DE19547933A1 - Multimeric forms of IL-16, process for their production and use - Google Patents
Multimeric forms of IL-16, process for their production and useInfo
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Abstract
Description
Gegenstand der Erfindung sind multimere Formen von Polypeptiden mit IL-16-Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.The invention relates to multimeric forms of polypeptides with IL-16 activity, process for their manufacture and their use.
IL-16 (Interleukin-16) ist ein Lymphokin, welches auch als "lymphocyte chemoattracting factor" (LCF) oder "immunodeficiency virus supressing lymphokine" (ISL) bezeichnet wird. ISL und seine Eigenschaften sind in der WO 94/28134, der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 sowie von Cruikshank, W. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 und von Baier, M., et al., Nature 378 (1995), 563 beschrieben. Dort ist auch die rekombinante Herstellung von IL-16 beschrieben. Danach ist IL-16 ein Protein mit einer molekularen Masse von 13,385 D. Von Cruikshank wurde ebenfalls gefunden, daß ISL in einer Molekularsiebchromatographie als multimere Form mit einem Molekulargewicht von 50-60 bzw. 55-60 kD eluiert. Dieser multimeren Form wird die "chemoattractant activity" zugeschrieben. Von Baier wird eine homodimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD beschrieben. Die von Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 beschriebene "chemoattractant activity" und die von Baier beschriebene Aktivität von rekombinantem humanem IL-16 sind jedoch sehr gering.IL-16 (Interleukin-16) is a lymphokine, which is also called "lymphocyte chemoattracting factor "(LCF) or" immunodeficiency virus supressing lymphokine "(ISL) is called. ISL and its properties are described in WO 94/28134, European Patent Application No. 95 113 013.7 and by Cruikshank, W. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 and by Baier, M., et al., Nature 378 (1995), 563. There is also that recombinant production of IL-16 described. After that, IL-16 is a protein with a molecular mass of 13.385 D. Cruikshank also found that ISL in molecular sieve chromatography as a multimeric form with a molecular weight of 50-60 or 55-60 kD eluted. This multimeric form becomes the "chemoattractant activity" attributed to. Baier developed a homodimeric form of IL-16 with a molecular weight of 28 kD. The by Cruikshank et al. in J. Immunol. 146 (1991) 2928-2934 described "chemoattractant activity" and the activity of recombinant human IL-16, however, are very low.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Aktivität von IL-16 zu verbessern und IL-16- Formen bereitzustellen, die vorteilhaft für eine therapeutische Anwendung geeignet sind.The object of the present invention is to improve the activity of IL-16 and IL-16 To provide forms that are advantageously suitable for therapeutic use.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch eine biologisch aktive multimere Form von IL-16-Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von mindestens ca. 70 kD (gemessen mit Gelfiltrations-HPLC) und/oder einem definierten Metallionenanteil.The object of the invention is achieved by a biologically active multimeric form of IL-16 subunits with a molecular weight of at least approx. 70 kD (measured with Gel filtration HPLC) and / or a defined proportion of metal ions.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß eine multimere Form von IL-16-Untereinheiten, welche mehr als vier Untereinheiten enthält, wesentlich mehr IL-16-Aktivität zeigt als monomere, dimere oder tetramere Formen. Dieses Multimeren unterscheiden sich in ihrem Molekulargewicht deutlich von den von Baier et al. und Cruikshank et al. beschriebenen Formen von IL-16.Surprisingly, it has been shown that a multimeric form of IL-16 subunits, which contains more than four subunits, shows significantly more IL-16 activity than monomeric, dimeric or tetrameric forms. These multimers differ in their molecular weight clearly different from that of Baier et al. and Cruikshank et al. described forms of IL-16.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die von Baier et al. als inaktiv beschriebene dimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von 28 kD durch eine Inkubation mit Metallionen in eine höhermolekulare Form mit einem Molekulargewicht von 45±4 kD überführt werden kann, die im folgenden zur Unterscheidung von Dimeren als "Tetramer" bezeichnet wird.Surprisingly, it was found that the method described by Baier et al. described as inactive dimers Form of IL-16 with a molecular weight of 28 kD by incubation with metal ions converted into a higher molecular form with a molecular weight of 45 ± 4 kD can be referred to below as "tetramer" to distinguish dimers becomes.
Sowohl die Herstellung dieser tetrameren Form von IL-16 durch einen Zusatz von Metallionen zu IL-16 enthaltenden Lösungen als auch die so erhältliche tetramere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von mindestens 45±4 kD (abhängig vom Molekulargewicht der Untereinheit) sind Gegenstand dieser Erfindung.Both the production of this tetrameric form of IL-16 by the addition of metal ions to IL-16 containing solutions as well as the tetrameric form of IL-16 available in this way with a molecular weight of at least 45 ± 4 kD (depending on the molecular weight of the Subunit) are the subject of this invention.
Darüber hinaus wurde gefunden, daß die tetramere Form von IL-16 in eine polymere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von mindestens ca. 70 kD überführt werden kann, die ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung ist.In addition, the tetrameric form of IL-16 was found to be in a polymeric form of IL-16 with a molecular weight of at least about 70 kD can be transferred, the is also the subject of this invention.
Eine multimere Form von IL-16 mit einem Molekulargewicht von mindestens ca. 70 kD enthält vorzugsweise eine definierte Anzahl von Untereinheiten, wobei die Zahl der Untereinheiten in einer solchen multimeren Form über sechs, vorzugsweise zwischen 6 und 32, besonders bevorzugt zwischen 8 und 16 liegt. Insbesondere bevorzugt sind multimere Formen von IL-16 mit 8 oder 16 Untereinheiten sowie definierte Gemische hiervon.A multimeric form of IL-16 with a molecular weight of at least about 70 kD preferably contains a defined number of subunits, the number of Subunits in such a multimeric form over six, preferably between 6 and 32, is particularly preferably between 8 and 16. Multimeric forms are particularly preferred of IL-16 with 8 or 16 subunits and defined mixtures thereof.
Es hat sich weiter gezeigt, daß die Aktivität von IL-16 durch die Gegenwart von Metallionen weiter gesteigert werden kann. Dabei ist es bevorzugt, daß eine Präparation einer aktiven monomeren oder multimeren Form von IL-16-Untereinheiten Metallionen in einer molaren Konzentration von mindestens 50% der molaren Konzentration der in der Lösung enthaltenen IL-16-Untereinheiten enthält. Vorzugsweise beträgt der Anteil der Metallionen pro Untereinheit zwischen 0,5 und 2, besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 1. Auch hier ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Form von IL-16 einen definierten Gehalt an Metallionen in den genannten Bereichen besitzt.It has also been shown that the activity of IL-16 is due to the presence of metal ions can be further increased. It is preferred that a preparation of an active monomeric or multimeric form of IL-16 subunits metal ions in a molar Concentration of at least 50% of the molar concentration of those contained in the solution Contains IL-16 subunits. The proportion of metal ions per subunit is preferably between 0.5 and 2, particularly preferably between 0.5 and 1. Here, too, it is preferred if the form of IL-16 according to the invention has a defined content of metal ions in the mentioned areas.
Bevorzugte Präparationen hierbei sind:Preferred preparations here are:
- - IL-16-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von ca. 13-35 kD, enthaltend ein Metallion pro Untereinheit,- Containing IL-16 subunit with a molecular weight of approx. 13-35 kD one metal ion per subunit,
- - Dimeres aus IL-16-Untereinheiten, enthaltend ein oder zwei Metallionen,Dimers of IL-16 subunits containing one or two metal ions,
- - Tetrameres aus IL-16-Untereinheiten, enthaltend zwei oder vier Metallionen.- Tetrameres from IL-16 subunits containing two or four metal ions.
Eine Präparation von IL-16 im Sinne der Erfindung ist beispielsweise eine wäßrige, vorzugsweise gepufferte Lösung oder ein Lyophilisat. Vorzugsweise ist die Präparation zur therapeutischen Anwendung oder zur Herstellung eines Arzneimittels geeignet. Hierbei liegt die Konzentration von IL-16 in einem therapeutisch wirksamen Bereich. Die Präparation kann zusätzlich Hilfsstoffe, insbesondere pharmazeutische Hilfsstoffe, wie Lösungsvermittler, Füllstoffe, etc. enthalten.A preparation of IL-16 in the sense of the invention is, for example, an aqueous one, preferably buffered solution or a lyophilisate. The preparation is preferably suitable for therapeutic use or for the manufacture of a medicament. Here is the concentration of IL-16 in a therapeutically effective range. The preparation can additionally Auxiliaries, in particular pharmaceutical auxiliaries, such as solubilizers, fillers, etc. included.
Unter einer biologischen Aktivität von IL-16 ist seine Eigenschaft zu verstehen, an T-Zellen über den CD4-Rezeptor zu binden und vorzugsweise die Replikation von HIV und SIV zu supprimieren, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschrieben, die Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung hierfür ist.A biological activity of IL-16 is to be understood as its property on T cells bind via the CD4 receptor and preferably replication of HIV and SIV too suppress as described in European Patent Application No. 95 113 013.7, the This is the subject of the disclosure of the present invention.
