DE19616645A1 - Method for transfection of animal cells - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen und dient zur Übertragung genetischer Information in kultivierte Säugerzellen (Transfektion) und in isolierte Gewebe und Organe in vitro (Explantate, Biopsie- und OP-Material). Sie ist in der medizinischen und biologischen Grundlagenforschung, insbesondere in Vorstudien zur Gentherapie (Untersuchungen zur Zugänglichkeit bestimmter Zellarten innerhalb von Organen, Testung verschiedener Promotoren) und in der pharmazeutischen Industrie einsetzbar.The invention relates to a method for gene transfer in animal cells and serves to transmit genetic Information in cultured mammalian cells (transfection) and in isolated tissues and organs in vitro (explants, biopsy and Surgical material). It is in medical and biological Basic research, especially in preliminary studies on gene therapy (Studies on the accessibility of certain cell types within organs, testing various promoters) and in can be used in the pharmaceutical industry.
Zum Gentransfer in kultivierte Säugerzellen (Transfektion) sind eine Anzahl von Verfahren bekannt geworden, die mit unterschiedlicher Effizienz bei verschiedenen Zelltypen arbeiten. Zu den wichtigsten zählen die Kalziumphosphat-DNA-Kopräzipitation, die Lipofektion und die Elektroporation, aber auch Virushüllproteine, chromosomale Proteine und synthetische kationische Polyaminosäuren wurden eingesetzt. Eine interessante Variante, die stark im Kommen ist, ist die Anknüpfung von Liganden für Zelloberflächenrezeptoren an durch z. B. mit Polylysin kondensierte DNA. Zu nennen ist hier die Transferrinfektion, bei der als Ligand das ubiquitäre Transferrin verwendet wird. Die kondensierte DNA wird über die Transferrin-Rezeptor-Wechselwirkung an die Zelloberfläche herangeführt und über Endozytose in die Rezipientenzelle eingeschleust (E. Wagner et. al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 3410-3414). Man kann wohl heute bei den meisten Anwendungsfällen für die in vitro Transfektion ein geeignetes und hinreichend effizientes Verfahren finden. Hauptnachteil ist das Fehlen einer universellen Methode und der häufige Einsatz von unphysiologischen Substanzen und Bedingungen, die zu einer Zellschädigung führen können. Hierauf ist häufig die Toxizität derartiger Verfahren beim in vivo Gentransfer zurückzuführen. Weitere Erfordernisse, die nur selten erfüllt sind, sind eine einfache Handhabung und ein günstiger Preis. Der derzeitige Kenntnisstand auf diesem Gebiet ist u. a. ausführlich in "Gene transfer and expression protocols" in Methods in Molecular Biology, Volume 7, 1991, E.J. Murray, ed., Humana Press, Clifton, N.J., beschrieben.For gene transfer to cultured mammalian cells (transfection) A number of procedures have become known that involve different efficiency for different cell types work. The most important are calcium phosphate-DNA coprecipitation, lipofection and electroporation, however also virus envelope proteins, chromosomal proteins and synthetic cationic polyamino acids were used. A interesting variant that is on the up is the Linking of ligands for cell surface receptors to e.g. B. DNA condensed with polylysine. It should be mentioned here Transfer infection, in which the ubiquitous ligand Transferrin is used. The condensed DNA is over the Transferrin-receptor interaction on the cell surface introduced and via endocytosis into the recipient cell introduced (E. Wagner et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)). You can probably do most today A suitable application for in vitro transfection and find a sufficiently efficient process. Main disadvantage is the lack of a universal method and the frequent use of unphysiological substances and conditions that lead to a Can lead to cell damage. This is often the toxicity of such methods in in vivo gene transfer. Other requirements that are rarely met are one easy handling and an affordable price. The current one Knowledge in this area is u. a. detailed in "Gene transfer and expression protocols "in Methods in Molecular Biology, Volume 7, 1991, E.J. Murray, ed., Humana Press, Clifton, N.J.
