DE1959603A1

DE1959603A1 - Kristalline Kombination aus L-Asparaginase und einem Metall- oder Metalloidion und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1959603A1
Application number: DE19691959603
Authority: DE
Inventors: Koh Ho Peter Peck
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1968-11-29
Filing date: 1969-11-27
Publication date: 1970-11-19
Also published as: IL33327A; AT295452B; BE742215A; IL33327A0; FR2024571B1; FR2024571A1; NL6917822A; GB1242976A

Description

PATENTANWÄLTE

D R. I. M A A S

DR. W. PFEIFFER

DR. F. VOITHENLEITNER

3 MÜNCHEN 23
UNG£RERSTR. 25 - TEL. 39 02 36

81 492 '

Eli Lilly and Company,Indianapolis,Indiana, V.St.A.

Kristalline Kombination aus L-Asparaginase und einem Metall- oder Metalloidion und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf ein kristallines L-Asparaginasepräparat und betrifft insbesondere eine kristalline | Kombination aus L-Asparaginase und einem Metall- oder Metalloid, die sich durch hohe enzymatische und oncolytische Aktivität auszeichnet, sowie ein Verfahren zu ihrer: Herstellung.

Die kristalline Kombination nach der Erfindung wird aus einem rohen L-Asparaginasepräparat, einem löslichen Metall- ; oder Metalloidsalz und einem Fällungsmittel folgendermaßen hergestellt: .

a) Man löst ein rohes L-Asparaginasepräparat in.Wasser;

b) öetzt ein geeignetes mit .Wasser mischbares Fällungsmittel (Antisolvena) bis zu beginnender Trübung zu;

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c) gibt eine wässrige Lösung eines Metall- oder Metalloidsalzes, das in der Solvens-Antisolvens-Mischung löslich ist und nach Auflösung in Wasser einen pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 9 ergibt, in solcher Menge zu, daß die L-Asparaginase auskristallisiert und

d) trennt die erhaltenen Enzymkristalle ab.

Durch Wiederholung dieser. Stufen kann eine höhere Reinheit der Kristalle erreicht werden.

Es ist zu ersehen, daß die Stufen (b) und (c) nicht in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden müssen, sondern ohne Abweichung von dem Wesen=der Erfindung vertauscht werden können. Die erhaltene kristalline Kombination zeichnet sich durch überlegene Reinheit und oncolytische Aktivität aus, wie noch erläutert wird.

Nach einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine kristalline Kombination aus !-Asparaginase und Magnesiumionen hergestellt werden, indem man eine kristalline Kombination aus L-Asparaginase und einem anderen Metall oder Metalloid als Magnesium in Wasser löst, in beliebiger Reihenfolge das Antiaolvens bis zu anhaltender beginnender Trübung und ein Magnesiumsalz, vorzugsweise Magnesiumacetat, zusetzt und anschließend das kristalline Produkt abtrennt.

Außer der hohen enzymatischen und oncolytischen Aktivität des kristallinen Enzyms iat das Produkt wegen der Größe, der geringeren Oberfläche und der höheren Dichte der Kristalle für pharmazeutische Abfüllvorgänge besonders vor-

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teilhaft. Bekannte L-Asparaginasepräparate sind amorphe Pulver, die in Lösung zu Unbeständigkeit neigen, und . werden im allgemeinen als Trockenpulver zusammen mit einer zweiten Flasche, die die erforderliche Flüssigkeit zur Zubereitung enthält, geliefert. Infolge ihrer hohen Oberfläche neigen diese amorphen Pulver zur Aufnahme von Verunreinigungen und statischen Ladungen. Ein Pulver mit derartigen statischen Ladungen bereitet in. der pharmazeutischen Industrie große Schwierigkeiten. Wenn man versucht, das amorphe Material mit inerten Füllstoffen und dergleichen zuzubereiten, klebt das Material an den Wänden der Vorrich- * tung und widersetzt sich der Vermischung. Das Material leistet dem Abfüllen in Ampullen, Kapseln, Flaschen und dergleichen Widerstand und neigt zum Haften an der Füllvorrichtung oder zum Wegfliegen.

ferner widersetzen sich Pulver dieser Art einer Benetzung durch die Flüssigkeit, die während der Zubereitung vor dem Gebrauch zugesetzt wird. Durch das erfindungsgemäße Produkt werden alle diese bekannten Schwierigkeiten wirksam behoben.