Unter dem Ausdruck "IL-16" ist im Sinne der Erfindung ein Polypeptid mit der Aktivität von IL-16 zu verstehen.For the purposes of the invention, the expression "IL-16" is a polypeptide with the activity of To understand IL-16.
In einer bevorzugten Ausführungsform zeigt IL-16 eine immunmodulierende Aktivtität, wie sie in der WO 94/28134 beschrieben ist und die hierfür Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Die immunmodulierende Eigenschaft kann über die Stimulierung der Zellteilung mit IL-16 mit einem Wachstumsfaktor wie IL-2 bzw. mit Anti-CD3-Antikörper bestimmt werden. Ein derartiges Verfahren ist in der WO 94/28134 beschrieben.In a preferred embodiment, IL-16 exhibits immunomodulating activity such as that is described in WO 94/28134 and the subject matter of the present invention for this purpose is. The immunomodulating property can be achieved by stimulating cell division with IL-16 be determined with a growth factor such as IL-2 or with anti-CD3 antibody. On such a method is described in WO 94/28134.
Insbesondere zeigt IL-16 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:In particular, IL-16 exhibits one or more of the following properties:
- - Bindung an T-Zellen über den CD4-Rezeptor,Binding to T cells via the CD4 receptor,
- -Stimulierung der Expression von IL-22-Rezeptor und/oder HLA-DR-Antigen auf CD4⁺-Lymphozyten,-Stimulation of the expression of IL-22 receptor and / or HLA-DR antigen on CD4⁺ lymphocytes,
- - Stimulierung der Proliferation von T-Helferzellen in Gegenwart von IL-2,Stimulation of the proliferation of T helper cells in the presence of IL-2,
- - Suppression der Proliferation von mit Anti-CD3-Antikörpern stimulierten T-Helferzellen,Suppression of the proliferation of T helper cells stimulated with anti-CD3 antibodies,
- - Suppression der Replikation von Viren, vorzugsweise von HIV-1, HIV-2 oder SIV.- Suppression of replication of viruses, preferably HIV-1, HIV-2 or SIV.
Unter einer IL-16-Untereinheit (IL-16-Monomeres) ist Polypeptid zu verstehen, welches nach Multimerisierung IL-16-Aktivität zeigt undAn IL-16 subunit (IL-16 monomer) is to be understood as a polypeptide which follows Multimerization shows IL-16 activity and
- a) von einer DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder einer komplementären Sequenz codiert wird,a) from a DNA sequence according to SEQ ID NO: 1 or a complementary one Sequence is encoded,
- b) codiert wird von DNA-Sequenzen, welche mit SEQ ID NO:1 unter stringenten Bedingungen hybridisieren.b) is encoded by DNA sequences which are stringent with SEQ ID NO: 1 Hybridize conditions.
Vorzugsweise zeigt das Polypeptid in dem in der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7 beschriebenen Testverfahren die dort genannte Wirkung oder stimuliert die Zellteilung gemäß WO 94/28134.Preferably, the polypeptide in the in European patent application no. 95 113 013.7 test method described the effect there or stimulates cell division according to WO 94/28134.
Eine IL-16-Untereinheit kann sich in ihrer Sequenz von den von solchen DNA-Sequenzen codierten Proteinsequenzen in gewissem Umfang unterscheiden. Solche Sequenzvariationen können Aminosäureaustausche, -deletionen oder -additionen sein. Vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz der IL-16-Untereinheit jedoch zu wenigstens 75%, besonders bevorzugt zu wenigstens 90% identisch mit SEQ ID NO:1. Das Molekulargewicht einer Untereinheit beträgt vorzugsweise ca. 13-35 kD, besonders bevorzugt 30±5 kD.An IL-16 subunit can differ in sequence from that of such DNA sequences to some extent differentiate encoded protein sequences. Such sequence variations can be amino acid exchanges, deletions or additions. Preferably, the Amino acid sequence of the IL-16 subunit, however, at least 75%, particularly preferred at least 90% identical to SEQ ID NO: 1. The molecular weight of a subunit is preferably approximately 13-35 kD, particularly preferably 30 ± 5 kD.
Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet, daß zwei Nukleinsäurefragmente unter standardisierten Hybridisierungsbedingungen miteinander hybridisieren, wie beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Solche Bedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6,0×SSC bei etwa 45°C, gefolgt durch einen Waschschritt bei 2×SSC bei 50°C. Zur Auswahl der Stringenz kann die Salzkonzentration im Waschschritt beispielsweise zwischen 2,0×SSC bei 50°C für geringe Stringenz und 0,2×SSC bei 50° für hohe Stringenz gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des im Waschschritt zwischen Raumtemperatur, ca. 22°C, für geringe Stringenz und 65°C bei hoher Stringenz variiert werden.The term "hybridize under stringent conditions" means that two nucleic acid fragments hybridize with each other under standardized hybridization conditions, as described for example in Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, United States. Such conditions are, for example, hybridization in 6.0 × SSC at approximately 45 ° C followed by a wash at 2 x SSC at 50 ° C. To select the stringency the salt concentration in the washing step can be, for example, between 2.0 × SSC at 50 ° C. low stringency and 0.2 × SSC at 50 ° for high stringency. In addition can the temperature of the wash step between room temperature, approx. 22 ° C, for low stringency and 65 ° C with high stringency.
Als Metallionen im Sinne der Erfindung sind eine Vielzahl von Metallionen geeignet. Wie sich gezeigt hat, sind sowohl Erdalkalimetalle als auch Elemente der Nebengruppen geeignet. Besonders geeignet sind Erdalkalimetalle, Kobalt, Zink, Selen, Mangan, Nickel, Kupfer, Eisen, Magnesium, Kalzium, Molybdän und Silber. Die Ionen können ein-, zwei-, drei- oder vierwertig sein. Besonders bevorzugt werden zweiwertige Ionen. Die Ionen werden vorzugsweise als Lösungen zugesetzt von Mg₂Cl₂, CaCl₂, MnCl₂, BaCl₂, LiCl₂, Sr(NO₃)₂, Na₂MoO₄, AgCl₂.A large number of metal ions are suitable as metal ions in the sense of the invention. How to has shown, both alkaline earth metals and elements of the subgroups are suitable. Alkaline earth metals, cobalt, zinc, selenium, manganese, nickel, copper, iron, Magnesium, calcium, molybdenum and silver. The ions can be one, two, three or tetravalent be. Divalent ions are particularly preferred. The ions are preferably called Solutions added by Mg₂Cl₂, CaCl₂, MnCl₂, BaCl₂, LiCl₂, Sr (NO₃) ₂, Na₂MoO₄, AgCl₂.
IL-16 wird vorzugsweise rekombinant in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen hergestellt. Derartige Herstellverfahren sind beispielsweise beschrieben in WO 94/28134 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 113 013.7, die auch hierfür Gegenstand der Offenbarung der vorliegenden Erfindung sind. Um allerdings die erfindungsgemäßen Formen von IL-16 durch rekombinante Herstellung definiert und reproduzierbar zu erhalten, müssen über die dem Fachmann geläufigen Verfahren zur rekombinanten Herstellung zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden.IL-16 preferably becomes recombinant in prokaryotic or eukaryotic host cells produced. Such manufacturing processes are described, for example, in WO 94/28134 and European Patent Application No. 95 113 013.7, which is also the subject of the disclosure of the present invention. However, in order for the forms of IL-16 must be defined and obtained reproducibly by recombinant production the methods familiar to the person skilled in the art for recombinant production additional measures be taken.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven multimeren Form von IL-16 durch Expression einer IL-16 codierenden Nukleinsäure in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle und Isolierung der genannten multimeren Form, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Herstellung oder Reinigung Metallionen in einer solchen Menge zugegen sind, daß pro IL-16-Untereinheit mindestens 0,5 Metallionen enthalten sind. Bei dem Herstellverfahren kann auch ein Gemisch von mehreren multimeren IL-16- Formen entstehen. Dieses Gemisch kann entweder in seine Einzelbestandteile getrennt oder als Gemisch, vorzugsweise nach Aufreinigung, zum Beispiel therapeutisch verwendet werden.The invention therefore relates to a method for producing a biologically active multimeric form of IL-16 by expression of an IL-16 coding nucleic acid in a prokaryotic or eukaryotic host cell and isolation of the multimers mentioned Form, characterized in that in the manufacture or cleaning metal ions in a such an amount is present that at least 0.5 metal ions per IL-16 subunit are. In the manufacturing process, a mixture of several multimeric IL-16 Forms emerge. This mixture can either be separated into its individual components or as Mixture, preferably after purification, can be used therapeutically, for example.