Forderungen, die heute an Transfektionsmethoden zu knüpfen sind, gehen über eine effiziente Transfektion und Expression von Fremdgenen in Zellkultur hinaus, sollen aber diese mit einschließen. Im Hinblick auf die Einführung der Gentherapie werden gegenwärtig etablierte Transfektionstechniken auf ihre Anwendbarkeit beim nichtviralen in vivo Gentransfer getestet. Bisher ist praktisch noch keine effiziente Methode des nichtviralen Gentransfers in ganze Organismen beschrieben worden. Die Ursachen sind vielfältig. Erwähnt sei die Größe der DNA-Kondensate, die häufig den Transport durch die Mikrokapillaren der Lunge und des peripheren Blutkreislaufs erschwert, der vorzeitige Abbau der Fremd-DNA in den Endosomen, der mangelnde Schutz gegen Scherkräfte und nukleolytische Enzyme sowie Toxizitäts- und Immunitätsprobleme. Ein als aussichtsreich angesehenes Verfahren, das auf Liposomen, einem inaktivierten Virus (Sendai-Virus) und dem Nichthistonprotein HMG1 beruht (Y. Kaneda et. al.: Science 243 (1989), 375-378), erwies sich international als sehr schwer reproduzierbar. Physikalische Transfersysteme, wie der Partikelbeschuß, erfordern einen hohen experimentellen Aufwand und befinden sich ebenfalls noch im Experimentalstadium.Demands that tie to transfection methods today are about efficient transfection and expression of foreign genes in cell culture, but should also lock in. With regard to the introduction of gene therapy are currently established transfection techniques on their Applicability tested for non-viral in vivo gene transfer. So far, there is practically no efficient method of described nonviral gene transfers in whole organisms been. The causes are many. The size of the DNA condensates, which are often transported through the Microcapillaries of the lungs and peripheral blood circulation difficult, the premature breakdown of foreign DNA in the endosomes, the lack of protection against shear forces and nucleolytic Enzymes as well as toxicity and immunity problems. A as promising procedure based on liposomes, a inactivated virus (Sendai virus) and the non-histone protein HMG1 is based (Y. Kaneda et al .: Science 243 (1989), 375-378), turned out to be very difficult to reproduce internationally. Physical transfer systems, such as particle bombardment, require a lot of experimentation and are located also still in the experimental stage.
Auch für den Gentransfer in explantierte Gewebe- und Organproben (Explantate, OP-Material), der als ein vereinfachender Modellfall für den in vivo Gentransfer anzusehen ist, wurden bisher keine geeigneten Methoden beschrieben.Also for gene transfer into explanted tissue and Organ samples (explants, surgical material) that act as a Simplifying model case for in vivo gene transfer So far, no suitable methods have been considered described.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein kostengünstiges, vielseitig anwendbares und hocheffizientes Verfahren zur Transfektion zu entwickeln, das es gestattet kultivierte Säugerzellen in vitro und explantierte Gewebe- und Organproben zu transfizieren und das sich potentiell auch zum Gentransfer in vivo in ganze Organismen eignet. The invention was therefore based on the object cost-effective, versatile and highly efficient To develop methods for transfection that allow cultured mammalian cells in vitro and explanted tissue and To transfect organ samples and potentially also to Gene transfer in vivo in whole organisms is suitable.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Ansprüche realisiert.This object is achieved by the claims realized.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen ist dadurch gekennzeichnet, daß man zum Transport von DNA-Sequenzen vorgesehene Vektor-DNA mit Proteinfraktionen des Zellkerns oder daraus einzeln aufgereinigten Proteinen in Wechselwirkung bringt und die gebildeten kondensierten und/oder aggregierten Protein-DNA-Komplexe zur Transfektion mit Rezi pientenzellen in Verbindung bringt.The inventive method for gene transfer to animal Cells are characterized in that one is used to transport DNA sequences provided vector DNA with protein fractions of the Nucleus or proteins purified therefrom individually Brings interaction and the condensed and / or formed aggregated protein-DNA complexes for transfection with Rezi connects client cells.
Die Proteinfraktionen bzw. die aufgereinigten Proteine werden im Überschuß zur Vektor-DNA eingesetzt.The protein fractions or the purified proteins are used in excess of the vector DNA.
Die Proteinfraktionen werden durch saure Extraktion von Zellkernen und Fällung erhalten, wobei man zur Extraktion der Zellkerne 5% Perchlorsärue (PCA) bzw. 0,4 N Schwefelsäure und zur Gewinnung der transfektionsaktiven Proteinfraktionen durch fraktionierte Fällung 2 bis 6,5 Volumen Aceton, vorzugsweise bis 3,5 Volumen Aceton in Schritten von 0,5 Volumen bzw. bei Verwendung von Schwefelsäure zur Fällung 3,5 Volumen Aceton verwendet.The protein fractions are extracted by acid extraction from Obtain cell nuclei and precipitation, one for extracting the Cell nuclei 5% perchloric acid (PCA) or 0.4 N sulfuric acid and to obtain the transfection-active protein fractions fractional precipitation 2 to 6.5 volumes of acetone, preferably up to 3.5 volumes of acetone in increments of 0.5 volume or at Use sulfuric acid to precipitate 3.5 volumes of acetone used.
Zum Erreichen einer weiteren Erhöhung der Transfektionsaktivi tät werden die Proteinfraktionen mittels chromatographischer Verfahren, z. B. FPLC (fast protein liquid chromatography) einer weiteren Aufreinigung unter Einsatz von Anionen- und Kationenaustauschern unterzogen.To achieve a further increase in transfection activity The protein fractions are determined using chromatographic Process, e.g. B. FPLC (fast protein liquid chromatography) one further purification using anion and Cation exchangers subjected.
