DE19531678A1 - Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen durch zusätzliche cystosolische Pyruvat, Phosphat Dikinase - Google Patents

Description

Problemstellung

Die Samen vieler Pflanzen sind unerwünscht. Deshalb ist es das Bestreben vieler Züchter, samenlose Pflanzen zu züchten. Bei einigen Weintrauben-, Mandarinen- oder Apfelsinensorten z. B. ist das auch geglückt. Die Züchtung solcher Pflanzen ist ein sehr zeitaufwendiger Prozeß und ermöglicht keine Voraussagen über die letztendliche Qualität des Produktes hinsichtlich des Ertrages und des Geschmacks. Im folgenden wird aufgezeigt, wie diese Probleme unter Zuhilfenahme der Pflanzenmolekularbiologie umgangen werden können.

Pflanzen können ihren gesamten Energiebedarf mit Hilfe des Sonnenlichtes decken. Zusätzlich generieren sie bei dem, als Photosynthese bekannten Prozeß, Kohlenhydrate aus Kohlendioxid. Diese Stoffe können sowohl als Energiespeicher, zur Biosynthese als auch als strukturelle Bestandteile verwendet werden. Aber nicht alle pflanzlichen Gewebe sind zur Photosynthese befähigt. Zu den nicht-photosynthetisch aktiven Geweben gehören alle, die nicht mit Licht in Kontakt kommen oder aber andere Aufgaben haben, wie beispielsweise die unterirdischen Wurzeln, die Leitgewebe und die reifenden Samen. Im Dunkeln kann natürlich auch keine Photosynthese stattfinden. Die photosynthetisch aktiven Gewebe müssen also während der Lichtphasen genügend Energie produzieren und speichern, um den gesamten Organismus zu versorgen und wenn möglich das Wachstum und die Reproduktion voranzutreiben. Normalerweise erfolgen kurzfristige Speicherung (Stärke, Saccharose) und Transfer (Saccharose) von Energie in Form von Zuckern. Hauptabnehmer von Saccharose sind heranwachsende Blätter und die nicht-photosynthetisch aktiven Pflanzenteile. Die nicht-photo­ synthetisch aktiven Pflanzenteile müssen auch ihre gesamten organischen Bestandteile aus den transferierten Kohlenstoffgerüsten herstellen. Die reifenden Samen sind also auf Transportmetaboliten aus den photosynthetisch aktiven Geweben angewiesen. Für die Energiezufuhr und den größten Teil der Kohlenstoffgerüste sorgt die Saccharose (Dennis und Turpin 1990; Mohr und Schopfer 1978; Strasburger et al. 1991; Taiz und Zeiger 1991). Bei der Veratmung der aus der Saccharose stammenden Hexosen Glucose und Fructose können bis zu 38 ATP (Adenosintriphophat (ATP) ist die Energiewährung der Zellen. Die Änderung der freien Energie (ΔG) für die ATP-Hydrolyse beträgt unter physiologischen Bedingungen -50 bis -65 kJ/mol. Ein NADH kann zu 3 ATP umgewandelt werden) gewonnen werden (Voet und Voet 1992).

Lösungsansatz

Will man nun die Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe erfolgreich verhindern, muß man dafür sorgen, daß dieses Gewebe die importierten Zucker nicht wie vorgesehen verwerten kann. In Abb. 1 ist eine hypothetische biochemische Möglichkeit aufgeführt. Wird eine Pyruvat, Phosphat Dikinase (PPDK; EC 2.7.9.1) in das Cytosol einer pflanzlichen Zelle geschleust, so könnte sie im Verbund mit einer Pyruvatkinase die Glykolyse sozusagen kurzschließen. Die Glykolyse kann dann nur noch bis zum Pyruvat voranschreiten. Das Pyruvat wird dann von der cytosolischen PPDK wieder zu Phosphoenolpyruvat (PEP) umgewandelt, welches durch die Pyruvatkinase wieder zu Pyruvat umgewandelt wird. So schließt sich der Kreis. Die Pyruvatkinase erzeugt dabei zwar ein ATP, doch die PPDK verbraucht bei der Rückreaktion gleich zwei energiereiche Phosphatgruppen. Eine weitere Folge ist, daß dem Citrat-Zyklus (Mitochondrien) weniger Pyruvat zufließt. Der Citrat-Zyklus erzeugt einen Großteil der Energie atmender Gewebe. Vom Pyruvat an werden noch 15 ATP produziert, während die Glykolyse nur 4 ATP generiert. Die Zelle verarmt an Energie, wenn dem Citrat-Zyklus zu wenig Pyruvat zugeführt wird. Geschieht das während der Samenbildung, die sicherlich einer der Prozesse ist, der die meiste Energie benötigt, so können keine Samen gebildet werden. Da dieses Stoffwechselschema rein hypothetischer Natur ist, wird im folgenden eine Zusammenfassung über den Stand des Wissens über cytosolische PPDKs gegeben.