Die kristalline Kombination aus L-Asparaginase und einem Metall- oder Metalloidsalz nach der Erfindung weist eine f spezifische Aktivität von mehr als 350 internationalen Einheiten (I.U.) L-Asparagmase auf und wird aus einem rohen L-Asparaginasepräparat mit einer spezifischen Aktivität in der Größenordnung von 60 I.U. nach der beschriebenen Methode hergestellt. j

Die spezifische Aktivität ist ein Maß für die -enzymatisch^ Aktivität, wobei eine internationale Einheit der Enzymmenge entspricht, die zur Freisetzung von 1 Mikromol Asparaginat pro Minute in dem folgenden Test nötig ist.

1 bis 100 Λ. der unverdünnten Testlösung werden zu 1 ml v/ässriger 0,02 m L-Asparagihaselösung und 1 ml was sr if_;Q_f2,. m Natriumacetatpuffer .(pH 5,0) gegeben. Das durch

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T95ÄQ3

die folgende E.nzymreaktion freigesetzte Asparaginat wird durch HOchspannungselektrophorese in Pyiidin-Acetat-Puff er bei pH 6,3 auf einem GelluToseträger abgetrennt. Beispielsweise trägt man 20 Λ der Probe auf mit Puffer behandeltes Whatman-Papier Nr. 1 auf und führt die Elektrophorese 30 Minuten bei 2000 Millivolt durch. Das .Papier wird 10; Minuten im Ofen getrocknet und dann mit Ninhydrinreagens angefärbt, wobei sich dunkelblaue Flecken bilden, die dem Asparaginat entsprechen,. Die Dichte der Flecken wird mit einem Densitometer bestimmt. Für jeden Test werden Bestimmungen mit Standärdkonzentrationen von Asparaginat und mit- Kontrollproben, die nur die Reagentien ohne die zugesetzte [EestlöBung enthalten, durchgeführt, um anderes als durch Enzymaktivität freigesetztes Asparaginat zu messen. Alternativ kann die Enzymaktivität nach der Methode von Campbell et al. _t Bioehem., 6, 721 (1967); bestimmt wenden, bei der man: das Enzym mit überschussigem ii-Asparagin reagieren läßt und das freigesetzte Ammoniak mit Ifessler-Reagens um.*- setzt. Die freigesetzte Ammoniakmenge wird durch Bestimmung der Änderung der optischen Dichte des Nessler-Reagens geraessen. ' ■

Die Herstellung von roher L-Asparaginase, die wie oben beschrieben für die erfindungsgemäßen Zwecke eingesetzt wird, kann die folgenden Stufen umfassen:

a) Ein L-Asparaginase produzierender Stamm von E. coli, für den die Kultur A.T.C.G. 13706 ein typisches Beispiel ist, wird in einem Fährmedium, das assimilierbares Kohlenhydrat, Stickstoff und Mineralien enthält, unter üblichen Bedingungen etwa 5 bis' 10 Stunden aerob fermentiert;

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b) dann wird die Fermentationsmischung unter anaeroben Bedingungen etwa 1 Stunde lang altern gelassen;

o) die Zellen werden geerntet;

d) die Zellen werden in Wasser resuspendiert;

e) die resuspendierten Zellen werden mit hochfrequenten. Schallwellen behandelt, um die Zellwände aufzubrechen, zusätzlich oder alternativ werden die resuspendierten Zellen mit Lysocym nach der Methode von Cedar und Schwartz, J. Biöl. Chem. 242, 3753 (196?) behandelt oder -zusätzlich oder alternativ wird der wässrige Zellkuchen eingefroren und aufgetaut, um die Zellstruktur aufzubrechen;

f) die Mischung wird auf pH 5 eingestellt und zur Entfernung der Zellenbruchstücke filtriert;·

g) die erhaltene Lösung wird auf pH 8 eingestellt;

h) das Filtrat wird mit festem Ammoniumsulfat his zu einer Konzentration von 45 $ (G-ewicht/Volumen) versetzt, und die erhaltene Mischung wird filtriert ( der feste Rückstand wird verworfen); ^x