Die Zugabe der Metallionen kann während der Fermentation oder während der Reinigung erfolgen. Es hat sich gezeigt, daß erfindungsgemäße IL-Formen erhalten werden, wenn bei der Fermentation pro Gramm entstehendem rekombinanten IL-16 etwa 0,1 µmol/l bis 10 mmol/l Metallionen zugegen sind. Dabei ist die Obergrenze der Metallionenkonzentration an sich unkritisch und hängt lediglich von der Verträglichkeit der Mikroorganismen oder Zellinien für diese Metallionen sowie von der Löslichkeit der verwendeten Metallverbindung oder Salzes ab. Vorzugsweise wird eine Metallionenkonzentration von 0,5 µmol/l bis 10 mmol/l verwendet. Eine Erhöhung der Ausbeute an aktivem Metalloprotein durch den Zusatz von Metallionen zum Fermentationsmedium ist z. B. von Hoffman et al. in Protein Expression & Purific. 6 (1995) 646-654 beschrieben.The metal ions can be added during fermentation or during purification respectively. It has been shown that IL forms according to the invention are obtained when at the fermentation per gram of recombinant IL-16 about 0.1 µmol / l bis 10 mmol / l metal ions are present. The upper limit is the metal ion concentration per se uncritical and depends only on the tolerance of the microorganisms or Cell lines for these metal ions and the solubility of the metal compound used or salt. A metal ion concentration of 0.5 μmol / l to is preferred 10 mmol / l used. An increase in the yield of active metalloprotein by the Addition of metal ions to the fermentation medium is e.g. B. by Hoffman et al. in protein Expression & Purific. 6 (1995) 646-654.
Der Zusatz der Metallionen oder Metallverbindungen, aus denen Metallionen ablösbar sind, erfolgt vorzugsweise im Verlauf des Aufschlusses des Fermentationsansatzes, bei der Reinigung oder auf der Stufe des gereinigten IL-16. Zweckmäßig werden die Metallionen vor oder bei einer Dialyse oder einem Chromatographie-Schritt in einem Auftrags- oder Elutionspuffer verwendet.The addition of metal ions or metal compounds from which metal ions can be removed preferably takes place in the course of the digestion of the fermentation batch, during cleaning or at the level of the purified IL-16. The metal ions are expediently placed in front of or during a dialysis or a chromatography step in an application or elution buffer used.
Bei der rekombinanten Herstellung der erfindungsgemäßen IL-16-Formen wird eine Präparation einer multimeren Form von IL-16-Untereinheiten erhalten, in der die Anzahl der Untereinheiten vorzugsweise 6 bis 32 beträgt und die als Produkt einer rekombinanten Produktion in Prokaryonten im wesentlichen frei von Säugerzellproteinen oder als Produkt einer rekombinanten Produktion in Eukaryonten im wesentlichen frei von natürlichen Humanproteinen ist.A preparation is used in the recombinant production of the IL-16 forms according to the invention a multimeric form of IL-16 subunits obtained in which the number of subunits is preferably 6 to 32 and as a product of recombinant production in prokaryotes essentially free of mammalian cell proteins or as a product of a recombinant Production in eukaryotes is essentially free of natural human proteins.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von multimeren IL-16-Untereinheiten durch Inkubation von monomeren IL-16-Untereinheiten oder IL-16-Dimeren mit Metallionen. Ein solches Verfahren ist unabhängig davon anwendbar, ob die IL-16-Untereinheiten auf rekombinante Weise oder anders (z. B. synthetisch oder aus natürlichen Quellen) isoliert wurden.Another embodiment of the invention relates to a method for producing multimeric IL-16 subunits by incubation of monomeric IL-16 subunits or IL-16 dimers with metal ions. Such a method is applicable regardless whether the IL-16 subunits in a recombinant manner or otherwise (e.g. synthetic or from natural sources) were isolated.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung des Multimerisierungsgrads einer monomeren oder multimeren Form aus IL-16-Untereinheiten. Bei einem solchen Verfahren wird die monomere oder multimere Form mit Metallionen inkubiert, wodurch eine oder mehrere höher multimerisierte Formen von IL-16-Untereinheiten entstehen.Another object of the invention is a method for increasing the degree of multimerization a monomeric or multimeric form of IL-16 subunits. With such a The monomeric or multimeric form is incubated with metal ions, thereby one or more higher multimerized forms of IL-16 subunits arise.
Die Multimerisierung wird vorzugsweise im neutralen oder sauren Bereich, besonders bevorzugt im Bereich zwischen pH 3 und 8 durchgeführt. Die Ausbeute an multimeren Formen und die Dauer der Multimerisierung können durch Zusatz von Denaturierungsmitteln wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff verbessert werden. Zweckmäßig werden solche Denaturierungsmittel in Konzentrationen von 0 bis 8 mol/l zugesetzt. Bei der Inkubation mit Metallionen kann die Konzentration an Denaturierungsmittel durch Verdünnung oder Dialyse vorzugsweise auf eine nicht denaturierende Konzentration (für Guanidinhydrochlorid z. B. ca. 0 bis 2 mol/l) verringert werden.The multimerization is preferably in the neutral or acidic range, particularly preferred performed in the range between pH 3 and 8. The yield of multimeric forms and the duration of multimerization can be increased by adding denaturing agents such as Guanidine hydrochloride or urea can be improved. Such denaturing agents are useful added in concentrations of 0 to 8 mol / l. When incubated with metal ions the concentration of denaturant by dilution or dialysis may be preferred to a non-denaturing concentration (for guanidine hydrochloride e.g. approx. 0 can be reduced to 2 mol / l).
Die Metallionen-abhängige Multitetramerisierung kann durch Chelatbildner wie EDTA oder durch freie Bindungsstellen für Metallionen auf der für die Reinigung verwendeten Metallaffinitäts- Chelat-Sepharose inhibiert werden.The metal ion-dependent multitetramerization can be carried out by chelating agents such as EDTA or due to free binding sites for metal ions on the metal affinity used for cleaning Chelated Sepharose can be inhibited.
Eine besonders effiziente Tetramerisierung wird erzielt, wenn Metallionen in annähernd äquimolarer Konzentration oder im Überschuß bezüglich IL-16 mit IL-16 inkubiert werden, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit von der Konzentration der Reaktanden abhängt. Die Tetramerisierung erfolgt in einem breiten pH-Bereich, insbesondere im Bereich pH 2,5 bis 10. Anschließend an die Tetramerisierung kann die weitere Multimerisierung vorzugsweise zwischen pH 5 bis 7 auch ohne Zusatz von weiteren Metallionen durchgeführt werden.A particularly efficient tetramerization is achieved when metal ions are approximately equimolar Concentration or in excess of IL-16 with IL-16, where the reaction rate depends on the concentration of the reactants. The tetramerization takes place in a wide pH range, in particular in the range pH 2.5 to 10. Then to the tetramerization, the further multimerization can preferably be between pH 5 to 7 can also be carried out without the addition of further metal ions.
Besonders bevorzugt sind IL-16-Multimere, die als diskreter peak von einer analytischen Molekularsieb-HPLC-Säule mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. über 70 kD, vorzugsweise 90 bis 150 kD eluieren. Die Polymerbildung kann durch eine vorhergehende Metallionen- abhängige Tetramerisierung induziert werden. Weiterhin wird der Multimerisierungsgrad von der jeweiligen Pufferzusammensetzung (Art des Puffers, z. B. Imidazol, MES, Acetat, Glycin, Citrat, pH-Wert, GdmCl-Konz.) beeinflußt.Particularly preferred are IL-16 multimers, which as a discrete peak from an analytical Molecular sieve HPLC column with an apparent molecular weight of about 70 kD, preferably Elute 90 to 150 kD. Polymer formation can be prevented by a previous metal ion dependent tetramerization can be induced. The degree of multimerization continues the respective buffer composition (type of buffer, e.g. imidazole, MES, Acetate, glycine, citrate, pH, GdmCl conc.) Affected.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform von biologisch aktivem IL-16 besitzt ein Molekulargewicht von mindestens 45±4 kD und ist nach Inkubation von Monomeren oder Dimeren mit Metallionen erhältlich.Another preferred embodiment of biologically active IL-16 has a molecular weight of at least 45 ± 4 kD and is after incubation of monomers or dimers available with metal ions.
Derartige IL-16-Präparationen sind besonders zur therapeutischen Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen geeignet. Solche Zusammensetzungen enthalten zweckmäßig noch die üblichen Füll-, Hilfs- und Zusatzstoffe.Such IL-16 preparations are particularly for therapeutic use in therapeutic Suitable compositions. Such compositions appropriately still contain the usual fillers, auxiliaries and additives.
Die folgenden Beispiele und Publikationen, das Sequenzprotokoll sowie Abbildungen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.The following examples and publications, the sequence listing and illustrations explain the invention, the scope of which results from the claims. The described methods are to be understood as examples, which also apply to modifications describe the subject of the invention.
