DE19600357C1 - DNA-Sequenz kodierend einen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diesen Transporter - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz aus Brassca oleracea var. botrytis (Blumenkohl), die die Kodierregion eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Transporters enthält, deren Einführung in ein pflanzliches Genom die Bildung und Weiterleitung von Kohlenstoffgrundgerüsten für die Synthese phenolischer Verbindungen in transgenen Pflanzen verändert, Plasmide, Hefen und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenz, sowie transgene Pflanzen, bei denen durch Einführung der DNA-Sequenz Veränderungen der Aktivität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Transporters und somit Änderungen im Gehalt phenolischer Verbindungen, vor allem aromatischer Aminosäuren und Flavonoiden, hervorgerufen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die durch die Erhöhung des Gehaltes an phenolischen Verbindungen in ihrer Fähigkeit der Abwehr von pflanzlichen Pathogenen und der Toleranz gegenüber UV-Strahlung beeinflußt sind. Ebenso betrifft die Erfindung die Benutzung der beschriebenen Sequenz des Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokators zur Identifizierung verwandter Translokatoren aus anderen Pflanzen durch Hybridisierung mit niedriger Stringenz oder durch PCR-Techniken, sowie die Nutzung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators als Ziel ("Target") für Herbizide.

Neben den primären Metaboliten wie Zuckern, Aminosäuren etc. produzieren Pflanzen eine Fülle sogenannter sekundärer Metabolite, die zunächst keinen direkten Bezug zum Wachstum und zur Entwicklung der Pflanze zu besitzen scheinen. Obwohl erst für einige wenige Stoffklassen die Funktion dieser Metabolite bekannt ist, sind diese für die Pflanzen ohne Zweifel von außerordentlicher Bedeutung. Angeführt seien die Produktion von Blütenfarbstoffen, Duftstoffen, Alkaloiden und Giftstoffen (Phytoalexine), die der Pflanze einen Schutz gegen Tierfraß und Pathogenbefall verleihen. Gemäß ihrer Biosynthesewege lassen sich die sekundären Metabolite in drei Gruppen einteilen:

• - Terpene (Grundbaustein: Isopren),
• - stickstoffhaltige Verbindungen (wie Alkaloide, Grundbaustein: Aminosäuren),
• - phenolische Verbindungen, die über den Shikimat-Weg und den Mevaolonat/Malonat-Stoffwechselweg synthetisiert werden.

Gerade die phenolischen Verbindungen bilden eine große, sehr heterogene Gruppe von Substanzen mit unterschiedlichen Aufgaben in der Pflanze (Übersichtsartikel: Herrmann, 1995, Plant Cell 7, 907-919; Schmid und Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749). Hierzu zählen die folgenden Substanzklassen:

• I. Die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin, wobei die beiden erstgenannten Aminosäuren für Menschen und Tiere essentiell sind, d. h. von diesen nicht synthetisiert werden können und deshalb mit der Nahrung aufgenommen werden müssen.
• II. Ausgehend von Tryptophan wird das Pflanzenhormon Auxin synthetisiert, welches an der Regulation einer Reihe von Wachstumsprozessen in der Pflanze beteiligt ist.
• III. Phenolcarbonsäuren wie die Zimtsäure, die wiederum die Ausgangsverbindungen für die Synthese weiterer Klassen von phenolischen Verbindungen sind wie z. B.:
• IV. Lignin, ein sehr komplexes Polymer verschiedener Phenolcarbonsäuren, welches in die pflanzlichen Zellwände eingelagert wird und zu deren Verholzung führt (Holzstoff), ein Vorgang, der den Zellen eine hohe Zug- und Druckfestigkeit verleiht. Der Anteil von Lignin am Zellwandmaterial kann bis zu 35% betragen, d. h. Lignin macht einen signifikanten Anteil der gesamten Biomasse aus.
• V. Salicylsäure, welche eine wichtige Rolle bei der Induktion der Abwehr gegen Pathogene spielt.
• VI. Cumarine, welche den charakteristischen Geruch einiger Pflanzenarten bedingen (Waldmeister).
• VII. Chinone, deren Bedeutung vor allem in ihrer Funktion als Elektronenüberträger in den Elektronentransportketten von Mitochondrien und Chloroplasten liegt.
• VIII. Gerbstoffe, einfache und polymere Phenole, deren Name sich von ihrer Verwendung beim Gerben von Leder herleitet. In der Pflanze schützen Gerbstoffe zusammen mit anderen Substanzen gegen den Befall von Mikroorganismen, insbesondere durch Einlagerung in die Zellwände.
• IX. Flavonoide, eine große Gruppe von Substanzen mit einem Flavan-Gerüst, welche unter Streß vermehrt gebildet werden, z. B. zur Abwehr von Pathogenen und Freßfeinden und zum Schutz gegen UV-Strahlung. Zudem sind Flavonoide als Signalstoffe bei der Bildung von Wurzelknöllchen in Leguminosen identifiziert worden, welche eine wichtige Rolle bei der Stickstoffversorgung dieser Pflanzen spielen. Zu dieser Gruppe gehören auch die Anthocyanidine, welche für die Färbung von Blüten und Früchten in zahlreichen Pflanzen verantwortlich sind.

