DE10155692A1 - Verfahren zum Nachweis von endogenen und exogenen Stoffen im Organismus - Google Patents
Verfahren zum Nachweis von endogenen und exogenen Stoffen im OrganismusInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere von Stoffen mit mindestens einer Peptidbindung, in einem Organismus, bei dem die in entnommenem körpereigenen Material, insbesondere von einem menschlichen oder tierischen Organismus entnommene körpereigene Material, vorhandenen endogenen und exogenen Stoffe auf einem Trägermaterial angereichert werden und anschließend diese Stoffe über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen und/oder differenziert werden.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere von Stoffen mit mindestens einer Peptidbindung, in einem Organismus.
- Exogene Stoffe, d. h. außerhalb eines Organismus entstandene Stoffe, wie z. B. rekombinante Proteine und Peptide, werden zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt, bei denen beispielsweise die endogenen Varianten, d. h. die im Körper selbst entstandenen, nicht von außen zugeführten bzw. aus der besonderen Anlage des Organismus hervorgegangenen Stoffe, vom Körper nur unzureichend gebildet werden können. Bereits in der klinischen Anwendung befindet sich das Wachstumshormon zur Behandlung von Wachstumshormondefizienzen unterschiedlicher Genese (Murray, R. D. and Shalet, S. M. (2000). Growth hormone: current and future therapeutic applications. Expert Opin Pharmacother 1, 975-990). Erythropoetin wird bei Anämien infolge beispielsweise von Tumoren eingesetzt (Kasper, C. (2001). Recombinant human erythropoietin in the treatment of anemic patients with hematological malignancies. Ann Hematol 80, 319-329). Rekombinante Gonadotropine werden bei Infertilität verwendet (Garcia-Campayo, V. and Boime, I. (2001). Novel recombinant gonadotropins. Trends Endocrinol Metab 12, 72-77). Blutgerinnungsfaktoren werden bei Erkrankungen mit erhöhter Blutungsneigung eingesetzt (Monroe, D. M., Hoffman, M., Allen, G. A. and Roberts, H. R. (2000). The factor VII-platelet interplay: effectiveness of recombinant factor VIIa in the treatment of bleeding in severe thrombocytopathia. Semin Thromb Hemost, 26, 373-377). Rekombinantes Thyrotropin findet bei Patienten mit einem Schilddrüsenkarzinom Anwendung (Baskin, H. J., Atwood, T. M. and Holcomb, L. P. (2000). Recombinant human thyrotropin stimulation of thyroglobulin in the follow-up of patients with stage I or II differentiated thyroid carcinoma. Endocr Pract 6, 430-434).
- Die meisten therapeutisch wichtigen Proteine sind Glykoproteine. Die Glykosylierung bestimmt Stabilität, Faltung und biologische Aktivität (Lerouge, P., Bardor, M., Pagny, S., Gomord, V. and Faye, L. (2000). N- glycosylation of recombinant pharmaceutical glycoproteins produced in transgenic plants: towards an humanisation of plant N-glycans. Curr Pharm Biotechnol 1, 347-354). In den meisten Fällen werden bei der Herstellung von z. B. rekombinanten Peptiden und Proteinen Modifikationen eingefügt, die deren Funktionalität hinsichtlich Stabilität und Effektivität (Rezeptorbindung) beeinflussen. Dies betrifft vor allem die Glykoproteine (Garcia-Campayo, V. and Boime, I. (2001). Novel recombinant gonadotropins. Trends Endocrinol Metab 12, 72-77; Lerouge, P., Bardor, M., Pagny, S., Gomord, V. and Faye, L. (2000); Lynch, T. J. (2000). Biotechnology: alternatives to human plasma-derived therapeutic proteins.
- Baillieres Best Pract Res Clin Haematol 13, 669-688; Macdougall, I. C. (2001). An overview of the efficacy and safety of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP). Nephrol Dial Transplant 16, 14-21). Modifikationen des Zuckerrestes werden beispielsweise bei Erythropoetin durchgeführt, um die Verweildauer des rekombinanten Proteins im Plasma zu verlängern (Egrie, J. C. and Browne, J. K. (2001). Development and characterization of novel erythropoiesis stimlulating protein (NESP). Nephrol Dial Transplant 16, 3-13).
