DE19617202A1

DE19617202A1 - Recombinant interleukin 16

Info

Publication number: DE19617202A1
Application number: DE19617202A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Prof Dr Kurth; Michael Dr Baier; Norbert Bannert; Albrecht Dr Werner; Kurt Dr Lang
Original assignee: Bundesministerium fuer Gesundheit; Boehringer Mannheim GmbH; Federal Government of Germany
Current assignee: Bundesrepublik Deutschland Vertreten Durch Das Bun
Priority date: 1996-04-30
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 1997-11-06
Also published as: ZA973688B

Abstract

Nucleic acid sequence (I) encoding an interleukin 16 (IL-16) with the amino-terminal sequence Ser-Ala-Ala, and having the 366 bp nucleic acid sequence given in the specification, is claimed. Also claimed are: (1) prokaryotic or eukaryotic host cell transformed or transfected with (I); (2) vector comprising (I); (3) primate, preferably human, IL-16 obtainable as a eukaryotic expression product after processing; (4) IL-16 polypeptide encoded by (I); (5) IL-16 polypeptide which is a multimer comprising several subunits, 1 of which is the polypeptide of (4); and (5) antibody that binds a portion of an IL-16 polypeptide with the amino acid sequence: Ser-Ala-Ala-Ser-Ala-Ser-Ala.

Description

Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide mit IL-16-Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstel lung und ihre Verwendung. Die Erfindung beschreibt korrekt prozessiertes IL-16.The invention relates to polypeptides with IL-16 activity, processes for their preparation treatment and its use. The invention describes correctly processed IL-16.

IL-16 (Interleukin-16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus suppressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. IL-16 und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 sowie von Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 und von Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von IL-16 beschrieben. Danach ist IL-16 ein Protein mit einer mo lekularen Masse von 13,385 D. Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsiebchromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert. Dieser multimeren Form, welche ein kationisches Homotetramer ist (Produktinformation AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11 177 186), wird die "chemoattractant activity" zugeschrieben. Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben. Die von Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattractant activity" und die von Baier beschrie bene Aktivität von rekombinantem humanem IL-16 sind jedoch sehr gering.IL-16 (Interleukin-16) is a lymphokine, which is also called "lymphocyte chemoattracting factor "(LCF) or" immunodeficiency virus suppressing lymphokine "(ISL) is called. IL-16 and its properties are described in WO 94/28134, the European patent application No. 95 113 013.7 and by Cruikshank, W.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 and by Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563. There is also that recombinant production of IL-16 described. Thereafter, IL-16 is a protein with a mo molecular mass of 13.385 D. Cruikshank also found that ISL is in a Molecular sieve chromatography as a multimeric form with a molecular weight of 50-60 or 55-60 kD eluted. This multimeric form, which is a cationic homotetramer (Product information AMS Biotechnology Ltd., Europe, Cat. No. 11 177 186), the attributed to "chemoattractant activity". Baier developed a homodimeric form of IL-16 with a molecular weight of 28 kD. The by Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 described "chemoattractant activity" and that described by Baier However, the level of activity of recombinant human IL-16 is very low.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von IL-16 zu verbessern und IL-16-For men bereitzustellen, die geringe Immunogenität zeigen und vorteilhaft für eine therapeuti sche Anwendung geeignet sind.The object of the present invention is to improve the activity of IL-16 and IL-16-For To provide men who show low immunogenicity and advantageous for a therapeutic suitable application.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine Nukleinsäure, mit welcher die Expression eines Polypeptids mit Interleukin-16-Aktivität in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle erreicht werden kann, wobei die genannte NukleinsäureThe object of the invention is achieved by a nucleic acid with which the expression of a polypeptide with interleukin-16 activity in a prokaryotic or eukaryotic Host cell can be reached, said nucleic acid

a) corresponds to the DNA sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary strand,
b) hybridi with the DNA of the sequence SEQ ID NO: 1 under stringent conditions siert,
c) or a nucleic acid sequence that is without the degeneration of the genetic String codes with the nucleic acid sequences defined by a) or b) hybridized conditions
d) and at the 5 'end for one of the amino acid sequences SEQ ID NO: 3 to 7 coded.

Eine solche Nukleinsäure codiert ein korrekt prozessiertes Polypeptid mit IL-16-Aktivität, besonders bevorzugt natürliches IL-16 von Primaten, wie humanes IL-16 oder IL-16 einer Affenart oder eines anderen Säugetiers, wie z. B. Maus.Such a nucleic acid encodes a correctly processed polypeptide with IL-16 activity, particularly preferably natural IL-16 from primates, such as human IL-16 or IL-16 one Monkey or other mammal, such as. B. mouse.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Fig. 2 der WO 94/28134 nicht das korrekt prozessierte IL-16 beschreibt. Das Startcodon "ATG" der precursor-Form des Proteins beginnt nicht mit Nukleotid 783, sondern mit Nukleotid 54 oder 174. Dieser Leserahmen ergibt sich, wenn nach Nukleotid 156 ein A, nach Nukleotid 398 ein C und nach Nukleotid 780 ein G eingefügt wird. Die Sequenz zeigt noch weitere Unterschiede zu Fig. 2 der WO 94/28134. Dabei handelt es sich allerdings nur um Nukleotidaustausche (313 G in A, 717 C in A). Bei der Expression in eukaryontischen Zellen wird IL-16 prozessiert. Dabei entsteht ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2. Die Kenntnis des korrekt prozessierten IL-16 erlaubt die Herstellung von IL-16 und Derivaten mit hoher Aktivität und geringer Immunogenität.Surprisingly, it has been shown that FIG. 2 of WO 94/28134 is not correct processed IL-16 describes. The start codon "ATG" of the precursor form of the protein does not start with nucleotide 783, but with nucleotide 54 or 174. This reading frame results if there is an A after nucleotide 156, a C after nucleotide 398 and after nucleotide 780 a G is inserted. The sequence shows still further differences from FIG. 2 of the WO 94/28134. However, these are only nucleotide exchanges (313 G in A, 717 C in A). When expressed in eukaryotic cells, IL-16 is processed. This creates a polypeptide according to SEQ ID NO: 2. Knowledge of the correctly processed IL-16 allows the Production of IL-16 and derivatives with high activity and low immunogenicity.

