DE19510344C1

DE19510344C1 - Use of a tumor vaccine

Info

Publication number: DE19510344C1
Application number: DE19510344A
Authority: DE
Inventors: Tamas Dr Schweighoffer
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2015-03-23
Also published as: WO1996029093A1

Abstract

A tumour vaccine made from autologous and/or allogenic tumour cells is modified with one or more antigens for which an immune response already exists in the patient's body. The tumour cells are transfected preferably using recombinant DNA, e.g. a plasmid, which contains the sequence coding for the antigen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Tumorvakzine.The invention relates to the use of a tumor vaccine.

Die Entwicklung von Tumorvakzinen beruht auf drei Voraussetzungen: 1. es bestehen qualitative und quantitative Unterschiede zwischen Tumorzellen und normalen Zellen; 2. das Immunsystem ist gut geeignet, diese Unterschiede festzustellen; 3. dem Immunsystem kann - durch aktive spezifische Immunisierung mit Vakzinen - beigebracht werden, diese Unterschiede zu erkennen und die Abstoßung des Tumors herbeizuführen.The development of tumor vaccines is based on three Requirements: 1. there are qualitative and quantitative differences between tumor cells and normal cells; 2. the immune system is well suited identify these differences; 3. the immune system can - through active specific immunization with Vaccines - are taught these differences too recognize and bring about the rejection of the tumor.

Für das Entstehen einer Anti-Tumorantwort müssen zwei Kriterien erfüllt sein: Erstens muß der Tumor neue Antigene oder Neoepitope, die auf normalen Zellen nicht vorkommen, präsentieren. Zweitens muß das Immunsystem entsprechend aktiviert werden, um auf diese neuen Antigene zu reagieren. Ein wesentliches Hindernis bei der Immuntherapie von Krebs ist die geringe Immunogenizität von Tumoren, besonders im Menschen. Dies ist insofern überraschend, als die große Anzahl von genetischen Veränderungen in fortgeschrittenen Krebserkrankungen zur Entstehung von Peptid-Neoepitopen führen sollte, die im Kontext mit MHC-I-Molekülen von zytotoxischen Lymphozyten erkannt werden sollten.For an anti-tumor response to arise, two Criteria are met: First, the tumor must be new Antigens or neoepitopes that are not on normal cells occur, present. Second, the immune system be activated accordingly to access these new Antigens to respond. A major obstacle to cancer immunotherapy is low Immunogenicity of tumors, especially in humans. This is surprising in that the large number of genetic changes in advanced Cancers for the development of peptide neoepitopes that should lead in the context of MHC-I molecules of cytotoxic lymphocytes should be detected.

Für die Immuntherapie von Krebs auf zellulärer Basis wurden zwei allgemeine Strategien entwickelt: Die adoptive Immuntherapie, die sich der in vitro Expansion von tumorreaktiven Lymphozyten und deren Wiedereinführung in den Wirt bedient; andererseits die aktive Immuntherapie, welche Tumorzellen verwendet, in der Erwartung, daß damit entweder neue oder verstärkte Immunantworten gegen Tumorantigene hervorgerufen werden, die zu einer systemischen Tumorantwort führen. For cancer immunotherapy on a cellular basis Two general strategies have been developed: The adoptive immunotherapy focusing on in vitro expansion of tumor-reactive lymphocytes and their Reintroduced to the host; on the other hand the active immunotherapy, which uses tumor cells, in the expectation that either new or reinforced Immune responses to tumor antigens elicited that lead to a systemic tumor response.

Tumorvakzine auf der Grundlage der aktiven Immuntherapie wurden auf verschiedene Arten hergestellt; ein Beispiel dafür sind bestrahlte Tumorzellen, die mit Adjuvantien wie Corynebacterium parvum versetzt werden, um neue Immunreaktionen hervorzurufen.Tumor vaccine based on active Immunotherapy has been done in several ways manufactured; an example of this is irradiated Tumor cells with adjuvants such as Corynebacterium parvum be added to new immune responses to evoke.

In den letzten Jahren wurden vor allem genetisch veränderte Tumorzellen für eine aktive Immuntherapie gegen Krebs verwendet. Eine der jüngsten dieser Strategien verwendet Tumorzellen, die verschiedene Zytokine sekretieren, wobei hier nicht die Expression fremder Gene in Tumorzellen induziert wird, sondern eine Veränderung der immunologischen Umgebung der Tumorzelle angestrebt wird. Damit soll entweder die Präsentierung von tumorspezifischen Antigenen gegenüber dem Immunsystem oder die Aktivierung von tumorspezifischen Lymphozyten verstärkt werden. Eine Übersicht über diese Strategien wird von Pardoll, 1992, gegeben.The past few years have been mostly genetic modified tumor cells for active immunotherapy used against cancer. One of the youngest of these Strategies used tumor cells that are different Secretion of cytokines, but not expression foreign genes is induced in tumor cells, but a change in the immunological environment of the Tumor cell is targeted. This should either Presentation of tumor-specific antigens the immune system or the activation of tumor-specific lymphocytes are increased. A Review of these strategies is provided by Pardoll, 1992 given.