Es können zur Transfektion auch die einzeln aufgereinigten Proteine, Histon H1, die Histone H2a, H2b, H3 und H4, entweder getrennt oder in äquimolarer Mischung und das Nichthistonprotein HMG 17 und weitere nichtidentifizierte Proteine, die in wechselnder Menge als Bestandteil der Fraktion vorkommen, eingesetzt werden.For the transfection, the individually cleaned ones can also be used Proteins, histone H1, the histones H2a, H2b, H3 and H4, either separately or in an equimolar mixture and that Non-histone protein HMG 17 and other unidentified Proteins in varying amounts as part of the fraction occur, are used.
Der erfindungsgemäße Protein-DNA-Komplex wird durch schrittweises Mischen oder durch Dialyse hergestellt, wobei divalente Kationen, insbesondere Kalzium, in der trans fektionsaktiven DNA-Protein-Mischung und im Zellkulturmedium anwesend sind.The protein-DNA complex according to the invention is by gradual mixing or made by dialysis, wherein divalent cations, especially calcium, in the trans infection-active DNA-protein mixture and in cell culture medium are present.
Es besteht eine reverse Relation zwischen Ca-Konzentration im Zellkulturmedium und Inkubationszeit der Zellen mit den Protein-DNA-Komplexen. Bei einer Inkubationszeit von 4 Stunden ist eine Ca-Konzentration im Zellkulturmedium von 2-4 mM CaCl₂ optimal.There is a reverse relation between Ca concentration in the Cell culture medium and incubation time of the cells with the Protein-DNA complexes. With an incubation period of 4 hours is a Ca concentration in the cell culture medium of 2-4 mM CaCl₂ optimal.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur in vitro Zelltransfektion mit transienter und stabiler Expression, zur in vitro Transfektion von Gewebe- oder Organexplantaten, wie Biopsie- und OP-Material, und zum in vivo Gentransfer geeignet.The method according to the invention is for in vitro Cell transfection with transient and stable expression, for in vitro transfection of tissue or organ explants, such as Biopsy and surgical material, and suitable for in vivo gene transfer.
Zur Verbesserung der Expression bei der Gewebetransfektion xenotransplantiert man transfizierte Gewebeexplantate in immunodefiziente Tiermodelle (z. B. nude, scid), beläßt diese dort für einige Tage und entnimmt sie dann zur Analyse der transfizierbaren Zellarten innerhalb des Explantates. Man kann auch über die Gewebetransfektion und syngene Transplantation einen in vivo Gentransfer durchführen.To improve expression in tissue transfection xenotransplant transfected tissue explants into immunodeficient animal models (e.g. nude, scid), leave them there for a few days and then removes it for analysis of the transfectable cell types within the explant. Man can also about tissue transfection and syngeneic Transplant an in vivo gene transfer.
Im Einzelnen läuft das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt ab:The method according to the invention proceeds as follows:
- 1. Aus frisch entnommenem oder tiefgefrorenem Kalbsthymus bzw. aus anderen Organen werden die Zellkerne isoliert und ein Gesamtextrakt der chromosomalen Proteine hergestellt. Dies kann mit Hilfe von Säureextraktionsmethoden (Perchlorsäure PCA], Schwefelsäure) bzw. mit Hilfe der Salzextraktion (Kochsalz, Ammoniumsulfat) erfolgen. Die extrahierten Proteine werden mit 6 Volumen Aceton gefällt und getrocknet. Andere Fällungsmittel sind Äthanol, Methanol und Trichloressigsäure (TCA) bzw. hydrophobische Medien.1. From freshly taken or frozen calf thymus or the cell nuclei are isolated from other organs Total extract of the chromosomal proteins produced. This can with the help of acid extraction methods (perchloric acid PCA), Sulfuric acid) or with the help of salt extraction (table salt, Ammonium sulfate). The extracted proteins are included 6 volumes of acetone are precipitated and dried. Other precipitants are ethanol, methanol and trichloroacetic acid (TCA) or hydrophobic media.
- 2. Nach Lösen des Gesamtproteins in physiologischem Puffer werden Proteinfraktionen durch fraktionierte Acetonfällung mit ansteigendem Volumen in Schritten von je 0,5 Volumeneinheiten Aceton, beginnend mit 2 Vol Aceton gewonnen. Nach jedem Fällungsschritt wird nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins der Überstand mit einer weiteren Portion Aceton versetzt und die nächste gefällte Fraktion erhalten. Auf ähnliche Weise kann man mit anderen Fällungsmitteln verfahren.2. After dissolving the total protein in physiological buffer become protein fractions by fractional acetone precipitation with increasing volume in steps of 0.5 Volume units of acetone, starting with 2 vol acetone. After each precipitation step, after centrifuging off the precipitated protein the supernatant with another serving Acetone added and the next precipitated fraction obtained. In a similar way you can with other precipitants method.