- International findet - bei unterschiedlichen legislativen Rahmenbedingungen - ein Einsatz von beispielsweise Wachstumshormon (auch als Growth Hormon (GH) oder somatotropes Hormon (STH) zu bezeichnen) in der Tierproduktion statt. Bei Milchkühen steht die Optimierung der Milchleistung im Vordergrund, während beispielsweise beim Schwein ein höherer Magerfleischanteil erzielt werden kann (Karg, H., Meyer, H. and Schams, D. (1992). Manipulation von Wachstum und Laktation beim Rind. Mh. Vet.-Med. 47, 113-118).
- Sowohl im Hochleistungssport als auch im Breitensport werden zunehmend leistungssteigernde Präparate aus dem Bereich der Protein- und Peptidhormone eingesetzt (Clarkson, P. M. and Thompson, H. S. (1997). Drugs and sport. Research findings and limitations. Sports Med 24, 366-384; Davey, G. and Nerurkar, R. (1998). Doping in sport. Lancet 352, 1781-1782; Davies, J. S., Morgan, C. L., Currie, C. J. and Green, J. T. (1997). Growth hormone use by body builders. Br J Sports Med 31, 352-353; Haug, E. (1994). [Abuse of doping preparations outside organized sports. A new challenge for health care]. Tidsskr Nor Laegeforen 114, 424-425). Dies betrifft gegenwärtig vor allem das Wachstumshormon und das Erythropoetin (Ehrnborg, C., Bengtsson, B. A. and Rosen, T. (2000). Growth hormone abuse. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 71-77; Jelkmann, W. (2000). Use of recombinant human erythropoietin as an antianemic and performance enhancing drug.
- Curr Pharm Biotechnol 1, 11-31). Erythropoetin wird zur Verbesserung des Sauerstofftransportes über eine Erhöhung des Anteils der roten Blutkörperchen, den Erythrozyten, vor allem im Radsport eingesetzt (Audran, M., Gareau, R., Matecki, S., Durand, F., Chenard, C., Sicart, M. T., Marion, B. and Bressolle, F. (1999). Effects of erythropoietin administration in training athletes and possible indirect detection in doping control. Med Sci Sports Exerc 31, 639-645; Breymann, C., Rohling, R., Krafft, A., Huch, A. and Huch, R. (2000). "Blood doping" with recombinant erythropoietin (rhEPO) and assessment of functional iron deficiency in healthy volunteers. Br J Haematol 108, 883-884; Gareau, R., Audran, M., Baynes, R. D., Flowers, C. H., Duvallet, A., Senecal, L. and Brisson, G. R. (1996). Erythropoietin abuse in athletes. Nature 380, 113; Jelkmann, W. (2000). Use of recombinant human erythropoietin as an antianemic and performance enhancing drug. Curr Pharm Biotechnol 1, 11-31). Berichte liegen auch über den Einsatz von Erythropoetin im Pferdesport vor (Kearns, C. F., Lenhart, J. A. and McKeever, K. H. (2000). Cross reactivity between human erythropoietin antibody and horse erythropoietin. Electrophoresis 21, 1454-1457).
- Der Einsatz von HCG (menschliches Choriongonadotropin), ACTH (adrenocorticotropes Hormon), Wachstumshormon und Erythropoetin sowie von den Substanzen, die ihre Freisetzung regulieren oder ihre Wirkung vermitteln, wurde 1989 von der Medizinischen Kommission des Internationalen Olympischen Komitees (IOC) gebannt (Kicman, A. T. and Cowan, D. A. (1992). Peptide hormones and sport: misuse and detection. Br Med Bull 48, 496-517).
- Trotz dieser Beschränkungen des Einsatzes oder gar des Verbotes bestehen bei Mensch und Tier Probleme hinsichtlich des mißbräuchlichen Einsatzes dieser Substanzen (Bidlingmaier, M., Wu, Z. and Strasburger, C. J. (2000). Test method: GH. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 99-109; Breymann, C. (2000). Erythropoietin test methods. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 135-145).