Die phenolischen Verbindungen werden in Pflanzen im wesentlichen über den Shikimat-Weg synthetisiert, dessen Bedeutung schon dadurch ersichtlich wird, daß, global gesehen, 20% des im Chloroplasten fixierten Kohlenstoffs in diesen Stoffwechselweg einfließen können (Haslam, 1993, in Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites. (Chichester, John Willey and Sons)).

Der Shikimat-Syntheseweg beginnt mit der Synthese von 3-Desoxyarabinoheptulosonsäure- 7-phosphat, einem Kondensationsprodukt aus Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat. Das entsprechende Enzym, die DAHP-Synthase, wird durch Pathogenbefall oder auch mechanische Verwundungen der Pflanze induziert, was zu einer erhöhten Bereitstellung von Chorismat (dem Endprodukt des Shikimat-Weges) als Vorläufer der Biosynthese von Lignin führt. Die Lignifizierung von Zellwänden ist u. a. eine Strategie der Pflanzen zur Pathogenabwehr. Transgene Pflanzen, in denen die Aktivität der DAHP-Synthase über einen anti-sense Ansatz reduziert wurde, wiesen Defekte in der Ligninbiosynthese auf (Jones et al., 1995, Plant Physiol., im Druck).

Das erste Substrat der DAHP-Synthase-Reaktion, Erythrose-4-phosphat, ist ein Zwischenprodukt des im Plastiden stattfindenden oxidativen bzw. reduktiven Pentosephosphatweges. Phosphoenolpyruvat ist Substrat dieser und einer zweiten Reaktion innerhalb des Shikimat-Weges. In der von der 5-Enolpyruvylshikimat-3- phosphat Synthase (EPSP-Synthase) katalysierten Reaktion wird 3-Enolpyruvylshikimat- 5-phosphat aus Shikimat-3-phosphat und Phosphoenolpyruvat gebildet. Die EPSP-Synthase ist das am besten untersuchte Enzym des gesamten Shikimat- Weges und das Target für das häufig eingesetzte Herbizid Glyphosat (Round-up, Monsanto). Überexpression der EPSP-Synthase in transgenen Pflanzen bzw. das Einbringen einer bakteriellen und Glyphosat-unempfindlichen EPSP-Synthase bewirkt eine (weitgehende) Herbizid-Resistenz/Toleranz (Stalker et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 4724-4728; Smart et al., 1985, J. Biol. Chem. 260, 16338-16346). Die durch Glyphosat bewirkte Hemmung kann interessanterweise durch Phosphoenolpyruvat aufgehoben werden, das hier als Kompetitor in die Reaktion eingeht.

Eukaryontische Zellen und deren Stoffwechsel sind stark kompartimentiert, wobei die einzelnen Kompartimente jeweils unterschiedliche Funktionen in der Zelle übernehmen. Die Enzyme des Shikimat-Weges sind im Chloroplasten lokalisiert. Diese Organelle sind von zwei Lipiddoppelschichtmembranen umschlossen, deren äußere Molekularsiebcharakter hat und Verbindungen bis zu einer Größe von ca. 10 kDa frei passieren läßt (Flügge und Benz, 1984, FEBS Lett. 169, 85-89). Die innere Membran ist permeabel für einige kleinere Verbindungen wie Wasser, Kohlendioxid, Sauerstoff und Nitrit, nicht jedoch für größere geladene Moleküle wie zum Beispiel Phosphoenolpyruvat.

Ob der Shikimat-Weg auch in anderen Kompartimenten wie dem Cytosol vorkommt, ist bislang unklar. Die chloroplastidäre Lokalisation zeigt sich auch daran, daß alle bislang klonierten Enzyme des Shikimat-Weges N-terminale und für Plastiden charakteristische Präsequenzen aufweisen, welche die Informationen für den Eintransport der im Zellkern kodierten Proteine enthalten. Gleichwohl kann das Vorhandensein cytosolischer Isoformen nicht völlig ausgeschlossen werden (Mousdale und Coggins, 1985, Planta 163, 241-249; Schmid und Amrhein, 1995, Phytochemistry 39, 737-749).

Die Herkunft des in den Plastiden benötigten Phosphoenolpyruvates ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Phopsphoenolpyruvat kann in der Zelle durch verschiedene Stoffwechselreaktionen bereitgestellt werden. Zum einen wird es in der Glykolyse aus 3-Phosphoglycerat gebildet (Phosphoglycerat-Mutase/Enolase) und kann andererseits, im anabolen Stoffwechselweg, über die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase aus Oxalacetat gebildet werden. In Pflanzen existiert noch eine dritte Möglichkeit, die Synthese ausgehend von Pyruvat durch die Pyruvat, Phosphat-Dikinase (PPDK). CAM-Pflanzen und C₄-Pflanzen besitzen eine chloroplastidäre PPDK, während in C₃-Pflanzen die PPDK, ebenso wie die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase, nur im Cytosol vorkommt.