Von Tumorzellen, die genetisch verändert wurden, um große Mengen verschiedener Zytokine wie IL-2, GM-CSF zu sekretieren oder um co-stimulierende Moleküle zu exprimieren, wurde in experimentellen Tiermodellen gezeigt, daß sie starke Anti-Tumorreaktionen des Wirts auslösen (Fearon et al., 1991; Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1993). Im Gegensatz dazu könnte es beim Menschen, wenn er bereits eine beträchtliche Tumorbelastung aufweist und eine Toleranz gegen den Tumor entwickeln hat, außerordentlich schwer sein, die ganze Kaskade von komplexen Wechselwirkungen zu erfassen, die benötigt wird, um eine wirkungsvolle Anti-Tumorreaktion auszulösen. Die tatsächliche Wirksamkeit von Zytokine sekretierenden Tumorvakzinen für solche Anwendungen ist noch nicht erwiesen. From tumor cells that have been genetically modified to large amounts of various cytokines such as IL-2, GM-CSF too secrete or to co-stimulating molecules express was used in experimental animal models shown to have strong host anti-tumor responses trigger (Fearon et al., 1991; Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1993). In contrast, it could in humans if he is already a considerable one Has tumor burden and a tolerance against the Tumor development has to be extraordinarily severe whole cascade of complex interactions too capture that is needed to be an effective Trigger anti-tumor reaction. The actual Efficacy of cytokine-secreting tumor vaccines for such applications has not yet been proven.

Im Zuge der Entwicklung der adoptiven Immuntherapie wurde ein Weg gezeigt, die Immuntoleranz zu brechen, indem CTLs (zytotoxische T-Lymphozyten) gegen das tolerierte Antigen erzeugt wurden (Ohashi et al., 1991; Röcken et al., 1992).In the course of the development of adoptive immunotherapy was shown a way to break immune tolerance by using CTLs (cytotoxic T lymphocytes) against the tolerated antigen were generated (Ohashi et al., 1991; Röcken et al., 1992).

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine neue Tumorvakzine bereitzustellen, mit welcher die Immuntoleranz gegen unbekannte Tumorantigene beseitigt werden kann.The present invention was based on the object to provide a new tumor vaccine with which the Immune tolerance to unknown tumor antigens eliminated can be.

Lehmann et al., 1992, beschreiben die Induktion einer experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) in entsprechend empfänglichen Tieren durch ein Peptid des Proteins MBP ("Myelin Basic Protein"), das einem einzigen Epitop entspricht. Von den aus den behandelten Tieren isolierten MBP-reaktiven T-Zellen wurde überraschenderweise festgestellt, daß sie nicht nur das Originalpeptid erkannten, mit dem immunisiert wurde, sondern auch diverse andere vom MBP-Molekül abgeleiteten Epitope. Diese Erweiterung der Immunantwort auf neue Epitope desselben Antigenmoleküls wurde als "Epitopausweitung" ("Epitope Spreading") oder "Antigenausweitung" ("Antigen Spreading") bezeichnet. Diese Erweiterung der Primärantwort auf unbekannte Epitope findet auf Molekülebene statt. Aus diesem Befund kann abgeleitet werden, daß, sobald ein spezielles Antigen erkannt wird, auch in der Nähe befindliche Antigene mit deutlich verstärkter Effizienz in den T-Zell-Aktivierungsweg geleitet werden.Lehmann et al., 1992, describe the induction of a experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in according to susceptible animals by a peptide of Proteins MBP ("Myelin Basic Protein") that one corresponds to single epitope. Of those treated MBP-reactive T cells were isolated from animals surprisingly found that not only that Recognized the original peptide used to immunize but also various others from the MBP molecule derived epitopes. This extension of the Immune response to new epitopes from the same antigen molecule was called "epitope spreading" or "Antigen Spreading" ("Antigen Spreading") referred to. This extension of the primary response to unknowns Epitopes take place at the molecular level. For this Findings can be inferred that once a special antigen is recognized, even nearby located antigens with significantly increased efficiency are directed into the T cell activation pathway.

