DE19616645A1 - Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen - Google Patents
Verfahren zum Gentransfer in tierische ZellenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gentransfer in
tierische Zellen und dient zur Übertragung genetischer
Information in kultivierte Säugerzellen (Transfektion) und in
isolierte Gewebe und Organe in vitro (Explantate, Biopsie- und
OP-Material). Sie ist in der medizinischen und biologischen
Grundlagenforschung, insbesondere in Vorstudien zur Gentherapie
(Untersuchungen zur Zugänglichkeit bestimmter Zellarten
innerhalb von Organen, Testung verschiedener Promotoren) und in
der pharmazeutischen Industrie einsetzbar.
Zum Gentransfer in kultivierte Säugerzellen (Transfektion) sind
eine Anzahl von Verfahren bekannt geworden, die mit
unterschiedlicher Effizienz bei verschiedenen Zelltypen
arbeiten. Zu den wichtigsten zählen die Kalziumphosphat-DNA-Kopräzipitation,
die Lipofektion und die Elektroporation, aber
auch Virushüllproteine, chromosomale Proteine und synthetische
kationische Polyaminosäuren wurden eingesetzt. Eine
interessante Variante, die stark im Kommen ist, ist die
Anknüpfung von Liganden für Zelloberflächenrezeptoren an durch
z. B. mit Polylysin kondensierte DNA. Zu nennen ist hier die
Transferrinfektion, bei der als Ligand das ubiquitäre
Transferrin verwendet wird. Die kondensierte DNA wird über die
Transferrin-Rezeptor-Wechselwirkung an die Zelloberfläche
herangeführt und über Endozytose in die Rezipientenzelle
eingeschleust (E. Wagner et. al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87 (1990), 3410-3414). Man kann wohl heute bei den meisten
Anwendungsfällen für die in vitro Transfektion ein geeignetes
und hinreichend effizientes Verfahren finden. Hauptnachteil ist
das Fehlen einer universellen Methode und der häufige Einsatz
von unphysiologischen Substanzen und Bedingungen, die zu einer
Zellschädigung führen können. Hierauf ist häufig die Toxizität
derartiger Verfahren beim in vivo Gentransfer zurückzuführen.
Weitere Erfordernisse, die nur selten erfüllt sind, sind eine
einfache Handhabung und ein günstiger Preis. Der derzeitige
Kenntnisstand auf diesem Gebiet ist u. a. ausführlich in "Gene
transfer and expression protocols" in Methods in Molecular
Biology, Volume 7, 1991, E.J. Murray, ed., Humana Press,
Clifton, N.J., beschrieben.
Forderungen, die heute an Transfektionsmethoden zu knüpfen
sind, gehen über eine effiziente Transfektion und Expression
von Fremdgenen in Zellkultur hinaus, sollen aber diese mit
einschließen. Im Hinblick auf die Einführung der Gentherapie
werden gegenwärtig etablierte Transfektionstechniken auf ihre
Anwendbarkeit beim nichtviralen in vivo Gentransfer getestet.
Bisher ist praktisch noch keine effiziente Methode des
nichtviralen Gentransfers in ganze Organismen beschrieben
worden. Die Ursachen sind vielfältig. Erwähnt sei die Größe der
DNA-Kondensate, die häufig den Transport durch die
Mikrokapillaren der Lunge und des peripheren Blutkreislaufs
erschwert, der vorzeitige Abbau der Fremd-DNA in den Endosomen,
der mangelnde Schutz gegen Scherkräfte und nukleolytische
Enzyme sowie Toxizitäts- und Immunitätsprobleme. Ein als
aussichtsreich angesehenes Verfahren, das auf Liposomen, einem
inaktivierten Virus (Sendai-Virus) und dem Nichthistonprotein
HMG1 beruht (Y. Kaneda et. al.: Science 243 (1989), 375-378),
erwies sich international als sehr schwer reproduzierbar.
Physikalische Transfersysteme, wie der Partikelbeschuß,
erfordern einen hohen experimentellen Aufwand und befinden sich
ebenfalls noch im Experimentalstadium.