- Das Problem des Nachweises der Verabreichung von beispielsweise rekombinantem Wachstumshormon oder Erythropoetin in Körperflüssigkeiten liegt darin, daß sich die endogene und exogene, z. B. rekombinante Form von Wachstumshormon und Erythropoetin, wenn überhaupt, dann nur in sehr geringem Maße unterscheiden (Healy, M. L. and Russell-Jones, D. (1997). Growth hormone and sport: abuse, potential benefits, and difficulties in detection. Br J Sports Med 31, 267-268). Der geringe Unterschied reicht bei gegenwärtig angewandten analytischen Methoden nicht aus, um innerhalb einer Probe sicher zwischen endogenen und exogenen Formen zu unterscheiden. Ein weiteres Problem ist die Tatsache, daß der Blutspiegel des natürlichen Wachstumshormons nicht konstant ist, sondern rhythmischen Schwankungen unterliegt. Plötzliche Erhöhungen können deshalb nur eine spontane Erhöhung endogener Wachstumshormon-Konzentrationen darstellen. Ferner ist die Freisetzung von Wachstumshormon und damit auch der Blutspiegel von quantitativen und qualitativen Veränderungen in der Nahrungszusammensetzung abhängig. Auch bei starker körperlicher Leistung ist eine Erhöhung des Wachstumshormon-Blutspiegels zu beobachten (Jenkins, P. J. (1999). Growth hormone and exercise. Clin Endocrinol (Oxf) 50, 683-689.) Ein akzeptiertes Nachweisverfahren existiert gegenwärtig weder für die Dopingkontrolle im Hochleistungssport noch für die Kontrolle des illegalen Einsatzes in der Tierproduktion. Deshalb werden für beide Proteohormone indirekte Nachweismethoden diskutiert (Bidlingmaier, M., Wu, Z. and Strasburger, C. J. (2000). Test method: GH. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 99-109); Birkeland, K. I., Stray- Gundersen, J., Hemmersbach, P., Hallen, J., Haug, E. and Bahr, R. (2000). Effect of rhEPO administration on serum levels of sTfR and cycling performance. Med Sci Sports Exerc 32, 1238-1243; Breymann, C. (2000). Erythropoietin test methods. Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 14, 135-145; Choi, D., Kim, M. and Park, J. (1996). Erythropoietin: physico- and biochemical analysis. J Chromatogr B Biomed Appl 687, 189-199). Indirekte Nachweismethoden sind jedoch mit dem hohen Risiko einer falschen positiven Aussage belastet. Ein erhöhter Hämatokrit, der bei Radrennfahrern zum Ausschluß führt, kann z. B. auch physiologischer oder pathophysiologischer Natur sein (Brun, J. F., Bouchahda, C., Chaze, D., Benhaddad, A. A., Micallef, J. P. and Mercier, J. (2000). The paradox of hematocrit in exercise physiology: which is the "normal" range from an hemorheologist's viewpoint? Clin Hemorheol Microcirc 22, 287-303; Schmidt, W., Biermann, B., Winchenbach, P., Lison, S. and Boning, D. (2000). How valid is the determination of hematocrit values to detect blood manipulations? Int J Sports Med 21, 133-138; Shaskey, D. J. and Green, G. A. (2000). Sports haematology. Sports Med 29, 27-38). Im Vordergrund steht die Differenzierung anhand der natürlicherweise vorkommenden verschiedenen Isoformen von Wachstumshormon, die bei einer Supplementierung nicht auftreten sollen (Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R. and Strasburger, C. J. (1999). Detection of doping with human growth hormone. Lancet 353, 895). Die Verwendung der Unterschiede im Isotopenverhältnis zwischen endogenem Wachstumshormon und verschiedenen rekombinanten Präparaten ist sehr aufwendig und erbringt keine einheitlichen Ergebnisse für die einzelnen Präparate (Abramson; F. P., Osborn, B. L. and Teffera, Y. (1996). Isotopic differences in human growth hormone preparations. Anal Chem 68, 1971-1972). Für Erythropoetin wird entweder der Hämatokrit herangezogen (Ekblom, B. (1996). Blood doping and erythropoietin. The effects of variation in hemoglobin concentration and other related factors on physical performance. Am J Sports Med 24, S40-42) oder andere Parameter des Eisenstoffwechsels (Clyne, N., Berglund, B. and Egberg, N. (1995). Treatment with recombinant human erythropoietin induces a moderate rise in hematocrit and thrombin antithrombin in healthy subjects. Thromb Res 79, 125-129; Gareau, R., Brisson, G. R., Chenard, C., Gagnon, M. G. and Audran, M. (1995). Total fibrin and fibrinogen degradation products in urine: a possible probe to detect illicit users of the physical-performance enhancer erythropoietin? Norm Res 44, 189-192). Neuere Methoden erlauben eine gewisse Differenzierung auf der Basis von Ladungsunterschieden in der isoelektrischen Fokussierung (Lasne, F. and de Ceaurriz, J. (2000). Recombinant erythropoietin in urine. Nature 405, 635).