IL-16 kann sich in seiner Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Protein sequenzen in gewissem Umfang unterscheiden. Solche Sequenzvariationen können Amino säureaustausche, -deletionen oder -additionen sein. Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz von IL-16 jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenigstens 90% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1. Varianten von Teilen der Amino- und Nuklein säuresequenz SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 sind beispielsweise in der europäischen Patent anmeldung Nr. 95 113 013.7 und den deutschen Patentanmeldungen Nr. 195 48 295.6 und 195 47 933.5 beschrieben. Wesentlich ist jedoch, daß die Polypeptide einen korrekten N-Terminus besitzen. IL-16 wird vermutlich in vivo von Interleukin Converting Enzymes (ICE) gespalten (Black, R.A. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 9437-9442, Fanchen, C. et al., EMBO J. 14 (1995) 1914-1922, Singer, J.I., J. Exp. Med. 182 (1995) 1447-1459).IL-16 can differ in its sequence from the protein encoded by such DNA sequences distinguish sequences to a certain extent. Such sequence variations can be amino acid exchanges, deletions or additions. Preferably the amino acid sequence is of IL-16, however, is at least 75%, particularly preferably at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Variants of parts of the amino and nuclein acid sequence SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2 are for example in the European patent application No. 95 113 013.7 and German patent applications No. 195 48 295.6 and 195 47 933.5. It is essential, however, that the polypeptides are correct Possess N-terminus. IL-16 is believed to be produced in vivo by Interleukin Converting Enzymes (ICE) cleaved (Black, R.A. et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 9437-9442, Fanchen, C. et al., EMBO J. 14 (1995) 1914-1922, Singer, J.I., J. Exp. Med. 182 (1995) 1447-1459).

Unter Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind beispielsweise DNA, RNA und Nukleinsäu rederivate und -Analoga zu verstehen. Bevorzugte Nukleinsäure-Analoga sind solche Verbin dungen, bei denen das Zuckerphosphatgerüst durch andere Einheiten, wie z. B. Aminosäuren, ersetzt ist. Solche Verbindungen werden als PNA bezeichnet und sind in der WO 92/20702 beschrieben. Da beispielsweise PNA-DNA-Bindungen stärker als DNA-DNA-Bindungen sind, sind die nachstehend beschriebenen stringenten Bedingungen für PNA-DNA-Hybridisierung nicht anwendbar. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind jedoch in der WO 92/20703 beschrieben.For the purposes of the invention, nucleic acids include, for example, DNA, RNA and nucleic acid understand rederivate and analogues. Such nucleic acids are preferred nucleic acid analogs dungen, in which the sugar phosphate structure by other units such. B. amino acids, is replaced. Such compounds are referred to as PNA and are described in WO 92/20702 described. For example, since PNA-DNA bonds are stronger than DNA-DNA bonds, are the stringent conditions for PNA-DNA hybridization described below not applicable. Suitable hybridization conditions are, however, in WO 92/20703 described.

Unter dem Ausdruck "IL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von IL-16 zu verstehen. Vorzugsweise zeigt IL-16 in dem in der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschriebenen Testverfahren die genannte Wirkung oder stimuliert die Zell teilung gemäß WO 94/28134.For the purposes of the invention, the expression "IL-16" is a polypeptide with the activity of To understand IL-16. Preferably IL-16 shows in that in the European patent application No. 95 113 013.7 the test method described the effect or stimulates the cell division according to WO 94/28134.

IL-16 bindet an CD4⁺ Lymphozyten und kann die Replikation von Viren, wie beispielsweise HIV-1, HIV-2 und SIV supprimieren. Die Funktion von IL-16 ist nicht durch seine Präsenta tion im MHC-Komplex limitiert.IL-16 binds to CD4⁺ lymphocytes and can replicate viruses such as Suppress HIV-1, HIV-2 and SIV. The function of IL-16 is not through its presenta tion in the MHC complex limited.

Insbesondere zeigt IL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:In particular, IL-16 exhibits one or more of the following properties:

Binding to T cells via the CD4 receptor,
- Stimulation of the expression of IL-2 receptor and / or HLA-DR antigen on CD4⁺ lymphocytes,
Stimulation of the proliferation of T helper cells in the presence of IL-2,
- Suppression of proliferation of those stimulated with anti-CD3 antibodies T helper cells,
- Suppression of replication of viruses, preferably HIV-1, HIV-2 or SIV.

Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäu refragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0 × SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2 × SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0 × SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2 × SSC bei 50°C für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Stringenz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden. The term "hybridize under stringent conditions" means that two nucleic acids hybridize with each other under standardized hybridization conditions, such as for example described in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, United States. Such conditions are, for example, hybridization in 6.0 × SSC at approximately 45 ° C followed by a wash at 2 x SSC at 50 ° C. To select the stringency the salt concentration in the washing step can be, for example, between 2.0 × SSC at 50 ° C. low stringency and 0.2 × SSC at 50 ° C for high stringency. In addition the temperature of the washing step between room temperature, approx. 22 ° C, for low Stringency and 65 ° C with high stringency can be varied.

IL-16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7, die auch hierfür Gegenstand der Offen barung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemäßen Formen von IL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnah men ergriffen werden.IL-16 preferably becomes recombinant in prokaryotic or eukaryotic host cells produced. Such manufacturing processes are described, for example, in WO 94/28134 and European Patent Application No. 95 113 013.7, which is also the subject of the Offen tion of the present invention. However, in order for the forms of IL-16 must be defined and obtained reproducibly by recombinant production the methods familiar to the skilled worker for recombinant production additional measures men are taken.

Die Herstellung von rekombinantem IL-16 kann nach den dem Fachmann geläufigen Metho den erfolgen. Dazu wird zunächst eine DNA hergestellt, welche in der Lage ist, ein Protein zu produzieren, welches die Aktivität von IL-16 besitzt. Die DNA wird in einen Vektor kloniert, der in eine Wirtszelle transferiert werden kann und dort replizierbar ist. Ein derartiger Vektor enthält zusätzlich zur IL-16-Sequenz Regulator-Elemente, die zur Expression der DNA-Se quenz erforderlich sind. Dieser Vektor, der die IL-16-Sequenz und die Regulator-Elemente enthält, wird in einen Vektor transferiert, der in der Lage ist, die DNA von IL-16 zu exprimie ren. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen, die zur Amplifikation des Vektors geeignet sind, kultiviert und IL-16 gewonnen. Dabei wird durch geeignete Maßnahmen sichergestellt, daß das Protein eine aktive tertiäre Struktur einnehmen kann, in der es IL-16-Eigenschaften zeigt.The production of recombinant IL-16 can be carried out according to the method known to the person skilled in the art the done. For this purpose, a DNA is first produced, which is able to convert a protein produce, which has the activity of IL-16. The DNA is cloned into a vector which can be transferred to a host cell and replicable there. Such a vector contains in addition to the IL-16 sequence regulatory elements that are used to express the DNA Se quenz are required. This vector, the IL-16 sequence and the regulatory elements is transferred to a vector that is capable of expressing the DNA of IL-16 ren. The host cell is, under conditions suitable for the amplification of the vector, cultivated and won IL-16. Suitable measures are taken to ensure that the protein can take an active tertiary structure in which it shows IL-16 properties.

