DE19612807A1

DE19612807A1 - Neue Benzaldehyd-Derivate aus Hericeum erinaceus

Info

Publication number: DE19612807A1
Application number: DE19612807A
Authority: DE
Inventors: Heike Dipl Ing Stump; Wilhelm Dr Stahl; Joachim Dr Wink; Irvin Dr Winkler; Herbert Dr Kogler; Juergen Prof Dr Backhaus
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 1997-10-02
Also published as: WO1997036852A1; EP0891319A1; JP2000507447A

Description

Die Erfindung betrifft neue Benzaldehyd-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers.

Die Erkrankungen des menschlichen Körpers, die durch den Human Immunodeficiency Virus (HIV) hervorgerufen, werden, sind lebensbedrohend und gehen mit einer Vielzahl von Sekundär-Erkrankungen einher. Die Stärke der Erkrankung ist direkt mit dem Virus-Titer, also der Zahl der im Körper vorhandenen Viren, verbunden. Eine Reduzierung des Virus-Titers stellt eine Möglichkeit dar, den Ausbruch der Krankheit zu verhindern oder den Verlauf der Erkrankung positiv zu beeinflussen. Essentiell für die Vermehrung des Virus ist das Enzym Reverse Transkriptase. Mit Inhibitoren dieses Enzyms konnte gezeigt werden, daß die Virus-Vermehrung deutlich verlangsamt (z. B. Azidothymidin).

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Anmeldung, Inhibitoren der HIV Reversen Transkriptase und damit zur Behandlung von Erkrankungen, welche durch HIV-Infektionen hervorgerufen werden, bereitzustellen.

Von verschiedensten synthetischen und natürlichen Stoffen ist bekannt, daß sie die HIV Reverse Transkriptase inhibieren (vgl. z. B. die Übersicht von G.T. Tan et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 185, 370-378) und damit eine Grundvoraussetzung für die Behandlung von HIV-Infektionen erfüllen. Darüberhinaus ist bekannt, daß Basisiomyceten Sekundärmetabolite mit biologischer Wirkung wie z. B. die Strobilurine (vgl. z. B. S. Zapf et al. Angew. Chemie (1995), 107, 255) bilden. Speziell der Fruchtkörper des Basisiomyceten Hericeum erinaceus bildet als Sekundärmetabolite die Hericenone und das Hericerin, deren Wirkungen mit cytotoxisch bzw. das Auswachsen von Neuriten aus Nervenzellend stimulieren beschrieben wird (vgl. H. Kawagishi et al, Tetrahedr. Lett. (1990), 31, 373).

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß auch aus dem Mycel des Basisiomyceten Hericeum erinaceus Sekundärmetabolite isoliert werden können, die die HIV Reverse Transkriptase inhibieren und sich deshalb zur Behandlung von HIV Infektionen eignen. Die Verbindungen sind bislang unbekannt und sind durch folgende Struktur (Formel I) gekennzeichnet

worin R¹ bis R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl bedeuten oder zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R¹ bis R¹⁰ stehen zusammen mit einer C-C-Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung mit der Maßgabe, daß in der mit R¹ bis R¹⁰ substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R¹ bis R¹⁰ Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C-Doppelbindung beiträgt.

Vorzugsweise bedeutet R⁵ in Formel I Methyl.

Besonders bevorzugt bedeuten R³ und R⁶ (beispielsweise Formel 1) oder R⁶ und R⁷ (beispielsweise Formel 2) zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C-Dop pelbindung.

Vorzugsweise liegt die Doppelbindung dieser Verbindungen in Z-Konfiguration vor.

Die neue Verbindung der Formel I, insbesondere die Verbindungen 1 und 2, zeichnen sich durch ihre Wirkung gegen die HIV Reverse Transkriptase aus, die derjenigen von anderen Metaboliten aus Basisiomyceten deutlich überlegen ist, wie die Tabelle zeigt.

Substanz
IC₅₀ [µM]

(HIV-RT)
Hyphodontal
77
Mniopetal B	91
Mniopetal D	54
Hericenal A	0,37

Weiterhin gehören zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen. Ein Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Hericeum erinaceus, vorzugsweise Hericeum erinaceus DSM 10600, in einem wäßrigen Medium kultiviert wird und die Zielverbindungen anschließend isoliert und gereinigt werden.

Der Mikroorganismus Hericeum erinaceus DSM 10600 ist am 20. März 1996 nach den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt worden.

Anstelle des Stammes DSM 10600 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie Verbindungen der Formel I synthetisieren können. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl- N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.

Die im folgenden beschriebenden Fermentationsbedingungen gelten für Hericeum erinaceus und das hinterlegte Isolat. Die Fermentation kann im Labormaßstab (Milliliter- und Litermaßstab) oder im industriellen Maßstab (Kubikmetermaßstab) erfolgen.