- 3. Die Fraktionen, die man durch Fällung mit 2 Volumen bis 6,5 Volumen Aceton erhält, erweisen sich nach dem unten beschriebenen Transfektionsansatz als transfektionsaktiv. Sie enthalten in wechselnder Zusammensetzung neben dem H1-Histon die großen und kleinen HMG-Proteine und weitere Proteine. Das Transfektionsmaximum liegt bei 3 Volumen Aceton. Aus der Zusammensetzung der aktiven Fraktionen, die man durch Polyacrylamidgelelektrophorese im Essigsäure/Harnstoff- System erhält, ergibt sich, daß die Proteine H1, HMG17, HMG1 und HMG2 neben weiteren Proteinen an der Transfektion beteiligt sind. HMG1 und HMG2 wurden bereits als transfektionsaktive Proteine identifiiziert (M. Böttger et al. DD 2 56 148, Biochim. Bioophys. Acta 950 (1988) 221-228). H1-Histon erwies sich unter den hier erprobten Transfektionsbedingungen auch allein als transfektionsaktiv und zeigt eine hohe Effizienz.3. The fractions obtained by precipitation with 2 volumes to 6.5 Volume of acetone obtained turns out to be below described transfection approach as transfection active. she contained in a changing composition in addition to the H1 histone the large and small HMG proteins and other proteins. The Transfection maximum is 3 volumes of acetone. From the Composition of the active fractions that go through Polyacrylamide gel electrophoresis in the acetic acid / urea system is obtained, it follows that the proteins H1, HMG17, HMG1 and HMG2 are involved in transfection in addition to other proteins. HMG1 and HMG2 have already been identified as transfection-active proteins identified (M. Böttger et al. DD 2 56 148, Biochim. Bioophys. Acta 950 (1988) 221-228). H1 histone turned out to be among those here tried transfection conditions alone as well active in transfection and shows high efficiency.
- 4. Transfizierende Komplexe mit der Vektor-DNA werden durch Mischung der Konstituenten DNA und Protein in Gegenwart von divalenten Kationen hergestellt. Als Protein können die o.g. Fraktionen, H1-Histon, die Histone H2a, H2b, H3 und H4, HMG 17 und HMG1/2 dienen. Die Anwesenheit von divalenten Kationen, z. B. Ca⁺⁺, ist für das Erreichen hoher Transferraten essentiell.4. Transfecting complexes with the vector DNA are made by Mixture of the constituents DNA and protein in the presence of divalent cations. As a protein, the above Fractions, H1 histone, the histones H2a, H2b, H3 and H4, HMG 17 and HMG1 / 2 serve. The presence of divalent cations, e.g. B. Ca⁺⁺ is for achieving high transfer rates essential.
- 5. Die Transfektion erfolgt einfach durch die Addition der Komplexe zum Zellkulturmedium, das ebenfalls divalente Kationen enthält und weiter durch die Addition dieser Transfektions mischung zu den Zellen. Die Transfektionsmischung wird in Abhängigkeit von der Zellverträglichkeit einige Stunden mit den Zellen unter den üblichen Bedingungen inkubiert. Nach Wechsel zum normalen Kulturmedium wird bis zum Fremdgen-Assay bzw. bis zum Beginn der Selektion weiter inkubiert. 5. The transfection is done simply by adding the Complexes to the cell culture medium, which is also divalent cations contains and further by the addition of this transfection mix to the cells. The transfection mix is in Depending on the cell tolerance a few hours with the Cells incubated under the usual conditions. After change the normal culture medium becomes the foreign gene assay or incubated further at the beginning of the selection.
- 6. Mit dieser Methode lassen sich auch Gewebe- bzw. Organproben (z. B. humanen Ursprungs aus Biopsien oder OP-Material) trans fizieren. Diese Materialien, soweit sie ausreichend vital sind, werden in den beschriebenen Transfektionsmischungen inkubiert und können anschließend auf die Anwesenheit der Fremdgene (z. B. Lac Z als Reportergen) analysiert werden. Eine Transplantation in immundefiziente Versuchstiere (z. B. nude- oder scid-Mäuse) verstärkt die Fremdgenexpression.6. Tissue or organ samples can also be taken with this method (e.g. human origin from biopsies or surgical material) trans fection. These materials, as far as they are sufficiently vital, are incubated in the described transfection mixtures and can then check for the presence of the foreign genes (e.g. Lac Z as reporter gene) can be analyzed. A Transplantation into immunodeficient experimental animals (e.g. nude or scid mice) enhances foreign gene expression.