Auch für den Gentransfer in explantierte Gewebe- und
Organproben (Explantate, OP-Material), der als ein
vereinfachender Modellfall für den in vivo Gentransfer
anzusehen ist, wurden bisher keine geeigneten Methoden
beschrieben.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein
kostengünstiges, vielseitig anwendbares und hocheffizientes
Verfahren zur Transfektion zu entwickeln, das es gestattet
kultivierte Säugerzellen in vitro und explantierte Gewebe- und
Organproben zu transfizieren und das sich potentiell auch zum
Gentransfer in vivo in ganze Organismen eignet.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Ansprüche
realisiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Gentransfer in tierische
Zellen ist dadurch gekennzeichnet, daß man zum Transport von
DNA-Sequenzen vorgesehene Vektor-DNA mit Proteinfraktionen des
Zellkerns oder daraus einzeln aufgereinigten Proteinen in
Wechselwirkung bringt und die gebildeten kondensierten und/oder
aggregierten Protein-DNA-Komplexe zur Transfektion mit Rezi
pientenzellen in Verbindung bringt.
Die Proteinfraktionen bzw. die aufgereinigten Proteine werden
im Überschuß zur Vektor-DNA eingesetzt.
Die Proteinfraktionen werden durch saure Extraktion von
Zellkernen und Fällung erhalten, wobei man zur Extraktion der
Zellkerne 5% Perchlorsärue (PCA) bzw. 0,4 N Schwefelsäure und
zur Gewinnung der transfektionsaktiven Proteinfraktionen durch
fraktionierte Fällung 2 bis 6,5 Volumen Aceton, vorzugsweise
bis 3,5 Volumen Aceton in Schritten von 0,5 Volumen bzw. bei
Verwendung von Schwefelsäure zur Fällung 3,5 Volumen Aceton
verwendet.
Zum Erreichen einer weiteren Erhöhung der Transfektionsaktivi
tät werden die Proteinfraktionen mittels chromatographischer
Verfahren, z. B. FPLC (fast protein liquid chromatography) einer
weiteren Aufreinigung unter Einsatz von Anionen- und
Kationenaustauschern unterzogen.
Es können zur Transfektion auch die einzeln aufgereinigten
Proteine, Histon H1, die Histone H2a, H2b, H3 und H4, entweder
getrennt oder in äquimolarer Mischung und das
Nichthistonprotein HMG 17 und weitere nichtidentifizierte
Proteine, die in wechselnder Menge als Bestandteil der Fraktion
vorkommen, eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße Protein-DNA-Komplex wird durch
schrittweises Mischen oder durch Dialyse hergestellt, wobei
divalente Kationen, insbesondere Kalzium, in der trans
fektionsaktiven DNA-Protein-Mischung und im Zellkulturmedium
anwesend sind.
Es besteht eine reverse Relation zwischen Ca-Konzentration im
Zellkulturmedium und Inkubationszeit der Zellen mit den
Protein-DNA-Komplexen. Bei einer Inkubationszeit von 4 Stunden
ist eine Ca-Konzentration im Zellkulturmedium von 2-4 mM
CaCl₂ optimal.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur in vitro
Zelltransfektion mit transienter und stabiler Expression, zur
in vitro Transfektion von Gewebe- oder Organexplantaten, wie
Biopsie- und OP-Material, und zum in vivo Gentransfer geeignet.
Zur Verbesserung der Expression bei der Gewebetransfektion
xenotransplantiert man transfizierte Gewebeexplantate in
immunodefiziente Tiermodelle (z. B. nude, scid), beläßt diese
dort für einige Tage und entnimmt sie dann zur Analyse der
transfizierbaren Zellarten innerhalb des Explantates. Man
kann auch über die Gewebetransfektion und syngene
Transplantation einen in vivo Gentransfer durchführen.
Im Einzelnen läuft das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt ab:
- 1. Aus frisch entnommenem oder tiefgefrorenem Kalbsthymus bzw. aus anderen Organen werden die Zellkerne isoliert und ein Gesamtextrakt der chromosomalen Proteine hergestellt. Dies kann mit Hilfe von Säureextraktionsmethoden (Perchlorsäure PCA], Schwefelsäure) bzw. mit Hilfe der Salzextraktion (Kochsalz, Ammoniumsulfat) erfolgen. Die extrahierten Proteine werden mit 6 Volumen Aceton gefällt und getrocknet. Andere Fällungsmittel sind Äthanol, Methanol und Trichloressigsäure (TCA) bzw. hydrophobische Medien.