Ausgehend von dieser Beobachtung wurde nun zur Lösung der gestellten Aufgabe zunächst von der Überlegung ausgegangen, daß als solche "in der Nähe befindlichen" nicht nur Epitope desselben Moleküls anzusehen sind, sondern daß dazu auch andere Moleküle gehören, die von der Zelle stammen, die anfänglich erkannt wurde. Obwohl der Mechanismus des Antigen Spreading noch nicht im einzelnen aufgeklärt ist, ist die Ausweitung des Konzepts auf andere Antigen-Moleküle, die nicht vom selben Protein-Molekül, sondern von der selben Zielzelle stammen, deshalb sinnvoll, weil die Zielzelle nach ihrer Erkennung durch das Immunsystem als ganze zerstört wird und somit die ganze Zelle Antigene zur Verfügung stellt, die von APCs (Antigen Presenting Cells) aufgenommen und prozessiert werden. Es ist nicht bekannt, ob das antigenische Repertoire, das von APCs aufgenommen wird, in irgend einer Weise gesteuert wird, aber da eine große Vielfalt an potentiellen Antigenen, einschließlich Zellfragmenten, ganzen Bakterien und sogar synthetischen Partikeln, von Makrophagen aufgenommen wird, ist eine anfängliche Beschränkung des Repertoires unwahrscheinlich.Based on this observation, the solution has now been found the task first of all by considering assumed that as such "nearby" not only epitopes of the same molecule can be seen, but that this also includes other molecules that are from the cell that was initially recognized. Although the mechanism of antigen spreading is not yet im is enlightened, is the expansion of the Concept on other antigen molecules that are not from same protein molecule, but from the same Target cell originate, meaningful because the target cell once recognized by the immune system as a whole is destroyed and thus the whole cell antigens Provided by APCs (Antigen Presenting Cells) are recorded and processed. It is not known whether the antigenic repertoire developed by APCs is controlled, controlled in some way, but there is a wide variety of potential antigens, including cell fragments, whole bacteria and even synthetic particles, from macrophages is an initial limitation of the Repertoires unlikely.

Die erfindungsgemäße Lösung der gestellten Aufgabe besteht nun darin, durch Erweiterung des Antigen Spreadings auf Tumorantigene eine Anti-Tumor-Immunität in tumortoleranten Wirten dadurch zu bewirken, daß man eine im Wirt bereits existierende, gut definierte Zellantwort vom Memory-Typ auslöst und sie gegen Tumorzellen lenkt.The inventive solution to the problem consists in expanding the antigen Spreadings on tumor antigens have anti-tumor immunity in tumor-tolerant hosts by causing a well-defined one that already exists in the host Triggers cell response from the memory type and counter it Directs tumor cells.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung einer Vakzine, die inaktivierte proliferationsunfähige autologe und/oder allogene Tumorzellen enthält, welche derart modifiziert sind, daß sie ein oder mehrere Antigene enthalten, zur Behandlung von Tumoren bei Individuen, in denen bereits eine Immunantwort auf das enthaltene oder die enthaltenen Antigene existiert.The invention thus relates to the use of a Vaccine, the inactivated incapable of proliferation contains autologous and / or allogeneic tumor cells, which are modified to include one or more Contain antigens to treat tumors Individuals who already have an immune response to that contained or the contained antigens exists.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Modifikation der Tumorzellen darin, daß sie, nach Transfektion mit einer für das Antigen kodierenden DNA, das Antigen exprimieren.In a preferred embodiment, the Modification of the tumor cells in that they, according to Transfection with a DNA coding for the antigen, express the antigen.

Als Antigene sind molekulare Einheiten, z. B. komplette Proteine, Fragmente davon, Peptide, Glykolipide oder durch stereospezifische Glykosylierung modifizierte Moleküle, geeignet. Diese Moleküle werden von den Tumorzellen derart exprimiert, daß sie vom Immunsystem, insbesondere von T-Zellen oder von Immunglobulinen, erkannt werden und eine effiziente Immunantwort auslösen können. Für die vorliegende Erfindung wird der Effekt ausgenützt, daß das Immunsystem ein Erinnerungsvermögen für bereits früher wahrgenommene Antigene besitzt. Dieses Erinnerungsvermögen äußert sich auf zellulärer Ebene insbesondere dadurch, daß T-Zellen und Plasmazellen (B-Zellen) auf das erneute Auftreten des Antigens, das nun, beim wiederholten Auftreten, ein "Erkennungsantigen" darstellt, mit erhöhter Reaktivität reagieren, was zu einer raschen Ausschüttung eines erhöhten Volumens von Zytokinen, einer Beschleunigung der Proliferation der T- bzw. B- Zellen sowie einer Beschleunigung der für die Prozessierung dieser Antigene erforderlichen sekundären Reaktionen führt. Die Folge davon ist die Eliminierung des Antigens bzw. der damit assoziierten Elemente (Viren, Bakterien, Zellen) durch eine erhöhte zytolytische Aktivität und/oder Antikörperproduktion. (Die durch erneutes Auftreten des Erkennungsantigens ausgelöste Reaktion des Immunsystems wird als "Memory Response" bezeichnet.)Molecular units, e.g. B. complete Proteins, fragments thereof, peptides, glycolipids or modified by stereospecific glycosylation Molecules, suitable. These molecules are used by the Tumor cells expressed in such a way that they from the immune system, especially of T cells or of immunoglobulins, be recognized and an efficient immune response can trigger. For the present invention, the Exploited effect that the immune system Memory for those previously perceived Possesses antigens. This memory expresses at the cellular level in particular by the fact that T cells and plasma cells (B cells) on renewed Appearance of the antigen, which now, when repeated Occurrence that represents a "recognition antigen" with increased reactivity react, resulting in a rapid Release of an increased volume of cytokines, an acceleration of the proliferation of T or B Cells as well as an acceleration of for the Processing of these antigens required secondary Leads reactions. The consequence of this is elimination of the antigen or the elements associated with it (Viruses, bacteria, cells) by an increased cytolytic activity and / or antibody production. (The by the recurrence of the recognition antigen triggered immune system response is called "memory Response ".)