- Erwünscht ist ein Testverfahren, in dem bei einem Organismus endogene und exogene Stoffe, insbesondere Peptidverbindungen, nachgewiesen werden könnten. Es soll ein direkter und schneller Nachweis dieser Stoffe möglich sein, mit einer hohen Sensibilität, Sensitivität und Spezifität. Ferner ist es erwünscht, zwischen den verschiedenen exogenen Stoffen zu differenzieren, insbesondere bei den rekombinant und gentechnisch hergestellten Stoffen, diese einem bestimmten Produzenten zuzuordnen.
- Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von exogenen und endogenen Stoffen bereitzustellen, was spezifisch, selektiv und sensitiv genug ist, mit vergleichsweise geringem Aufwand diese Stoffe nachzuweisen und damit beispielsweise einen illegalen Einsatz von rekombinanten, gentechnisch produzierten Wachstumshormonen zur Leistungssteigerung bei Mensch (Doping) und Tier (Milchleistung, Mast) nachzuweisen.
- Dieses Ziel wird gelöst durch das Verfahren, wie es in Anspruch 1 definiert ist. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen bis 2 bis 14 dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
- Überraschenderweise wurde gefunden, daß endogene und exogene Stoffe nach selektiver Anreicherung mit Hilfe eines hochsensitiven Nachweisverfahrens über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen werden können.
- Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere von Stoffen mit mindestens einer Peptidbindung, wobei die in entnommenen körpereigenen Material, insbesondere von einem menschlichen oder tierischen Organismus entnommene körpereigene Material, vorhandenen endogenen und exogenen Stoffe auf einem Trägermaterial angereichert werden, und anschließend diese Stoffe über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen und/oder differenziert werden.
- Erfindungsgemäß handelt es sich bei den endogenen und exogenen Stoffen um Peptide, Polypeptide, Proteine, Peptidhormone und/oder Proteohormone. Bei den Peptid- und/oder Proteohormonen werden insbesondere STH (somatotropes Hormon), Erythropoetin, ACTH (adrenocorticotropes Hormon), und/oder HCG (menschliches Choriongonadotropin) umfaßt, aber auch alle anderen endogenen und exogenen Stoffe, insbesondere Peptidverbindungen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden können, kommen in Frage.
- Vor der Anreicherung und/oder dem Nachweis der endogenen und exogenen Stoffe können diese modifiziert, insbesondere fraktioniert und/oder markiert werden. So kann z. B. zur Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen die selektive Verdauung oder die chemische Modifikation der Stoffe genutzt werden. Dazu können die auf einem Trägermaterial gebundenen Stoffe vor der Massenbestimmung enzymatisch oder chemisch behandelt werden. So ist es z. B. möglich, daß durch Behandlung mit Proteasen (z. B. Tripsin) Peptide und Proteine in, von der Variante (Aminosäuresequenz) abhängig, unterschiedliche Peptidfragmente gespalten werden. Die einzelnen Teilstücke weisen eine jeweils charakteristische Molekulargewichtsverteilung auf, da die jeweiligen Enzyme an bestimmten Aminosäurepositionen bevorzugt schneiden. Die Wahl der Proteasen ist varianten- und speziesspezifisch, da speziesspezifische Unterschiede hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung von beispielsweise Wachstumshormonen bestehen. Als Ergebnis entsteht ein für die jeweilige Peptid- und Protein-Variante charakteristischer "Fingerabdruck". Diese Vorbehandlung der Peptide und Proteine verbessert nicht nur die Unterscheidung geringer Massenunterschiede, sondern erlaubt auch die Differenzierung von möglichen Varianten mit Unterschieden in der Aminosäuresequenz.