- 2. Nach Lösen des Gesamtproteins in physiologischem Puffer werden Proteinfraktionen durch fraktionierte Acetonfällung mit ansteigendem Volumen in Schritten von je 0,5 Volumeneinheiten Aceton, beginnend mit 2 Vol Aceton gewonnen. Nach jedem Fällungsschritt wird nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins der Überstand mit einer weiteren Portion Aceton versetzt und die nächste gefällte Fraktion erhalten. Auf ähnliche Weise kann man mit anderen Fällungsmitteln verfahren.
- 3. Die Fraktionen, die man durch Fällung mit 2 Volumen bis 6,5 Volumen Aceton erhält, erweisen sich nach dem unten beschriebenen Transfektionsansatz als transfektionsaktiv. Sie enthalten in wechselnder Zusammensetzung neben dem H1-Histon die großen und kleinen HMG-Proteine und weitere Proteine. Das Transfektionsmaximum liegt bei 3 Volumen Aceton. Aus der Zusammensetzung der aktiven Fraktionen, die man durch Polyacrylamidgelelektrophorese im Essigsäure/Harnstoff- System erhält, ergibt sich, daß die Proteine H1, HMG17, HMG1 und HMG2 neben weiteren Proteinen an der Transfektion beteiligt sind. HMG1 und HMG2 wurden bereits als transfektionsaktive Proteine identifiiziert (M. Böttger et al. DD 2 56 148, Biochim. Bioophys. Acta 950 (1988) 221-228). H1-Histon erwies sich unter den hier erprobten Transfektionsbedingungen auch allein als transfektionsaktiv und zeigt eine hohe Effizienz.
- 4. Transfizierende Komplexe mit der Vektor-DNA werden durch Mischung der Konstituenten DNA und Protein in Gegenwart von divalenten Kationen hergestellt. Als Protein können die o.g. Fraktionen, H1-Histon, die Histone H2a, H2b, H3 und H4, HMG 17 und HMG1/2 dienen. Die Anwesenheit von divalenten Kationen, z. B. Ca⁺⁺, ist für das Erreichen hoher Transferraten essentiell.
- 5. Die Transfektion erfolgt einfach durch die Addition der Komplexe zum Zellkulturmedium, das ebenfalls divalente Kationen enthält und weiter durch die Addition dieser Transfektions mischung zu den Zellen. Die Transfektionsmischung wird in Abhängigkeit von der Zellverträglichkeit einige Stunden mit den Zellen unter den üblichen Bedingungen inkubiert. Nach Wechsel zum normalen Kulturmedium wird bis zum Fremdgen-Assay bzw. bis zum Beginn der Selektion weiter inkubiert.
- 6. Mit dieser Methode lassen sich auch Gewebe- bzw. Organproben (z. B. humanen Ursprungs aus Biopsien oder OP-Material) trans fizieren. Diese Materialien, soweit sie ausreichend vital sind, werden in den beschriebenen Transfektionsmischungen inkubiert und können anschließend auf die Anwesenheit der Fremdgene (z. B. Lac Z als Reportergen) analysiert werden. Eine Transplantation in immundefiziente Versuchstiere (z. B. nude- oder scid-Mäuse) verstärkt die Fremdgenexpression.
Anschließend wird die Erfindung an Beispielen erläutert, auf
die sie aber nicht beschränkt sein soll.