Fig. 1: SDS-PAGE von IL-16 unter reduzierenden Bedingungen (Probe mit 0,1 M DTE) 1) vor Spaltung mit Thrombin, 2) nach Spaltung mit Thrombin und 3)-5) nach Spaltung und Reinigung mittels Q-Sepharose (verschiedene Fraktionen). Fig. 1: SDS-PAGE of IL-16 under reducing conditions (sample with 0.1 M DTE) 1) before cleavage with thrombin, 2) after cleavage with thrombin and 3) -5) after cleavage and purification by means of Q-Sepharose (different fractions).
Fig. 2 RP-HPLC-Elutionsdiagramm von IL-16 nach Spaltung mit Thrombin und Reinigung mittels Q-Sepharose. Fig. 2 RP-HPLC elution diagram of IL-16 after cleavage with thrombin and purification by means of Q-Sepharose.
Fig. 3A, Fig. 3B: Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm A) des IL-16-Fusionsproteins für Spaltung mit Thrombin, B) von IL-16 nach Spaltung mit Thrombin und Reinigung mittels Q-Sepharose. Fig. 3A, Fig 3B. Molecular sieve HPLC elution A) of the IL-16 fusion protein for cleavage by thrombin, B) of IL-16 by cleavage with thrombin and purification by Q-Sepharose.
Fig. 4: Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm von dimeren (RT=11,4 min) und tetrameren (RT=10,06 min) IL-16 nach Renaturierung von denaturierten IL-16 in 0,1 M Tris/HCl, 250 µM Cu(II)-Acetat, pH 8,5 (siehe Beispiel 4). Fig. 4: molecular sieve HPLC elution of dimeric (RT = 11.4 min) and tetrameric (RT = 10.06 min) IL-16 denatured by renaturation of IL-16 in 0.1 M Tris / HCl, 250 uM Cu (II) acetate, pH 8.5 (see example 4).
Fig. 5: Eichlauf der HPLC-Siebsäule mit BSA (MW 66 kD; RT 9,17 min), Ovalbumin (MW 43 kD; RT 9,98 min), Chymotrypsinogen (MW 25 kD, RT 11,89 min) und Ribonuklease A (MW 13,7 kD; RT 12,87 min). FIG. 5 shows the calibration run HPLC sieve column with BSA (MW 66 kD; RT 9.17 min), ovalbumin (MW 43 kD; RT 9.98 min), chymotrypsinogen (MW 25 kD, RT 11.89 min) and ribonuclease A (MW 13.7 kD; RT 12.87 min).
Fig. 6 Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm von tetrameren IL-16 nach Inkubation von 137 µM IL-16 mit 250 µM Cu(II)-Acetat (siehe Beispiel 10). Fig. 6 molecular sieve HPLC elution of tetrameric IL-16 after incubation of 137 uM IL-16 with 250 uM Cu (II) acetate (see Example 10).
Fig. 7: Molekularsieb-HPLC-Elutionsdiagramm von Dimeren (3%; RT 11,66 min), Tetrameren (32%; RT 10,30 min) und Polymeren (65%; RT 7,93 min) nach Inkubation von IL-16 für 16 Stunden in 50 mM MES, 250 µM Cu(II)-Acetat, pH 5.5. Fig. 7: molecular sieve HPLC elution of dimers (3%; RT 11.66 min), tetramer (32%; RT 10.30 min) and polymers (65%; RT 7.93 min) after incubation of IL- 16 for 16 hours in 50 mM MES, 250 µM Cu (II) acetate, pH 5.5.
SEQ ID NO:1 zeigt die Sequenz von humanem IL-16.SEQ ID NO: 1 shows the sequence of human IL-16.
5×10⁷ PBMC (vom Menschen oder Affen) wurden 48 Stunden mit 10 µg/ml Concanavalin A und 180 U/ml IL-2 kultiv iert. Zur Herstellung der RNA wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 5 ml Denaturierungslösung (RNA Isolation Kit, Stratagene) lysiert. Nach Zugabe von 1 ml Na-Acetat, 5 ml Phenol und 1 ml Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24 : 1) wurde das Lysat 15 min auf Eis gehalten. Die wäßrige Phase wurde anschließend mit 6 ml Isopropanol vermischt, um die RNA auszufällen, und 2 Stunden bei -20°C gelagert. Das Präzipitat wurde schließlich einmal mit reinem Ethanol gewaschen und in 150 µl H₂O gelöst. Die Ausbeute wurde photometrisch bestimmt und betrug 120 µg.5 × 10⁷ PBMC (from humans or monkeys) were treated with 10 µg / ml Concanavalin A for 48 hours and 180 U / ml IL-2 cultivated. To prepare the RNA, the cells were washed once with PBS washed and then with 5 ml denaturing solution (RNA isolation kit, Stratagene) lysed. After adding 1 ml Na acetate, 5 ml phenol and 1 ml chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) the lysate was kept on ice for 15 min. The aqueous phase was then with 6 ml of isopropanol mixed to precipitate the RNA and stored at -20 ° C for 2 hours. The The precipitate was finally washed once with pure ethanol and dissolved in 150 ul H₂O. The yield was determined photometrically and was 120 µg.
Die Mischung für die cDNA-Synthese enthielt 10 µg RNA, 0,2 µg Oligo-dT, 13 mM DTT und 5 µl "bulk first strand reaction mix" (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia) in einer Menge von 15 µl. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend bei -20°C zur späteren Verwendung gelagert.The mixture for cDNA synthesis contained 10 µg RNA, 0.2 µg oligo-dT, 13 mM DTT and 5 µl "bulk first strand reaction mix" (first strand cDNA synthesis kit, Pharmacia) in a quantity of 15 µl. The mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour and then stored at -20 ° C for later use.
Zur Amplifikation von IL-16 cDNA mittels PCR und zur anschließenden Klonierung wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:For the amplification of IL-16 cDNA by means of PCR and the subsequent cloning synthesized the following oligonucleotides:
Primer 1: GCTGCCTCTCATATGGACCTCAACTCCTCCACTGACTCT
Primer 2: GATGGACAGGGATCCCTAGGAGTCTCCAGCAGCTGTGGPrimer 1: GCTGCCTCTCATATGGACCTCAACTCCTCCACTGACTCT
Primer 2: GATGGACAGGGATCCCTAGGAGTCTCCAGCAGCTGTGG
Die Primer führen zusätzliche NdeI oder BamHI-Schnittstellen ein.The primers introduce additional NdeI or BamHI interfaces.
Die PCR-Mischungen (100 µl Reaktionsvolumina) enthielten jeweils 1 µl cDNA ( aus der Synthese in Abschnitt 3), 50 pmol Primer 1 und 2, 12,5 µmol dNTPs, 10 µl 10×TAQ-Puffer und 2,5 Einheiten Taq Polymerase (Perkin-Elmer).The PCR mixtures (100 ul reaction volumes) each contained 1 ul cDNA (from the synthesis in section 3), 50 pmol primers 1 and 2, 12.5 µmol dNTPs, 10 µl 10 × TAQ buffer and 2.5 units of Taq polymerase (Perkin-Elmer).
Die Zyklusbedingungen waren 30 sec, 94°C, 1 min, 53°C und 1 min, 72°C. Es wurden 35 Zyklen durchgeführt.The cycle conditions were 30 sec, 94 ° C, 1 min, 53 ° C and 1 min, 72 ° C. There were 35 Cycles performed.
Die PCR-Produkte wurden gereinigt und 16 Stunden bei 37°C mit NdeI und BamHI verdaut. Für die Klonierungspräparation wurde der Vektor pET15b (Novagen) ebenfalls mit NdeI und BamHI gespalten und anschließend über Agarosegel gereinigt.The PCR products were purified and digested with NdeI and BamHI for 16 hours at 37 ° C. For the cloning preparation, the vector pET15b (Novagen) was also treated with NdeI and BamHI cleaved and then purified on agarose gel.
Die Ligationen wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in 20 µl Mischungen, welche 100 ng Vektor, 25 ng PCR Produkt (Insert), 2 µl 10× Ligasepuffer und 0,2 µl Ligase (New England Biolabs) enthielten, durchgeführt. Nach Transformation durch Elektroporation bei 2,5 kV, 25 µ Farad, 200 Ohm (BIO-RAD Elektroporator) in E. coli DH5 wurden die Zellen auf Ampicillin-resistente Platten aufgetragen.The ligations were carried out for 2 hours at room temperature in 20 ul mixtures containing 100 ng Vector, 25 ng PCR product (insert), 2 ul 10 × ligase buffer and 0.2 ul ligase (New England Biolabs) included. After transformation by electroporation at 2.5 kV, 25 µ Farad, 200 ohms (BIO-RAD electroporator) in E. coli DH5, the cells were opened Ampicillin resistant plates applied.