PPDK-DNA wurde bisher aus sechs Pflanzenarten isoliert. Mais enthält zwei PPDK-Gene (Sheen 1991), während in allen anderen Arten nur ein Gen für dieses Enzym detektiert wurde (Fißlthaler et al. 1995; Rosche et al. 1994; Rosche und Westhoff 1990; Usami et al. 1995). In Mais (Aoyagi und Bassham 1984c; Glackin und Grula 1990; Sheen 1991) und in Weizen (Aoyagi und Bassham 1984c) soll das Enzym in zwei unterschiedlichen intrazellulären Kompartimenten vorkommen: eine dominante Isoform in den Plastiden und eine Isoform im Cytosol. Eines der Mais-Gene kodiert für eine cytosolische Isoform. Das zweite Gen erzeugte zwei ppdk mRNAs, welche sich in der 5′-Region unterscheiden. Eine wird mit und die andere ohne Plastidenerkennungssequenz transkribiert. Diese Resultate wurden durch partielle cDNA-Sequenzanalyse bestätigt (Sheen 1991). Bisher wurde die Anzahl der Weizen-PPDK- Gene, sowie deren DNA Sequenz noch nicht bestimmt. Über die Gewebespezifität der PPDK- Expression wurden gegensätzliche Resultate veröffentlicht. Einige Autoren detektierten die cytosolische PPDK-Isoform in Wurzeln und etiolierten Blättern von Mais (Glackin und Grula 1990) und Samenkörnern von Mais und Weizen (Aoyagi und Bassham 1984c), während die plastidäre Isoform nur in Blättern gefunden wurde (Aoyagi und Bassham 1984c; Glackin und Grula 1990). Sheen (1991) detektierte sowohl die plastidäre, als auch beide cytosolischen PPDK-Isoformen in Blättern, ergrünenden Blättern und etiolierten Blättern, während nur die cytosolischen PPDK-Isoformen in Wurzeln und Stämmen von Mais exprimiert wurden. Studien zur intrazellulären Lokalisation hingegen detektierten das Enzym nur in Chloroplasten (CAM-Pflanzen; Spalding et al. (1979); Winter et al. (1982)) oder Plastiden (Schließzellprotoplasten der C₃-Pflanze Vicia faba; Schnabl (1981)). Bisher wurde über die metabolische Rolle der unterschiedlichen intrazellulären Lokalisation von PPDKs in Pflanzenzellen nicht diskutiert.

Lösungen

Um die obigen Überlegungen zu untersuchen, verwendete ich die ppdk-cDNA aus der fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum. Die cDNA der M. crystallinum PPDK kodiert für ein plastidäres Enzym von 103 kDa mit und 94 kDa ohne Plastidensignalsequenz (Fißlthaler 1993; Fißlthaler et al. 1995). Die cDNA wurde so manipuliert, daß dieses ursprünglich plastidäre Enzym im Cytosol verbleibt. Dazu wurden 183 bp vom 5′-Ende der cDNA entfernt (siehe Abb. 2), was zur Deletion von 120 bp der Plastidensignalsequenz führte. Als Translationsstart wurde ein zweites ATG (bei +258 bp) des Leserasters benutzt, so daß die Plastidensignalsequenz bis auf neun Aminosäuren deletiert wurde. Die PPDK gelangt dann nicht mehr in die Plastiden und verbleibt im Cytosol. Solche Konstrukte werden im folgenden ΔPPDK genannt.