a) Herstellung der Kernfraktionen (in Anlehnung an C. Sanders,
E. W. Jones: Biochem. Soc. Trans. 2 (1974), 547-550):
Tiefgefrorener Kalbsthymus (ca. 50 g) wird mechanisch zerkleinert und grob im Puffer I, der auch bei allen weiteren Schritten Anwendung findet, homogenisiert (Ultraturrax). Um nicht die Kerne zu schädigen, erfolgt die Feinhomogenisierung per Hand in einem Potter-Homogenisator. Nach Grobfiltration wird zur Kernisolierung das Homogenisat bei ca. 50 × g für 20 min zentrifugiert. Die resultierenden Kerne sollen ein gelartiges, weißes Pellet bilden. Der Gewebeaufschluß und die gesamte Kernisolierung wird bei 0°C durchgeführt. Nach einem Waschschritt in Puffer I zur Entfernung von Fett werden die Kerne unter Kühlung vorsichtig mit kurzen Ultraschallimpulsen aufgeschlossen, mit 5% Perchlorsäure im Potter-Homogenisator per Hand extrahiert und 1,5 Stunden auf Eis gehalten. Die Extrakte werden weiter bei ca. 7000 × g zentrifugiert, der Überstand gesammelt und auf Eis gekühlt. Nach einer weiteren Extraktion der Pellets werden die Proteine aus dem Überstand mit 6 Volumen (V) kalten Aceton in Gegenwart von 0,1 M HCl über Nacht bei -20°C gefällt. Das gefällte Protein wird bei 6000 × g für 10 min bei -15°C abzentrifugiert und getrocknet. Nach Lösen in physiologischem Puffer wird eine Fraktionierung durch schrittweise Addition der folgenden Volumen (V) kalten Aceton/0,1 M HCl 1 V, 2 V, 2,5 V, 3 V, 3,5 V, 4,5 V, 5,5 V, 6,5 V erreicht. Die Proteine werden jedes Mal durch Zentrifugation bei 6000 × g bei -15°C abzentrifugiert und das nächste Volumen Aceton zum Überstand addiert. Die gesammelten Proteine werden mehrfach mit reinem Aceton gewaschen, getrocknet (lyophilisiert) und in getrocknetem Zustand bei -20°C aufbewahrt.
Puffer I: 0,05 M NaCl, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl₂, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM DTT, 50 mM PMSF.
Tiefgefrorener Kalbsthymus (ca. 50 g) wird mechanisch zerkleinert und grob im Puffer I, der auch bei allen weiteren Schritten Anwendung findet, homogenisiert (Ultraturrax). Um nicht die Kerne zu schädigen, erfolgt die Feinhomogenisierung per Hand in einem Potter-Homogenisator. Nach Grobfiltration wird zur Kernisolierung das Homogenisat bei ca. 50 × g für 20 min zentrifugiert. Die resultierenden Kerne sollen ein gelartiges, weißes Pellet bilden. Der Gewebeaufschluß und die gesamte Kernisolierung wird bei 0°C durchgeführt. Nach einem Waschschritt in Puffer I zur Entfernung von Fett werden die Kerne unter Kühlung vorsichtig mit kurzen Ultraschallimpulsen aufgeschlossen, mit 5% Perchlorsäure im Potter-Homogenisator per Hand extrahiert und 1,5 Stunden auf Eis gehalten. Die Extrakte werden weiter bei ca. 7000 × g zentrifugiert, der Überstand gesammelt und auf Eis gekühlt. Nach einer weiteren Extraktion der Pellets werden die Proteine aus dem Überstand mit 6 Volumen (V) kalten Aceton in Gegenwart von 0,1 M HCl über Nacht bei -20°C gefällt. Das gefällte Protein wird bei 6000 × g für 10 min bei -15°C abzentrifugiert und getrocknet. Nach Lösen in physiologischem Puffer wird eine Fraktionierung durch schrittweise Addition der folgenden Volumen (V) kalten Aceton/0,1 M HCl 1 V, 2 V, 2,5 V, 3 V, 3,5 V, 4,5 V, 5,5 V, 6,5 V erreicht. Die Proteine werden jedes Mal durch Zentrifugation bei 6000 × g bei -15°C abzentrifugiert und das nächste Volumen Aceton zum Überstand addiert. Die gesammelten Proteine werden mehrfach mit reinem Aceton gewaschen, getrocknet (lyophilisiert) und in getrocknetem Zustand bei -20°C aufbewahrt.