Rekombinante Klone wurden durch Restriktionsanalyse von Plasmidpräparationen (pMISLB) identifiziert und in den Stamm BL21-DE3 für die beabsichtigte Proteinexpression transformiert. Die Klonierung von ISL cDNA konnte zusätzlich durch Bestimmung der Nukleotidsequenzen bestätigt werden. Die gefundenen Sequenzen stimmten mit der publizierten LCF Sequenz (Cruikshank, W. W., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113) bis auf eine Diskrepanz in Codon 96 überein. Im Gegensatz zur veröffentlichten Sequenz besteht Codon 96 nicht aus der Basensequenz TTG, sondern aus der Sequenz TTT und codiert somit für Leucin, und nicht für Phenylalanin. Die Sequenzierung von weiteren ISL-Klonen, die aus unabhängigen PCR-Amplifikationen erhalten wurden, zeigte deutlich, daß die authentische ISL-Sequenz in Codon 96 tatsächlich von der Sequenz TTT dargestellt wird. Recombinant clones were analyzed by restriction analysis of plasmid preparations (pMISLB) identified and transformed into the strain BL21-DE3 for the intended protein expression. The cloning of ISL cDNA was also possible by determining the nucleotide sequences beeing confirmed. The sequences found matched the published LCF Sequence (Cruikshank, W.W., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113) to there is a discrepancy in codon 96. In contrast to the published sequence Codon 96 not from the base sequence TTG, but from the sequence TTT and thus codes for leucine, and not for phenylalanine. Sequencing of further ISL clones from Independent PCR amplifications were obtained, clearly showing that the authentic ISL sequence in codon 96 is actually represented by the sequence TTT.
Zur Amplifikation von ISL cDNA und zur anschließenden Expressionsklonierung wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:For the amplification of ISL cDNA and the subsequent expression cloning, the synthesized the following oligonucleotides:
Primer ISL1:
ccc gaa ttc tat gca tca cca cca cca cca cga tga cga cga caa acc cga cct caa ctc ctc cac tPrimer ISL1:
ccc gaa ttc tat gca tca cca cca cca cca cga tga cga cga caa acc cga cct caa ctc ctc cac t
Primer ISL2:
ccc gaa ttc tat gcc cga cct caa ctc ctc cPrimer ISL2:
ccc gaa ttc tat gcc cga cct caa ctc ctc c
Primer ISL3:
ccc gaa ttc tat gca tca cca cca cca cca cga tga cga cga caa aat gcc cga cct caa ctc ctc cPrimer ISL3:
ccc gaa ttc tat gca tca cca cca cca cca cga tga cga cga caa aat gcc cga cct caa ctc ctc c
Primer ISL4:
gcg gat cca agc tta gga gtc tcc agc agc tgtPrimer ISL4:
gcg gat cca agc tta gga gtc tcc agc agc tgt
Primer ISL1 fügt nach PCR am ISL-Gen eine EcoRI-Schnittstelle, sowie ein "t" zur Erzeugung von lacZ Fusionen in pUC, 6 Histidin-Codons, und die Codons für eine Enterokinase- Schnittstelle ein (DDDDK).After PCR, primer ISL1 adds an EcoRI interface to the ISL gene, as well as a "t" for generation of lacZ fusions in pUC, 6 histidine codons, and the codons for an enterokinase Interface on (DDDDK).
Primer ISL2 fügt nach PCR am ISL-Gen eine EcoRI-Schnittstelle sowie ein "t" zur Erzeu gung von lacZ Fusionen in pUC ein.After PCR, primer ISL2 adds an EcoRI interface and a "t" to the ISL gene insertion of lacZ fusions into pUC.
Primer ISL3 fügt dieselben Eigenschaften ein wie Primer ISL1 und zusätzlich noch ein weiteres ATG nach dem AAA (Lys) Codon.Primer ISL3 adds the same properties as primer ISL1 and one more ATG according to the AAA (Lys) codon.
Primer ISL4 ist der Gegenprimer zu ISL1 bis ISL3, er fügt am 3′-Ende des ISL-Gens eine BamHI sowie eine HindIII-Spaltstelle ein.Primer ISL4 is the counterprimer to ISL1 to ISL3, it adds one at the 3′-end of the ISL gene BamHI and a HindIII cleavage site.
Durch geeignete Kombination der oberen Primer und Einklonierung der PCR-Produkte in geeignete Vektoren ist es möglich, in E. coli verschiedene Arten von ISL zur Expression zu bringen: By a suitable combination of the upper primers and cloning of the PCR products in suitable vectors it is possible to express different types of ISL in E. coli bring:
Eine Kombination von ISL1 mit ISL4 ergibt z. B. nach PCR, Nachschneiden des Poduktes mit EcoRI und HindIII und Einklonieren hinter z. B. einem lac-Promotor bei Expression ein ISL, das N-terminal 6 Histidine und eine Enterokinase-Schnittstelle enthält und nach Aufarbeitung und Schnitt mit Enterokinase reifes ISL ohne N-terminales Met ergibt (N-terminus PDLNS . . . ).A combination of ISL1 with ISL4 results in e.g. B. after PCR, re-cutting the product with EcoRI and HindIII and cloning behind e.g. B. a lac promoter when expressed an ISL, the N-terminal contains 6 histidines and an enterokinase interface and after working up and sectioning with enterokinase results in mature ISL without N-terminal Met (N-terminus PDLNS. . . ).
Eine Kombination von ISL2 mit ISL4 ergibt nach PCR, Nachschneiden des Produktes mit EcoRI und HindIII sowie Einklonieren hinter z. B. einen lac-Promoter nach Expression direkt ein reifes ISL, welches mit der Sequenz MPDLNS . . . beginnt.A combination of ISL2 with ISL4 results after PCR, re-cutting the product with EcoRI and HindIII as well as cloning behind e.g. B. a lac promoter directly after expression a mature ISL, which with the sequence MPDLNS. . . begins.
Eine Kombination von ISL3 mit ISL4 ergibt nach PCR, Nachschneiden des Produktes mit EcoRI und HindIII sowie Einklonieren hinter z. B. einem lac-Promoter nach Expression und Schnitt mit Enterokinase reifes ISL mit der N-terminalen Sequenz MPDLNS . . .A combination of ISL3 with ISL4 results after PCR, re-cutting the product with EcoRI and HindIII as well as cloning behind e.g. B. a lac promoter after expression and Cut with enterokinase mature ISL with the N-terminal sequence MPDLNS. . .
Je nach verwendetem Plasmid kann eine lacZ-Fusion (z. B. beim Klonieren in pUC-Plasmide) entstehen.Depending on the plasmid used, a lacZ fusion (e.g. when cloning in pUC plasmids) arise.
Es liegt auf der Hand, daß außer dem lac-Promoter jeglicher in E. coli gut funktionierender Promoter verwendet werden kann. Beispiele wären z. B. der tac-Promoter oder auch der mgl- Promoter. Als Plasmide kommen sowohl low-copy als auch high-copy-Plasmide in Frage.It is clear that, apart from the lac promoter, any one that works well in E. coli Promoter can be used. Examples would be e.g. B. the tac promoter or the mgl- Promoter. Both low-copy and high-copy plasmids are suitable as plasmids.
Aus Stammkulturen (Plattenausstrich oder bei -20°C gelagerten Ampullen) werden Vorkulturen angesetzt, die geschüttelt bei 37°C inkubiert werden. Das Überimpfvolumen in die nächst höhere Dimension beträgt jeweils 1-10 Vol.-%. Zur Selektion gegen Plasmidverlust wird in Vor- und Hauptkultur Ampicillin (50-100 mg/l) eingesetzt.Pre-cultures are made from stock cultures (plate smear or ampoules stored at -20 ° C) prepared, which are incubated shaken at 37 ° C. The vaccination volume in the next higher dimension is 1-10 vol .-% in each case. For selection against plasmid loss, in Pre- and main culture ampicillin (50-100 mg / l) used.
Als Nährstoffe werden enzymatisch verdautes Eiweiß und/oder Hefeextrakt als N- und C- Quelle sowie Glycerin und/oder Glucose als zusätzliche C-Quelle verwendet. Das Medium wird auf ph 7 gepuffert und Metallsalze werden zur Stabilisierung des Fermentationsprozesses in physiologisch verträglichen Konzentrationen zugesetzt. Die Fermentation wird als Feed batch mit einer gemischten Hefeextrakt/C-Quellen-Dosage durchgeführt. Die Fermenta tionstemperatur beträgt 25-37°C. Über Belüftungsrate, Drehzahlregulierung und Dosage geschwindigkeit wird der gelöste Sauerstoffpartialdruck (pO₂) < 20% gehalten. Enzymatically digested protein and / or yeast extract are used as nutrients as N- and C- Source as well as glycerin and / or glucose used as an additional C source. The medium is buffered to pH 7 and metal salts are used to stabilize the fermentation process added in physiologically acceptable concentrations. The fermentation is called a feed batch with a mixed yeast extract / C source dose. The fermenta tion temperature is 25-37 ° C. About ventilation rate, speed regulation and dosage speed, the dissolved oxygen partial pressure (pO₂) is kept <20%.