- Es lassen sich auch andere kovalente Proteinmodifikationen wie beispielsweise Glykosylierungen oder Phosphorylierungen durch die enzymatische Vorbehandlung der auf dem Trägermaterial (angereicherten und gereinigten) Proteine oder Peptide wie beispielsweise Wachstumshormon- und Erythropoetin-Varianten mit beispielsweise Glykosidasen oder Phosphorylasen nachweisen. Hierbei wird die spezifisch auf dem Trägermaterial angereicherte Probe entsprechend üblicher Methoden mit spezifischen Enzymen versetzt, die eine vollständige oder selektive Abspaltung von Zucker- oder Phosphatresten erlauben. Als Enzyme eignen sich beispielsweise die Glykosidasen PNGase-F oder Phosphorylasen wie die Alkalische Phosphatase und andere. Durch den Einsatz von verschiedenen Glykosidasen kann zwischen N- bzw. O- Verknüpfungen der Zuckerreste unterschieden werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die chemische Abspaltung von Zuckerresten dar. Dabei findet Hydrazin Anwendung. Die analytischen Schritte erfolgen in Volumen, Zeit und Temperatur an die Trägermaterialoberfläche angepaßt, entsprechend bekannter Verfahren (Savage, A. (1997). Glycosylation: A post-translational modification. In Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, (ed. H. Hauser and R. Wagner), pp. 231-276. Berlin, New York: Walter de Gruyter).
- Weitere Möglichkeiten der z. B. Proteinmodifikation, die eine Verbesserung der Unterscheidung zwischen natürlichen und künstlichen Peptiden und Proteinen unter den beschriebenen Anreicherungs- und Meßbedingungen ermöglichen können, stellen verschiedene bekannte und künftige Möglichkeiten zur selektiven Markierung von Aminosäuren oder kovalenten Modifikationen dar, die zu Masseveränderungen führen und so massenspektroskopisch nachgewiesen werden können.
- Bei dem körpereigenem Material handelt es sich bevorzugt um Material, daß von einem lebenden Organismus entnommen wurde, aber auch die ex mortem Entnahme ist erfindungsgemäß vorgesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den körpereigenen Materialien um Körperflüssigkeiten, Gewebe und/oder Organe. Dabei könnten die Körperflüssigkeiten Blut, Serum, Plasma, Harn, Milch, Schweiß, Speichel und/oder Liquor sowie alle anderen Körperflüssigkeiten sein. Das Blut kann dabei durch Punktion von Blutgefäßen (Venenpunktion) gewonnen werden. Auf Grund des sehr geringen Volumens, das für die Analyse benötigt wird, kann Blut auch durch die Punktion von Blutkapillaren (beispielsweise der Fingerbeere) gewonnen werden. Die Blutentnahme bzw. die Plasma-/Serumgewinnung sowie die Gewinnung anderer Körperflüssigkeiten erfolgt nach etablierten Verfahren. Sie beinhalten die Punktion der Gefäße, Trennung der Blutbestandteile, vorzugsweise durch Zentrifugation, und die Lagerung, vorzugsweise bei -80°C. Im Fall einer unmittelbaren Analyse ist die Probe vorzugsweise bis zur Analyse bei 4°C zu lagern. Gewebe und Organe werden durch etablierte Biopsieverfahren oder post mortem entnommen und entsprechend etablierten Verfahren gelagert. Vor der Analyse müssen die Organe und Gewebe zunächst beispielsweise nach etablierten Verfahren in entsprechenden Puffer homogenisiert werden. Als Puffer bietet sich beispielsweise Tris-HCl (pH 7,8) an. Die Körperflüssigkeiten wie z. B. Serum, Plasma, Liquor oder Harn können in der Originalkonzentration, verdünnt oder aufkonzentriert auf das Trägermaterial als definiertes Volumen mittels einer Pipette aufgetragen werden. Zur Vergrößerung des Auftragvolumens kann ein Adapter verwendet werden. Ein vergleichbares Vorgehen bietet sich für die Homogenate von Geweben und Organen an. Verdünnungsschritte und Probenvolumen (> 2 µl) sind von der Konzentration des zu untersuchenden Peptides und Proteins in der jeweiligen Matrix, z. B. Lösung, abhängig. Eine selektive Anreicherung auf dem Trägermaterial kann beispielsweise durch selektive Fraktionierung erfolgen. Methoden für Gewebehomogenate und den Harn sind dem Fachmann bekannt.