Puffer I: 0,05 M NaCl, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl₂, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM DTT, 50 mM PMSF.
b) Weitere Separierung und Aufreinigung der Kernfraktionen:
Eine weitere Aufreinigung der so erhaltenen Kernfraktionen erfolgt durch FPLC (fast protein liquid chromatography), wobei die Erhöhung der Transfektionseffizienz als Kriterium für die fortschreitende Aufreinigung fungiert. Sowohl der Einsatz von starken Anionenaustauschern (Mono Q) als auch von Kationenaustauschern (Mono S) der Firma Pharmacia sowie deren Kombination führen zu Fraktionen mit weiter erhöhter Transfektionseffizienz. Beschrieben wird hier die Aufreinigung der 3,5 V-Fraktion. Nach Anwendung der Mono Q-Säule erwies sich die nicht an die Säule bindende Proteinfraktion (Ausschluß) am effektivsten. Sie wird hier 3,5 VA genannt. Die weitere Fraktionierung der 3,5 VA-Fraktion auf einer Mono S-Säule führte zu einer Reihe von Subfraktionen (3,5 VA S3-S9). Im einzelnen: Die lyophilisierte Fraktion 3,5 V wurde in Puffer A gelöst und in einer Konzentration von 2 mg/ml auf die Säule Mono Q HR 5/5 aufgetragen. Die Elution erfolgte durch einen Salzgradient von 3-73% in Puffer B. Die resultierende Ausschluß-Fraktion 3,5 VA wurde nach Fällung, Lyophilisierung und Aufnahme in Puffer A auf die Säule Mono S HR 5/5 aufgetragen und in analoger Weise mit dem gleichen Salzgradienten, aber in Puffer C eluiert. Die Protein zusammensetzung der untersuchten Fraktionen wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese im Säure-Harnstoff-System (S. Paniym, R. Chalkley: Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969), 337-346) untersucht.
Puffer A: 0,02 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 M β-Mercaptoethanol,
Puffer B: 0,82 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 M β-Mercaptoethanol,
Puffer C: 1,82 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 β-Mercaptoethanol.
Eine weitere Aufreinigung der so erhaltenen Kernfraktionen erfolgt durch FPLC (fast protein liquid chromatography), wobei die Erhöhung der Transfektionseffizienz als Kriterium für die fortschreitende Aufreinigung fungiert. Sowohl der Einsatz von starken Anionenaustauschern (Mono Q) als auch von Kationenaustauschern (Mono S) der Firma Pharmacia sowie deren Kombination führen zu Fraktionen mit weiter erhöhter Transfektionseffizienz. Beschrieben wird hier die Aufreinigung der 3,5 V-Fraktion. Nach Anwendung der Mono Q-Säule erwies sich die nicht an die Säule bindende Proteinfraktion (Ausschluß) am effektivsten. Sie wird hier 3,5 VA genannt. Die weitere Fraktionierung der 3,5 VA-Fraktion auf einer Mono S-Säule führte zu einer Reihe von Subfraktionen (3,5 VA S3-S9). Im einzelnen: Die lyophilisierte Fraktion 3,5 V wurde in Puffer A gelöst und in einer Konzentration von 2 mg/ml auf die Säule Mono Q HR 5/5 aufgetragen. Die Elution erfolgte durch einen Salzgradient von 3-73% in Puffer B. Die resultierende Ausschluß-Fraktion 3,5 VA wurde nach Fällung, Lyophilisierung und Aufnahme in Puffer A auf die Säule Mono S HR 5/5 aufgetragen und in analoger Weise mit dem gleichen Salzgradienten, aber in Puffer C eluiert. Die Protein zusammensetzung der untersuchten Fraktionen wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese im Säure-Harnstoff-System (S. Paniym, R. Chalkley: Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969), 337-346) untersucht.
Puffer A: 0,02 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 M β-Mercaptoethanol,
Puffer B: 0,82 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 M β-Mercaptoethanol,
Puffer C: 1,82 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,02 β-Mercaptoethanol.