In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Henricium erinaceus, insbesondere H. erinaceus DSM 10600, die Verbindung der Formel I.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D-Mnanit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phasphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.

Die Bildung der Verbindung der Formel I mit H. erinaceus, bevorzugt DSM 10600, verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die 0,1 bis 2%, bevorzugt 0,5-1%, Cornstep, 0,5 bis 10% bevorzugt 1 bis 5% Tomatenpaste, 0,1 bis 5% bevorzugt 0,5 bis 3% Hafermehl 0,1 bis 5% bevorzugt 0,5 bis 3% Glucose sowie Spurenelemente (% Angaben jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung) enthält. Die Spurenelementlösung kann folgende Zusammensetzung aufweisen:

Die Kultivierung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren oder in Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Wasserstoff. Sie wird in einem Temperaturbereich von 15 bis 30°C, vorzugsweise von 20 bis 30°C, insbesondere von 23 bis 28°C, durchgeführt werden. Der pH-Wert liegt von pH 1 bis 7, vorteilhaft von pH 2,5 bis 4,5. Man kultiviert den Pilz unter diesen Bedingungen über einen Zeitraum von 100 bis 300 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden.

Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 100 bis 200 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm 7 bis 40 Tage, bevorzugt 10 bis 20 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz- Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar, wachsen läßt.

Der Fermentationsverlauf kann jeweils anhand des pH-Wertes der Kultur oder des Mycelvolumens sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder High Pressure Liquid Chromatography, überwacht werden. Die Verbindung der Formel I ist überwiegend im Kulturfiltrat enthalten.

Die Isolierung der Verbindung der Formel I aus dem jeweiligen Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Es können z. B. das Adsorptions-, Ionenaustausch- oder Gelfiltrationsverfahren angewendet werden.

Ethylacetat/Methanol/Wasser-Mischungen werden als Laufmittel in dem Fachmann bekannten Konzentrationen, angewandt. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielsweise auch UV-Löschung und Färbereagentien wie Anisaldehyd, Tetraozolblau oder Orcin gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffe in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.

In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.

Die Hericenale können sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat vorkommen, gewöhnlich befindet sich die Hauptmenge im Kulturfiltrat. Es ist deshalb zweckmäßig, die Zellmasse durch Filtration oder Zentrifugation vom Filtrat zu trennen. Das Filtrat wird lyophilisiert und das Lyophilisat mit einem Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril oder 1-Butanol extrahiert. In gleicher Weise können Hericenale aus dem Mycel extrahiert werden. Die Extraktionen können über einen weiten pH-Bereich durchgeführt werden, zweckmäßig ist ein Bereich von pH 3.0-pH 7.5.

Eine andere Methode der Isolierung ist die Lösungs-Verteilung in an sich bekannter Weise.

Eine weitere Methode der Reinigung ist die Chromatographie an Adsorptionsharzen wie z. B. an Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), an Amberlite® XAD 7 (Rohm und Haas, USA) an Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA), oder an ähnlichen Trägern. Geeignet sind darüberhinaus zahlreiche reversed-phase Träger, z. B. RP-18, wie sie in der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie allgemein verwendet werden. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit für die Hericenale besteht in der Verwendung sogenannter straight-Phase Träger wie z. B. Kieselgel oder Aluminiumoxid oder anderen in an sich bekannter Weise. Geeignet zur Elution sind viele Lösungsmittel wie z. B. Chloroform/Methanol- oder Dichlormethan/n-Butanol- Gemische.

Ein alternatives Verfahren zur Isolierung der Texenomycine ist die Verwendung sog. Molekularsiebe, wie z. B. Fractogel® TSK HW-40, Sephadex® LH-20 und andere in an sich bekannter Weise. Es ist darüberhinaus auch möglich, die Texenomycine aus angereichertem Material durch Kristallisation zu gewinnen. Geeignet hierzu sind z. B. organische Lösungsmittel und ihre Gemische, wasserfrei oder mit Wasserzusatz. Ebenso können Zusätze von Säuren, wie z. B. Trifluoressigsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Ameisensäure oder andere von Vorteil sein.

Die Verbindungen der Formel I sind ferner als Therapeutikum gegen Krankheiten geeignet, welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen werden. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch die Verbindung der Formel I zur Verwendung als Arzneimittel, vorzugsweise zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird.

Die Arzneimittel können eine oder mehrere Verbindungen der Formel I und pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Hericeum erinaceus DSM 10600 sowie dessen Mutanten und Varianten.