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Trägermaterial um ein chromatographisches Trägermaterial. Dieses chromatographische Trägermaterial kann ein hydrophobes, hydrophiles, kationenaustauschendes, anionenaustauschendes und/oder metallionenbindendes Trägermaterial sein, aber auch alle anderen chromatographischen Trägermaterialien werden von dem erfindungsgemäßen Verfahren beansprucht. Die Bindung erfolgt während einer Inkubationsperiode, deren Parameter (Dauer, Temperatur etc.) von der Matrix und der Konzentration des jeweils zu untersuchenden Peptids oder Proteins abhängig sind. In einem weiteren Schritt (Waschschritt) erfolgt die selektive Entfernung möglichst vieler Stoffe, insbesondere Proteine und Peptide, von der Matrix bzw. dem Trägermaterial, die nicht von Interesse sind. Als Differenzierungskriterien zwischen endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere Peptid- oder Proteinvarianten, dienen beispielsweise spezielle Bindungen an bestimmte chromatographische Oberflächen, Unterschiede in der Bindungsintensität an diese Oberflächen in Abhängigkeit von der Stringens des Waschpuffers etc. Als Trägermaterial kann aber auch ein immobilisiertes Trägermaterial genutzt werden, welches in einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens beansprucht wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dieses immobilisierte Trägermaterial mit Antikörpern, Bindungsproteinen und/oder Rezeptoren immobilisiert worden. Dabei kann das Trägermaterial bzw. die Oberfläche des Trägermaterials vor Immobilisierung aktiviert werden. Auf diesen aktivierten/inaktivierten Trägermaterialien wird entsprechend publizierten Standardverfahren entweder ein Antikörper (monoklonal/polyklonal), Bindungsproteine und/oder Rezeptoren immobilisiert, die in der Lage sind, endogene und exogene Stoffe, z. B. STH oder Erythropoetin zu binden und so zusammen mit evtl. vorhandenen Fragmenten oder Varianten aus komplexen Matrizes, z. B. Lösungen, zu fischen. Die Kopplung von Antikörpern, Bindungsproteine und/oder Rezeptoren kann entweder direkt oder über einen Spacer erfolgen. Durch die Verwendung eines Spacers kann die Orientierung des Antikörpers, Bindungsproteins und/oder Rezeptors kontrolliert werden. Die Kopplung von Antikörpern oder Rezeptoren erfolgt in üblicher Weise während einer Inkubationsperiode, deren Parameter (Dauer, Temperatur etc.) von der Matrix und der Konzentration des jeweils zu untersuchenden Stoffes, insbesondere der Peptid- und/oder Proteinverbindung, abhängig ist. In einem weiteren Schritt (Waschschritt) erfolgt die Entfernung aller in der Matrix vorhandenen Substanzen, die nicht auf dem Trägermaterial gebunden wurden bzw. nicht von Interesse sind.
- Bei dem Trägermaterial kann es sich z. B. um einen Chip, vorzugsweise einen Proteinchip, handeln. Auf oder an diesem Chip kann die Anreicherung, der Nachweis und ggf. eine notwendige Modifizierung erfolgen.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die endogenen und exogenen Stoffe vor deren Nachweis voneinander abgetrennt. Diese Abtrennung der endogenen und exogenen Stoffe kann vor oder nach der Anreicherung auf einem geeigneten Trägermaterial erfolgen. Desweiteren kann die Abtrennung nach erfolgter Modifizierung, insbesondere Fraktionierung und/oder Markierung, erfolgen. So lassen sich z. B. die schon weiter oben dargestellten Modifikationen der Stoffe, wie beispielsweise Glykosylierung oder Phosphorylierung, durch die enzymatische Vorbehandlung der auf dem Trägermaterial (eventuell zuvor angereicherten) gereinigten endogenen und exogenen Stoffe mit beispielsweise Glykosidasen oder Phosphorylasen zur Auftrennung nutzen.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die endogenen und exogenen Stoffe über ihre unterschiedlichen Molekulargewichte nachgewiesen. So stellt z. B. das sogenannte SELDI (für surface enhanced laser desorption/ionization)-Verfahren ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von endogenen und exogenen Stoffen anhand des unterschiedlichen Molekulargewichts dar. Auch kann eine Analyse über z. B. Flugzeitmassenspektrometer (TOF [time-of-flight]-Analysator) oder vergleichbaren Apparaturen erfolgen, die eine Differenzierung auf der Basis der Molekülmasse oder beispielsweise anderen Selektionsmethoden erlauben. Die Stoffe werden dabei nach Zugabe einer energieabsorbierenden Matrix mit Hilfe eines Laserstrahls ionisiert und anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt. Die Schußfrequenz des Laserstrahls beträgt dabei im Durchschnitt 50 bis 100 Schüsse. Aus der Flugzeit der Stoffe vom Probenträger bis zum Detektor am Ende des Flugtunnels wird die Molekülmasse der gebundenen Partikel und ihrer eventuell vorhandenen Fragmente bestimmt. Die Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen erfolgt in der Regel auf der Basis des Unterschieds des Molekulargewichts der Stoffe und/oder ihrer eventuell vorhandenen Fragmente. Die Genauigkeit des Systems in Bezug auf die Aussage über das Molekulargewicht (in Abhängigkeit von der Molekülgröße) beträgt ca. 0,1 bis 0,01 Prozent.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die endogenen und exogenen Stoffe quantifiziert. Dies Quantifizierung kann dabei über Standards von endogenen und exogenen Stoffen erfolgen.