Mit der erfindungsgemäßen Verwendung der Tumorvakzine wird somit bewirkt, daß die schon existierenden spezifischen Memory-T-Zellen zum Immunogen, also den Tumorzellen des Vakzins, gelangen, weil diese genau das Antigen exprimieren, gegen das die spezifischen Memory-T-Zellen gerichtet sind. Dies führt zu einer wirksamen Erkennung und einer verstärkten Präsentierung nicht nur des von den Zellen aufgrund der gentechnischen Veränderung exprimierten Erkennungsantigens, sondern auch anderer Antigene, die auf den Tumorzellen vorhanden sind, also auch der Tumorantigene, was auf zellulärer Ebene eine Erweiterung einer Primärantwort, also ein Antigen Spreading, auf unbekannte Epitope, darstellt.With the use of the tumor vaccine according to the invention causes the already existing specific Memory T cells for the immunogen, i.e. the tumor cells of the Vaccine, because this is exactly the antigen express against which the specific memory T cells are directed. This leads to an effective detection and an enhanced presentation not only of the cells due to the genetic modification expressed recognition antigen, but also others Antigens that are present on the tumor cells, so also the tumor antigens, which is a cellular level Extension of a primary response, i.e. an antigen Spreading, on unknown epitopes.

Die durch die erfindungsgemäße Verwendung der Tumorvakzine im Wirt ausgelösten Vorgänge führen weiterhin dazu, daß die Re-Fokussierung der Memory-Response auf die Tumorzellen nicht nur die Toleranz des Wirts gegen den Tumor bricht, sondern auch zu einem rascheren und besser vorhersagbaren Aufbau der Anti-Tumorimmunität führt.The by the inventive use of the tumor vaccine in the host triggered processes continue to cause the Re-focusing of the memory response on the tumor cells not just the tolerance of the host to the tumor breaks, but also to a faster and better leads to predictable build-up of anti-tumor immunity.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Verwirklichung des Prinzips, das im Wirt existierende Erinnerungsvermögen an das Erkennungsantigen für die Immunabwehr von unbekannten Tumorantigenen auszunutzen, anhand eines Hybridproteins der Bezeichnung "Heat1" auf der Grundlage des hsp65-Proteins von Mycobacterium bovis BCG gezeigt. Dieses Hybridprotein wurde als Erkennungsantigen verwendet, indem ein dafür kodierendes Plasmid in Zellen der Maus-Melanomzellinie M3 transfiziert wurde, die als Tumorvakzine dient. Es konnte gezeigt werden, daß die Verabreichung einer solchen Tumorvakzine in Mäuse, die entweder mit dem ganzen BCG (Lebend-Impfstoff) oder mit dem gereinigten rekombinanten hsp65-Protein vorimmunisiert worden und somit für eine Memory-Response bereit gemacht worden waren, eine Immunität gegen anschließende Tumorsetzungen mit Wildtyp-M3-Zellen induzieren konnte. In the context of the present invention, the Realization of the principle that exists in the host Memory of the recognition antigen for the To use immune defense against unknown tumor antigens, based on a hybrid protein called "Heat1" based on the Mycobacterium hsp65 protein bovis BCG shown. This hybrid protein was called Recognition antigen used by one for this coding plasmid in cells of the mouse melanoma cell line M3 was transfected, which serves as a tumor vaccine. It could be shown that the administration of a such tumor vaccine in mice, either with the whole BCG (live vaccine) or with the purified recombinant hsp65 protein and thus made ready for a memory response were immunity to subsequent Could induce tumor placement with wild-type M3 cells.

In den durchgeführten Versuchen diente das verwendete hsp65-Hybridprotein als Prototyp eines Erkennungsantigens.In the experiments carried out the used one hsp65 hybrid protein as a prototype of a Recognition antigen.

M. bovis BCG ist ein Vertreter von Immunogenen, die eine stabile und langanhaltende, in vielen Fällen lebenslängliche, Immunität hinterlassen. In immunen Menschen kann dieser Schutz als sog. "Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ" ("delayed-type hypersensitivity reaction" DTH) charakterisiert werden. Diese Reaktion wird in erster Linie von T-Zellen des Typs Th1 (inflammatorische T-Zellen) erzeugt (Mutis et al., 1993; ElGhazali et al., 1993); eben dieses Reaktionsmuster dürfte eine Voraussetzung für eine effizienten Anti-Tumorreaktion sein (Puccetti et al., 1994). Von hsp65 des M. bovis war gezeigt worden, daß es eines der Hauptziele dieser Wirtsreaktion ist (Kaufmann, 1988; Kaufmann et al., 1987).M. bovis BCG is a representative of immunogens that a stable and long lasting, in many cases lifelong, immunity. In immune This protection can be called "Delayed Type Hypersensitivity Response" ("delayed-type hypersensitivity reaction" DTH) be characterized. This reaction is in the first place Line of T cells of type Th1 (inflammatory T cells) (Mutis et al., 1993; ElGhazali et al., 1993); this reaction pattern should be one A prerequisite for an efficient anti-tumor reaction be (Puccetti et al., 1994). From hsp65 of the M. bovis had been shown to be one of the main objectives of this Host reaction is (Kaufmann, 1988; Kaufmann et al., 1987).