Dieses Konstrukt wurde in einen binären Expressionsvektor (Bevan 1984) kloniert. In einem Kontrollkonstrukt wurde die cDNA in umgekehrter Orientierung (ΔAntisense) in den binären Expressionsvektor kloniert. Die Δppdk-cDNA befand sich in beiden Fällen unter der Kontrolle des konstitutiv, in allen Geweben exprimierten CaMV 35S-Promotors. Eine weitere Kontrolle stellt der Vektor ohne PPDK dar. Dieser Vektor enthielt zur Transformationskontrolle ein β-Glucuronidase-Gen (Vancanneyt et al 1990). Tabak erhielt durch diese binären Vektoren (siehe Abb. 2) mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens zusätzliche Erbinformationen. Die T-DNA des binären Plasmids wird von A. tumefaciens in Pflanzengenome integriert. Die Integration der T-DNA in das Pflanzengenom erfolgt an einen unbestimmten Ort des Genoms, so daß man bei verschiedenen Transformanden mit Variationen in der Expression der Gene rechnen muß, da diese von der chromosomalen Lokalisation beeinflußt wird (Schell 1987). Die Kontrollkonstrukte (ΔAntisense-PPDK und β-Glucuronidase) verhielten sich in allen Fällen wie der Wildtyp. Im weiteren werden sie daher nicht immer gesondert erwähnt.

Das Testsystem Tabak diente hier nur als Modell und wurde aufgrund der einfachen Handhabung gewählt. Die PPDK aus M. crystallinum diente als Stellvertreter dieser Enzymklasse und wurde aufgrund ihrer Verfügbarkeit gewählt.

Die Expression der heterologen Gene in Tabakblättern ist in Abb. 3 gezeigt. Sowohl ΔSense-, wie auch ΔAntisense-mRNAs wurden hierbei detektiert, da bei der Hybridisierung mit einer doppelsträngigen Sonde operiert wurde. Der mRNA-Spiegel der heterolog exprimierten PPDK war etwa 1/4x so hoch wie in Blättern von M. crystallinum im CAM- Zustand. Der Tabak-Wildtyp zeigte unter den gewählten Reaktionsbedingungen keinerlei ppdk-mRNA-Signal. Abb. 4 zeigt, daß in Blättern der ΔSense-PPDK-Pflanzen die PPDK produziert wurde. Im Verhältnis zu Blättern salzgestreßter M. crystallinum war die Expressionshöhe des Proteins allerdings sehr gering und steht damit im Kontrast zum mRNA- Spiegel, der bei den meisten Pflanzen recht hoch war. Im Wildtyp wie auch in den ΔAntisense-PPDK-Pflanzen konnten unter diesen Bedingungen keine oder nur geringe PPDK-Mengen detektiert werden.

Abb. 5 zeigt, daß die ΔPPDK-überexprimierenden Tabakpflanzen auch erhöhte PPDK-Aktivität (ΔPPDK1 210%, ΔPPDK2 189% der Aktivität des Wildtyps) besaßen. Die β- Glucuronidase-Kontrolltransformanten (Gus) zeigten keine erhöhte PPDK-Aktivität. Die PPDK-Aktivität des Wildtyps entsprach den in der Literatur für Tabak beschriebenen Werten (Kisaki et al. 1973).

Als nächstes wurden die von den ΔPPDK-überexprimierenden Tabaklinien produzierten Samenmengen ermittelt (Abb. 6). In allen drei analysierten Mutanten fanden sich weniger Samen pro Samenkapsel als im Wildtyp (= 100%). Den niedrigsten Wert erreichte hier die Mutante ΔPPDK 2 mit nur 2%. Diese Tendenz spiegelt sich auch im Verhältnis der Gewichtsanteile von Samen zu Samenkapsel wieder. Während die Samen beim Wildtyp 50% des Gewichtes der Samenkapsel ausmachten, machten die Samen bei der Linie ΔPPDK 2 nur noch knapp 2% des Gewichts der Samenkapsel aus. Das Gewicht der Samenkapseln aber betrug bei ΔPPDK 2 noch 42,5% der Wildtypsamenkapseln. Die Produktion von Samenkapseln war also kaum vermindert, was auch durch die Analyse der Samenkapselanzahl bestätigt wurde. ΔPPDK 2 produzierte im Vergleich zum Wildtyp 61% Samenkapseln und ΔPPDK 1 versuchte mit knapp 114% gar die geringe Samenproduktion zu kompensieren. Die cytosolische PPDK, die wegen des konstitutiven Promotors in diesen Pflanzen in allen Geweben exprimiert wurde, wirkte sich also am drastischsten auf die Samenbildung aus. Alle drei unabhängigen ΔPPDK-überexprimierenden Tabaklinien produzierten auch insgesamt weniger Samen als der Wildtyp. ΔPPDK 2 erreichte hier mit 1% den niedrigsten Wert. Sechs der zehn ΔPPDK 2-Pflanzen produzierten gar keine Samen, so daß die Samenbildung also auch völlig verhindert werden kann.