- Abschließend werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die exogenen Stoffe anhand ihrer charakteristischen Modifizierung, insbesondere anhand ihrer bereits vorhandenen Modifizierung, voneinander unterschieden. So erfolgt z. B. die Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen in der Regel auf der Basis des Unterschiedes des Molekulargewichts der Stoffe, insbesondere Peptid- und Proteinverbindung, oder ihrer Fragmente. Diese Unterschiede ergeben sich beispielsweise aus einer oder mehreren zusätzliche Aminosäuren. Die N-terminale Verlängerung des z. B. rekombinanten Wachstumshormons führt beispielsweise zu einer Erhöhung des Molekulargewichtes. Die Genauigkeit des z. B. TOF-Analysators in Bezug auf die Aussage über das Molekulargewicht (in Abhängigkeit von der Molekülgröße beträgt die Meßgenauigkeit 0,1 bis 0,01%) erlaubt daher nicht nur die Differenzierung zwischen endogenen und exogenen Stoffen, z. B. Wachstumshormonvarianten, sondern im Fall von Unterschieden in der Länge der N- terminalen Verlängerung auch Hinweise auf die Quelle des rekombinanten Wachstumshormons. Auch Modifikationen im Bereich der Zuckerreste wie beispielsweise beim Erythropoetin können so direkt oder nach beispielsweise enzymatische Modifikation nachgewiesen und z. B. zur Zuordnung zu einem bestimmten Produzenten genutzt werden.
- Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens und von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die jeweiligen Merkmale für sich allein oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
- Spezifische monoklonale bzw. polyklonale Antikörper gegen die zu untersuchenden Partikel sowie eine IgG-Kontrolle in einer Konzentration zwischen 0,01 und 0,09 mg/ml werden in einem Volumen von 20 µl auf die voraktivierten Oberflächen eines Trägermaterials aufgetragen. Anschließend erfolgt die Inkubation in einer wasserdampfgesättigten Kammer (Inkubationskammer) für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4°C über Nacht (14-16 Stunden). Während dieser Inkubationsperiode werden die Antikörper kovalent an die aktivierten Trägermaterialoberflächen gebunden. Die verbleibenden freien Stellen des Trägermaterials werden durch die nun anschließende Zugabe von 20 µl Glyzerinlösung (0,1 M, pH 7,8) blockiert. Es erfolgt eine weitere Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Anschließend wird die Antikörperlösung durch mehrmaliges Waschen entfernt. Im ersten Schritt wird das Trägermaterial mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,8)- Lösung (50-100 µl) gewaschen. Anschließend erfolgt eine zweimalige Waschung mit jeweils 300 µl PBS-Lösung, die 0,5% (v/v) Triton X-100 enthält. Die Inkubationsdauer bei Raumtemperatur beträgt dabei jeweils 20 Minuten in der Inkubationskammer. Anschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit jeweils 300 µl PBS (ohne Triton X-100) für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer.
