen Anstieg von 0.5%/min der Acetonitrilkonzentration im Puffer, ausgehend von 10% Acetonitril in 0.06% TFA in Wasser bis 80% Acetonitril in 0.05% TFA in Wasser. Die eluierenden Peptide werden durch eine fused-silica Kapillare über einen UV-Detektor direkt in die Elektrospray-Ionisationseinrichtung des Quadrupol- Massenspektrometers (SCIEX API III, Perkin-Elmer, Langen) geführt. Im Massenspektrometer erfolgt die Bestimmung der m/z (Masse zu Ladung) Werte über einen Bereich von 400 bis 2400 amu (atomic mass units) alle 4.2 Sekunden. Aus dem aufgezeichneten Totalionenchromatogramm und den jeweiligen Massenspektren kann durch computergestützte Auswertung das Fragment des Wildtypes und der Mutanten nachgewiesen werden.

Nach der beschriebenen Trennung wurde eine Probe der nicht­ mutierten β-MHC zusammen mit den synthetischen Peptiden mit den Sequenzen des nicht-mutierten und des mutierten Fragmentes unter den gleichen Bedingungen analysiert. Die vorher gefundenen Moleküle liegen in den Bereichen, in denen die synthetischen Peptide eluieren.

Abb. 1: Oberer Bereich: Totalionenchromatogramm der Trennung der durch Endoproteinase Lys-C erhaltenen Fragmente der mutierten β-MHC.
Mittlerer Bereich: Nachweis des nicht mutierten Fragmentes in dem schraffierten Bereich (1) des oberen Bildes. Das nicht­ mutierte Fragment hat ein Molekulargewicht von 1475.5. amu.
Unterer Bereich: Nachweis des mutierten Fragmentes in dem schraffierten Bereich (2) des oberen Bildes. Das mutierte Fragment hat ein Molekulargewicht von 1507.5 amu.

Beispiel 2 Nachweis der Fragmente des Wildtypes und der Mutante der β-MHC mit Hilfe der MALDI-MS Technik

Wie in Beispiel 1 beschrieben erfolgte die Spaltung der β-MHC durch Inkubation mit Endoproteinase Lys-C und eine anschließende Trennung über eine reverse-phase C18 Säule mit den oben angegebenen Bedingungen. In diesem Beispiel werden statt einer direkten Kopplung mit dem Massenspektrometer durch einen automatischen Fraktionssammler alle 2 Minuten Fraktionen gesammelt und von diesen Fraktionen jeweils 0.5 µl mit 1 µl einer geeigneten Matrixsubstanz, üblicherweise alpha- Hydroxyzimtsäure oder Sinapinsäure, gelöst in 60% Acetonitril und 0.2% TFA, auf einem Träger für die MALDI-MS vermischt. Die Bestimmung der Molekulargewichte erfolgt anschließend in einem MALDI-MS (Vestec, Houston) unter Verwendung eines externen Standards, d. h. zweier bekannter synthetischer Peptide, zur Kalibrierung der Messung.

Diese Messungen ergaben in den korrespondierenden Fraktionen aus Beispiel 1 die erwarteten Massen von 1477.5 und 1507.5 amu.

Somit können auch unter Zuhilfenahme der MALDI-MS die mutierten Fragmente eindeutig nachgewiesen werden.

Beispiel 3 Analyse der Fraktionen aus Beispiel 2 mit Hilfe der Kapillarelektrophorese

Die Fraktionen aus Beispiel 2 wurden mit Hilfe der Kapillarelektrophorese (Beckmann P/ACE 2000, Beckman München) unter Verwendung von fused-silica Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 75 µm in einem Puffer mit 100 mM Natriumphosphat, pH 8.0, bei einer Spannung von 15 bis 17 kV getrennt. Die Detektion der Peptide erfolgt mit Hilfe eines UV Detektors bei 200 nm.

Durch Koinjektion der synthetischen Peptide in einem zweiten Trenngang konnte die Identität der natürlichen nicht-mutierten und mutierten Fragmente gezeigt werden.

Claims (5)

1. Verwendung der beschriebenen erfindungsgemäßen Methode zum medizinisch-diagnostischen direkten Nachweis der Expression und der Inkorporation von Wildtyp neben Mutante auf Proteinebene in Präparationen die aus Biopsien aus humanem oder tierischem Gewebe gewonnen wurden.

2. Verwendung der beschriebenen Methode für die medizinisch-diagnostische Quantifizierung der Expression und der Inkorporation in physiologisch funktionelle Strukturen von Wildtyp und Mutante auf Proteinebene.

3. Verwendung der beschriebenen Methode zur medizinisch- diagnostischen Analyse der Expression und Inkorporation und des Verhältnisses von Wildtyp zu Mutante in verschiedenen Gewebe- und Organbereichen.

4. Verwendung der Methode für die medizinisch- diagnostische Analyse von Biopsie-Proben, die nur in geringsten Mengen vorliegen.

5. Verwendung der beschriebenen Methode für den medizinisch-diagnostische Nachweis von bisher unbekannten pathogenen und nicht-pathogenen Mutationen direkt auf Proteinebene.