Phosphoenolpyruvat kann nicht, jedenfalls nicht in genügender Menge, von den Plastiden selbst bereitgestellt werden. Ursache hierfür ist zum einen die cytosolische Lokalisation von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und PPDK, zum anderen die offenbar nicht ausreichende Aktivität von Phosphoglyceratmutase, die die Umwandlung von 3-Phosphoglycerat in 2-Phosphoglycerat katalysiert (Stitt und apRees, 1979, Phytochemistry 18, 1905-1911), d. h. Plastiden besitzen keinen der für die Phosphenolpyruvat-Synthese verantwortlichen Stoffwechselwege, zumindest nicht in ausreichender Aktivität. Dieser Tatbestand wird durch Untersuchungen an intakten (belichteten) Chloroplasten bestätigt, die zeigten, daß die Synthese aromatischer Aminosäuren durch extern zugesetztes Phosphoenolpyruvat deutlich stimuliert wurde, was bedeutet, daß der Shikimat-Weg auf Phosphoenolpyruvat angewiesen ist, das im Cytosol bereitgestellt und in die Plastiden importiert werden muß (Schulze-Siebert et al., 1984, Plant Physiol. 76, 465-471).

Es war bislang eine offene Frage, auf welche Weise Phosphoenolpyruvat in die Plastiden transportiert werden kann. Der in der inneren Hüllmembran lokalisierte chloroplastidäre Phosphattranslokator aus C₃-Pflanzen katalysiert den Austausch von Phosphat, Triosephosphaten und 3-Phosphoglycerat, hat aber nur eine sehr geringe Affinität gegenüber dem Substrat Phosphoenolpyruvat (Fliege et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 502, 232-247; Flügge und Heldt, 1991, Annu. Rev. Plant Physol. Plant Mol. Biol. 42, 129-144). Da alle Substrate um die gleiche Bindungsstelle am Translokator kompetitieren, erscheint es zudem fraglich, ob unter den gegebenen zellulären Metabolitspiegeln Phosphoenolpyruvat überhaupt von dem Translokator gebunden werden kann. Die Frage besteht, ob die Plastiden für den Transport von Phosphoenolpyruvat einen speziellen Transporter besitzen.

Zur Klärung dieser Frage wurde daher zunächst der bei Membranproteinen außerordentlich schwierige Weg der biochemischen Charakterisierung, Reinigung und Isolation einer Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität beschritten, da es nicht gelang, einen entsprechenden Klon mittels Hybridisierung mit der DNA für den chloroplastidären Phosphattranslokator zu isolieren. Es ist nun gelungen, das Translokator-Protein als Komponente der inneren Hüllmembran von Amyloplasten aus Blumenkohl mit einer apparenten molekularen Masse von 30 000 Dalton zu identifizieren. Der beschriebene Reinigungsprozedur ist jedoch nicht geeignet, für eine Proteinsequenzierung ausreichende Mengen Protein zu präparieren, zumal sich ergab, daß der N-Terminus des Proteins blockiert und somit einer N-terminalen Proteinsequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau nicht zugänglich war. Daher war es nötig, das Protein durch präparative SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in ausreichender Menge zu isolieren, enzymatisch zu spalten und interne Peptidsequenzen zu erhalten (siehe Ausführungsbeispiel 1).

Es konnten auf diese Weise drei Peptidsequenzen von 10, 12 und 15 Aminosäuren erhalten werden. Dadurch gelang es, durch Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek mit nach den erhaltenen Peptiden modellierten synthetischen Oligonukleotiden das Gen für den plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphate-Translokator zu isolieren. Es zeigte sich nach Sequenzierung des Klones, daß dieser nur eine ca. 30%ige Homologie zum chloroplastidären Phosphattranslokator aufweist. Es gelang, diesen Transporter in einem heterologen System (Hefezellen) zu exprimieren und seine Transporteigenschaften im rekonstruierten System (an künstlichen Membranen) zu charakterisieren. Wie aus der Abb. 1 ersichtlich, handelt es sich bei diesem Transporter um ein Gegentauschsystem für Phosphoenolpyruvat und anorganisches Phosphat. Dieser Translokator besitzt nur eine geringe Affinität gegenüber den Substraten des chloroplastidären Phosphattranslokators (Triosephosphate und 3-Phosphoglycerat), was sinnvoll erscheint, sollte dieser Transporter bevorzugt dem Transport von Phosphoenolpyruvat dienen.