Das Wachstum wird über Ermittlung der optischen Dichte (OD) bei 528 nm bestimmt. Mittels IPTG wird die Expression des IL-16 induziert. Nach einer Fermentationsdauer von ca. 10 Stunden wird bei OD-Stillstand die Biomasse durch Zentrifugation geerntet. Die Biomasse wird in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM Natriumchlorid, pH 7 aufgenommen und über eine kontinuierliche Hochdruckpresse bei 1000 Bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Suspension wird erneut abzentrifugiert und der Überstand, der das gelöste IL-16 enthält, wird weiterverarbeitet.The growth is determined by determining the optical density (OD) at 528 nm. Means IPTG induces the expression of IL-16. After a fermentation period of approx. The biomass is harvested by centrifugation for 10 hours with the OD at a standstill. The biomass is taken up in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 100 mM sodium chloride, pH 7 and opened up via a continuous high pressure press at 1000 bar. The so obtained Suspension is centrifuged again and the supernatant, which contains the dissolved IL-16, becomes processed further.
550 ml Aufschlußüberstand in 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7,2 wurden mit 55 ml 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8,0 versetzt, 30 min gerührt und anschließend 30 min bei 20 000 g zentrifugiert. 400 ml des Überstandes wurden auf eine Nickel-Chelat-Sepharose-Säule (V = 60 ml; Pharmacia) aufgezogen, die vorher mit 30 µMol NiCl₂/ml Gel beladen und mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0 äquilibriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit 300 ml 50 mM Natriumsphosphat, 0,5 M, NaCl, pH 7,0 gespült und das IL-16-Fusionsprotein dann mit einem Gradienten von 0 M bis 300 mM Imidazol, pH 7,0 in 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0 (2* 0,5 l Gradientenvolumen) eluiert. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und ver einigt.550 ml digestion supernatant in 50 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7.2 were mixed with 55 ml of 5 M NaCl, 60 mM MgCl₂, pH 8.0, stirred for 30 min and then centrifuged at 20,000 g for 30 min. 400 ml of the supernatant were placed on a Nickel-chelate-Sepharose column (V = 60 ml; Pharmacia), which was previously coated with 30 µmol NiCl₂ / ml gel loaded and equilibrated with 50 mM sodium phosphate, 0.2 M NaCl, pH 8.0 was. The column was then washed with 300 ml of 50 mM sodium phosphate, 0.5 M, NaCl, pH 7.0 rinsed and the IL-16 fusion protein then with a gradient from 0 M to 300 mM Imidazole, pH 7.0 in 50 mM sodium phosphate, 0.1 M NaCl, pH 7.0 (2 * 0.5 l gradient volume) eluted. Fractions containing IL-16 were identified by SDS-PAGE and ver agrees.
300 mg des so erhaltenen Fusionsproteins wurden bei 4°C gegen 20 l 20 mM Imidazol, pH 5,5 dialysiert und anschließend zur Entfernung von Trübungen 30 min bei 20 000 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde anschließend mit NaOH auf pH 8,5 eingestellt, mit 0,3 mg Thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) versetzt und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Spaltansatz mit HCl auf pH 6,5 und die Leitfähigkeit durch Verdün nung mit H₂O auf 1,7 mS eingestellt. Die Probe wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule (45 ml; Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 20 mM Imidazol, pH 6,5 äquilibriert worden war. Die Elution von IL-16 erfolgt mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl in 20 mM Imidazol, pH 6,5. IL-16 enthaltende Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert und vereinigt. Die Identität von IL-16 wurde durch Massenanalyse (Molekulargewicht 13.566 ± 3 D) und automatisierte N-terminale Sequenzanalyse bestätigt. Zur Konzentrationsbestimmt wurde die UV-Absorption von IL-16 bei 280 nm und ein berechneter molarer Extinktionskoeffizient von 5540 M-1cm-1 bei dieser Wellenlänge (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) und ein Molekulargewicht von 13566 D verwendet. 300 mg of the fusion protein thus obtained were dialyzed at 4 ° C. against 20 l of 20 mM imidazole, pH 5.5 and then centrifuged at 20,000 g for 30 minutes to remove turbidity. The supernatant from the centrifugation was then adjusted to pH 8.5 with NaOH, 0.3 mg of thrombin (Boehringer Mannheim GmbH) was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 4 hours. The gap was then adjusted to pH 6.5 with HCl and the conductivity was adjusted to 1.7 mS by dilution with H₂O. The sample was applied to a Q-Sepharose FF column (45 ml; Pharmacia), which had previously been equilibrated with 20 mM imidazole, pH 6.5. IL-16 is eluted with a gradient of 0 to 0.3 M NaCl in 20 mM imidazole, pH 6.5. Fractions containing IL-16 were identified by SDS-PAGE and pooled. The identity of IL-16 was confirmed by mass analysis (molecular weight 13,566 ± 3 D) and automated N-terminal sequence analysis. The UV absorption of IL-16 at 280 nm and a calculated molar extinction coefficient of 5540 M -1 cm -1 at this wavelength were determined for the concentration (Mack et al. (1992) Analyt. Biochem. 200, 74-80) and a Molecular weight of 13566 D used.
Die so erhaltene IL-16 wies in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen eine Rein heit von mehr als 95% auf.The IL-16 obtained in this way was pure on SDS-PAGE under reducing conditions of more than 95%.
Von einer analytischen HPLC-Gelfiltrationssäule (Superdex HR 75; Pharmacia), die mit BSA, Ovalbumin, Chymotrypsinogen und Ribonuklease A geeicht worden war, eluierte IL-16 mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 27 000 D (siehe Fig. 3), weshalb diese Molekül spezies im folgenden als "Dimer" bezeichnet wird.IL-16 with an apparent molecular weight of approx. 27,000 D (see FIG. 3) eluted from an analytical HPLC gel filtration column (Superdex HR 75; Pharmacia), which had been calibrated with BSA, ovalbumin, chymotrypsinogen and ribonuclease A, which is why this molecule is hereinafter referred to as "dimer".
Die analytische Superdex 75 FPLC-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, 10% Glycerin, pH 7,0 und einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Die aufgetragene Proteinmenge in einem Volumen von 100 bis 150 µl betrug 1,5 bis 15 µg Protein. Die Detention erfolgte bei 220 nm.The analytical Superdex 75 FPLC column (Pharmacia) was washed with 25 mM Na phosphate, 0.5 M NaCl, 10% glycerol, pH 7.0 and a flow rate of 1 ml / min. The applied The amount of protein in a volume of 100 to 150 µl was 1.5 to 15 µg protein. The detention took place at 220 nm.
Zur Reinheitsanalyse mittels RP-HPLC wurde eine Vydac, Protein & Peptide C18, 4×18 mm Säule verwendet. Die Eulution erfolgt durch einen linearen Gradienten von 0% nach 80% B (Lösungsmittel B: 90% Acetonitril in 0,1% TFA; Lösungsmittel A: 0,1% TFA in H₂O) inner halb von 30 min mit einer Flußrate von 1 ml/min. Die Detention erfolgte bei 220 nm.A Vydac, Protein & Peptide C18, 4 × 18 mm was used for purity analysis using RP-HPLC Column used. The elution is carried out by a linear gradient from 0% to 80% B. (Solvent B: 90% acetonitrile in 0.1% TFA; solvent A: 0.1% TFA in H₂O) inner half of 30 min with a flow rate of 1 ml / min. Detection took place at 220 nm.
Da von Cruikshank, W. W., et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 eine polymere Form von IL-16 mit einem apparenten Molekulargewicht von 50-60 kD als aktive Molekülspezies beschrieben worden war, wurde durch De- und Renaturierungsexperimente mit dem derart isolierten hochreinen IL-16 versucht, die dimere Form in eine polymere Form zu überführen.As reported by Cruikshank, W. W., et al. In Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5109-5113 a polymeric form of IL-16 with an apparent molecular weight of 50-60 kD as active Molecular species had been described by denaturation and renaturation experiments with the high-purity IL-16 isolated in this way tried to convert the dimeric form into a polymeric form to convict.
37 mg IL-16 wurden gegen 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0 dialysiert und anschließend auf eine Konzentration von 7,1 mg/ml konzentriert. Die Denaturierung von IL-16 erfolgte durch die Zugabe von 1 ml 8 M GdmCl, 0,1 M Glycin/HCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTE, pH 1,8 zu 0,5 ml des IL-16-Konzentrates. Nach 1 Stunde Inkubation wurden je 100 µl dieser Lösung in je 2,2 ml der in Tabelle 1 beschriebenen Renaturierungspuffer bei Raumtemperatur (23+/-3°C) verdünnt. Die Bildung von polymeren IL-16 wurde nach einer Inkubtion von mindestens 2 Stunden mittels Molekularsieb-HPLC analysiert.37 mg of IL-16 were dialyzed against 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 and then up a concentration of 7.1 mg / ml concentrated. IL-16 was denatured by the addition of 1 ml of 8 M GdmCl, 0.1 M glycine / HCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTE, pH 1.8 0.5 ml of the IL-16 concentrate. After 1 hour of incubation, 100 μl of this solution were in each case 2.2 ml each of the renaturation buffers described in Table 1 at room temperature (23 +/- 3 ° C) diluted. The formation of polymeric IL-16 was analyzed by means of molecular sieve HPLC after an incubation of at least 2 hours.