Anschließend wird die Erfindung an Beispielen erläutert, auf die sie aber nicht beschränkt sein soll.The invention is then explained using examples but it should not be limited.
a) Herstellung der Kernfraktionen (in Anlehnung an C. Sanders,
E. W. Jones: Biochem. Soc. Trans. 2 (1974), 547-550):
Tiefgefrorener Kalbsthymus (ca. 50 g) wird mechanisch
zerkleinert und grob im Puffer I, der auch bei allen weiteren
Schritten Anwendung findet, homogenisiert (Ultraturrax). Um
nicht die Kerne zu schädigen, erfolgt die Feinhomogenisierung
per Hand in einem Potter-Homogenisator. Nach Grobfiltration
wird zur Kernisolierung das Homogenisat bei ca. 50 × g für 20 min
zentrifugiert. Die resultierenden Kerne sollen ein
gelartiges, weißes Pellet bilden. Der Gewebeaufschluß und die
gesamte Kernisolierung wird bei 0°C durchgeführt. Nach einem
Waschschritt in Puffer I zur Entfernung von Fett werden die
Kerne unter Kühlung vorsichtig mit kurzen Ultraschallimpulsen
aufgeschlossen, mit 5% Perchlorsäure im Potter-Homogenisator
per Hand extrahiert und 1,5 Stunden auf Eis gehalten. Die
Extrakte werden weiter bei ca. 7000 × g zentrifugiert, der
Überstand gesammelt und auf Eis gekühlt. Nach einer weiteren
Extraktion der Pellets werden die Proteine aus dem Überstand
mit 6 Volumen (V) kalten Aceton in Gegenwart von 0,1 M HCl über
Nacht bei -20°C gefällt. Das gefällte Protein wird bei 6000 × g
für 10 min bei -15°C abzentrifugiert und getrocknet. Nach
Lösen in physiologischem Puffer wird eine Fraktionierung durch
schrittweise Addition der folgenden Volumen (V) kalten
Aceton/0,1 M HCl 1 V, 2 V, 2,5 V, 3 V, 3,5 V, 4,5 V, 5,5 V,
6,5 V erreicht. Die Proteine werden jedes Mal durch
Zentrifugation bei 6000 × g bei -15°C abzentrifugiert und das
nächste Volumen Aceton zum Überstand addiert. Die gesammelten
Proteine werden mehrfach mit reinem Aceton gewaschen,
getrocknet (lyophilisiert) und in getrocknetem Zustand bei -20°C
aufbewahrt.
Puffer I: 0,05 M NaCl, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl₂, 0,01 M Tris-HCl,
pH 7,4, 1 mM DTT, 50 mM PMSF.a) Preparation of the core fractions (based on C. Sanders, EW Jones: Biochem. Soc. Trans. 2 (1974), 547-550):
Frozen calf thymus (approx. 50 g) is mechanically crushed and roughly homogenized in buffer I, which is also used in all further steps (Ultraturrax). In order not to damage the cores, the fine homogenization is carried out by hand in a Potter homogenizer. After coarse filtration, the homogenate is centrifuged at approx. 50 × g for 20 min to isolate the core. The resulting cores are said to form a gel-like, white pellet. Tissue disruption and all core insulation are carried out at 0 ° C. After a washing step in buffer I to remove fat, the cores are carefully digested with short ultrasound pulses while cooling, extracted by hand with 5% perchloric acid in a Potter's homogenizer and kept on ice for 1.5 hours. The extracts are further centrifuged at approx. 7000 × g, the supernatant collected and cooled on ice. After a further extraction of the pellets, the proteins are precipitated from the supernatant with 6 volumes (V) of cold acetone in the presence of 0.1 M HCl overnight at -20 ° C. The precipitated protein is centrifuged at 6000 × g for 10 min at -15 ° C. and dried. After dissolving in physiological buffer, fractionation is carried out by gradually adding the following volumes (V) of cold acetone / 0.1 M HCl 1 V, 2 V, 2.5 V, 3 V, 3.5 V, 4.5 V, 5 , 5 V, 6.5 V reached. The proteins are centrifuged each time by centrifugation at 6000 × g at -15 ° C. and the next volume of acetone is added to the supernatant. The collected proteins are washed several times with pure acetone, dried (lyophilized) and stored in the dried state at -20 ° C.
Buffer I: 0.05 M NaCl, 0.1 M KCl, 1 mM MgCl₂, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM DTT, 50 mM PMSF.
b) Weitere Separierung und Aufreinigung der Kernfraktionen:
Eine weitere Aufreinigung der so erhaltenen Kernfraktionen
erfolgt durch FPLC (fast protein liquid chromatography), wobei
die Erhöhung der Transfektionseffizienz als Kriterium für die
fortschreitende Aufreinigung fungiert. Sowohl der Einsatz von
starken Anionenaustauschern (Mono Q) als auch von
Kationenaustauschern (Mono S) der Firma Pharmacia sowie deren
Kombination führen zu Fraktionen mit weiter erhöhter
Transfektionseffizienz. Beschrieben wird hier die
Aufreinigung der 3,5 V-Fraktion. Nach Anwendung der Mono
Q-Säule erwies sich die nicht an die Säule bindende
Proteinfraktion (Ausschluß) am effektivsten. Sie wird hier 3,5
VA genannt. Die weitere Fraktionierung der 3,5 VA-Fraktion auf
einer Mono S-Säule führte zu einer Reihe von Subfraktionen
(3,5 VA S3-S9). Im einzelnen: Die lyophilisierte Fraktion 3,5 V
wurde in Puffer A gelöst und in einer Konzentration von 2
mg/ml auf die Säule Mono Q HR 5/5 aufgetragen. Die Elution
erfolgte durch einen Salzgradient von 3-73% in Puffer B. Die
resultierende Ausschluß-Fraktion 3,5 VA wurde nach Fällung,
Lyophilisierung und Aufnahme in Puffer A auf die Säule Mono S
HR 5/5 aufgetragen und in analoger Weise mit dem gleichen
Salzgradienten, aber in Puffer C eluiert. Die Protein
zusammensetzung der untersuchten Fraktionen wurde durch
Polyacrylamidgelelektrophorese im Säure-Harnstoff-System (S.