Abb. 1 Bestimmung der Substrataffinitäten rekombinanter Phosphattranslokatoren aus Chloroplasten und nicht-grünem Gewebe Messung rekonstruierter Phosphattransportaktivitäten

Die rekombinanten Translokatoren wurden über eine Ni²⁺-Affinitätssäule aus Hefezellen gereinigt und in Liposomen rekonstruiert, die mit den angegebenen Substraten vorbeladen worden waren. Gemessen wurde die Aufnahme von radioaktiv markiertem [³²P]Phosphat (Unveröffentlichte Daten).

Klone für den entsprechenden Transporter wurden dann mittels der Blumenkohlsonde aus Mais-Wurzeln und Mais-Endosperm isoliert. Mittlerweile konnten wir zeigen, daß der Phosphoenolpyruvat-(PEP-)Phosphat-Transporter auch in grünen Geweben exprimiert wird und es gelang, den entsprechenden cDNA-Klon aus Arabidopsis thaliana und Tabak (Nicotiana tabacum) zu isolieren. Damit verfügen wir aus mehreren Pflanzen über den Transporter, der Phosphoenolpyruvat als Substrat für den Shikimat-Weg (DAHP-Synthase und EPSP-Synthase) in die Plastiden zu transportieren vermag.

Transportprozesse sind in vielen Fällen der für einen Stoffwechselweg begrenzende Faktor. In neueren Publikationen wurde gezeigt (Riesmeier et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6160-6164; Heineke et al., 1994, Planta 193, 174-180), daß die Effektivität der photosynthetischen Kohlenstoffreduktion (Lichtreaktion und Calvinzyklus) ganz wesentlich durch die Verfügbarkeit eines Substrats der Lichtreaktion, des anorganischen Phosphats, und dem Abtransport des in der Reaktionsfolge entstandenen reduzierten, organisch gebundenen Kohlenstoffs (Triosephosphat) beeinflußt werden kann. Auch diese Reaktionen finden in den Chloroplasten der Pflanze statt und der Ein- bzw. Austransport der Substrate über die innere Chloroplastenhüllmembran wird durch das oben erwähnte spezifische Translokatorprotein katalysiert (Triosephosphat/Phosphat-Translokator, Flügge et al., 1989, EMBO J. 8, 39-46; Flügge et al., 1991, Nature 353, 364-367) und limitiert. Dieses Translokatorprotein stellt demzufolge eine Engstelle im Kohlenstoffwechsel dar. Wie oben beschrieben, nimmt der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator der Plastidenhüllmembran eine Schlüsselstellung bei der Versorgung des Plastiden mit der Ausgangsverbindung des Shikimat-Weges ein. Es sollte also möglich sein, mit Hilfe der erhaltenen Sequenz die Aktivität des Translokators in Pflanzen zu steigern und dadurch die Konzentration von Phosphoenolpyruvat in den Plastiden zu erhöhen. Dies sollte bei Bedarf zu einem erhöhten Fluß von fixiertem Kohlenstoff in den Shikimatweg führen und damit zu einem erhöhten Gehalt an phenolischen Verbindungen. Da diese Verbindungen, wie oben ausgeführt, eine entscheidende Rolle bei der Abwehr pflanzlicher Pathogene wie Bakterien und Pilzen spielen und solche Infektionen jährlich zu großen Ernteausfällen führen, sollte eine höhere Kapazität zur Synthese solcher Verbindung einen verbesserten Schutz der Pflanzen bewirken. Zum anderen sind diese phenolischen Verbindungen an dem Schutz der Pflanzen gegen schädliche UV- Strahlung beteiligt, ein Mechanismus, der angesichts ständig ansteigender UV- Strahlung infolge des Ozon-Abbaues in der Atmosphäre immer wichtiger werden könnte.

An Pflanzen mit derart verbesserten Schutzmechanismen besteht dringender Bedarf, denn der überwiegende Teil der Menschen auf der Erde ist auf pflanzliche Ernährung angewiesen.