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurden bei Renaturierung in Puffern mit vorheriger N₂-Begasung und EDTA unabhängig vom pH-Wert keine höhermolekularen IL-16-Spezies gebildet. Höhermolekulare IL-16-Assoziate wurden überraschenderweise nur in Puffern ohne EDTA und ohne Stickstoffbegasung, sowie insbesondere in Gegenwart von Kupferacetat gebildet. Die höhermolekulare Fom eluiert als homogener peak von einer analytischen Molekularsieb- HPLC-Säule (siehe Fig. 4) und hat ein apparentes Molekulargewicht von ca. 45±4 kD. Zur Unterscheidung von der "dimeren" Form wird diese Molekülspezies im weiteren als "Tetramer" bezeichnet.As can be seen from Table 1, no higher molecular weight IL-16 species were formed when renaturing in buffers with previous N₂ fumigation and EDTA regardless of the pH. Higher molecular IL-16 associates were surprisingly formed only in buffers without EDTA and without nitrogen fumigation, and in particular in the presence of copper acetate. The higher molecular weight elutes as a homogeneous peak from an analytical molecular sieve HPLC column (see FIG. 4) and has an apparent molecular weight of approx. 45 ± 4 kD. To distinguish it from the "dimeric" form, this molecular species is hereinafter referred to as "tetramer".
Da Kupferionen auch zur oxidativen Herstellung von Disulfidbrücken verwendet werden, wurde der Einfluß von Redox-Systemen auf die Tetramerisierung im folgenden näher unter sucht.Since copper ions are also used for the oxidative production of disulfide bridges, The influence of redox systems on tetramerization was discussed in more detail below is looking for.
Je 400 µl des in Beispiel beschriebenen Konzentrates von IL-16 mit einer Konzentration von 7,1 mg/l wurden in400 µl each of the concentrate of IL-16 described in the example with a concentration of 7.1 mg / l were in
- 1) 800 µl 8,0 GdmCl, 0,1 M Glycin/HCl, 1 mM DTE, pH 1,8 (=denaturiertes IL-16) oder1) 800 µl 8.0 GdmCl, 0.1 M glycine / HCl, 1 mM DTE, pH 1.8 (= denatured IL-16) or
- 2) 800 µl 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0 (=natives IL-16)2) 800 µl 20 mM sodium phosphate, pH 7.0 (= native IL-16)
verdünnt und 1 Stunde inkubiert. Je 100 µl dieser Verdünnungen wurden anschließend in je 2,2 ml einer wäßrigen Lösung aus 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 sowie der in Tabelle 2 beschriebenen Zusätze verdünnt, wobei die Puffer, in die das "native IL-16" aus 2) verdünnt wurden, zusätzlich 0,23 M GdmCl enthielten, so daß alle Renaturierungslösungen identische Konzen trationen auch an GdmCl aufwiesen.diluted and incubated for 1 hour. Each 100 ul of these dilutions were then in 2.2 ml of an aqueous solution of 0.1 M Tris / HCl, pH 8.5 and that described in Table 2 Additives diluted, the buffers into which the "native IL-16" from 2) were diluted, additionally contained 0.23 M GdmCl, so that all renaturation solutions had identical concentrations trations of GdmCl.
Wie Tabelle 2 zeigt, scheinen Redox-Reaktionen keinen Einfluß auf die Tetramerisierung zu haben, da die üblichen Redox-Systeme für Proteine aus GSH und GSSG keinen Einfluß haben. Vielmehr scheinen Metallionen für eine Stabilisierung des Teramers essentiell zu sein, da neben Kupfer- auch Magnesium- und Kalziumionen die Tetramerisierung induzieren können. Eine Denaturierung von IL-16 durch hohe Konzentration an Denaturierungsmitteln ist offenbar für eine Tetramerisierung nicht erforderlich, da diese auch ohne vorhergehende Denaturierung von IL-16 erfolgt.As Table 2 shows, redox reactions appear to have no effect on tetramerization have, since the usual redox systems for proteins from GSH and GSSG have no influence. Rather, metal ions seem to be essential for stabilizing the teramer, because In addition to copper, magnesium and calcium ions can also induce tetramerization. Denaturation of IL-16 by high concentration of denaturing agents is evident not required for tetramerization, as this can also be done without prior denaturation from IL-16.
Wie bei einer Gleichgewichtseinstellung und auch bei einer Assoziationsreaktion zweiter Ordnung zu erwarten, nimmt weiterhin die Ausbeute an Tetrameren IL-16 mit der Konzentration an Metallionen zu, wie es in der Tabelle 2 für Cu-Acetat ersichtlich ist. As with equilibrium and also with a second order association reaction To be expected, the yield of tetramers IL-16 continues to increase with the concentration to metal ions, as can be seen in Table 2 for Cu acetate.
Da eine vollständige Denaturierung von IL-16 für eine Tetramerisierung offenbar nicht erfor derlich ist, wurde der Einfluß niedriger GdmCl-Konzentrationen untersucht. Dazu wurde das in Beispiel 4a beschriebene IL-16-Konzentrat 71fach in 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 verdünnt, das zusätzlich die in Tabelle 3 beschriebenen Zusätze enthielt.Since complete denaturation of IL-16 for tetramerization does not appear to be necessary The influence of low GdmCl concentrations was investigated. That was what IL-16 concentrate described in Example 4a diluted 71-fold in 0.1 M Tris / HCl, pH 8.5, the additionally contained the additives described in Table 3.
Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, kann bei geringen IL-16-Konzentrationen für verschiedene Metallionen durch den Zusatz von nicht-denaturierenden Konzentrationen an Denaturie rungsmittel die Tetramerisierung unterstützt werden. As can be seen from Table 3, at low IL-16 concentrations, different Metal ions through the addition of non-denaturing concentrations of denatury tetramerization are supported.
Da es sich bei der Tetramerisierung von IL-16 um eine Reaktion zumindest 2. oder höherer Ordnung handelt, wurde die Geschwindigkeit der Tetramerisierung in Gegenwart von Cu(II)- Acetat untersucht.Since the tetramerization of IL-16 is a reaction at least 2nd or higher Order, the rate of tetramerization in the presence of Cu (II) - Acetate examined.
Dazu wurden 20 µl eines in Beispiel 4a beschriebenen IL-16-Konzentrats in 800 µl 0,1 M Tris/HCl, 250 µM Cu(II)-Acetat, 0,25 M GdmCl, pH 8,5 verdünnt und nach unterschiedlichen Inkubationszeiten Proben mittels einer analytischen Molekularsieb-HPLC-Säule auf ihren Tetramergehalt analysiert. Wie Tabelle 4 zeigt, ist die Tetramerisierung eine relativ langsame Reaktion, deren Geschwindigkeit jedoch von der Konzentration der Reaktanden abhängt. For this purpose, 20 ul of an IL-16 concentrate described in Example 4a in 800 ul 0.1 M were Tris / HCl, 250 µM Cu (II) acetate, 0.25 M GdmCl, pH 8.5 diluted and after different Incubation times on an analytical molecular sieve HPLC column on your samples Analyzed tetramer content. As Table 4 shows, tetramerization is a relatively slow one Reaction, the rate of which, however, depends on the concentration of the reactants.
EDTA bildet mit zweiwertigen Metallionen einen hochaffinen Komplex. Die Inhibition der Tetramerisierung durch EDTA sollte daher beweisen, daß diese durch zweiweritge Metallionen induziert wird.EDTA forms a high affinity complex with divalent metal ions. The inhibition of Tetramerization by EDTA should therefore prove that this is caused by two metal ions is induced.
Dazu wurde ein im Beispiel 4a beschriebenes IL-16-Konzentrat 40fach in Puffer verdünnt, die sich aus 0,1 M Tris/HCl, 0,25 M GdmCl, 250 µM Cu(II)-Acetat, pH 8,5 und steigende Kon zentrationen an EDTA zusammensetzten. Der Tetramergehalt wurde wiederum mittels Mole kularsieb-HPLC nach einer Inkubationszeit von mindestens 1 Stunde ermittelt.For this purpose, an IL-16 concentrate described in Example 4a was diluted 40-fold in buffer which consists of 0.1 M Tris / HCl, 0.25 M GdmCl, 250 µM Cu (II) acetate, pH 8.5 and increasing con Put together the concentrations at EDTA. The tetramer content was again determined using moles kularsieb HPLC determined after an incubation period of at least 1 hour.
Wie die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen, sind äquimolare Konzentrationen an EDTA bezüglich Cu(II)-Acetat tatsächlich in der Lage, die Tetramerisierung von IL-16 zu inhibieren.As the results in Table 5 show, equimolar concentrations of EDTA are related Cu (II) acetate is actually able to inhibit the tetramerization of IL-16.