Die Anwendung von Mycobakterien oder deren Derivaten wurde bereits hinsichtlich verschiedener Aspekte für diverse Tumortherapieansätze vorgeschlagen: diese Ansätze beinhalten u. a. die Anwendung verschiedener Formen von BCG als Adjuvans zwecks Verabreichung gemeinsam mit bestrahlten, lysierten oder auf andere Weise wachstumsunfähig gemachten Tumorzellen (Bloemena et al., 1993); Ansätze, die sich der Kreuzreaktivität zwischen BCG-abgeleiteten Proteinantigenen und Tumor spezifischen Antigenen bedienen; Ansätze auf der Grundlage der Transfektion eines kompletten hsp65 von M. leprae in Tumorzellen, um eine Immunantwort hervorzurufen.The use of mycobacteria or their derivatives has already been considered for various aspects of Various tumor therapy approaches proposed: these Approaches include a. the application of various Forms of BCG as an adjuvant for administration together with irradiated, lysed or others Tumor cells (Bloemena et al., 1993); Approaches to cross-reactivity between BCG-derived protein antigens and tumor operate specific antigens; Approaches on the Basis of transfection of a complete hsp65 from M. leprae in tumor cells to an immune response to evoke.

Von BCG-hsp65 wurde ferner gezeigt, daß es mit der Hepatom-Zellinie "Line 10" Antigen-Determinanten gemeinsam hat (Ahsan und Sasaki, 1991). Meerschweinchen, die mit sonikierten BCG-Membranen immunisiert worden waren, zeigten keine oder nur eine verzögerte Tumorentwicklung, wenn ihnen mit Zellen der Hepatomlinie ein Tumor gesetzt wurde. Auch zeigten T-Zellen von Ratten, die mit Lebend-BCG behandelte worden waren, eine Zytotoxizität gegen eine H-ras transformierte Fibrosarkom-Zellinie (Tamura et al., 1993); in diesem Fall erwies sich das Säugetier- Homologe hsp70 als Ziel für die Reaktion. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die aufgrund der erfindungsgemäßem Verwendung der Tumorvakzine erreichten Effekte auf anderen Mechanismen beruhen; dies äußert sich u. a. in den Vergleichsversuchen, in denen die Immunisierung von Mäusen mit BCG die Tiere dann nicht vor einer Tumorentwicklung nach Tumorsetzung mit M3-Zellen schützte, wenn der Vakzinierungsschritt mit den Heat1-transfizierten M3-Zellen ausgelassen wurde.BCG-hsp65 has also been shown to match the Hepatoma cell line "Line 10" antigen determinants has in common (Ahsan and Sasaki, 1991). Guinea pigs covered with sonicated BCG membranes immunized, showed none or only one delayed tumor development if they are treated with cells of the Hepatoma line a tumor was set. Also showed T cells from rats treated with live BCG had been cytotoxic to H-ras transformed fibrosarcoma cell line (Tamura et al., 1993); in this case the mammalian Homologous hsp70 as the target for the reaction. The in the frame results obtained by the present invention show that due to the inventive use of the tumor vaccine effects achieved are based on other mechanisms; this manifests itself u. a. in the comparative experiments, in those who immunized mice with BCG the animals then not before tumor development after tumor setting protected with M3 cells when the vaccination step omitted with the Heat1 transfected M3 cells has been.

In einem weiteren bekannten Vorschlag wurde von Tumorvakzinen in Form von isolierten hsp- Peptidkomplexen gezeigt, daß sie eine wirksame Schutzimmunität hervorrufen. Dieser Schutz ist jedoch tumorspezifisch, was zeigt, daß er nicht spezifisch für hsp als solches, sondern auf die mit hsp assoziierten Peptide zurückzuführen ist (Udono et al., 1994).Another known proposal was made by Tumor vaccines in the form of isolated hsp Peptide complexes have been shown to be effective Cause protective immunity. However, this protection is tumor specific, showing that it is not specific for hsp as such, but on those associated with hsp Peptides (Udono et al., 1994).