Paniym, R. Chalkley: Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969),
337-346) untersucht.
Puffer A: 0,02 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 M
β-Mercaptoethanol,
Puffer B: 0,82 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 M
β-Mercaptoethanol,
Puffer C: 1,82 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02
β-Mercaptoethanol.b) Further separation and purification of the core fractions:
The core fractions thus obtained are further purified by FPLC (fast protein liquid chromatography), the increase in transfection efficiency acting as a criterion for the progressive purification. Both the use of strong anion exchangers (Mono Q) and cation exchangers (Mono S) from Pharmacia and their combination lead to fractions with further increased transfection efficiency. The purification of the 3.5 V fraction is described here. After using the Mono Q column, the protein fraction (exclusion) not binding to the column proved to be the most effective. It is called 3.5 VA here. Further fractionation of the 3.5 VA fraction on a Mono S column resulted in a series of sub-fractions (3.5 VA S3-S9). In detail: The lyophilized 3.5 V fraction was dissolved in buffer A and applied in a concentration of 2 mg / ml to the Mono Q HR 5/5 column. The elution was carried out by a salt gradient of 3-73% in buffer B. The resulting exclusion fraction 3.5 VA was applied to the column Mono S HR 5/5 after precipitation, lyophilization and absorption in buffer A and in an analogous manner with the same salt gradient, but eluted in buffer C. The protein composition of the fractions examined was examined by polyacrylamide gel electrophoresis in the acid-urea system (S. Paniym, R. Chalkley: Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969), 337-346).
Buffer A: 0.02 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4, 0.02 M β-mercaptoethanol,
Buffer B: 0.82 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4, 0.02 M β-mercaptoethanol,
Buffer C: 1.82 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4, 0.02 β-mercaptoethanol.
c) Herstellung transfektionsaktiver Protein-DNA-Komplexe und
Transfektion:
Vektor-DNA und Protein werden bei Zimmertemperatur in
physiologischem Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6)
und in Gegenwart von 2 mM CaCl₂, bezogen auf 100 µl
Gesamtansatz, gemischt. Um Trübungen zu vermeiden, wird das
Protein schrittweise in Portionen zur DNA zugesetzt. Im
allgemeinen wird ein Endverhältnis von Protein/DNA von ca. 20
eingestellt, höhere Protein/DNA-Ratios resultieren nicht in
höherer Transfektionseffizienz. Vor der Transfektion werden die
Komplexe etwa 15 min geschüttelt. Für die in vitro
Transfektion werden i.a. 2 × 10⁵ Zellen, hier NIH 3T3, und 2 µg
DNA eingesetzt. Die fertigen Komplexe (100 µl) werden direkt
ins Kulturmedium gegeben, das 8 mM Calciumchlorid enthält,
und nach Umschütteln zu den Zellen addiert. Die
Transfektionsmischung bleibt 4 Stunden auf den Zellen, die
Zellen werden dann mit RPMI gewaschen, frisches Kulturmedium
(RPMI, 10% FKS) hinzugefügt und ca. 24 Std. wie üblich
inkubiert. Anschließend wird mit dem Assay bzw. bei stabiler
Expression mit der Selektion begonnen. Die Transfereffizienz
kann am einfachsten mit Reportergenen (pCMVLuci und pSVβgal)
abgeschätzt werden. Die Nachweismethoden sind Routine und
werden hier nicht weiter beschrieben (z. B. Gene Transfer and
Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 7, E.J.