Sollte es sich bei IL-16 um ein Metallprotein handeln, ist zu erwarten, daß stöchiometrische Mengen bzgl. Monomer oder Dimer zur Stabilisierung der tetrameren Form erforderlich sind. Im Gegensatz dazu sollten für eine katalytische Funktion der Cu2+-Ionen, z. B. bei einer Oxi dation von IL-16, geringere Mengen ausreichend sein.If IL-16 is a metal protein, it can be expected that stoichiometric amounts of monomer or dimer are required to stabilize the tetrameric form. In contrast, for a catalytic function of the Cu 2+ ions, e.g. B. with an Oxi dation of IL-16, smaller amounts may be sufficient.
Ein in Beispiel 4a beschriebenes IL-16-Konzentrat wurde zu einer Konzentration von 15 µM in Puffer verdünnt, die 50 mM MES, 250 mM GdmCl, pH 6,5 und zusätzlich zunehmende Konzentrationen an Cu(II)-Acetat enthielten. Proben dieser Verdünnungen wurden nach mindestens 9 Stunden Inkubationszeit mittels Molekularsieb-HPLC auf ihren Tetramergehalt analysiert.An IL-16 concentrate described in Example 4a became a concentration of 15 μM diluted in buffer, the 50 mM MES, 250 mM GdmCl, pH 6.5 and additionally increasing Concentrations of Cu (II) acetate contained. Samples of these dilutions were made after at least 9 hours of incubation by means of molecular sieve HPLC on their tetramer content analyzed.
Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, sind katalytische Mengen an Cu(II)-Acetat für eine Tetrameri sierung nicht ausreichend, weshalb es sich bei IL-16 um ein Metalloprotein handeln muß, dessen oligomere Konformation durch Metallionen stabilisiert wird.As shown in Table 5, catalytic amounts of Cu (II) acetate are for a tetramer not sufficient, which is why IL-16 must be a metalloprotein whose oligomeric conformation is stabilized by metal ions.
Um einen Eindruck über die Spezifität der Metallbindung von IL-16 und der Affinität für ver schiedene Metallionen zu erhalten, wurde ein in Beispiel 4a beschriebenes IL-16-Konzentrat zu einer Konzentration von 0,2 mg/ml in einen Puffer (0,1 M Tris/HCl, 0,23 M GdmCl, 1 mM EDTA, pH 8,5) verdünnt, der unterschiedliche Metallsalze in einer Konzentration von jeweils 500 µM enthielt. Der Tetramergehalt der Proben wurde mittels Molekularsieb-HPLC ca. 3 Stunden nach der Verdünnung, sowie nach aufeinanderfolgenden Dialysen gegen Puffer, die kein GdmCl (1. Dialyse) bzw. kein Metallsalz (2. Dialyse) enthielten, analysiert.To give an impression of the specificity of the metal binding of IL-16 and the affinity for ver To obtain different metal ions, an IL-16 concentrate was described in Example 4a to a concentration of 0.2 mg / ml in a buffer (0.1 M Tris / HCl, 0.23 M GdmCl, 1 mM EDTA, pH 8.5) diluted, the different metal salts in a concentration of each Contained 500 µM. The tetramer content of the samples was determined by means of molecular sieve HPLC approx. 3 Hours after dilution, as well as after successive dialyses against buffers contained no GdmCl (1st dialysis) or no metal salt (2nd dialysis).
Wie aus Tabelle 6 hervorgeht, sind verschiedene Metallionen prinzipiell in der Lage, eine Tetramerisierung von IL-16 zu induzieren. Die im Vergleich zu Cu(II)-Acetat geringeren Ausbeuten an Tetramer können durch die spezifischen unphysiologischen Pufferbedingungen verursacht werden und unter anderen Bedingungen eventuell wesentlich höher sein.As can be seen from Table 6, various metal ions are in principle able to form one To induce tetramerization of IL-16. The smaller ones compared to Cu (II) acetate Yields of tetramer can be determined by the specific unphysiological buffer conditions caused and may be significantly higher under other conditions.
Für die präparative Herstellung von tetramerem IL-16 wurde eine IL-16-Lösung mit 1,85 mg IL-16/ml (137 µm IL-16) in 20 mM Imidazol, 150 mM NaCl, pH 6,5 mit 250 µM Cu(II)Acetat in An- und Abwesenheit von 0,25 M GdmCl versetzt und der Tetrameranteil nach 90 min mittels Molekularsieb-HPLC analysiert. Wie Tabelle 7 zeigt, ist die Tetramerisierung nahezu vollständig und unabhängig von der GdmCl-Konzentration unter diesen Bedin gungen.An IL-16 solution with 1.85 mg was used for the preparative preparation of tetrameric IL-16 IL-16 / ml (137 µm IL-16) in 20 mM imidazole, 150 mM NaCl, pH 6.5 with 250 µM Cu (II) acetate in the presence and absence of 0.25 M GdmCl and the tetramer portion after 90 min analyzed by molecular sieve HPLC. As Table 7 shows, the tetramerization is almost completely and independent of the GdmCl concentration under these conditions gung.
Bei einer anschließenden Dialyse dieser Proben mit überwiegend Tetrameren für bis zu 4 Tage gegen 20 mM Na-Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0 wurde keine signifikante Abnahme der Tetramere beobachtet.Subsequent dialysis of these samples with predominantly tetramers for up to 4 days against 20 mM Na phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.0, there was no significant decrease in Tetramers observed.
Eine in Beispiel 4a beschriebene IL-16-Stammlösung wurde zu einer Konzentration von 0,2 mg in Puffer mit verschiedenen pH-Werten verdünnt, die jweils 250 µm Cu(II)-Acetat und 0,25 M GdmCl enthielten.An IL-16 stock solution described in Example 4a was made to a concentration of 0.2 mg diluted in buffer with different pH values, each 250 µm Cu (II) acetate and contained 0.25 M GdmCl.
Der Anteil an Tetrameren wurde mittels Molekularsieb-HPLC analysiert. Dabei wurde eine neue polymere Spezies von IL-16 detektiert, die im sauren pH-Bereich gebildet wird, mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 100 kD eluiert und zur Unterscheidung von der Dimeren und tetrameren Form von IL-16 im folgenden als "Polymer" bezeichnet wird. Offenbar kann IL-16 abhängig von den Pufferbedingungen in drei diskrete Assoziationszuständen vorliegen (Dimer, Tetramer und Polymer.The proportion of tetramers was analyzed by means of molecular sieve HPLC. One was detected new polymeric species of IL-16, which is formed in the acidic pH range an apparent molecular weight of approximately 100 kD and to distinguish it from the Dimeric and tetrameric form of IL-16 is hereinafter referred to as "polymer". Apparently can IL-16 in three discrete association states depending on the buffer conditions are present (dimer, tetramer and polymer.
Die Tetramerisierung ist im wesentlichen Metallionen-abhängig und hat ein breites pH-Opti mum, während die Polymerisierung in einem relativ engen pH-Bereich erfolgt.The tetramerization is essentially metal ion dependent and has a broad pH opti mum, while the polymerization takes place in a relatively narrow pH range.
Da aus obigen Beispielen ersichtlich ist, daß eine Tetramerisierung auch in Abwesenheit von GdmCl erfolgen kann, wurde die pH-Wert-Abhängigkeit dieser Reaktion in Analogie zu Beispiel 10 auch in Abwesenheit von GdmCl untersucht.Since it can be seen from the above examples that a tetramerization even in the absence of GdmCl can take place, the pH-dependence of this reaction became analogous to example 10 also examined in the absence of GdmCl.
Wie Tabelle 9 zeigt, ist der pH-Bereich der Tetramerisierung unter diesen Bedingungen enger, und vor allem werden Polymere fast ausschließlich bei pH 5,5 gebildet.As shown in Table 9, the pH range of the tetramerization is narrower under these conditions, and above all, polymers are almost exclusively formed at pH 5.5.
Eine erhöhte Ausbeute an polymeren IL-16 von 65% wurde erzielt, wenn die Inkubation von IL-16 in 50 mM MES, pH 5,5 bei einer Proteinkonzentration von 0,4 anstelle von den in Tabelle 9 verwendeten 0,2 mg/ml IL-16 erfolgte und die Inkubationszeit vor der Analytik von ca. 3 Stunden auf 16 h verlängert wurde. Durch eine Optimierung der Bedingungen kann also voraussichtlich annähernd quantitativ polymeres IL-16 hergestellt werden.An increased yield of polymeric IL-16 of 65% was achieved when the incubation of IL-16 in 50 mM MES, pH 5.5 at a protein concentration of 0.4 instead of that in Table 9 used 0.2 mg / ml IL-16 and the incubation time before the analysis of about 3 hours to 16 hours. So by optimizing the conditions expected to be produced approximately quantitatively polymeric IL-16.
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