Manche ΔPPDK 2-Transformanden wuchsen langsamer als der Wildtyp. Diese Pflanzen wurden vermehrt. Sie blühten ungefähr anderthalb Monate später als der Wildtyp. Wenn die Nachkommen dieser Mutanten im Dauerlicht angezogen wurden, so wurde die Wachstumsverlangsamung von sechs auf gerade noch zwei Wochen bis zur Blüte reduziert.

Als Kontrolle diente im Dauerlicht gezogener Wildtyptabak und parallel dazu im normalen Tag/Nacht-Rhythmus gezogene Pflanzen beider Sorten. Es wurden insgesamt 14 Wildtyppflanzen und 30 ΔPPDK 2-Pflanzen verwendet. Dieser Effekt deutet an, daß Zellen mit hoher Atmungsrate behindert waren, da der Hauptfaktor, der durch das Dauerlicht reduziert wurde, die aerobe Atmung im Dunkeln war.

Interessante Ergebnisse ergab die Analyse der Samenspeicherstoffe (Zucker, Proteine und Lipide) und des Samengewichts. Die hier beobachteten Veränderungen waren in gleicher Weise ausgeprägt, wie es der Effekt der cytosolischen PPDK auf die Samenproduktion nahelegt (Verhältnis der Gewichtsanteile von Samen zu Samenkapsel: Wt 50%, ΔPPDK 1 34%, ΔPPDK3 22%, ΔPPDK 22%). Die Samen von ΔPPDK 3 (117%) und ΔPPDK 2 (142%) wogen mehr als die Wildtypsamen (100%). Das Gewicht der ΔPPDK 1-Samen (103%) entsprach in etwa dem des Wildtyps. Alle Mutanten enthielten mehr Protein pro Samen als der Wildtyp (ΔPPDK1 120%, ΔPPDK 3 126%, ΔPPDK 2 152%). Die Zuckermengen von ΔPPDK 1- und ΔPPDK 3-Samen entsprachen denen des Wildtyps, während ΔPPDK 2 157% freie Zucker akkumulierte (Stärke konnte nicht detektiert werden). Die Lipidanalyse zeigte, daß ΔPPDK 3- (69%) und ΔPPDK 2-Samen (44%) weniger Lipide akkumulierten als die Wildtypsamen. Die Hauptspeichersubstanzen in den kleinen Tabaksamen waren, wie erwartet, Lipide (ca. 48% des Samengewichts). Dieser Wert war in den Mutanten kleiner (ΔPPDK 3: 29% und ΔPPDK 2: 15%). Die Samen der Mutanten speicherten also mehr Proteine und freie Zucker, um den Lipidmangel auszugleichen. Daher wogen sie mehr als die Samen des Wildtyps, denn Proteine und Zucker sind stärker hydriert als Lipide. Trotzdem war der Energiegehalt der Samen der Mutanten im Vergleich zu denen des Wildtyps sehr viel geringer (ΔPPDK 2: 52%; Tabelle 1). Erstaunlicherweise wurde der Keimungsprozeß nicht von dem niedrigen Energiegehalt in Mitleidenschaft gezogen, denn die Samen der ΔPPDK-überexprimierenden Tabaklinien waren, wie die des Wildtyps, zu 90% keimfähig. Das stimmt sehr gut mit meiner Vermutung überein, daß atmungsintensive Prozesse durch die cytosolische PPDK stark behindert sein könnten, denn Fettsäure- und Lipidbiosynthese sind energetisch gesehen teuer und verbrauchen einen Großteil der Energie von reifenden Lipid-speichernden Tabaksamen.

Schlußfolgerungen

Zusammenfassend kann hier festgestellt werden, daß die Samenbildung bei den ΔPPDK- überexprimierenden Tabakpflanzen behindert werden konnte. Es sind drei verschieden starke Ausprägungen dieser Inhibition zu sehen. Die stärkste Ausprägung führte zur völligen Unterdrückung der Samenbildung. Auch andere stark atmende Gewebe waren behindert. Die Inhibition ist wahrscheinlich auf die ineffektive Verwertung von Hexosen durch Glykolyse und Citrat-Zyklus zurückzuführen. Hervorgerufen wird dieser Effekt durch eine PPDK im Cytosol der Pflanzen.

Die signifikante Verhinderung der Wachstumsverlangsamung unter Dauerlicht, die reduzierte Samenproduktion und die reduzierten Lipidmengen der Samen der Mutanten lassen vermuten, daß zusätzliche cytosolische PPDK einen ATP-Mangel herbeiführt. Der gesamte Energiegehalt, der in den Samen einer durchschnittlichen ΔPPDK 2-Pflanze gespeichert wurde, betrug im Vergleich zum Wildtyp gerade noch 0,37% und in den stärksten Ausprägungen gar 0% (siehe Tabelle 1).