Dabei ist es nicht erforderlich, daß das exprimierte Protein die exakte IL-16-Aminosäurese quenz aus SEQ ID NO: 1 enthält. Ebenso geeignet sind Proteine, welche im wesentlichen die gleiche Sequenz enthalten und analoge Eigenschaften zeigen. Insbesondere geeignet sind Proteine, die N-terminal mit SEQ ID NO: 3 bis 7 beginnen.It is not necessary for the expressed protein to have the exact IL-16 amino acid contains a sequence from SEQ ID NO: 1. Proteins, which are essentially the most suitable contain the same sequence and show similar properties. Are particularly suitable Proteins that begin N-terminal with SEQ ID NO: 3 to 7.

Auch die Nukleinsäuresequenz des Proteins kann modifiziert sein. Derartige Modifikationen sind beispielsweise:The nucleic acid sequence of the protein can also be modified. Such modifications are for example:

- Change the nucleic acid to different recognition sequences from Restriction enzymes to facilitate the steps of ligation, cloning and To introduce mutagenesis
- Change the nucleic acid to incorporate preferred codons for the Host cell
- Supplementation of the nucleic acid with additional operator elements to the express sion in the host cell.

Die Expression des Proteins erfolgt vorzugsweise in Mikroorganismen, insbesondere in Pro karyonten, und dort in E. coli. Die Expression in Prokaryonten führt zu einem unglycosylier ten Polypeptid.The protein is preferably expressed in microorganisms, in particular in Pro caryotes, and there in E. coli. Expression in prokaryotes leads to an unglycosylation th polypeptide.

Die Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der die Expression des Proteins im Wirtsorganismus erlaubt. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und sind bei spielsweise lac Promotor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp Promotor (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ_PL Promotor (Shimatake et al., Nature 292 (1981)128) und T5 Promotor (US-Patent Nr. 4,689,406). Ebenfalls geeignet sind synthetische Promoto ren wie beispielsweise tac Promotor (US-Patent Nr. 4,551,433). Ebenso geeignet sind ge koppelte Promotorsysteme wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). Ebenso geeignet sind hybride Promotoren aus einem Bacteriophagen-Promotor und der Operator-Region des Mikroorganismus (EP-A 0 267 851). Zusätzlich zum Promotor ist eine effektive Ribosomenbindungsstelle erforderlich. Für E. coli wird diese Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).The expression vectors must contain a promoter which allows expression of the protein in the host organism. Such promoters are known to the person skilled in the art and are, for example, lac promoter (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp promoter (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), λ _PL promoter ( Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128) and T5 promoter (U.S. Patent No. 4,689,406). Synthetic promoters such as, for example, tac promoter (US Pat. No. 4,551,433) are also suitable. Coupled promoter systems such as, for example, T7 RNA polymerase / promoter system (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113) are also suitable. Hybrid promoters comprising a bacteriophage promoter and the operator region of the microorganism are also suitable (EP-A 0 267 851). An effective ribosome binding site is required in addition to the promoter. For E. coli, this ribosome binding site is referred to as the Shine-Dalgarno (SD) sequence (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA).

Zur Verbesserung der Expression ist es möglich, das Protein als Fusionsprotein zu exprimie ren. In diesem Fall wird üblicherweise eine DNA-Sequenz, welche für den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder ein anderes stabiles Protein codiert, an das 5′-Ende der für IL-16 codierenden Sequenz fusioniert. Beispiele hierfür sind beispielsweise lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166).To improve expression, it is possible to express the protein as a fusion protein In this case, a DNA sequence is usually used, which is for the N-terminal part an endogenous bacterial protein or another stable protein, at the 5'-end of the sequence coding for IL-16 fused. Examples include lacZ (Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884), trpE (Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166).

Nach Expression des Vektors, vorzugsweise eines biologisch funktionellen Plasmids oder eines viralen Vektors, werden die Fusionsproteine vorzugsweise mit Enzymen (z. B. Faktor Xa) gespalten (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Weitere Beispiele für die Spaltstellen die IgA-Protease-Spaltstelle (WO 91/11520, EP-A 0 495 398) und die Ubiquitin-Spaltstelle (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698).After expression of the vector, preferably a biologically functional plasmid or of a viral vector, the fusion proteins are preferably treated with enzymes (e.g. factor Xa) cleaved (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Further examples of the cleavage sites IgA protease cleavage site (WO 91/11520, EP-A 0 495 398) and the ubiquitin cleavage site (Miller et al., Bio / Technology 7 (1989) 698).

Die auf diese Weise in Bakterien exprimierten Proteine werden durch Aufschluß der Bakterien und Proteinisolierung in üblicher Weise gewonnen.The proteins expressed in this way in bacteria are digested by the bacteria and protein isolation in the usual way.

In einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, die Proteine als aktive Proteine aus den Mikroorganismen zu sezernieren. Hierzu wird vorzugsweise ein Fusionsprodukt verwendet, welches aus der Signalsequenz, die für die Sekretion von Proteinen in den verwendeten Wirts organismen geeignet ist, und der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, besteht. Das Protein wird dabei entweder in das Medium (bei grampositiven Bakterien) oder in den peri plasmatischen Raum (bei gramnegativen Bakterien) sezerniert. Zwischen der Signalsequenz und der für IL-16 codierenden Sequenz ist zweckmäßig eine Spaltstelle angebracht, die ent weder bei der Prozessierung oder in einem zusätzlichen Schritt die Abspaltung des Proteins erlaubt. Derartige Signalsequenzen stammen beispielsweise von ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).In a further embodiment it is possible to select the proteins as active proteins from the To secrete microorganisms. A fusion product is preferably used for this, which from the signal sequence used for the secretion of proteins in the host organisms is suitable, and the nucleic acid which codes for the protein. The Protein is either in the medium (for gram-positive bacteria) or in the peri plasmatic space (in Gram-negative bacteria) secreted. Between the signal sequence and the sequence coding for IL-16 is suitably a cleavage site ent the protein is not split off either during processing or in an additional step allowed. Such signal sequences originate, for example, from ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), phoA (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212).