c) Herstellung transfektionsaktiver Protein-DNA-Komplexe und
Transfektion:
Vektor-DNA und Protein werden bei Zimmertemperatur in physiologischem Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6) und in Gegenwart von 2 mM CaCl₂, bezogen auf 100 µl Gesamtansatz, gemischt. Um Trübungen zu vermeiden, wird das Protein schrittweise in Portionen zur DNA zugesetzt. Im allgemeinen wird ein Endverhältnis von Protein/DNA von ca. 20 eingestellt, höhere Protein/DNA-Ratios resultieren nicht in höherer Transfektionseffizienz. Vor der Transfektion werden die Komplexe etwa 15 min geschüttelt. Für die in vitro Transfektion werden i.a. 2 × 10⁵ Zellen, hier NIH 3T3, und 2 µg DNA eingesetzt. Die fertigen Komplexe (100 µl) werden direkt ins Kulturmedium gegeben, das 8 mM Calciumchlorid enthält, und nach Umschütteln zu den Zellen addiert. Die Transfektionsmischung bleibt 4 Stunden auf den Zellen, die Zellen werden dann mit RPMI gewaschen, frisches Kulturmedium (RPMI, 10% FKS) hinzugefügt und ca. 24 Std. wie üblich inkubiert. Anschließend wird mit dem Assay bzw. bei stabiler Expression mit der Selektion begonnen. Die Transfereffizienz kann am einfachsten mit Reportergenen (pCMVLuci und pSVβgal) abgeschätzt werden. Die Nachweismethoden sind Routine und werden hier nicht weiter beschrieben (z. B. Gene Transfer and Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 7, E.J. Murray, ed., Humana Press, Clifton, N.J.).
Vektor-DNA und Protein werden bei Zimmertemperatur in physiologischem Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6) und in Gegenwart von 2 mM CaCl₂, bezogen auf 100 µl Gesamtansatz, gemischt. Um Trübungen zu vermeiden, wird das Protein schrittweise in Portionen zur DNA zugesetzt. Im allgemeinen wird ein Endverhältnis von Protein/DNA von ca. 20 eingestellt, höhere Protein/DNA-Ratios resultieren nicht in höherer Transfektionseffizienz. Vor der Transfektion werden die Komplexe etwa 15 min geschüttelt. Für die in vitro Transfektion werden i.a. 2 × 10⁵ Zellen, hier NIH 3T3, und 2 µg DNA eingesetzt. Die fertigen Komplexe (100 µl) werden direkt ins Kulturmedium gegeben, das 8 mM Calciumchlorid enthält, und nach Umschütteln zu den Zellen addiert. Die Transfektionsmischung bleibt 4 Stunden auf den Zellen, die Zellen werden dann mit RPMI gewaschen, frisches Kulturmedium (RPMI, 10% FKS) hinzugefügt und ca. 24 Std. wie üblich inkubiert. Anschließend wird mit dem Assay bzw. bei stabiler Expression mit der Selektion begonnen. Die Transfereffizienz kann am einfachsten mit Reportergenen (pCMVLuci und pSVβgal) abgeschätzt werden. Die Nachweismethoden sind Routine und werden hier nicht weiter beschrieben (z. B. Gene Transfer and Expression Protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 7, E.J. Murray, ed., Humana Press, Clifton, N.J.).
d) Ergebnisse:
Die Ergebnisse von Transfektionsversuchen zur transienten Transfektion mit dem Luciferasegen (pCMVβgal) in NIH 3T3-Zellen als Komplex mit den durch Acetonfällung erhaltenen Proteinfraktionen 1 V-6,5 V werden in Abb. 1 dargestellt. Das übertragene Gen induziert in Gegenwart von Luciferin eine Lichtemission, die in Form von relativen Lichteinheiten an einem Luminometer (Berthold, Lumat) gemessen werden kann.
Die Ergebnisse von Transfektionsversuchen zur transienten Transfektion mit dem Luciferasegen (pCMVβgal) in NIH 3T3-Zellen als Komplex mit den durch Acetonfällung erhaltenen Proteinfraktionen 1 V-6,5 V werden in Abb. 1 dargestellt. Das übertragene Gen induziert in Gegenwart von Luciferin eine Lichtemission, die in Form von relativen Lichteinheiten an einem Luminometer (Berthold, Lumat) gemessen werden kann.
Die Abb. 1 zeigt, daß ausgehend von 2 V Aceton bis zu 3,5 V
eine hohe Transfektionseffizienz erhalten wird (Maximum bei 3 V).
Freie DNA als Negativkontrolle ist inaktiv und liefert
Werte, die dem Leerwert (ca. 2000 RLU) zuzuordnen sind.
Oberhalb 3,5 V nimmt die Effizienz ab, eine geringe
Transfektion wird jedoch noch bei 6,5 V erhalten. Hieraus ist
zu schließen, daß insbesondere bis zu 3,5 V Aceton
Proteinkomponenten mit hoher Transfektionsaktivität enthalten
sind.