I) das Filtrat wird mit festem Ämmoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 80 fo (G-ewicht/Volumen) versetzt, und die erhaltene Mischung wird filtriert;

j) der'feste Rückstand-wird in wässriger 10 m Ammoniumbioarbonatlb'yung r«suspendiert und die erhaltene Mischung v/ird gegen Waaser dialysiert;

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k) die wässrige Lösung des dialysierten "Produkts wird mit dem gleichen Volumen Äthanol, versetzt, und die erhaltene Mischung wird filtriert (der feste Rückstand wird verworfen) ; ΐ-.. ' ■'■■■■

1) das wässrige Filtrat wird ein zweites-Mal mit dem gleichen Volumen Äthanol versetzt.und die erhaltene Mischung wird filtriert; ·..··.·. ...

m) der Rückstand wird 'in wässriger 10 m Ammoniumbicarbonatlösung gelöst und die erhaltene Lösung wird gefriergetrocknet; ' - · · ' ■■■■'"«'

n) das erhaltene Pulver wird in Wasser suspendiert, und die Suspension wird mit festem Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 45 $ (Gewicht/Volumen) versetzt und filtriert (der Feststoff wird verworfen);

o) das Filtrat wird mit weiterem festem Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 80 % 'versetzt und die Mischung wird filtriert;

p) der Rückstand wird in 10 m Ammoniumbicarbonatlösung gelöst, die Lösung wird dialysiert. (Wasser) und die Lösung wird lyophilisiert, wodurch das fertige rohe L-Asparaginase-Präparat erhalten wird.

Für die erfindungsgemäßen Zwecke wird die Verwendung von Enzym bevorzugt, das bis zu Stufe (p) gereinigt ist, ob- . wohl auch das Enzympräparat von'Stufe (m) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kristallisierbar ist.

'Ifach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst die" rohe L-Asparaginase in Wasser in jeder gewünschten Konzeh-

tration bis sum Sättigungswert gelöst (es leuchtet ein, . daß eine verhältnismäßig große Viassermenge schon allein wegen der mechanischen Verluste nicht vorteilhaft wäre).

Sann wird die wässrige Lösung mit einem An'tisolvens Ms zur beginnenden Trübung versetzt.. Geeignete wassermischbare Antisolventien oüer ]? al lungs mittel für das erfindungsgemäße _; Verfahren sind beispielsweise Äthanol, Aceton und Isopro- ^. panol.

Hierauf wird zu der verdünnten lösung von L-Asparaginase . ^ tropfenweise eine wässrige Lösung eines Metall- oder Metalloidsalzes gegeben, was zu unmittelbarer Kristallisation des erfindungsgeiuäßen Kombinationsprodukts führt. Im allgemeinen liefern Ionen sämtlicher Metalle des Per.i odensystems sowie Ketalloidionen wie Ammonium- und Hydraziniumionen ein kristallines P:odukt mit L-Asparaginase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Entscheidend für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist offenbar nur, daß das Salz im Wasser und in der Wasser-Antisolvens-Kisehung löslich sein ' muß und darin eine Wasserstoffionenkonzentration erzeugen muß, die einen pK-Wert zwischen etwa 6,0 und etwa 9 entspricht.'

Die bevorzugten Ausführungsform· der Erfindung sind Kristalle, die die Metalloidionen KEL⁺ und ^2^5 ⁺ ^{unö di}v^e Metallionen

25 Na⁺, K⁺, Id⁺, Mg ⁺⁺, Ba⁺⁺, Sr⁺⁺ _>
Mn++, Ca⁺⁺, Zn⁺⁺, Gd++, jj

Co⁺⁺, Ni⁺⁺ _f Cr++, 3?e+3, Pb++, Al+5, oder Cu⁺⁺ enthalten. Die bei Kristallisation mit Zn++ erhaltene Depotform des Enzyms ist eine besonders wertvolle pharmazeutische Eorm.. W_enn man l'ür das Enzym ein Molekulargewicht von 180 000 annimmt, s^nd im allgemeinen etwa 150 Alkalimetall- oder Metalloidionen pro Enzymmolekül, etwa 30 Erdalkaliionen pro Enzymifcolekül und etwa 4 bis 6 Ubergangsmetalllionen pro Enzymmolekül zur Kristallisation des kristallinen Kombinationsprodukts erforderlich.