Zusätzlich enthalten die Vektoren noch Terminatoren. Terminatoren sind DNA-Sequenzen, die das Ende eines Transkriptionsvorganges signalisieren. Sie zeichnen sich meist durch zwei strukturelle Eigenarten aus: eine umgekehrt repetitive G/C-reiche Region, die intramolekular eine Doppelhelix bilden kann, sowie eine Anzahl von U(bzw. T)-Resten. Beispiele sind der Haupt-Terminator in der DNA des Phagen fd (Beck und Zink, Gene 16 (1981) 35-58) sowie rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).The vectors also contain terminators. Terminators are DNA sequences which signal the end of a transcription process. They are usually characterized by two structural peculiarities: an inversely repetitive G / C-rich region, the intramolecular can form a double helix and a number of U (or T) residues. Examples are the Main terminator in the DNA of phage fd (Beck and Zink, Gene 16 (1981) 35-58) as well rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).

Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren üblicherweise einen selektierbaren Marker, um transformierte Zellen zu selektieren. Derartige selektierbare Marker sind beispielsweise die Resistenzgene für Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Ebenso geeignete selektier bare Marker sind die Gene für essentielle Substanzen der Biosynthese von für die Zelle not wendigen Stoffen wie z. B. Histidin, Tryptophan und Leucin.In addition, the expression vectors usually contain a selectable marker, um to select transformed cells. Such selectable markers are, for example Resistance genes for ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, kanamycin, neomycin and Tetracycline (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Also suitable selection bare markers are the genes for essential substances of the biosynthesis of cells manoeuvrable fabrics such as B. histidine, tryptophan and leucine.

Es sind eine Vielzahl von geeigneten bakteriellen Vektoren bekannt. Beispielsweise sind für die folgenden Bakterien Vektoren beschrieben: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans und Streptomyces lividans (US-Patent Nr. 4,747,056).A variety of suitable bacterial vectors are known. For example, for described the following bacterial vectors: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans and Streptomyces lividans (U.S. Patent No. 4,747,056).

Weitere gentechnologische Verfahren zur Herstellung und Expression von geeigneten Vekto ren sind in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y. beschrieben.Other genetic engineering processes for the production and expression of suitable vectors Ren are in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y. described.

Eine Expression von rekombinanter IL-16 ist außer in prokaryontischen Mikroorganismen auch in Eukaryonten (wie beispielsweise CHO-Zellen, Hefe oder Insektenzellen) möglich. Als eukaryontisches Expressionssystem wird das Hefesystem oder Insektenzellen bevorzugt. Die Expression in Hefe kann über drei Arten von Hefevektoren (integrierende YI_P (yeast integra ting plasmids)-Vektoren, replizierende YR_P (yeast replicon plasmids)-Vektoren und episomale YE_P (yeast episomal plasmids)-Vektoren erfolgen. Näheres hierzu ist beispielsweise in S.M. Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57 beschrieben.In addition to prokaryotic microorganisms, recombinant IL-16 can also be expressed in eukaryotes (such as CHO cells, yeast or insect cells). The yeast system or insect cells is preferred as the eukaryotic expression system. Expression in yeast can be via three types of yeast vectors (integrating YI _P (yeast integrating plasmids) vectors, replicating YR _P (yeast replicon plasmids) vectors and episomal YE _P (yeast episomal plasmids) vectors. For more information, see for example in SM Kingsman et al, Tibtech 5 (1987) 53-57.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine prokaryontische oder eukaryontische Wirts zelle, welche mit einer Nukleinsäure, welche für ein erfindungsgemäßes IL-16-Polypeptid codiert, so transformiert oder transfiziert ist, daß die Wirtszelle das genannte Polypeptid exprimiert. Eine solche Wirtszelle enthält üblicherweise einen biologisch funktionellen Nukleinsäurevektor, vorzugsweise einen DNA-Vektor, eine Plasmid-DNA, welche diese Nukleinsäure enthält.Another object of the invention is a prokaryotic or eukaryotic host cell which contains a nucleic acid which is used for an IL-16 polypeptide according to the invention is encoded, transformed or transfected in such a way that the host cell contains said polypeptide expressed. Such a host cell usually contains a biologically functional one Nucleic acid vector, preferably a DNA vector, a plasmid DNA, these Contains nucleic acid.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist humanes Interleukin-16 oder Interleukin-16 aus Primaten, vorzugsweise humanes IL-16, wie es als Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression im wesentlichen frei von anderen Humanproteinen erhältlich ist. IL-16 ist ein Protein, welches monomer oder als Multimer bestehend aus monomerem IL-16 (im weiteren auch als Untereinheiten bezeichnet) vorkommt. Ein solches IL-16 beginnt N-terminal mit einer der Sequenzen SEQ ID NO: 3 bis 7. Das Molekulargewicht einer mono meren IL-16-Untereinheit beträgt vorzugsweise 12420,90 Da (berechnet, ohne Glycosylierung). Weiter bevorzugt ist ein monomeres IL-16-Polypeptid, welches nicht in weitere Untereinheiten aufspaltbar ist.Another object of the invention is human interleukin-16 or interleukin-16 from Primates, preferably human IL-16, as a product of a prokaryotic or eukaryotic expression is available essentially free of other human proteins. IL-16 is a protein which is monomeric or as a multimer consisting of monomeric IL-16 (hereinafter also referred to as subunits). Such an IL-16 begins N-terminal with one of the sequences SEQ ID NO: 3 to 7. The molecular weight of a mono meren IL-16 subunit is preferably 12420.90 Da (calculated without Glycosylation). A monomeric IL-16 polypeptide which is not in further subunits can be split.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die in der WO 94/28134 beschriebene Nuklein säure und Proteinsequenz von IL-16 nicht den natürlichen humanen Sequenzen entsprechen. Es handelt sich hier lediglich um ein IL-16-Fragment. Für eine therapeutische Anwendung ist es jedoch bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches entweder mit dem natürlichen Protein identisch ist oder sich vom natürlichen Protein nur geringfügig unterscheidet und mindestens vergleichbare Aktivität und Immunogenität zeigt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß natürliches IL-16 entgegen der bisherigen Annahme ein kleineres Protein mit einem Moleku largewicht von ca. 12,4 Da ist. Seine Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 beschrieben.It has surprisingly been found that the nuclein described in WO 94/28134 acid and protein sequence of IL-16 do not correspond to the natural human sequences. This is just an IL-16 fragment. For therapeutic use however, it prefers to use a protein that is either with the natural protein is identical or differs only slightly from the natural protein and at least shows comparable activity and immunogenicity. Surprisingly, it was found that Contrary to the previous assumption, natural IL-16 is a smaller protein with one molecule lar weight of approx. 12.4 Da. Its sequence is described in SEQ ID NO: 1.