Die gelelektrophoretische Analyse im Essigsäure/Harnstoff-System
(nicht gezeigt) erbrachte das Ergebnis, daß insbesondere
von 2 bis 2,5 V Aceton in Gegenwart von CaCl₂ das H1-Histon die
entscheidende Komponente ist. Ab 3,5 V spielen auch HMG17
sowie HMG1 und 2 eine Rolle. Des weiteren sind
nichtidentifizierte Proteinkomponenten beteiligt. HMG1 und 2
sind bereits als transfektionsaktive Proteine identifiziert
worden (M. Böttger et. al. DD 2 56 148 A1, Biochim. Biophys.
Acta 950 (1988), 221-228).
Um die Transfektionsaktivität von gereinigtem H1 in Gegewart
von CaCl₂ zu beweisen, wurde ein Transfektionsversuch wie oben,
mit kommerziellem H1 durchgeführt (Calbiochem Lot B12480).
Abb. 2 zeigt eine hohe Transfektionseffizienz von H1 in der
Gegenwart von CaCl₂. In Abwesenheit von Ca ist H1 inaktiv
(nicht gezeigt). Zum Vergleich ist auch die
Transfektionseffizienz von FPLC-gereinigtem HMG1 dargestellt.
Abb. 3 zeigt die Transfektionsaktivität einer Serie von
Proteinfraktionen, die den Effekt verschiedener
Reinigungsschritte, angefangen vom ungereinigtem Gesamtprotein
(Σ PCA) bis hin zum hocheffektiven, durch 2 FPLC-Säulen
aufgereinigtem Protein (3,5 VA S8) demonstriert. Es sei erwähnt,
daß in diesem Fall noch keine Aufreinigung zur Homogenität
beobachtet wird. Die Essigsäure/Harnstoff-Proteinelektrophorese
zeigt, daß neben H1-Histon noch das HMG-Protein HMG17 und
weitere unbekannte Minorfraktionen vorhanden sind (nicht
gezeigt).
Arteriensegmente (Aorta carotis) wurden Ratten entnommen und
nach Spülung in isotonischer NaCl-Lösung in Zellkulturmedium
(RPMI, 10% fötales Kälberserum) zwecks Aufbewahrung bis zu 16
Stunden aufgenommen. Vitalitätskontrollen anhand der
Prostaglandinsekretion bzw. durch Xenotransplantation in nude
und scid Mäuse zeigten einen hohen Vitalitätsgrad über mehrere
Tage an. Die Arterien wurden in analogen
Transfektionsmischungen wie bei der in vitro Transfektion (3 V,
3,5 V), jedoch pSVβgal enthaltend, für 16 Stunden inkubiert.
Mit diesem Reporterplasmid kann man nach gelungener
Einschleusung in die Zellen eine intensive Blaufärbung nach
Anfärbung mit dem Farbstoff X-gal und histochemischer Analyse
erzielen. (Lit. Gene transfer and expression protocols, wie
oben). Die Arterienproben werden nach Spülung wie oben für 2
Stunden in 10% FKS, 8 mM CaCl₂ inkubiert, anschließend für 24
Stunden in 10% FKS inkubiert und für die histochemische
Analyse tiefgefroren. Ein Teil der Arterienstücke wird nach der
Inkubation in nude oder scid Mäuse xenotransplantiert.
Die histochemische Analyse erbrachte sowohl bei den direkt
untersuchten, als auch bei den transplantierten Aorten eine
intensive Blaufärbung sowohl der luminalen Endothelien, als
auch der Adventitia. Auch eine Anfärbung der glatten
Muskelzellen ist nachweisbar. Nach der Xenotransplantation in
eine scid-Maus ist deutlich eine Expressionszunahme erkennbar.
Die beobachtete Expressionszunahme ist auf die verbesserte
Stoffwechsellage der transplantierten Aorta zurückzuführen, die
in einer Steigerung der Transkription des eingeschleusten
Fremdgens resultiert.
Claims (13)
1. Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen, dadurch
gekennzeichnet, daß man zum Transport von DNA-Sequenzen
vorgesehene Vektor-DNA mit Proteinfraktionen des Zellkerns oder
einzeln daraus aufgereinigten Proteinen in Wechselwirkung
bringt, die gebildeten kondensierten und/oder aggregierten
Protein-DNA-Komplexe zur Transfektion mit Rezipientenzellen in
Verbindung bringt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Proteinfraktionen durch saure Extraktion von Zellkernen und
Fällung erhält.