Meine Daten stehen im Konflikt mit Berichten über eine cytosolische Lokalisation der PPDK (Aoyagi und Bassham 1984c; Glackin und Grula 1990; Sheen 1991), da stark atmende Gewebe, in denen eine solche Isoform von allen Autoren gefunden wurde, in ihrer Entwicklung inhibiert wurden. Offensichtlich aber hat zusätzlich im Cytosol produziertes PEP fatale Auswirkungen auf stark atmende Gewebe.

Durch die hier beschriebene gentechnische Veränderung mit einer cytosolischen PPDK, und damit der Produktion von zusätzlichem PEP im Cytosol, sollte sich die Entwicklung atmender Gewebe, insbesondere die Samenbildung bei nahezu jeder Pflanze verhindern lassen. Die Gentechnik erlaubt zusätzlich, solche Veränderungen sehr schnell herbeizuführen, während die Züchtung eines solchen Merkmals ein sehr zeitaufwendiger Prozeß ist. Durch die Produktion von zusätzlichem PEP im Cytosol von nur einem Zielgewebe (z. B. reifende Samen) wird sich das Wachstum dieses Gewebes spezifisch unterdrücken lassen. So können dann z. B. Pflanzen erzeugt werden, die keine Samen produzieren, aber ansonsten völlig dem Wildtyp gleichen.

Legenden

Abb. 1: Stoffwechselschema: Die glykolytischen Reaktionen, deren Verbindung zum Citratzyklus und der mögliche Effekt einer cytosolischen PPDK sind aufgezeigt. Glykolyse und Citratzyklus erzeugen insgesamt 38 ATP.

Abb. 2: Schematische Zeichnung der konstruierten binären Vektoren mit M. crystallinum-PPDK-Insertion. Ganz oben ist die PPDK-cDNA mit einigen Restriktionsschnittstellen dargestellt (Fißlthaler 1993; Fißlthaler et al. 1995). Die PPDK- cDNA-Sequenz aus M. crystallinum ist 3173 bp lang wovon 9 bp am 5′-Ende die Linkersequenz aus der cDNA-Synthese und die 3′-terminalen 12 bp das nach der Transkription angehängte PolyA-Ende darstellen. Das Startkodon befindet sich an Position 63, das Terminationskodon des längsten offenen Leserasters an Position 2910. Das aus der cDNA-Sequenz der PPDK aus M. crystallinum abgeleitete Protein besteht aus 949 Aminosäuren, was einem Molekulargewicht von 103244 Dalton entspricht. Die Präsequenz der PPDK aus M. crystallinum hat eine Länge von 74 Aminosäuren, so daß das reife, im Chloroplasten prozessierte Protein, eine Größe von etwa 94 kDa hat. Die Aminosäurezusammensetzung des reifen, prozessierten Proteins ergibt einen pI von 7,6. 5′- und 3′-untranslatierte Bereiche der cDNA sind als terminale schraffierte Boxen dargestellt. In der Sense-PPDK ist die PPDK-cDNA in richtiger Orientierung dargestellt (links 5′-, rechts 3′-untranslatierter Bereich; die gepunktete Box stellt die Plastidensignalsequenz mit den drei im Leseraster befindlichen ATGs dar; das erste ATG wird normalerweise als Translationsstart benutzt). Δ zeigt eine Deletion von 183 bp am ursprünglichen 5′-Ende an.

BR, BL: rechte bzw. linke Grenzregion der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens; Km: Kanamycinresistenz mit bakteriellen Regulationselementen; nptII: Neomycinphosphotransferase (Kanamycinresistenz) mit pflanzlichen Regulationselementen; 35S CaMV: Promotor des Blumenkohlmosaikvirus; ocs polyA: Polyadenylierungssignal des Octopinsynthasegens von Agrobacterium tumefaciens (Bevan 1984).

Die Transformation der Tabakpflanzen mit Hilfe des A. tumefaciens-vermittelten Gentransfers wurde nach Horsch et al. (1985) vollzogen.