Die Nukleinsäuresequenz von IL-16 kann im Rahmen der Erfindung Deletionen, Mutationen und Additionen erhalten. Die monomere Form von IL-16 kann in einer bevorzugten Ausfüh rungsform multimerisiert sein. Dadurch kann die Aktivität von IL-16 gesteigert werden. Vorzugsweise sind solche multimeren Formen dimere, tetramere oder oktamere Formen. In the context of the invention, the nucleic acid sequence of IL-16 can be deletions, mutations and get additions. The monomeric form of IL-16 can be in a preferred embodiment be multimerized. This can increase the activity of IL-16. Such multimeric forms are preferably dimeric, tetrameric or octameric forms.

In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung zusätzlich einen definierten Gehalt an Metallionen enthalten, wobei die Anzahl der Metallionen pro Unterein heit vorzugsweise 0,5 bis 2 beträgt.In a further embodiment, the polypeptides of the invention can additionally have one contain defined content of metal ions, the number of metal ions per subunit unit is preferably 0.5 to 2.

Als Metallionen im Sinne der Erfindung sind eine Vielzahl von Metallionen geeignet. Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Kalzium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwer tig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von MgCl₂, CaCl₂, MnCl₂, BaCl₂, LiCl₂, Sr(NO₃)₂, Na₂MoO₄, AgCl₂.A large number of metal ions are suitable as metal ions in the sense of the invention. How to has shown, both alkaline earth metals and elements of the subgroups are suitable. Alkaline earth metals, cobalt, zinc, selenium, manganese, nickel, copper, iron, Magnesium, calcium, molybdenum and silver. The ions can be one, two, three or four be active. Divalent ions are particularly preferred. The ions are preferably called Solutions added by MgCl₂, CaCl₂, MnCl₂, BaCl₂, LiCl₂, Sr (NO₃) ₂, Na₂MoO₄, AgCl₂.

Solche multimeren Formen und metallionenhaltige Formen von IL-16 sind in der deutschen Patentanmeldung Nr. 195 47 933.5 beschrieben.Such multimeric forms and forms of IL-16 containing metal ions are in German Patent application No. 195 47 933.5.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann dadurch hergestellt werden, daß eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert oder transfiziert ist, unter geeigneten Nährbedingungen kultiviert wird und das gewünschte Polypeptid gegebenenfalls isoliert wird. Falls die Herstellung des Poly peptids im Rahmen einer gentherapeutischen Behandlung in vivo erfolgen soll, wird das Poly peptid natürlich nicht aus der Zelle isoliert.The polypeptide according to the invention can be produced in that a prokaryotic or eukaryotic host cell which has a nucleic acid sequence according to claims 1 or 2 is transformed or transfected, is cultivated under suitable nutrient conditions and optionally isolating the desired polypeptide. If the production of the poly peptide is to be carried out in vivo as part of a gene therapy treatment, the poly peptide is of course not isolated from the cell.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid in einer für eine therapeutische Anwendung ausreichenden Menge und/oder spezifische Aktivität sowie gegebenenfalls ein pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Trägermittel enthält.Another object of the invention is a pharmaceutical composition containing a Polypeptide according to the invention in a sufficient for a therapeutic application Amount and / or specific activity and optionally a pharmaceutically suitable one Contains diluent, adjuvant and / or carrier.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insbesondere geeignet zur Behandlung von patholo gischen Zuständen, die durch virale Replikation, insbesondere retrovirale Replikation, verur sacht sind, und zur Immunmodulation. Derartige therapeutische Anwendungen sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschrieben. Hierin sind ebenfalls auch diagnostische Testverfahren beschrieben.The polypeptides according to the invention are particularly suitable for the treatment of patholo conditions caused by viral replication, especially retroviral replication are gentle, and for immune modulation. Such therapeutic applications are in the European Patent Application No. 95 113 013.7. Here are also also diagnostic test procedures described.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Immunsuppression verwendet werden. Diese Immunsuppression erfolgt vorzugsweise über eine Hemmung der Helferfunk tion der TH₀ und/oder TH₁ und TH₂ Zellen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dem nach bei allen Erkrankungen von therapeutischem Wert, bei denen eine immundisregulatori sche Komponente bei der Pathogenese postuiert wird, insbesondere eine Hyperimmunität. Als IL-16-therapierbare Erkrankungen können in der Kardiologie/Angiologie Erkrankungen wie Myokarditis, Endokarditis und Perikarditis in Frage kommen, in der Pulmonologie beispiels weise Bronchitis, Asthma, in der Hämatologie Autoimmunneuropenien und Transplantatab stoßung, in der Gastroenterologie chronische Gastritis, in der Endokrinologie Diabetes mellitus Typ I, in der Nephrologie Glomerulonephritis, Erkrankungen im rheumatischen Formenkreis, Erkrankungen in der Ophthalmologie, in der Neurologie, wie Multiple Sklerose, in der Dermatologie Ekzeme. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Polypeptide bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und zur Vermeidung von Transplantatabstoßungen verwendet werden.The polypeptides according to the invention can preferably be used for immunosuppression will. This immunosuppression is preferably carried out by inhibiting helper radio tion of TH₀ and / or TH₁ and TH₂ cells. The polypeptides according to the invention are according to all diseases of therapeutic value in which an immune regulation postulated component in the pathogenesis, in particular hyperimmunity. As IL-16-treatable diseases can be used in cardiology / angiology diseases such as Myocarditis, endocarditis and pericarditis come into question, for example in pulmonology wise bronchitis, asthma, autoimmune Europe and hematology in hematology rejection, chronic gastritis in gastroenterology, diabetes in endocrinology mellitus type I, in nephrology glomerulonephritis, diseases in rheumatic Shape range, diseases in ophthalmology, in neurology, such as multiple sclerosis, in dermatology eczema. In particular, the polypeptides according to the invention can Autoimmune diseases, allergies and to avoid graft rejection be used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nuklein säuren im Rahmen der Gentherapie. Hierfür geeignete Vektorsysteme sind beispielsweise retrovirale oder nicht-virale Vektorsysteme.Another object of the invention is the use of the nuclein according to the invention acids in the context of gene therapy. Suitable vector systems for this are, for example retroviral or non-viral vector systems.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-IL-16-Anti körper oder ein immunoaktives Fragment davon, welcher an SEQ ID NO: 3 bindet, sowie Verfahren zur Herstellung von solchen Antikörpern und ihre Verwendung zur Bestimmung von IL-16 sowie zur Bestimmung von viralen Infektionen in eukaryontischen Zellen und insbesondere in Säugerzellmaterial. Mit IL-16 können auch Virus-aktivierte Säugerzellen, insbesondere T Zellen, bestimmt werden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt durch Immunisierung mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid. Die Herstellung eines solchen Antikörpers wird nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren durchgeführt.Another object of the invention is a polyclonal or monoclonal anti-IL-16 anti body or an immunoactive fragment thereof, which binds to SEQ ID NO: 3, and Process for the production of such antibodies and their use for determination of IL-16 and for the determination of viral infections in eukaryotic cells and especially in mammalian cell material. Virus-activated mammalian cells, in particular T cells. Such antibodies are produced by Immunization with a polypeptide according to the invention. The making of one Antibody is carried out according to the methods familiar to the person skilled in the art.