Bislang sind aus anderen, nicht pflanzlichen Organismen keine Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokatoren isoliert worden, die für diesen Zweck eingesetzt werden könnten. Zudem müßten diese Translokatoren einen Gegentausch mit Phosphat durchführen, um das im Shikimatweg freigesetzte Phosphat aus dem Chloroplasten zu exportieren. Die zweite auftretende Schwierigkeit wäre der korrekte Einbau dieser Fremdproteine in die innere Plastidenhüllmembran, da die authentischen Proteine dieser Membran neben der für die "Plastiden-Adressierung" nötigen Präsequenz im reifen Teil (der Teil des Proteins, der nach der Abspaltung der Präsequenz durch eine spezifische Protease verbleibt) noch weitere Informationen für die Integration in die Membran besitzen (eigene, unveröffentlichte Beobachtungen; Li et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 18999-19004). Die genaue Lokalisation dieser Informationen im reifen Teil der bisher bekannten Proteine der inneren Hüllmembran (37 kDa-Protein: Dreses- Werringloer et al., 1991, Eur. J. Biochem. 195: 361-368; Triosephosphat-Phosphat- Translokator: Flügge et al., 1989, EMBO J. 8: 39-46; Willey et al., 1991, Planta 183, 451-461; Fischer et al., 1994, Plant J. 5(2), 215-226; Ca²⁺-ATPase: Huang et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10066-10070) gelang bisher nicht. Eigene Untersuchungen am Beispiel eines mitochondrialen Carriers, des ADP/ATP-Transporters zeigten, daß dieses Protein nicht oder nur mit einer sehr geringen Effizienz zu den Chloroplasten dirigiert und dort in die Hüllmembran eingebaut werden. Selbst ein Hybridprotein, bestehend aus einer chlorplastidären Präsequenz (die Information für die Chloroplasten- Adressierung enthaltend) und diesem mitochondrialen Carrier, zeigte gegenüber dem authentischen Protein einen kaum erhöhten Einbau in die Chlorplasten- Hüllmembran (unveröffentlichte Beobachtungen). Da für eine korrekte Insertion die Protein/Lipid-Wechselwirkung von Bedeutung ist und sich die chlorplastidäre Hüllmembran in ihrer Lipidzusammensetzung grundlegend von der anderer Membranen unterscheidet (Joyard et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199, 489-509), ist es sehr unwahrscheinlich, daß eine, wenn auch gerinfügige Insertion, eines fremden Proteins, dann auch funktionell ist, d. h. daß ein Transporter aus anderen Organellen überhaupt in einer seiner Funktion entsprechenden Konformation und Orientierung in die Chloroplasten-Hüllmembran eingebaut werden kann.

Somit ist es nach gegenwärtigem Stand der Technik nicht möglich, mit Hilfe bekannter Plastiden-"Targeting"-Sequenzen nicht-plastidäre Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Transporter, so diese denn existieren, funktionell in die innere Plastidenhüllmembran zu integrieren. Beim gegenwärtigen Stand der Technik ist es erfolgversprechender, für die Konstruktion der oben geschilderten Pflanzen auf die pflanzeneigenen Translokatoren zurückzugreifen.

Die vorliegende Erfindung stellt nun DNA-Sequenzen zur Verfügung, die aus einem pflanzlichen Genom stammen und für einen plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator kodieren, wobei die in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Einführung und Expression in pflanzlichen Zellen zur Bildung einer Ribonukleinsäure führt und über diese Ribonukleinsäure eine Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator Aktivität in die Zellen eingeführt werden kann oder eine endogene Phosphoenolpyruvat- Phosphat-Translokator Aktivität unterdrückt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere eine DNA-Sequenz aus Brassica oleracea mit der folgenden Nukleotidabfolge (Seq ID No. 1):

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die mit der unter Seq.-ID No. 1 genannten DNA-Sequenz oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators besitzt.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen. Um die Expression des Phosphoenolpyruvat-phosphat- Translokators in transformierten Zellen zu gewährleisten, kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Plasmide eingebracht werden und dabei mit Steuerelementen für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen kombiniert werden (siehe Ausführungsbeispiele 3, 5). Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions-Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer übersetzbaren Botenribonukleinsäure (RNA), die die Synthese eines plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators in den transformierten Zellen erlaubt, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht übersetzbaren, invers orientierten ("anti-sense"), Botenribonukleinsäure, die die Synthese der endogenen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatoren verhindert. Zu diesem Zweck könnten auch kürzere Fragmente der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen mit einem relativ hohen Grad an Homologie (mehr als ca. 65% Homologie) verwendet werden. Ebenso kann die Expression von endogenen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatoren durch die Expression eines für diesen Zweck konstruierten Ribozyms unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen inhibiert werden. Durch die Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators wird eine Veränderung des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels, in diesem Falle der Synthese phenolischer Verbindungen, die über den Shikimat-Weg hergestellt werden, ermöglicht, deren wirtschaftliche Bedeutung darin liegt, daß eine Verbesserung der Weiterleitung von Phosphoenolpyruvat aus dem Cytosol in die Plastiden zu einer Erhöhung des Gehaltes an diesen phenolischen Verbindungen führt. Es können somit Pflanzen erzeugt werden, die eine höhere Resistenz gegen Befall von Pathogenen und eine gesteigerte Toleranz gegen UV-Bestrahlung aufweisen. Diese Modifikation senkt den Ernteausfall und steigert damit deren wirtschaftlichen Wert. Weiterhin ermöglicht die heterologe Expression der beschriebenen Sequenz in Spalthefen (Ausführungsbeispiele 3, 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2155-2159) Struktur-Funktionsstudien des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators, die letztendlich zur Entwicklung eines spezifischen Hemmstoffs für dieses Protein führen könnten. Insbesondere ist hier an die Herbizidentwicklung zu denken, da die Hemmung eines Proteins mit Schlüsselfunktion im Stoffwechselgeschehen zwangsweise letal für die Pflanze wäre.

Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244, 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. Plant Physiol. 42, 205-225). Zur Expression von kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind bekannt (u. a. Koster-Topfer et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219, 390-396). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminations-Signal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Solche Elemente sind ebenfalls beschrieben (Gielen et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und -terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanze das Ti oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend beschrieben (Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerÿ Kanters B-V. Ablasserdam, 1985, Chapter V; Fraley et al., Critic. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; An et al., 1985, EMBO J. 4, 277-287). Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen eine Resistenz gegenüber Bioziden oder Antibiotika wie Kanamycin, Bleomycin oder Hygromycin verleiht. Der individuell eingeführte Marker wird daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Selektionsmedium ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mit gängigen molekularbiologischen Methoden auf die Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Teile dieser Sequenz oder Derivate dieser Sequenz (können auch in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für die Expression in Zellen von Spalthefen versehen werden (siehe Ausführungsbeispiel 3). Die Einführung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators führt zu einer erheblichen Zunahme der durch Rekonstitution in künstliche Liposomen meßbaren Aktivität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators in den rekombinanten Hefezellen. Dieser in Hefezellen exprimierte Translokator kann zur Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen und zur Entwicklung von spezifischen Hemmstoffen, welche als Herbizide zur Anwendung kommen können, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (oder Derivate oder Teile dieser Sequenz) können auch in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators verändert werden. Ebenso könnte eine Unempfindlichkeit gegenüber für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator spezifischer Herbizide erreicht werden. Mit Hilfe von Standardverfahren (Sambrock et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche und/oder Basendeletionen vorgenommen und/oder synthetische oder natürliche Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können Adapter oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die nicht benötigte DNA entfernen, eingesetzt werden. Dort wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen oder Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethoden werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden wie z. B. die Expression des modifizierten Proteins in Spalthefe und die Messung der modifizierten Transporteigenschaften in artifiziellen Liposomen (siehe Ausführungsbeispiel 4 und Loddenkötter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2155-2159; sowie Fischer et al., 1994, Plant Journal 5, 215-226) oder die Messung der modifizierten Transporteigenschaften am in transgenen Pflanzen exprimierten Protein mit Hilfe einer kürzlich von uns zu diesem Zweck entwickelten Methode (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194, 181-185) angewandt.

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz (oder Teile oder Derivate dieser Sequenz) kann dazu genutzt werden, nach Standardverfahren (insbesondere Hybridisierungs- Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken mit niedriger Stringenz unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teilen der DNA-Sequenz als Sonde oder die Erstellung von Sonden für stringente und niedrig stringente Durchmusterungs- Strategien durch Ableitung von degenerierten und/oder nicht degenerierten Primern aus der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für PCR-Experimente mit DNA oder cDNA von Spinat oder anderen Pflanzen) aus dem Genom von Pflanzen ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Phosphoenolpyruvat transportieren.

Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrunde liegenden Ausführungsbeispiele werden die wichtigsten eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung wurden der Phage Lambda gt10 sowie der Vektor pBluescript II KS (pBSC) (Short et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 7583-7600) verwendet.

Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pEVP11 (Russel und Nurse, 1986, Cell 45, 145-153) verwendet.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66, 221-230) kloniert.

2. Bakterien- und Hefestämme

Für den pBluescriptKS (pBSC) Vektor sowie für pEVP11- und pBinAR-Konstrukte wurden die E. coli Stämme DH5α (Hanahan et al., 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580) und TG1 (Gibson, 1984, Ph. D. Thesis, Cambridge University, England) verwendet.

Die Transformation der pBinAR-Konstrukte in Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12, 8711- 8720) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen und Willmitzer (1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch auf Richtigkeit und Orientierung analysiert.

4. Pflanzentransformation

Pro Transformation wurden 15 kleine mit Schmirgelpapier und Skalpell verwundete Blätter einer Tabak-Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 100 µl einer unter strenger Selektion gewachsenen, transformierten Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 15minütigem leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg Giberellinsäure, 500 mg/l Betabactyl®, 15 mg/l Hygromycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3.000 Lux Beleuchtungsstärke wurde die Betabactylkonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.

Hinterlegungen

Am 14. 11. 1995 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide in Form von E. coli Stämmen, enthaltend diese Plasmide, hinterlegt.

Abbildungen

1.) Abb. 1: Rekonstruktion der Transportaktivität des in Hefe exprimierten rekombinanten Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators.