Murray, ed., Humana Press, Clifton, N.J.).c) Production of transfection-active protein-DNA complexes and transfection:
Vector DNA and protein are mixed at room temperature in physiological buffer (0.15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6) and in the presence of 2 mM CaCl₂, based on 100 ul total batch. To avoid cloudiness, the protein is gradually added to the DNA in portions. In general, a final protein / DNA ratio of approx. 20 is set; higher protein / DNA ratios do not result in higher transfection efficiency. The complexes are shaken for about 15 minutes before transfection. Generally 2 × 10⁵ cells, here NIH 3 T3, and 2 µg DNA are used for the in vitro transfection. The finished complexes (100 µl) are added directly to the culture medium containing 8 mM calcium chloride and added to the cells after shaking. The transfection mixture remains on the cells for 4 hours, the cells are then washed with RPMI, fresh culture medium (RPMI, 10% FCS) is added and incubated for about 24 hours as usual. Then the assay or, if expression is stable, the selection is started. The easiest way to estimate transfer efficiency is with reporter genes (pCMVLuci and pSVβgal). The detection methods are routine and are not described further here (e.g. Gene Transfer and Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 7, EJ Murray, ed., Humana Press, Clifton, NJ).
d) Ergebnisse:
Die Ergebnisse von Transfektionsversuchen zur transienten
Transfektion mit dem Luciferasegen (pCMVβgal) in NIH 3T3-Zellen
als Komplex mit den durch Acetonfällung erhaltenen
Proteinfraktionen 1 V-6,5 V werden in Abb. 1 dargestellt. Das
übertragene Gen induziert in Gegenwart von Luciferin eine
Lichtemission, die in Form von relativen Lichteinheiten an
einem Luminometer (Berthold, Lumat) gemessen werden kann.d) Results:
The results of transfection experiments for transient transfection with the luciferase gene (pCMVβgal) in NIH 3 T3 cells as a complex with the protein fractions 1 V-6.5 V obtained by acetone precipitation are shown in FIG. 1. The transmitted gene induces light emission in the presence of luciferin, which can be measured in the form of relative light units on a luminometer (Berthold, Lumat).
Die Abb. 1 zeigt, daß ausgehend von 2 V Aceton bis zu 3,5 V eine hohe Transfektionseffizienz erhalten wird (Maximum bei 3 V). Freie DNA als Negativkontrolle ist inaktiv und liefert Werte, die dem Leerwert (ca. 2000 RLU) zuzuordnen sind. Oberhalb 3,5 V nimmt die Effizienz ab, eine geringe Transfektion wird jedoch noch bei 6,5 V erhalten. Hieraus ist zu schließen, daß insbesondere bis zu 3,5 V Aceton Proteinkomponenten mit hoher Transfektionsaktivität enthalten sind. Fig. 1 shows that a high transfection efficiency is obtained from 2 V acetone up to 3.5 V (maximum at 3 V). Free DNA as a negative control is inactive and provides values that can be assigned to the blank value (approx. 2000 RLU). The efficiency decreases above 3.5 V, but a low transfection is still obtained at 6.5 V. From this it can be concluded that in particular up to 3.5 V acetone protein components with high transfection activity are contained.
Die gelelektrophoretische Analyse im Essigsäure/Harnstoff-System (nicht gezeigt) erbrachte das Ergebnis, daß insbesondere von 2 bis 2,5 V Aceton in Gegenwart von CaCl₂ das H1-Histon die entscheidende Komponente ist. Ab 3,5 V spielen auch HMG17 sowie HMG1 und 2 eine Rolle. Des weiteren sind nichtidentifizierte Proteinkomponenten beteiligt. HMG1 und 2 sind bereits als transfektionsaktive Proteine identifiziert worden (M. Böttger et. al. DD 2 56 148 A1, Biochim. Biophys. Acta 950 (1988), 221-228).Gel electrophoretic analysis in the acetic acid / urea system (not shown) gave the result that in particular from 2 to 2.5 V acetone in the presence of CaCl₂ the H1-histone is crucial component. From 3.5 V also HMG17 play and HMG1 and 2 a role. Furthermore are unidentified protein components involved. HMG1 and 2 are already identified as transfection-active proteins (M. Böttger et. al. DD 2 56 148 A1, Biochim. Biophys. Acta 950 (1988) 221-228).
Um die Transfektionsaktivität von gereinigtem H1 in Gegewart von CaCl₂ zu beweisen, wurde ein Transfektionsversuch wie oben, mit kommerziellem H1 durchgeführt (Calbiochem Lot B12480).To maintain the transfection activity of purified H1 to prove CaCl₂, a transfection experiment as above, performed with commercial H1 (Calbiochem Lot B12480).
Abb. 2 zeigt eine hohe Transfektionseffizienz von H1 in der Gegenwart von CaCl₂. In Abwesenheit von Ca ist H1 inaktiv (nicht gezeigt). Zum Vergleich ist auch die Transfektionseffizienz von FPLC-gereinigtem HMG1 dargestellt. Fig. 2 shows a high transfection efficiency of H1 in the presence of CaCl₂. In the absence of Ca, H1 is inactive (not shown). The transfection efficiency of FPLC-purified HMG1 is also shown for comparison.