Die folgenden Beispiele und Publikationen sowie das Sequenzprotokoll erläutern die Erfin dung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.The following examples and publications as well as the sequence listing explain the Erfin tion, the scope of which results from the patent claims. The described Processes are to be understood as examples, which are the subject even after modifications describe the invention.

example 1 Cloning, Expression and Purification of IL-16 1.1 RNA isolation

5 × 10⁷PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 µg/ml Concanavalin A und 180 U/ml IL-2 kultiviert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslösung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert. Nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24 : 1) wurde das Lysat 15 min. auf Eis gehalten. Die wäßrige Phase wurde anschließend mit 6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufällen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert. Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 µl H₂O gelöst. Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 µg.5 × 10⁷PBMC (from humans or monkeys) were treated with 10 µg / ml Concanavalin A for 48 hours and 180 U / ml IL-2 cultured. To prepare the RNA, the cells were washed once with PBS washed and then with 5 ml denaturing solution (RNA isolation kit, Stratagene) lysed. After adding 1 ml Na acetate, 5 ml phenol and 1 ml chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) the lysate was 15 min. kept on ice. The aqueous phase was then with 6 ml of isopropanol mixed to precipitate the RNA and stored at -20 ° C for 2 hours. The The precipitate was finally washed once with pure ethanol and dissolved in 150 ul H₂O. The yield was determined photometrically and was 120 µg.

1.2 cDNA synthesis

Die Mischung für die cDNA Synthese enthielt 10 µg RNA, 0,2 µg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 µl "bulk first strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 µl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur späteren Verwendung gelagert.The mixture for the cDNA synthesis contained 10 μg RNA, 0.2 μg oligo-dT, 13 mM DTT and 5 µl "bulk first strand reaction mix" (first strand cDNA synthesis kit, Pharmacia) in a quantity of 15 µl. The mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour and then stored at -20 ° C for later use.

Amplifikation, Klonierung von IL-16 cDNA und Herstellung eines Expressionsklons erfolgen wie in der WO 94/28134 oder der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschrie ben, unter Berücksichtigung der veränderten Sequenzen.Amplification, cloning of IL-16 cDNA and production of an expression clone are carried out as described in WO 94/28134 or European Patent Application No. 95 113 013.7 ben, taking into account the changed sequences.

Example 2 10 l fermentation of an E. coli expression clone for IL-16 and high pressure digestion

Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkultu ren angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden. Das Überimpfvolumen in die nächst höhere Dimension beträgt jeweils 1-10 Vol.-%. Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/l) eingesetzt.Pre-cultivation is made from stock cultures (plate smear or ampoules stored at -20 ° C) are prepared, which are shaken and incubated at 37 ° C. The vaccination volume in the next higher dimension is 1-10 vol .-% in each case. For selection against plasmid loss, in Pre- and main culture ampicillin (50-100 mg / l) used.

Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C-Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusätzliche C-Quelle verwendet. Das Medium wird auf pH 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch verträglichen Konzentrationen zugesetzt. Die Fermentation wird als Feed batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt. Die Fermentations temperatur beträgt 25-37°C. Über Belüftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosagege schwindigkeit wird der gelöste Sauerstoffpartialdruck (pO₂) < 20% gehalten.Enzymatically digested protein and / or yeast extract as N and C source are used as nutrients as well as glycerin and / or glucose used as an additional C source. The medium is buffered to pH 7 and metal salts are used to stabilize the fermentation process added in physiologically acceptable concentrations. The fermentation is called a feed batch with a mixed yeast extract / C source dose. The fermentation temperature is 25-37 ° C. About ventilation rate, speed regulation and dosage counter speed, the dissolved oxygen partial pressure (pO₂) is kept <20%.

Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt. Mittels IPTG wird die Expression des IL-16 induziert. Nach einer Fermentationsdauer von ca. 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geerntet. Die Biomasse wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das gelöste IL-16 enthält, wird weiterverarbeitet.The growth is determined by determining the optical density (OD) at 528 nm. Means IPTG induces the expression of IL-16. After a fermentation period of approx. The biomass is harvested by centrifugation for 10 hours with the OD at a standstill. The biomass is taken up in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 100 mM sodium chloride, pH 7 and opened up via a continuous high pressure press at 1000 bar. The so obtained Suspension is centrifuged again and the supernatant, which contains the dissolved IL-16, becomes processed further.

Example 3 Purification of recombinant human IL-16

550 ml Aufschlußüberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8,0 versetzt, 30 min. gerührt und an schließend 30 min. bei 20 000 g zentrifugiert. 400 ml des Überstandes wurden auf eine Nickel-Che lat-Sepharose-Säule (V = 60 ml; Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 µMol NiCl₂/ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 äquillibriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,0 gespült und das IL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imida zol, pH 7,0 in 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2 _* 0,5 l Gradientenvolumen) eluiert. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt.550 ml of digestion supernatant in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7.2 were mixed with 55 ml of 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8.0, 30 min. stirred and then 30 min. centrifuged at 20,000 g. 400 ml of the supernatant were applied to a nickel-chelate-Sepharose column (V = 60 ml; Pharmacia), which was previously loaded with 30 µmol NiCl₂ / ml gel and with 50 mM sodium phosphate, 0.2 M NaCl, pH 8, 0 had been equillibrated. The column was then rinsed with 300 ml of 50 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, pH 7.0 and the IL-16 fusion protein then with a gradient of 0 M to 300 mM imidazole, pH 7.0 in 50 mM sodium phosphate , 0.1 M NaCl, pH 7.0 (2 _* 0.5 l gradient volume) eluted. Fractions containing IL-16 were identified by SDS-PAGE and pooled.