Heat-Shock-Proteine sind sog. molekulare "Chaperones", eine Proteinfamilie mit einem hohen Grad an speziesübergreifender Übereinstimmung. Sie wirken immunogen, vermutlich weil sie Peptide nicht-kovalent an sich binden. Von Lukacs et al., 1993, und in der WO 94/11513 wurde eine Tumorvakzine, bestehend aus Tumorzellen, die mit einem hsp oder einem anderen "Chaperone" transfiziert sind, vorgeschlagen. In diesem System dürfte die Antitumorwirkung eine direkte Folge der Chaperone-Funktion des transfizierten Proteins sein. Die "Chaperone"-Funktion ist eine Art Begleiterfunktion für andere Proteine. Im Fall von hsp65, das ein typischer Vertreter von Chaperone- Proteinen ist, dürfte die Antitumorwirkung auf die verstärkte Chaperone-Funktion für das Tumorsuppressor- Protein p53 zurückzuführen sein, die zur richtigen Faltung und Konformation von inaktivem p53 führt, wodurch dessen Verlust der Tumorsuppressorfunktion aufgehoben wird. Die von Lukacs et al., 1993, durchgeführten Versuche zeigten, daß transduzierte J774-Makrophagen-Tumorzellinien ihre tumorigene Wirkung in normalen (naiven, d. h. noch nie mit dem Antigen bzw. den Tumorzellen konfrontierten) Wirten verlieren und daß ein Inoculum aus solchen Tumorzellen in der Lage ist, auch nachfolgende Tumorsetzungen mit Wildtyp- J774-Zellen abzuwehren.Heat shock proteins are so-called molecular "chaperones", a protein family with a high degree cross-species match. they seem immunogenic, presumably because they are non-covalent peptides bind to yourself. By Lukacs et al., 1993, and in WO 94/11513 was a tumor vaccine consisting of Tumor cells with one hsp or another "Chaperones" are transfected, suggested. In this System, the antitumor effect is likely to be a direct result the chaperone function of the transfected protein his. The "chaperone" function is a kind Companion function for other proteins. In case of hsp65, which is a typical representative of chaperone Is the antitumor effect on the proteins enhanced chaperone function for the tumor suppressor Protein p53 can be attributed to the right one Folding and conformation of inactive p53 leads, causing its loss of tumor suppressor function will be annulled. That of Lukacs et al., 1993, Experiments carried out showed that transduced J774 macrophage tumor cell lines their tumorigenic effect in normal (naive, i.e. never with the antigen or the hosts facing the tumor cells) and that an inoculum from such tumor cells in the Is able to also follow-up tumor placement with wild-type Fight off J774 cells.

Von dem in der WO 94/11513 beschriebenen Vorschlag unterscheidet sich die vorliegende Erfindung dadurch, daß für die Herstellung und Anwendung der Tumorvakzine die im Wirt bereits vorhandene Immunantwort benutzt wird, indem diese gegen das von den Tumorzellen der Tumorvakzine exprimierte Antigen gerichtet wird. Daß die Voraussetzung einer existierenden Immunantwort gegeben ist, erweist sich in den durchgeführten Tierversuchen darin, daß Heat1 exprimierende M3-Tumorzellen in naiven Mäusen mit der Kinetik von Wildtyp-Zellen wachsen. Im Gegensatz zu dem von Lukacs et al., 1993, beschriebenen System ist die erfindungsgemäß verwendete Tumorvakzine nicht auf hsp65-Derivate bzw. andere Proteine mit Chaperone-Funktion beschränkt.From the proposal described in WO 94/11513 the present invention differs in that that for the manufacture and application of the Tumor vaccine already in the host existing immune response is used by this against which was expressed by the tumor cells of the tumor vaccine Antigen is targeted. That the premise of a existing immune response is shown in the animal experiments carried out in that Heat1 expressing M3 tumor cells in naive mice with the Kinetics of wild-type cells grow. Contrary to that system described by Lukacs et al., 1993 is the Tumor vaccines used according to the invention are not based on hsp65 derivatives or other proteins with chaperone function restricted.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Versuchsergebnisse zeigen anhand eines Erkennungsantigens, gegen das eine Immunantwort des Wirts bereits existiert, daß diese Immunantwort gezielt gegen Tumorzellen umgeleitet werden kann, um dem Tumorwachstum Einhalt zu gebieten. Der mit der erfindungsgemäßen Verwendung der Tumorvakzine erzielbare Schutzmechanismus unterscheidet sich von dem der Tumorvakzine des Standes der Technik: das in den Versuchen verwendete Heat1-Protein stellt aufgrund seiner Verkürzung kein hinsichtlich der Chaperone- Wirkung funktionelles hsp dar; außerdem wird es aufgrund seiner angefügten Signalsequenz und der GPI(Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol)-Link-Modifikation einem intrazellulären Biosyntheseweg zugeleitet, der sich von dem des natürlichen hsp unterscheidet.The obtained in the context of the present invention Test results show using a Detection antigen against which an immune response of the Host already exists that target this immune response against tumor cells can be redirected to the To halt tumor growth. The one with the Achievable use of the tumor vaccine according to the invention Protection mechanism differs from that of Tumor vaccine of the prior art: that in the Try used Heat1 protein due to its shortening none with regard to the chaperone Effect functional hsp; besides, it will due to its attached signal sequence and the GPI (glycosyl phosphatidyl inositol) link modification an intracellular biosynthetic pathway that differs from that of the natural hsp.

Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich vom Stand der Technik vor allem hinsichtlich des ihr zugrunde liegenden Prinzips und der Wirkungsweise der Vakzine hsp65 von BCG wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung stellvertretend für andere Erkennungsantigene daraufhin untersucht, ob der Mechanismus der Umleitung der Memory-Response auf Tumorzellen und die dadurch vom Wirtsorganismus ausgelösten Abwehrmechanismen gezielt für ein neuartiges Anwendungsprinzip für die Tumortherapie genutzt werden kann.The present invention differs from State of the art above all regarding the underlying principle and the The BCG vaccine hsp65 was used in the present invention representative of others Detection antigens are then examined to determine whether the Mechanism of redirection of the memory response Tumor cells and therefore the host organism triggered defense mechanisms targeted for a novel application principle for tumor therapy can be used.

Aufgrund der Tatsache, daß weite Teile der Weltbevölkerung gegen verschiedene Pathogene geimpft sind, davon ca. 40% mit BCG (Aldovini und Young, 1991), kann die vorliegende Erfindung als allgemeine Strategie für die Immuntherapie von Tumorerkrankungen breit angewendet werden. Neben hsp65 bzw. Fragmenten oder Derivaten davon sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche Proteine bzw. Fragmente als Erkennungsantigene (bzw. die dafür kodierenden Sequenzen) zur Herstellung der Tumorvakzine geeignet, für die eine entsprechende Memory-Response in dem zu behandelnden Organismus vorhanden ist.Due to the fact that large parts of the World population vaccinated against various pathogens 40% with BCG (Aldovini and Young, 1991), the present invention can be general Strategy for immunotherapy of tumor diseases be widely applied. In addition to hsp65 or fragments or derivatives thereof are within the scope of the present Invention all proteins or fragments as Recognition antigens (or the coding for them Sequences) suitable for the production of the tumor vaccine, for which a corresponding memory response in the treating organism is present.

Bezüglich der Eignung eines Erkennungsantigen für die Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind vor allem die folgenden Parameter zu berücksichtigen:With regard to the suitability of a recognition antigen for the Applications in the context of the present invention are proposed all the following parameters to consider:

1. The antigen must be good from the host's immune system be recognized. It is advantageous if the pre-existing immune response as a cellular response in the form of memory T lymphocytes or in the form of a DTH Protection exists. The immune response can, however also express in the form of antibodies to the antigen, provided in the host for the detection of the antigen correspondingly high titer is present.
2. It is beneficial if methods, in particular suitable immunoassays are available with which can be determined whether the host has immunity to which has recognition antigen.
3. It should, in the event that the antigens are not considered such, but rather the coding DNA molecules are used, at least a partial sequence of the Recognition antigen already known (or that Antigen identified and purified to the extent possible To determine partial sequences), with which the production of Vectors and thus its expression on the for the Tumor vaccine used cells is enabled. Such antigens are among the easiest Derivatives of common human pathogens found be long-term "memory" after natural Infections or after immunizations, in particular Vaccinations.

Für die Anwendung der Erfindung auf größere Patientenkollektive wird somit in der Praxis zweckmäßig so vorgegangen, daß die zu behandelnden Patienten darauf getestet werden, ob sie eine Immunantwort auf ein vorher definiertes Antigen, ein Pathogen, aufweisen, z. B. ob sie gegen BCG, Tetanus, Röteln, Masern, Hepatitis B, Herpes, Influenza, etc. immun sind. Für diese und andere Infektionskrankheiten sind diagnostische Tests auf der Grundlage immunologischer Methoden, z. B. ELISA-Tests, bekannt und werden routinemäßig angewandt; ein Beispiel dafür ist der Tuberkulintest.For the application of the invention to larger patient groups is thus in the Practice appropriately proceeded so that the to treating patients are tested for whether they an immune response to a previously defined antigen, a pathogen, e.g. B. whether they are against BCG, Tetanus, rubella, measles, hepatitis B, herpes, Influenza, etc. are immune. For this and others Infectious diseases are diagnostic tests on the Basis of immunological methods, e.g. B. ELISA tests, known and routinely applied; an example that's what the tuberculin test is for.

Eine mögliche Anwendungsstrategie kann darin bestehen, beim einzelnen Patienten individuell hergestellte Tumorvakzine auf der Grundlage der bei diesem Patienten individuell festgestellten Immunität gegen bestimmte Antigene einzusetzen; d. h. daß die für die Herstellung der Tumorvakzine verwendeten Antigene von den Pathogenen abgeleitet sind, gegen die der Patient immun ist.A possible application strategy can be individually manufactured for each patient Tumor vaccine based on that in this patient individually determined immunity to certain Use antigens; d. H. that the for manufacturing of the tumor vaccine used antigens from the Pathogens are derived from which the patient is immune is.