Zwar beginnt die Kristallisation, wie oben angegeben wurde, sofort' nach Behandlung der mit Antisolvens verdünnten enzym-' haltigen lösung mit dem Metall- oder Metalloidsalz, um eine möglichst hohe Ausbeute zu erzielen, wird es jedoch bevorzugt, die kristallisierende lösung bei Raumtemperatur oder darunter stehen zu lassen, bis die Kristallisation praktisch vollständig ist. Das kristalline Produkt kann durch Dekantieren, Filtrieren, Zentrifugieren oder ahn-_ liehe Trennmethoden abgetrennt werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Magnesium-L-Asparaginasekristalle gehören zum orthorhombischen System und haben folgende Elementarzellenparameter:

a = 153° A

b = 64 A ·

c = 127 A

ν = 1 224 153 A⁵ = 122 415 x'10"²¹'cm³

Zum Nachweis dafür, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte Enzympräparat oncolytisch ,wirksame !■^Asparaginase enthält, wird die Antitumoraktivität des isolierten Produkts nach folgender Methode getestet.

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ßAD OFHOiNAL.

Lymphosarcoin G-aranoi'j ein fester, keine Metastasen bildender Tumor, wird Mäusen subkutan durch einen Trocar in die Axillarregion implantiert. 24 Stunden nach der Implantation wird mit der Behandlung begonnen. Die Tiere werden durch tägliche intramuskuläre Verabreichung' des Enzyms während insgesamt 10 Tagen behandelt. Die Aktivität wird durch Vergleich der Tumorgröße bei Testtieren zu der Größe bei Kontrolltieren, die nach der Implantation des Tumors keine Behandlung erhalten, bestimmt. Jede Testgruppe besteht aus 10 Tieren. Die Er- . % gebnisse sind als Durchschnittswert der Tumorgröße, die bei jedem Tier beobachtet wird, angegeben. Tabelle I zeigt die Dosia-V/irkungs-Beziehung für L-Asparaginase dieoiirii Testsystem. In Spalte 1 der Tabelle ist die in Dosis in I. Ii. pro Maus genannt, in der das Enzym täglich verabreicht wird. Dazu wird die entsprechende Menge an metallorganischem kristallinem Enzym vor jeder täglichen Injektion in steriler Salzlösung'gelöst. Spalte 2 gibt die Aktivität des Wirkstoffs in dem Testsyteiri. an, wobei die erste Zahl der Verminderung der Tumorgröße gegenüber den Kontrolltieren in Prozent entspricht und die in Klammern genannte Zahl die Zahl ' ■ I der überlebenden Tiere in jeder Testgruppe am Ende der Teotüauer angibt. Keines der 10 Kontrolltiere überlebte die Testdauer.

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- yt -	I .	Aktivität	(8)
		100	(8)
Tabelle		100	(8)
'·		- 100	(8)
		98	(9)
		■68

I.U./Maus

Ähnliche Ergebnisse werden bei subkutaner Verabreichung des Snzyins erzielt.

Beispiel .1

5 gL-Asparaginase in Form eines lyopholisierten Pulvers mit einer Aktivität von 81 I.II. pro Milligramm Protein werden in 60 ml destilliertem V/asser gelöst. Die Lösung ivird mit 0,1 η Natrxumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt und etwa -

—3

18 Stunden lang gegen wässrige 10m Ammoniumbicarbonatlösung dialysiert Die erhaltene Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt, und die klare gelbe überstehende !Flüssigkeit wird durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 80 ml und eine Proteinkonzentration von 38 mg pro ml gebracht. Die Mischung wird gerührt und mit 80 ml absolutem Äthanol versetzt. Die Lösung wird auf 4⁰G abgekühlt, 1 Stunde bei 4°0 gehalten und dann mit 1 ml 1m Kaliumphosphatlösung versetzt. Die Mischung wird auf -20⁰G abgekühlt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Ss scheidet sich ein weißer Niederschlag von Kalium-L-Asparaginase ab,

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der durch Zentrifugieren "bei -1O°C isoliert wird. Der Niederschlag wird mit 20 ml destilliertem Wasser gerührt, und die Suspension wird durch Zentrifugieren geklärt. Die überstehende !Flüssigkeit wird tropfenweise mit Äthanol versetzt, "bis die Trübung "bestehen "bleibt.--Die Lösung wird 18 Stunden bei 4°C aufbewahrt. Während dieser Zeit scheidet sich ein weißes kristallines Enzympräparat ab. Die Kristalle werden abzentrifugiert. Ausbeute 51,5 %, spezifische Aktivität 380 I.TJ. pro mg Protein. Analytisches Ultrazentrifugieren ergibt eine Produkthomogenität von 99»0 ^.