300 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 l 20 mM Imidazol, pH 5,5 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min. bei 20 000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit NaOH auf pH 8,5 eingestellt, mit 0,3 mg Thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) versetzt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCl auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdün nung mit H₂O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (45 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquillibriert worden war. Die Elution von IL-16 erfolgte mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt. Die Identität von IL-16 wurde durch Massenanalyse (Molekulargewicht 13 566 ± 3 D) und automatisierte N-terminale Sequenzanalyse bestätigt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die UV-Absorption von IL-16 bei 280 nm und ein berechneter molarer Extinktionskoeffizient von 5540 M^-1cm^-1 bei dieser Wellenlänge (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) verwendet.300 mg of the fusion protein thus obtained were dialyzed at 4 ° C. against 20 l of 20 mM imidazole, pH 5.5 and then for 30 minutes to remove turbidity. centrifuged at 20,000 g. The supernatant from the centrifugation was then adjusted to pH 8.5 with NaOH, 0.3 mg of thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 4 hours. The gap was then adjusted to pH 6.5 with HCl and the conductivity was adjusted to 1.7 mS by dilution with H₂O. The sample was applied to a Q-Sepharose FF column (45 ml; Pharmacia), which had previously been equilibrated with 20 mM imidazole, pH 6.5. IL-16 was eluted with a gradient of 0 to 0.3 M NaCl in 20 mM imidazole, pH 6.5. Fractions containing IL-16 were identified by SDS-PAGE and pooled. The identity of IL-16 was confirmed by mass analysis (molecular weight 13 566 ± 3 D) and automated N-terminal sequence analysis. The UV absorption of IL-16 at 280 nm and a calculated molar extinction coefficient of 5540 M ^-1 cm ^-1 at this wavelength (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) were used to determine the concentration.

Das so erhaltene IL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein heit von mehr als 95% auf. Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 µl betrug 1,5 bis 15 µg Protein. Die Detention erfolgte bei 220 nm.The IL-16 thus obtained was pure on SDS-PAGE under reducing conditions of more than 95%. The analytical Superdex 75 FPLC column (Pharmacia) was used 25 mM Na phosphate, 0.5 M NaCl, 10% glycerol, pH 7.0 and a flow rate of 1 ml / min eluted. The amount of protein applied in a volume of 100 to 150 ul was 1.5 to 15 µg protein. Detection took place at 220 nm.

Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein & Peptide C18, 4 × 180 mm Säule verwendet. Die Elution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0,1% TFA in H₂O) inner halb von 30 min. mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.A Vydac, Protein & Peptide C18, 4 × 180 mm was used for purity analysis using RP-HPLC Column used. Elution is carried out by a linear gradient from 0% to 80% B (Solvent B: 90% acetonitrile in 0.1% TFA; solvent A: 0.1% TFA in H₂O) inner half of 30 min. with a flow rate of 1 ml / min. The detection took place at 220 nm.

Example 4 Cleavage of recombinant IL-16 with cell lysate 4.1 Separation of CD8⁺ and CD4⁺ lymphocytes via MACS

Die mittels Ficoll-Gradienten aus einem "buffy coat" isolierten Lymphozyten werden in 500 µl PBS-azid/1 × 10⁸ Zellen ("Phosphat Buffered Saline" ohne Ca²⁺ und Mg²⁺, 0.01% Natriumazid, 5 mM EDTA, pH 7.2) resuspendiert. Nach Zugabe von 20 ml CD8-Microbeads/1 × 10⁸ zu erwartende Zellen (Maus anti-human CD8-Antikörper, konjugiert mit magnetischen Partikeln, Miltenyi Biotec GmbH), erfolgt eine Inkubation bei 4°C über 15 min. Für weitere 5 min bei 4°C wird 2 mg DTAF/1 × 10⁷ zu erwartende Zellen (anti-Maus-IgG FITC konjugiert, Firma Dianova) hinzugegeben. Nach Verdünnung mit 25 ml PBS-azid/1% BSA erfolgt eine erneute Zentrifugation (10 min, 1200 rpm, 4°C). Der Überstand wird verworfen, die Zellen in 2 ml PBS/1% BSA resuspendiert und die Zellsuspension auf eine Säule, die sich in einem Magnetseparator (Miltenyi Biotec GmbH) befindet, aufgetragen. Die CD8⁺-Zellen, an die die CD8-Micro beads gekoppelt sind, werden in der Säule zurückgehalten, die Durchflußfraktion enthält dementsprechend alle Lymphozyten (ca. 80%-CD4⁺-Zellen) mit Ausnahme der CD8⁺-Zellen. Nach Waschung wird die Säule aus der Halterung genommen und die CD8⁺-Zellfraktion mit PBS-azid/1% BSA eluiert. Die Durchfluß- und die CD8⁺-Zell fraktion werden zentrifugiert, in Zellkulturmedium (RPMI 1640, 20% FKS, 2 mM Glutamin, 180 U/ml IL-2) resuspendiert, die Zellzahl auf 3 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt und die Zellen mit PHA stimuliert (9 mg/ml). Die Qualität der Lymphozytensubpopula tionstrennung wird mittels FACS überprüft. The lymphocytes isolated by means of Ficoll gradients from a "buffy coat" are in 500 ul PBS-azide / 1 × 10⁸ cells ("phosphate buffered saline" without Ca ²⁺ and Mg ²⁺ , 0.01% sodium azide, 5 mM EDTA, pH 7.2 ) resuspended. After adding 20 ml of CD8 microbeads / 1 × 10⁸ expected cells (mouse anti-human CD8 antibody, conjugated with magnetic particles, Miltenyi Biotec GmbH), incubation takes place at 4 ° C for 15 min. For a further 5 min at 4 ° C., 2 mg of DTAF / 1 × 10⁷ cells to be expected (anti-mouse IgG FITC conjugated, Dianova company) are added. After dilution with 25 ml PBS-azide / 1% BSA, centrifugation is carried out again (10 min, 1200 rpm, 4 ° C). The supernatant is discarded, the cells are resuspended in 2 ml of PBS / 1% BSA and the cell suspension is applied to a column which is located in a magnetic separator (Miltenyi Biotec GmbH). The CD8⁺ cells to which the CD8 microbeads are coupled are retained in the column, the flow fraction accordingly contains all lymphocytes (approx. 80% -CD4⁺ cells) with the exception of the CD8⁺ cells. After washing, the column is removed from the holder and the CD8⁺ cell fraction eluted with PBS-azid / 1% BSA. The flow-through and the CD8⁺ cell fraction are centrifuged, resuspended in cell culture medium (RPMI 1640, 20% FCS, 2 mM glutamine, 180 U / ml IL-2), the cell number adjusted to 3 × 10⁶ cells / ml and the cells stimulated with PHA (9 mg / ml). The quality of the lymphocyte subpopulation separation is checked using FACS.