Ausführungsbeispiel 1 Isolation von Peptidfragmenten des Translokators und Erstellung von Sonden für die Hybridisationsdurchmusterung von cDNA-Bibliotheken

Gereinigtes Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatorprotein wurde ein präparativen SDS- Polyacrylamidgelen (Laemmli, 1970, Nature 227, 680-685) von verbleibenden Verunreinigungen getrennt und nach Detektion des Proteins durch Anfärbung mit Kupfersulfat (Lee et al., 1987, Anal. Biochem. 166, 308-312) aus dem Gel ausgeschnitten und in der Gelmatrix mit Endoproteinase LysC verdaut (Eckerskorn und Lottspeich, 1989, Chromatographia 28, 92-94). Die resultierenden Peptide wurden aus dem Gel und mittels HPLC getrennt. Die Aminosäuresequenz der gereinigten Peptidfraktionen wurde durch automatisierten Edman-Abbau in der Gasphase bestimmt (Eckerskorn et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176, 509-519). Aus der Aminosäuresequenz von drei Peptiden wurden degenerierte Oligonukleotidsequenzen, kodierend diese Aminosäuresequenzen, abgeleitet und die respektiven Oligonukleotide durch in vitro DNA-Synthese hergestellt. Für den Einsatz als Sonde wurden die Oligonukleotide durch Anhängen einer ³²P-Phosphatgruppe an das 5′-Ende mittels einer Oligonukleotidkinase radioaktiv markiert.

Ausführungsbeispiel 2 Klonierung des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators aus Blumenkohl

Aus Blumenkohlköpfen wurde poly-A⁺-RNA isoliert und ausgehend hiervon eine cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda gt10 angelegt. Ca. 300.000 Klone dieser Bibliothek wurden mit nach Endoproteinase LysC-Peptidfragmenten des gereinigten Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators modellierten synthetischen Oligonukleotiden sondiert (siehe Ausführungsbeispiel 1). Positiv reagierende Klone wurden nach Standardverfahren gereinigt und nach Präparation der amplifizierten Phagen-DNA aus den gereinigten Plaques wurde durch EcoRI-Restriktionsverdau die Insertion kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator erhalten und durch Southern- Blot Analyse, mit den oben erwähnten Oligonukleotiden als Sonde, verifiziert. Nach Umklonierung der Insertionen der Phagen-DNA in den Vektor pBluescript (pBSC) wurden die Klone durch Bestimmung der DNA-Sequenz analysiert (Didesoxymethode: Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) und aus dieser DNA-Sequenz die Primärstruktur des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators abgeleitet. Die Sequenz der zum Sondieren der cDNA-Bibliothek benutzten Oligonukleotide bzw. Peptide konnte wiedergefunden werden.

Ausführungsbeispiel 3 Expression des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators aus Blumenkohl in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Die Insertion in dem oben erwähnten Plasmid pBluescript (pBSC), kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, wurde mit den Endonucleasen PstI und SspI herausgeschnitten und durch Elektrophorese isoliert. Die Überhänge des so erhaltenen Fragmentes wurden mit Hilfe des Enzyms T4-DNA Polymerase geglättet. Das Insert, kodierend für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator, wurde dann in den Vektor pQE32 (Quiagen), der mit BamHI linearisiert und dessen Überhänge mit T4- DNA-Polymerase geglättet wurden, kloniert. Das Insert inklusive des 6x His-tags wurde wiedergewonnen, indem der Vektor pQE32, enthaltend das Insert, mit EcoRI linearisiert, die Enden mit T4-DNA-Polymerase geglättet und anschließend mit HindIII gespalten wurde. Das so gewonnene Fragment wurde in den Hefe-Expressionsvektor pEVP11, der mit SacI gespalten, mit T4-DNA-Polymerase geglättet und mit HindIII gespalten wurde, gerichtet eingesetzt und nach Amplifikation des Konstrukts in E. coli in durch LiCl/PEG kompetent gemachte (Ito et al., 1983, J. Bact. 153, 163-168) Leucinsynthese-defiziente S. pombe Zellen transformiert. Transformanten wurden durch Selektion auf Minimalmedium ohne Leucin selektiert, da das pEVP11-PEP Konstrukt den Hefezellen die Fähigkeit zum Wachstum auf leucinfreiem Medium verleiht.

Ausführungsbeispiel 4 Messung der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität in rekombinanten Hefelinien

Mit dem pEVP11-PEP Plasmid transformierte Hefezellen wurden in Minimalmedium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1.0 angezogen und durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 5 min geerntet. Anschließend wurden die Zellen durch kräftiges Schütteln mit 1/2 vol (bezogen auf die Zellen) Glasperlen aufgebrochen und Glasperlen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation (600 g für 1 min) abgetrennt. Der Überstand wurde auf eine Konzentration von 0.5% Triton X-100 eingestellt, mit dem gleichen Volumen Liposomen versetzt und die resultierenden Proteoliposomen sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Liposomen wurden zuvor durch Beschallen von Sojabohnen-Phospholipid (20 mg/ml) für 10 min bei 4°C in Gegenwart von 100 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 20 mM Phosphoenolpyruvat und 30 mM Kaliumglukonat hergestellt. Nach dem Auftauen der Proteoliposomen und erneutem Beschallen der Suspension mit 10 Pulsen à 1 s wurden die Proteoliposomen vom umgebendem Medium durch Größenausschlußchromatographie auf Sephadex G-25, das zuvor mit 10 mM Tricine-NaOH (pH 7,6), 100 mM Natriumglukonat und 50 mM Kaliumglukonat äquilibriert worden war, abgetrennt. Die eluierten Proteoliposomen wurden für die Messung der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität eingesetzt. Die Messung wurde nach der von Menzlaff und Flügge (1993, Biochim. Biophys. Acta 1147, 13-18) beschriebenen "Inhibitor-Stop" Methode durchgeführt.