Beispiel 2

L-Asparaginase wird nach der Methode von Beispiel 1 gereinigt und kristallisiert, mit der Ausnahme, daß der wässrigen Äthanollösung der rohen L-Asparaginase 1 ml wässriges 1 m Ammoniumsulfat anstelle des Kaliumphosphats zugesetzt wird. Ausbeute 61 #, spezifische Aktivität 382 I.U./mg Protein.

Beispiel 3

Man löst das Produkt von Beispiel 2 in 10 ml Wasser, gibt 25 λ. wässrige 1 m Magnesiumacetatlösung zu und versetzt tropfenweise mit Alkohol, bis-die Trübung bestehen bleibt. Die erhaltene Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die entstandenen rechtwinkligen Kristalle werden durch Zentrifugieren und Dekantieren isoliert und dann zweimal mit 50 $-igem wässrigem Alkohol gewaschen. Die Ausbeute beträgt 55 i° der Theorie, bezogen auf die ursprüngliche rohe L-Asparaginase von Beispiel 2. Spezifische Aktivität: 425 I.IT./mg Protein.

Beispiel 4

5 g L-Asparaginase in Porm eines lyophilisierten Pulvers mit einer Aktivität von 81 I.TJ. pro mg Protein werden in 60 ml·

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destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit wässriger 0,1 η Natriumhydroxidlösung auf pH 7,0 eingestellt und etwa 18 Stunden gegen wässrige -10 m Ammoniumbicarbonatlösung dialysiert. Die erhaltene Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt, und die klare, gelbe überstehende Flüssigkeit wird durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 80 ml und eine Proteinkonzentration von 38 mg pro ml gebracht. Dann werden unter Rühren 80 ml absolutes Äthanol zugesetzt. Die Lösung wird auf 4°C gekühlt, 1 Stunden bei 4⁰C gehalten und dann mit 1 ml 1 m Hatriumehloridlösung versetzt. Die Mischung wird auf -20⁰C abgekühlt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Es scheidet sich ein ■weißer Niederschlag aus Natrium-L-Äsparaginase ab, der durch Zentrifugieren bei -10⁰C isoliert wird. Der Niederschlag wird mit 20 ml destilliertem Wasser gerührt. Die erhaltene Lösung wird durch Zentrifugieren geklärt. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 1 ml wässriger 1 m Magnesiumacetatlösung versetzt. Durch tropfenweise Zugabe von Äthanol bis zur beginnenden Trübung und anschließendes Aufbewahren während 18 Stunden bei 4°C werden weiße Kristalle von Magnesium-L-Asparaginase gebildet, die 5 Mol Mg ⁺ pro Mol Enzym enthalten. Die Kristalle werden durch Zentrifugieren gewonnen. Ausbeuter 80 $, spezifische Aktivität 382 I.U. pro mg Protein.

Die kristalline Magnesium-L-Asparaginase wird durch Auflö-

sen in Wasser, Zugabe von Alkohol bis zur beginnenden Trübung und Stehenlassen bei Raumtemperatur während 2 Stunden und bei -4°C über Nacht in 69 i° Ausbeute zu Magnesium-L-Asparaginase mit einer spezifischen Aktivität von 400 I.TJ./mg umkristallisiert. Das gereinigte Produkt enthält ebenfalls 5 Mol Mg⁺⁺ pro Mol Enzym. .

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Beispiel 5

Sin rones L-Asparaginaseproclukt wie in Beispiel 4- wird über Kacht gegen wässrige 10 m Ammoniumbicarbonatlösung dialysiert. Die dialysierte Bnzymlösung enthält etwa 10 ppm Mg . Ein Versuch, Kristallisation durch Zugabe von Äthanol herbeizuführen, ergibt nur einen nichtkristallinen Niederschlag.