4.2 Preparation of Cell Lysate and Digestion of IL-16

Es werden 1 × 10⁸ CD8⁺-Lymphozyten, die drei Tage mit PHA stimuliert wurden, in 2 ml PBS, das mit 1% Triton X100 versetzt ist, für 10 min auf Eis lysiert. Sodann werden Zelldebris und Zellkerne durch Zentrifugation entfernt. 45 µl des so gewonnenen Zellysats werden mit 10 µg rekombinantem IL-16, das entweder am amino- oder carboxyterminalen Ende in Fusion mit einem Histamin-tag (HIS-tag) exprimiert wurde, 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann werden die HIS-tag tragenden Fragmente mit Hilfe einer Nickel-Agarosematrix gereinigt. Nach weiterer Reinigung der entstandenen Fragmente in der HPLC werden die Massen der Fragmente massenspek trographisch bestimmt. There are 1 × 10⁺ CD8ymph lymphocytes stimulated with PHA for three days in 2 ml of PBS to which 1% Triton X100 has been added are lysed on ice for 10 min. Then cell debris and cell nuclei are removed by centrifugation. 45 µl of the thus obtained Cell lysates are mixed with 10 ug recombinant IL-16, which is either at the amino or carboxy terminal end was expressed in fusion with a histamine tag (HIS tag), Incubated for 16 hours at room temperature. Then the HIS-day will be carried Fragments cleaned using a nickel agarose matrix. After further cleaning the Fragments created in the HPLC, the masses of the fragments are mass spec determined trographically.

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Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437
Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057
Kingsman, S.M., et al, Tibtech 5 (1987) 53-57
Mack et al., Analyt. Biochem. 200 (1992) 74-80
Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698
Nagai et al., Nature 309 (1984) 810
Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212
Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582
Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884
Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655
Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA
Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128
Singer, J.I., J. Exp. Med. 182 (1995) 1447-1459
Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113
US-Patent Nr. 4,551,433
US-Patent Nr. 4,689,406
US-Patent Nr. 4,747,056
WO 91/11520
WO 92/20702
WO 92120703
WO 94/28134
Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166 Aman et al., Gene 40 (1985) 183
Baier, M., et al., Nature 378 (1995) 563
Beck and Zink, Gene 16 (1981) 35-58
Black, RA et al., J. Biol. Chem. 263 (1988) 9437-9442
Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127
Chang et al., Nature 198 (1977) 1056
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Cruikshank, WW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113
Davies et al., Arm. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469
German patent application No. 195 47 933.5
German patent application No. 195 48 295.6
EP-A 0 267 851
EP-A 0 495 398
European patent application No. 95 113 013.7
Fanchen, C. et al., EMBO J. 14 (1995) 1914-1922
Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437
Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057
Kingsman, SM, et al, Tibtech 5 (1987) 53-57
Mack et al., Analyt. Biochem. 200 (1992) 74-80
Miller et al., Bio / Technology 7 (1989) 698
Nagai et al., Nature 309 (1984) 810
Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7212
Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582
Phillips and Silhavy, Nature 344 (1990) 882-884
Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655
Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA
Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128
Singer, JI, J. Exp. Med. 182 (1995) 1447-1459
Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113
U.S. Patent No. 4,551,433
U.S. Patent No. 4,689,406
U.S. Patent No. 4,747,056
WO 91/11520
WO 92/20702
WO 92120703
WO 94/28134
Yansura, Meth. Enzymol. 185 (1990) 161-166

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Nucleic acid with which the expression of a polypeptide with interleukin-16 activity can be achieved in a prokaryotic or eukaryotic host cell, said nucleic acid

a) corresponds to the DNA sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary strand,
b) hybridizing with the DNA of the sequence SEQ ID NO: 1 under stringent conditions,
c) or a nucleic acid sequence which would hybridize under strict conditions without the degeneration of the genetic code with the nucleic acid sequences defined by a) and b)
d) and at the 5 'end for one of the amino acid sequences SEQ ID NO: 3 to 7 coded.

2. Nucleic acid according to claim 1, which encodes interleukin-16 of primates.

3. Prokaryotic or eukaryotic host cell, which with a nucleic acid after claims 1 or 2 is transformed or transfected so that the host cell expressed polypeptide expressed.

4. Biologically functional nucleic acid vector which is a nucleic acid according to claim 1 or contains 2.

5. Interleukin-16 from primates, as is the product of eukaryotic expression Processing is available essentially free of other human proteins.

6. Human interleukin-16, as is the product of eukaryotic expression Processing is available essentially free of other human proteins.

7. Polypeptide with interleukin-16 activity, which is encoded by a nucleic acid according to claims 1 or 2.

8. polypeptide with interleukin-16 activity, characterized in that it is a multimer from a defined number of subunits, the polypeptide of An saying 7 is a subunit.

9. Polypeptide according to claim 8, characterized in that it consists of 4 to 32 subunits ten exists.

10. Polypeptide according to claims 7 to 9, characterized in that it defines one contains the content of metal ions, the number of metal ions per subunit (Polypeptide according to claim 7) is 0.5 to 2.

11. A method for producing a polypeptide according to claims 7 to 10, characterized characterized in that a prokaryotic or eukaryotic host cell with a Nucleic acid sequence according to claims 1 or 2 is transformed or transfected, is cultivated under suitable nutrient conditions and against the desired polypeptide is also isolated.

12. A pharmaceutical composition comprising a polypeptide according to claims 5 to 10 and a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant and / or carrier contains tel.

13. antibody which binds to the part of a polypeptide with interleukin-16 activity, which is represented by the sequence SEQ ID NO: 3.

14. Pharmaceutical composition containing Interleukin-16 available from primates after eukaryotic expression and pre-cessation in one for a therapeutic Apply sufficient amount.