Abb. 3 zeigt die Transfektionsaktivität einer Serie von Proteinfraktionen, die den Effekt verschiedener Reinigungsschritte, angefangen vom ungereinigtem Gesamtprotein (Σ PCA) bis hin zum hocheffektiven, durch 2 FPLC-Säulen aufgereinigtem Protein (3,5 VA S8) demonstriert. Es sei erwähnt, daß in diesem Fall noch keine Aufreinigung zur Homogenität beobachtet wird. Die Essigsäure/Harnstoff-Proteinelektrophorese zeigt, daß neben H1-Histon noch das HMG-Protein HMG17 und weitere unbekannte Minorfraktionen vorhanden sind (nicht gezeigt). Fig. 3 shows the transfection activity of a series of protein fractions, which demonstrates the effect of various purification steps, from the unpurified total protein (Σ PCA) to the highly effective protein (3.5 VA S8) purified by 2 FPLC columns. It should be mentioned that no purification to homogeneity is observed in this case. The acetic acid / urea protein electrophoresis shows that, in addition to H1 histone, the HMG protein HMG17 and other unknown minor fractions are also present (not shown).
Arteriensegmente (Aorta carotis) wurden Ratten entnommen und nach Spülung in isotonischer NaCl-Lösung in Zellkulturmedium (RPMI, 10% fötales Kälberserum) zwecks Aufbewahrung bis zu 16 Stunden aufgenommen. Vitalitätskontrollen anhand der Prostaglandinsekretion bzw. durch Xenotransplantation in nude und scid Mäuse zeigten einen hohen Vitalitätsgrad über mehrere Tage an. Die Arterien wurden in analogen Transfektionsmischungen wie bei der in vitro Transfektion (3 V, 3,5 V), jedoch pSVβgal enthaltend, für 16 Stunden inkubiert. Mit diesem Reporterplasmid kann man nach gelungener Einschleusung in die Zellen eine intensive Blaufärbung nach Anfärbung mit dem Farbstoff X-gal und histochemischer Analyse erzielen. (Lit. Gene transfer and expression protocols, wie oben). Die Arterienproben werden nach Spülung wie oben für 2 Stunden in 10% FKS, 8 mM CaCl₂ inkubiert, anschließend für 24 Stunden in 10% FKS inkubiert und für die histochemische Analyse tiefgefroren. Ein Teil der Arterienstücke wird nach der Inkubation in nude oder scid Mäuse xenotransplantiert.Artery segments (aorta carotis) were taken from rats and after rinsing in isotonic NaCl solution in cell culture medium (RPMI, 10% fetal calf serum) for storage up to 16 Hours recorded. Vitality checks based on the Prostaglandin secretion or by xenotransplantation in nude and scid mice showed a high degree of vitality over several Days on. The arteries were made in analog Transfection mixtures as in in vitro transfection (3 V, 3.5 V), but containing pSVβgal, incubated for 16 hours. With this reporter plasmid you can look for more successful Smugging into the cells after intense blue staining Staining with the X-gal dye and histochemical analysis achieve. (Lit. Gene transfer and expression protocols, such as above). The arterial samples are rinsed as above for 2 Incubated in 10% FCS, 8 mM CaCl₂ for hours, then for 24 Incubated for 10 hours in FCS and for histochemical Frozen analysis. Part of the artery pieces will be after the Incubation xenografted in nude or scid mice.
Die histochemische Analyse erbrachte sowohl bei den direkt untersuchten, als auch bei den transplantierten Aorten eine intensive Blaufärbung sowohl der luminalen Endothelien, als auch der Adventitia. Auch eine Anfärbung der glatten Muskelzellen ist nachweisbar. Nach der Xenotransplantation in eine scid-Maus ist deutlich eine Expressionszunahme erkennbar. Die beobachtete Expressionszunahme ist auf die verbesserte Stoffwechsellage der transplantierten Aorta zurückzuführen, die in einer Steigerung der Transkription des eingeschleusten Fremdgens resultiert.The histochemical analysis showed both in the direct examined, as well as in the transplanted aortas intense blue staining of both the luminal endothelia and also the adventitia. Also staining the smooth Muscle cells are detectable. After the xenograft in a scid mouse clearly shows an increase in expression. The observed increase in expression is due to the improved Metabolic position of the transplanted aorta attributed to the in an increase in transcription of the infiltrated Foreign gene results.
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|---|---|---|---|
| DE1996116645 DE19616645A1 (en) | 1996-04-26 | 1996-04-26 | Method for transfection of animal cells |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0908521A1 (en) * | 1997-10-10 | 1999-04-14 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Transfection system for the transfer of nucleic acids into cells |
| WO1999019502A1 (en) * | 1997-10-10 | 1999-04-22 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Transfection system for the transfer of nucleic acids into cells |
| EP0967288A1 (en) * | 1998-06-16 | 1999-12-29 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Transfection system for the transfer of nucleic acids into cells |
| WO2002063026A1 (en) * | 2001-02-08 | 2002-08-15 | Geneporter, Inc. | Complexes and components thereof for introducing polynucleotides into eukaryotic cells |
-
1996
- 1996-04-26 DE DE1996116645 patent/DE19616645A1/en not_active Withdrawn
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