Aliquote Teile dieser Lösung von je 1. ml werden nacheinander mit 20 Λ. einer wässrigen 0,1 m Lösung von Metalloder Metalloidsalz und Alkohol versetzt, bis nach Stehen über Facht bei 4°C Kristallisation erfolgt. Die Menge an Metall- oder Metalloidionen, die zur Induzierung der Kristallisation erforderlich ist, wird aufgrund eines geschätzten Molekulargewichts von 180 000 für die L-Asparaginase ermittelt.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse der verschiedenen Versuche zusammengefaßt".

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Metall- oder Metalloidkation. Molverhältnis Kation : Protein

₄ ⁺ ' 150

N₂H₅ ⁺ 150

Na⁺ 150

K⁺ 150

Li⁺ , 30

Mg⁺⁺ . 6

Ba⁺⁺ ' 6

Sr⁺⁺ ■ . ■ ' δ

Ca⁺⁺ 6

Mn⁺⁺ 6

Zn⁺⁺ 6

0d⁺⁺ 6

0o⁺⁺ · 6

Cr⁺⁺ δ

Pb⁺⁺ - β

Cu⁺⁺ · 6

Al⁺³ "" ■■'"' 6

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Die Metalle und Metalloide werden in Form ihrer Acetate, h Citrate, Phosphate, Bicarbonate oder Sulfate eingesetzt. ''

Daraus ist zu ersehen, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung roher Präparate von L-Asparaginase durch Auskristallisieren eines ICombinationsprodukts und anschließendes Dialysieren des kristallinen KomMnationsprodukts zur Entfernung der Metallionen geeignet ist. Auf diese Weise kann ein metallfreies Produkt hoher Reinheit erhalten werden.

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Claims

Patent ans τ> r ü c h e

1, Kristalline Kombinationen aus !^Asparaginase und Metall·*- oder Metalloididionen.

2. Kristalline Kombination nach Anspruch 1,, dadurch gekenn* zeichnet, daß die Metallianen aus\Alka.limetallionen stehen, ■

5,-^Kristalline Kombination nach Anspruch 1\, dadurch zeichnet, daß die Metallionen aus
gestehen'.'

4, Kristalline Kombination nach .Anspruch 3_:.» dadurch gei:ennzeich-,, ,daß die Metall*- oder Metalloldionen ..aus W⁺ ; K⁺,' M*,,

, Zn⁺⁺, , i»b⁺⁺, ^H₄ ⁺ oder H

3* iKristalline Kombination -nach Anspruch ¹I oder 4, dadurch . geicennzeicbne*» daß die iMetallionen aus Zinkionen beste'hen.

6. Kristalline Kombination mach Anspruch 1, 3 oder 4, gekennzeichnet, daß die MetaO-lionen aus Magnesiumionen "bestehen.

?.. Kristalline Kombination nach Anspruch 1 pÄ@r 4, gekennzeichnet,, daß die Metalloiäionen aus Ammoniumionen bestehen.

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If·

8« Kristalline Kombination nach Anspruch 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallionen aus Kaliumionen "bestehen.

9. Verfahren zur Herstellung von kristallinen Kombinationen aus L-Asparaginase und Metall- oder Metalloidionen, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Asparaginase in Wasser löst und in beliebiger Reihenfolge

a) ein Antisolvens oder lällungsmittel bis zu anhaltender ^ beginnender Trübung und

b) ein Metall- oder Metalloidsalz, das in der Wasser-AntisοIvens-Mischung löslich ist und bei Auflösung in Wasser einen pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 9,0 ergibt, zusetzt und das kristalline Kombinationsprodukt abtrennt. · '

10. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung einer kristallinen Kombination aus L-Asparaginase und Magnesiumionen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine kristalline Kombination aus L-Asparaginase und anderen Metall- oder Metalloiö ionen als Magnesiumionen in Wasser auflöst und in beliebi- f ger Reihenfolge

ä) das Antisolvens bis zu anhaltender beginnender Trübung und

b) ein Magnesiumsalz

zusetzt und die kristalline Kombination aus L-Asparaginase und Magneaiumionen abtrennt.

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11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Magnesiumsala Magnesxumacetat verwendet.

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