Abb. 3: Die Δppdk-mRNA von Blättern der PPDK-überexprimierenden Tabakpflanzen (ΔSense und ΔAntisense; siehe auch Abb. 2) wurde durch Hybridisierung mit der M. crystallinum-ppdk-cDNA-Sonde auf einem Northern-Blot sichtbar gemacht. RNA der Blätter des untransformierten Tabaks (Wt) diente als Negativkontrolle, während Blatt-RNA einer M. crystallinum im CAM-Zustand als Positivkontrolle diente. Die einzelnen ΔPPDK-Mutanten sind in allen Abbildungen mit den selben Nummern versehen. Es wurden je 40 µg Tabak-RNA und 20 µg M. crystallinum-RNA eingesetzt.

Abb. 4: PPDK-Proteinspiegel von Blättern der ΔPPDK-überexprimierenden Tabakpflanzen (siehe auch Abb. 2) wurden durch Western-Blots untersucht. 2 µg Blattrohextrakt einer salzgestreßten M. crystallinum dienten als Positivkontrollen. Blätter untransformierter Tabak (Wt) und ΔAntisense-Tabakpflanzen dienten als Negativkontrollen. 62 µg der löslichen Blattproteine und 45 µg der löslichen Samenproteine der Tabakpflanzen wurden eingesetzt. Bei den analysierten transgenen Pflanzen handelte es sich jeweils um die F1-Generation unabhängiger Transformanden.

Abb. 5: PPDK-Aktivitätmessungen nach Holtum und Winter (1982) aber ohne Pyruvat oder KH₂PO₄ im Homogenisationspuffer. Die Bestimmung wurde aus Blattrohextrakten vorgenommen. Die Standardfehler von sieben (ΔPPDK1 und ΔPPDK2) und 41 Wildtyp (Wt; Samsun SNN) unabhängigen Messungen sind eingezeichnet.

Abb. 6: Ertragsanalyse der ΔPPDK-überexprimierenden Tabaklinien. Für die Analyse wurden 33 Wildtyp-Tabakpflanzen und 27 der ΔPPDK-überexprimierenden Tabakpflanzen bis zur Samenreife herangezogen und ausgewertet. Die einzelnen unabhängigen Transformanden (F1-Generation) wurden in folgenden Mengen analysiert: Transformand Nr. 1, 2: je 10 Pflanzen; Transformand Nr. 3: 7 Pflanzen. Die Standardfehler sind eingezeichnet.

Abb. 7: Zusammensetzung der Samen der ΔPPDK-überexprimierenden Tabaklinien. Für die Bestimmung der Samengewichte wurden 6 × 100 Wildtypsamen und 3 × 100 Samen der ΔPPDK-überexprimierenden Tabaklinien gewogen. Die Proteinmengen der Samen des Wildtyps und von allen Transformanten (je 100 mg) wurden mit Coomassie blau (Spector 1978) bestimmt. Die Standardfehler sind eingezeichnet.

Die Zuckeranalyse wurde nach Carroll et al. (1956) durchgeführt. 100 mg Samen wurden homogenisiert und mit 2 ml 25% Ethanol bei 70°C für 30 min inkubiert. Die Messungen wurden mit Glucose standardisiert.

Die Lipidanalyse wurde mit 100 mg Samen von zwei Transformanten und zwei Wildtypproben nach Zöllner und Kirsch (1962) durchgeführt. Die Messungen wurden mit Sonnenblumenöl standardisiert.

Referenzen

Aoyagi K. and Bassham J.A. (1984c) Pyruvate orthophosphate dikinase mRNA organ specificity in wheat and milze. Plant Physiol. 76, 278-280.

Bevan M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721.

Carroll N.V., Langley R.W. and Roe J.H. (1956) The determination of glycogen in liver and muscle by use of anthrone reagent. J. Biol. Chem. 220, 583-593.

Dennis D.T. and Turpin D.H. (1990) Plant Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Longman Group UK Limited, Essex.

Fißlthaler B. (1993) Die Pyruvat, Phosphat Dikinase aus der fakultativen Crassulaceen- Säurestoffwechsel-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum: Sequenzierung und Charakterisierung des Gens. Freie Universität Berlin, Dissertation.

Fißlthaler B., Meyer G., Bohnert H.J. and Schmitt J.M. (1995) Age-dependent induction of pyruvate, orthophosphate dikinase in Mesembryanthemum crystallinum L. Planta 196, 492-500.

Glackin C.A. and Grula J.W. (1990) Organ-specific transcripts of different size and abundance derive from the same pyruvate, orthophosphate dikinase gene in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3004-3008.

Holtum J.A.M. and Winter K. (1982) Activity of enzymes of carbon metabolism during the induction of Crassulacean acid metabolism in Mesembryanthemum crystallinum L. Planta 155, 8-16.

Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.G. and Fraley R.T. (1985) A simple general method for transferring genes into plants. Science 227, 1229-1231.

Kisaki T., Hirabayashi S. and Yano N. (1973) Effect of the age of tobacco leaves on photosynthesis and photorespiration. Plant Cell Physiol. 14, 505-514.

Mohr H. and Schopfer P. (1978) Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. Springer-Verlag, Berlin.

Newsholme E.A. and Leech A.R. (1983) Biochemistry for the medical sciences. Wiley, Rosche E., Streubel M. and Westhoff P. (1994) Primary structure of the photosynthetic pyruvate orthophosphate dikinase of the C₃ plant Flaveria pringlei and expression analysis of pyruvate orthophosphate dikinase sequences in C₃, C₃-C₄ and C₄ Flaveria species. Plant Mol. Biol. 26, 763-769.

Rosche E. and Westhoff P. (1990) Primary structure of pyruvate, orthophosphate dikinase in the dicotyledonous-C4 plant Flaveria trinervia. FEBS Lett 273, 116-121.

Schell J. (1987) Transgenic Plants as Tools to Study the Molecular Organization of Plant Genes. Science 237, 1176-1183.

Schnabl H. (1981) The compartmentation of carboxylating and decarboxylating enzymes in guard cell protoplasts. Planta 152, 307-313.

Sheen J. (1991) Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize Pyruvate, orthophosphate dikinase genes. Plant Cell 3, 225-245.

Spalding M.H., Schmitt M.R., Ku S.B. and Edwards G.E. (1979) Intracellular localization of some key enzymes of Crassulacean acid metabolism in Sedum praealtum. Plant Physiol. 63, 738-743.

Spector T. (1978) Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation. Anal. Biochem. 86, 142-146.

Strasburger E., Noll F., Schenck H. and Schimper A.F.W. (1991) Lehrbuch der Botanik. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart.

Taiz L. and Zeiger E. (1991) Plant Physiology. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Redwood City.

Usami S., Ohta S., Komari T. and Burnell J.N. (1995) Cold stability of pyruvate, orthophosphate dikinase of Flaveria brownii. Plant Mol. Biol. 27, 969-980.

Vancanneyt G., Schmidt R., O′Connor-Sanchez A., Willmitzer L. and Rocha-Sosa M. (1990) Construction of an intron-containing marker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant transformation. MGG 220, 245-250.

Voet D. and Voet J.G. (1992) Biochemie. VCH, Weinheim.

Winter K., Foster J.G., Edwards G.E. and Holtum J.A.M. (1982) Intracellular localization of enzymes of carbon metabolism in Mesembryanthemum crystallinum exhibiting C₃ photosynthetic characteristics or performing crassulacean acid metabolism. Plant Physiol. 69, 300-307.

Zöllner N. and Kirsch K. (1962) Z. ges. exp. Med. 135, 545.

Tabelle 1

Der Energiegehalt von Lipiden (L), Proteinen (P) und Kohlenwasserstoffen (Hexosen [H)) beträgt 37, 17 bzw. 16 kJ/g Trockengewicht (Newsholme und Leech 1983). Bei diesen Werten handelt es sich um grobe Abschätzungen, da ich von der Annahme ausging, daß Lipide, Proteine und Zucker den gesamten Energiegehalt ausmachen. Der Energiegehalt der Lipide, Proteine und Hexosen pro Samen wurde errechnet, dann addiert, um auf L+P+H zu kommen und danach mit den durchschnittlichen Samenanzahlen der entsprechenden Pflanzenlinien multipliziert, woraus sich die Werte der letzten Spalte ergeben. Die letzte Spalte gibt also eine Abschätzung der mobilisierbaren Energiemenge an, die von der Pflanze in Form von Samen abgespeichert werden konnte.

Claims (30)

1. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß im Cytosol der Pflanze zusätzliches Phosphenolpyruvat produziert wird.

2. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in der Pflanze zusätzliche cytosolische PPDK produziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzliches Gen für eine im Cytosol lokalisierte PPDK in Pflanzenzellen integriert wird.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beispielsweise die PPDK-cDNA aus der fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum so manipuliert wird, daß sie im Cytosol verbleibt, dann in Pflanzen eingebracht und überexprimiert wird.

5. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß im Cytosol von C₃-Pflanzen zusätzliches Phosphenolpyruvat produziert wird.

6. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in C₃-Pflanzen zusätzliche cytosolische PPDK produziert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzliches Gen für eine im Cytosol lokalisierte PPDK in Zellen von C₃-Pflanzen integriert wird.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beispielsweise die PPDK-cDNA aus der fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum so manipuliert wird, daß sie im Cytosol verbleibt, dann in C₃-Pflanzen eingebracht und überexprimiert wird.

9. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß im Cytosol von Dikotyledonen zusätzliches Phosphenolpyruvat produziert wird.

10. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in Dikotyledonen zusätzliche cytosolische PPDK produziert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzliches Gen für eine im Cytosol lokalisierte PPDK in Zellen von Dikotyledonen integriert wird.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beispielsweise die PPDK-cDNA aus der fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum so manipuliert wird, daß sie im Cytosol verbleibt, dann in Dikotyledonen eingebracht und überexprimiert wird.

13. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß im Cytosol von dikotyledonen C₃-Pflanzen zusätzliches Phosphenolpyruvat produziert wird.

14. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in dikotyledonen C₃-Pflanzen zusätzliche cytosolische PPDK produziert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzliches Gen für eine im Cytosol lokalisierte PPDK in Zellen von dikotyledonen C₃-Pflanzen integriert wird.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beispielsweise die PPDK-cDNA aus der fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum so manipuliert wird, daß sie im Cytosol verbleibt, dann in dikotyledone C₃- Pflanzen eingebracht und überexprimiert wird.

17. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß im Cytosol von Nachtschattengewächsen (Solanaceae) zusätzliches Phosphenolpyruvat produziert wird.

18. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in Nachtschattengewächsen (Solanaceae) zusätzliche cytosolische PPDK produziert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzliches Gen für eine im Cytosol lokalisierte PPDK in Zellen von Nachtschattengewächsen (Solanaceae) integriert wird.

20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,daß beispielsweise die PPDK-cDNA aus der fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum so manipuliert wird, daß sie im Cytosol verbleibt, dann in Nachtschattengewächsen (Solanaceae) eingebracht und überexprimiert wird.

21. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß im Cytosol von Tabak zusätzliches Phosphenolpyruvat produziert wird.

22. Verfahren zur Behinderung oder Verhinderung der Bildung von atmendem pflanzlichen Gewebe, insbesondere zur Erzeugung samenloser Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in Tabak zusätzliche cytosolische PPDK produziert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzliches Gen für eine im Cytosol lokalisierte PPDK in Zellen von Tabak integriert wird.

24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beispielsweise die PPDK-cDNA aus der fakultativen CAM-Pflanze Mesembryanthemum crystallinum so manipuliert wird, daß sie im Cytosol verbleibt, dann in Tabak eingebracht und überexprimiert wird.

25. Verfahren zur Erhöhung der pflanzlichen Samenproduktion und zur Beschleunigung des Pflanzenwachstums, dadurch gekennzeichnet, daß in Pflanzen mit Hilfe einer cytosolischen PPDK die Gesamtaktivität der PPDK um mindestens 89% erhöht wird.

26. Verfahren zur Erhöhung der pflanzlichen Samenproduktion und zur Beschleunigung des Pflanzenwachstums, dadurch gekennzeichnet, daß in C₃-Pflanzen mit Hilfe einer cytosolischen PPDK die Gesamtaktivität der PPDK um mindestens 89% erhöht wird.

27. Verfahren zur Erhöhung der pflanzlichen Samenproduktion und zur Beschleunigung des Pflanzenwachstums, dadurch gekennzeichnet, daß in Dikotyledonen mit Hilfe einer cytosolischen PPDK die Gesamtaktivität der PPDK um mindestens 89% erhöht wird.

28. Verfahren zur Erhöhung der pflanzlichen Samenproduktion und zur Beschleunigung des Pflanzenwachstums, dadurch gekennzeichnet, daß in dikotyledonen C₃-Pflanzen mit Hilfe einer cytosolischen PPDK die Gesamtaktivität der PPDK um mindestens 89% erhöht wird.

29. Verfahren zur Erhöhung der pflanzlichen Samenproduktion und zur Beschleunigung des Pflanzenwachstums, dadurch gekennzeichnet, daß in Nachtschattengewächsen (Solanaceae) mit Hilfe einer cytosolischen PPDK die Gesamtaktivität der PPDK um mindestens 89% erhöht wird.

30. Verfahren zur Erhöhung der pflanzlichen Samenproduktion und zur Beschleunigung des Pflanzenwachstums, dadurch gekennzeichnet, daß in Tabak mit Hilfe einer cytosolischen PPDK die Gesamtaktivität der PPDK um mindestens 89% erhöht wird.