- Die Aufgabe des Probenmaterials erfolgt entweder direkt auf das voraktivierte und immobilisierte Trägermaterial bei geringem Probenmaterial (Volumen < 5 µl) oder über einen Adapter (Volumen > 5 µl). Die Inkubation erfolgt für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Anschließend wird das Probenmaterial mittels einer Pipette entfernt, und das beladene Trägermaterial wird zweimal mit jeweils 300 µl PBS-Lösung, die 0,5% (v/v) Triton X-100 enthält gewaschen. Die Inkubationsdauer bei Raumtemperatur beträgt dabei jeweils 10 Minuten in der Inkubationskammer. Anschließend erfolgen zwei weitere Waschschritte mit jeweils 300 µl PBS (ohne Triton X-100) für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Inkubationskammer. Die letzten beiden Waschschritte erfolgen mit Wasser (300 µl) für jeweils 10 Minuten. Anschließend wird das Trägermaterial getrocknet. Als energieabsorbierende Substanz wird beispielsweise alpha-Cyano-4-hydroxy Zimtsäure (2 mg/ml) in 50% (v/v) Acetonitril und 0,2% (v/v) Tri-flouressigsäure zugegeben. Die Analyse der endogenen und exogenen Stoffe erfolgt anschließend mit Hilfe eines Flugzeitmassenspektrometers.
- Durch diese Erfindung ist es möglich, aus z. B. einem komplexen Proteingemisch sehr ähnliche Varianten eines speziellen Peptids oder Proteins - beispielsweise des Wachstumshormons und des Erythropoetins - anzureichern und nachzuweisen, aber auch der Nachweis von anderen endogenen und exogenen Stoffen ist möglich. Der Gegenstand der Erfindung vereinigt daher unter anderem die hohe Selektivität von Antikörpern oder anderen Affinitätsschritten mit einer hohen Genauigkeit der Bestimmung des Molekulargewichtes der angereicherten Stoffe bzw. Moleküle. Nach der Aufgabe der Matrix auf die Trägermaterialoberfläche kann unter anderem die Anreicherung, Modifikation (enzymatische Spaltung) und der Nachweis auf dieser erfolgen. Damit werden ferner auch Fehlerquellen und das Kontaminationsrisiko reduziert. Ein Analysendurchgang ist im allgemeinen innerhalb von 4 Stunden abgeschlossen. Der Probendurchsatz ist vom Automatisierungsgrad abhängig.
Claims (14)
1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Differenzierung von
endogenen und exogenen Stoffen, insbesondere von Stoffen mit
mindestens einer Peptidbindung, dadurch gekennzeichnet, daß die in
entnommenem körpereigenen Material, insbesondere von einem
menschlichen oder tierischen Organismus entnommene
körpereigene Material, vorhandenen endogenen und exogenen Stoffe auf
einem Trägermaterial angereichert werden, und anschließend
diese Stoffe über ihre unterschiedlichen Massen nachgewiesen
und/oder differenziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei den endogenen und exogenen Stoffen um Peptide,
Polypeptide, Proteine, Peptidhormone und/oder Proteohormone handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei den Peptid- und/oder Proteohormonen um STH (somatotropes
Hormon), Erythropoetin, ACTH (adrenocorticotropes Hormon),
und/oder HCG (menschliches Choriongonadotropin) handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß vor der Anreicherung und/oder dem Nachweis der
endogenen und exogenen Stoffe diese modifiziert, insbesondere
fraktioniert und/oder markiert, werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei den körpereigenen Materialien
um Körperflüssigkeiten, Gewebe und/oder Organe handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei den Körperflüssigkeiten um Blut, Serum, Plasma, Harn, Milch,
Schweiß, Speichel und/oder Liquor handelt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägermaterial um ein
chromatographisches Trägermaterial handelt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei dem chromatographischen Trägermaterial um ein
hydrophobes, hydrophiles, kationenaustauschendes,
anionenaustauschendes und/oder metallionenbindendes Trägermaterial handelt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Trägermaterial um ein
immobilisiertes Trägermaterial handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
bei dem immobilisierten Trägermaterial um ein mit Antikörpern,
Bindungsproteinen und/oder Rezeptoren immobilisiertes
Trägermaterial handelt.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die endogenen und exogenen Stoffe vor
deren Nachweis voneinander abgetrennt werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die endogenen und exogenen Stoffe mit der
SELDI- und/oder TOF-Methode nachgewiesen werden.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die endogenen und exogenen Stoffe
quantifiziert werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die exogenen Stoffe anhand ihrer
charakteristischen Modifizierungen, insbesondere anhand ihrer bereits
vorhandenen Modifizierungen, voneinander unterschieden werden.
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