Beispiele 1. a) Herstellung von Mycel des Produzentenstammes H. erinaceus DSM 10600

100 ml Nährlösung (20 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, 0,5 g (NH₄)₂HPO₄ in 1 l Leitungswasser, pH-Wert vor der Sterilisation 6,0) in einem 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm DSM 7427 beimpft und 240 Stunden bei 25°C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem sterilen 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden [Kartoffelinfus 4,0 g/l (Infus aus 200 g Kartoffel in 1000 ml H₂O), 20,0 g D-Glucose, pH vor der Sterilisation 5,6] dem zusätzlich 15 g Agar/l zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 21 Tage bei 25°C inkubiert. Das nach dieser Zeit entstandene Mycel eines Kolben wird mit einer sterilen Impfnadel abgenommen, sofort weiterverwendet oder bei -4°C in Wasser aufbewahrt.

b) Herstellung einer Vorkultur des Produzentenstammes

Ein steriler 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der unter a) beschriebenen Nährlösung wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gewachsenen Kultur oder mit einem 1 Quadratzentimeter großen Agarstück angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25°C inkubiert. Die maximale Produktion einer Verbindung der Formel I ist nach ca. 168 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 4 (500 ml in 200 ml Erlenmeyer) genügt eine 168 Stunden alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 5%) aus der gleichen Nährlösung.

2. Herstellung der Verbindungen der Formeln 1 und 2

Ein 2000 ml Erlenmeyer Schüttelkolben wird unter folgenden Bedingungen betrieben:

5 g/l Cornstep
4 g/l Tomatenpaste
10 g/l Hafermehl
pH 6,8 (vor der Sterilisation)
10 g/l Glucose
10 ml/l Spurenelementlösung.

Der pH-Wert wird mit wäßriger 2 N NaOH oder HCl eingestellt.

Inkubationszeit: 168 Stunden
Inkubationstemperatur: 25°C
Schüttelgeschwindigkeit: 140 Rpm.

Spurenelementlösung

Composition
amount in percent
FeSO₄7 H₂O
0,100
MnSO₄1 H₂O	0,100
CuCl₂2 H₂O	0,0025
CaCl₂2 H₂O	0,010
H3BO₃	0,0056
(NH₄) 6Mo70244 H₂O	0,0019
ZnSO₄7 H₂O	0,020

Comments: Spurenelementlösung für Dokument 5158

Sterilisation-Details 3. Isolierung der Hericenale

Die nach Beispiel 2 gewonnene Kulturlösung wird abzentrifugiert und die Zellmasse wird gefriergetrocknet. Das klare Kulturfiltrat wird an Mitsubishi Diaion® CHP20 adsorbiert Säulenmaße 30 × 6 cm) und mit einem Isopropanol Gradienten 0-70% Isopropanol eluiert (Fluß 50 ml/min). Die die Hericenale enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bis auf die Wasserphase eingeengt und lyophilisiert.

4. Reinigung der Hericenale

270 mg des in Beispiel 3 erhaltenen Rohgemisches werden in 20% wäßr. Acetonitril gelöst und zunächst an einer Säule mit Nucleosil® 100-12 C₁₈ mit einem Gradienten von 25-40% Acetonitril in Wasser mit 0.05% Trifluoressigsäure (Säulenmaße 250 × 32 mm, Fluß 50 ml/min) chromatographiert. Die Fraktionen, die die Hericenale enthalten, werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und an Nucleosil® 100-10 C₁₈ AB mit dem gleichen Gradienten endgereinigt (Säulenmaße 250 × 20 mm, Fluß 25 ml/min). Nach Konzentration der Fraktionen und Lyophilisation werden 17,6 mg eines Gemisches aus Hercenal A und Hericenal B. Das Gemisch wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (Merck, 0,015-0,040 mm, Säulenvolumen 5 ml) mit Dichlormethan/n-Butanol 20 : 1 als Eluens in die Einzelkomponenten getrennt.

Claims

1. Verbindung der Formel I worin R¹ bis R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl bedeuten oder zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R¹ bis R¹⁰ stehen zusammen mit einer C-C-Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung mit der Maßgabe, daß in der mit R¹ bis R¹⁰ substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R¹ bis R¹⁰ Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C-Dop pelbindung beiträgt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ Methyl bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R³ und R⁶ zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C-Dop pelbindung bedeuten.

4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelbindung in Z-Konfiguration vorliegt.

5. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R⁶ und R⁷ zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C-Dop pelbindung bedeuten.

6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelbindung in Z-Konfiguration vorliegt.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Hericeum erinaceus in einem wäßrigen Medium kultiviert wird und die Zielverbindung anschließend isoliert und gereinigt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Hericeum erinaceus DSM 10600 eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Mutanten oder Varianten des Mikroorganismus Hericeum erinaceus DSM 10600 eingesetzt werden.

10. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Arzneimittel.

11. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird.

12. Arzneimittel enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und pharmazeutische Hilfsstoffe.

13. Hericeum erinaceus DSM 10600 sowie dessen Mutanten und Varianten.