3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß
man zur Extraktion der Zellkerne 5% Perchlorsäure (PCA) und
zur Gewinnung der transfektionsaktiven Proteinfraktionen durch
fraktionierte Fällung 2 bis 6,5 Volumen Aceton, vorzugsweise
bis 3,5 Volumen Aceton in Schritten von 0,5 Volumen verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß man
zur Extraktion der Zellkerne 0,4 N H₂SO₄ und zur Gewinnung der
transfektionsaktiven Proteinfraktion durch Fällung 3,5 Volumen
Aceton verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Proteinfraktionen mittels chromatographischer
Verfahren, z. B. FPLC (fast protein liquid chromatography) einer
weiteren Aufreinigung unter Einsatz von Anionen- und
Kationenaustauschern unterzieht.
6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß
man die einzeln aufgereinigten Proteine, Histon H1, die Histone
H2a, H2b, H3 und H4, entweder getrennt oder in äquimolarer
Mischung und das Nichthistonprotein HMG 17 und weitere
nichtidentifizierte Proteine, die in wechselnder Menge als
Bestandteil der Fraktionen vorkommen, zur Transfektion
verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß
die Proteinfraktionen bzw. die aufgereinigten Proteine im
Überschuß zur Vektor-DNA eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Protein-DNA-Komplexe durch schrittweises Mischen oder durch
Dialyse hergestellt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß
divalente Kationen, insbesondere Kalzium, in der transfek
tionsaktiven DNA-Protein-Mischung und im Zellkulturmedium
anwesend sind.
10. Verwendung von Protein-DNA-Komplexen, die man erhält, indem
man zum Transport von DNA-Sequenzen vorgesehene Vektor-DNA mit
Proteinfraktionen des Zellkerns oder daraus einzeln aufgerei
nigten Proteinen in Wechselwirkung bringt, zur in vitro
Zelltransfektion.
11. Verwendung von Protein-DNA-Komplexen, die man erhält, indem
man zum Transport von DNA-Sequenzen vorgesehene Vektor-DNA mit
Proteinfraktionen des Zellkerns oder daraus einzeln aufgerei
nigten Proteinen in Wechselwirkung bringt, zur in vitro
Transfektion von Gewebe- oder Organexplantaten, wie Biopsie-
und OP-Material.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
man die transfizierten Gewebeexplantate zur Verbesserung der
Expression in immunodefiziente Tiermodelle (z. B. nude, scid)
xenotransplantiert, sie dort für einige Tage beläßt und dann
zur Analyse der transfizierbaren Zellarten innerhalb des
Explantates entnimmt.
13. Verwendung von Protein-DNA-Komplexen, die man erhält, indem
man zum Transport von DNA-Sequenzen vorgesehene Vektor-DNA mit
Proteinfraktionen des Zellkerns oder daraus einzeln aufgerei
nigten Proteinen in Wechselwirkung bringt, zum in vivo
Gentransfer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996116645 DE19616645A1 (de) | 1996-04-26 | 1996-04-26 | Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996116645 DE19616645A1 (de) | 1996-04-26 | 1996-04-26 | Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19616645A1 true DE19616645A1 (de) | 1997-10-30 |
Family
ID=7792486
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1996116645 Withdrawn DE19616645A1 (de) | 1996-04-26 | 1996-04-26 | Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19616645A1 (de) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0908521A1 (de) * | 1997-10-10 | 1999-04-14 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Transfektionssystem für die Übertragung von Nukleinsäuren in Zellen |
| WO1999019502A1 (en) * | 1997-10-10 | 1999-04-22 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Transfection system for the transfer of nucleic acids into cells |
| EP0967288A1 (de) * | 1998-06-16 | 1999-12-29 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Transfektionssystem für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen |
| WO2002063026A1 (en) * | 2001-02-08 | 2002-08-15 | Geneporter, Inc. | Complexes and components thereof for introducing polynucleotides into eukaryotic cells |
-
1996
- 1996-04-26 DE DE1996116645 patent/DE19616645A1/de not_active Withdrawn
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