Die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität in den pEVP11-PEP Transformanten wurde mit der Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität von Transformanten verglichen, die lediglich mit dem Vektor pEVP11 transformiert waren. Es zeigte sich, daß die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität in den pEVP11-PEP Transformanten (gemessen in pmol transportiertes ³²P-Phosphat/mg Protein×Stunde) 100fach höher war als in pEVP11 Kontroll-Transformanten. Zudem konnte gezeigt werden, daß das rekombinante Translokatorprotein im Vergleich zu dem authentischen Protein der Plastidenmembran identische Transportcharakteristika aufweist.

Ausführungsbeispiel 5 Transformation von Pflanzen mit einer Konstruktion zur Überexpression der Kodierregion des Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators

Aus dem Vektor pBluescript-(pBSC-), der als Insertion die cDNA für den Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator aus Blumenkohl enthielt (siehe Ausführungsbeispiel 2) wurde die Insertion durch Restriktionsverdau mit SalI und SmaI isoliert und in den Vektor pBinAR (Höfgen u. Willmitzer, 1990, Plant Sci 66, 221-230) der zuvor mit den Enzymen SalI und SmaI geschnitten worden war, kloniert. Nach Amplifikation des resultierenden Konstrukts pBinAR-PEP in E. coli wurden das Konstrukt in Agrobakterien transformiert und diese dann zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.

Die erhaltenen Transformanten wurden mit Hilfe von Southern-Blot Analysen auf die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens untersucht. Mit Hilfe der "Gesamtblatt-Rekonstitutionsmethode" (Flügge und Weber, 1994, Planta, 194, 181-184) wurde die Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Transportaktivität im Vergleich zu Kontrolltransformanten (transformiert mit Vektor pBinAR ohne Insertion) untersucht, ebenso die Photosyntheserate, Transpiration und Wachstum.

SEQ ID NO.:
1
Art der Sequenz:	Nukleotid mit entsprechendem Protein
Sequenzlänge:	1402 Basenpaare
Strangform:	Einzelstrang
Topologie:	linear
Art des Moleküls:	cDNA
Ursprüngliche Herkunft @	Organismus:	Brassica oleracea
Herkunft:	cDNA-Bibliothek in Phage Lambda gt10
Merkmale:	von Nukleotid 14 bis 1219 kodierende Region
Eigenschaften:	Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator

Claims (16)

1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß diese DNA-Sequenzen die folgende Nukleotidabfolge aufweisen (Seq-ID No.: 1):

2. DNA-Sequenzen, die mit der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, hybridisieren und für ein plastidäres Protein kodieren, das die biologische Aktivität eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators besitzt.

3. Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet sind.

4. Plasmid pEVP11-PEP hinterlegt als E. coli Stamm TG1 pEVP11-PEP unter der DSM-Nummer DSM 10326 enthaltend dieses Plasmid.

5. Plasmid pBinAR-PEP hinterlegt als E. coli Stamm TG1 pBinAR-PEP unter der DSM-Nummer DSM 10327 enthaltend dieses Plasmid.

6. Bakterien, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.

7. Hefen, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen davon oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind.

8. Bakterien enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 bis 6.

9. Hefen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 oder 4.

10. Pflanzenzellen enthaltend Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 oder 5.

11. Transformierte Pflanzenzellen und aus diesen regenerierte transgene Pflanzen enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Sequenz als Bestandteil eines rekombinierten DNA-Moleküls in die Pflanzenzellen eingeführt wurde.

12. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Einführung in pro- oder eukaryontische Zellen, wobei diese Sequenzen mit Steuerelementen, die die Transkription und Translation in den Zellen gewährleisten, verknüpft sind und zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokators bewirkt, führen.

13. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Expression einer nicht translatierbaren RNA, die mittels eines "anti-sense"-Effektes oder einer Ribozymaktivität die Synthese eines oder mehrerer endogener Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokatoren in den Zellen verhindert.

14. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für einen pflanzlichen plastidären Phosphoenolpyruvat-Phosphat-Translokator mit einer veränderten Spezifität kodieren.

15. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Isolierung von DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, das die biologische Aktivität eines Phosphoenolpyruvat-Phosphat- Translokators besitzt.

16. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Teilen oder Derivaten, die durch Insertion, Deletion oder Substitution von diesen Sequenzen abgeleitet sind, zur Identifizierung von Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf den Transport von Phosphoenolpyruvat über die innere Plastidenhüllmembran haben.