Eine alternative Strategie geht davon aus, entsprechend der statistischen Verteilung, die eine größere Bevölkerungsgruppe hinsichtlich der Immunität gegen verschiedene Pathogene aufweist, eine für diese Bevölkerungsgruppe einheitliche Tumorvakzine zu verwenden. Eine solche Tumorvakzine exprimiert dann ein Gemisch von Antigenen, die diese Verteilung abdeckt.An alternative strategy assumes accordingly the statistical distribution, which is a larger one Population group with regard to immunity to has different pathogens, one for them Population group uniform tumor vaccine too use. Such a tumor vaccine then expresses one Mixture of antigens that covers this distribution.

Die Voraussetzung für die vorliegende Erfindung, daß die zu behandelnden Patienten eine Immunität gegen das von den Tumorzellen der Tumorvakzine exprimierte Antigen aufweisen müssen, stellt für die Praxis keine Beschränkung dar. Aufgrund der vielfachen Kontakte mit Pathogenen, denen ein Mensch im Laufe seines Lebens ausgesetzt ist, existiert ein breites Spektrum von Antigenen, die für die Tumorvakzine in Frage kommen; es ist somit zu erwarten, daß praktisch die gesamte Bevölkerung auf diese Weise therapierbar ist.The prerequisite for the present Invention that the patient to be treated Immunity to that from the tumor cells of the Tumor vaccine must have expressed antigen, is not a limitation in practice of the multiple contacts with pathogens, the one Human being exposed throughout his life exists a wide range of antigens for the Tumor vaccines come into question; it can therefore be expected that practically the entire population in this way is treatable.

Für einige Anwendungen, z. B. wenn beim Patienten aufgrund seines schlechten Immunstatus keine ausreichend starke Memory-Response zu erwarten ist, können dem Patienten als unterstützende Maßnahme allogene Zellen, die anstelle der wirtseigenen Zellen die Funktion der Memory-Zellen übernehmen, verabreicht werden, z. B. vor oder gleichzeitig mit der erfindungsgemäß verwendeten Tumorvakzine bzw. in Mischung damit. Als allogene Memory-Zellen sind z. B. die in der GB-A 2230790 beschriebenen geeignet.For some applications, e.g. B. when the patient due to its poor immune status, none sufficiently strong memory response is to be expected can be used as a supportive measure by the patient allogeneic cells instead of the host's own cells take over the function of the memory cells be, e.g. B. before or simultaneously with Tumor vaccine used according to the invention or in a mixture with it. As allogeneic memory cells z. B. in the GB-A 2230790 described suitable.

Beispiele für Vertreter geeigneter Antigene sind das Membranprotein LMP des Epstein-Barr-Virus (Trivedi et al., 1991), Influenza-Nucleoproteine (Bowness et al., 1994; DiBrino et al., 1993), Tetanustoxin-Fragmente (Valmori et al., 1994; Reece et al., 1993), Adenovirus- Hüllprotein, bzw. Fragmente davon (Grunhaus et al., 1994; Hermiston et al., 1993), Hepatitis B-Virus- Antigen (Folgori et al., 1994; Lo Man et al., 1993), ein 10 kDa Protein von Mycobakterium tuberculosis (Barnes et al., 1992), Herpes simplex Virusantigene (Bonneau et al., 1993), oder Cytomegalovirusantigene (Berencsi et al., 1993).These are examples of representatives of suitable antigens Membrane protein LMP of the Epstein-Barr virus (Trivedi et al., 1991), influenza nucleoproteins (Bowness et al., 1994; DiBrino et al., 1993), tetanus toxin fragments (Valmori et al., 1994; Reece et al., 1993), Adenovirus Coat protein, or fragments thereof (Grunhaus et al., 1994; Hermiston et al., 1993), Hepatitis B virus Antigen (Folgori et al., 1994; Lo Man et al., 1993) 10 kDa protein from Mycobacterium tuberculosis (Barnes et al., 1992), herpes simplex virus antigens (Bonneau et al., 1993), or cytomegalovirus antigens (Berencsi et al., 1993).

Bezüglich der Größe der Moleküle besteht grundsätzlich keine Beschränkung, sofern der für den DNA-Transfer in die Zelle verwendete Vektor die Insertion großer Abschnitte erlaubt; eine etwaige Größenbeschränkung kann somit lediglich gegebenenfalls durch das im einzelnen verwendete Gentransfersystem bedingt sein, z. B. im Falle der Anwendung retroviraler Vektoren, die die Insertion einer Fremdsequenz von nur etwa maximal 7-10 kD erlauben.The size of the molecules basically exists no restriction, provided that for the DNA transfer in the cell used large insertion vector Sections allowed; any size limit can therefore only if necessary through the individual gene transfer system used, e.g. B. in the case of the application of retroviral vectors, the the insertion of a foreign sequence of only about maximum Allow 7-10 kD.

Für die Transfektion der Tumorzellen können komplette cDNAs, die für ein Protein eines pathogenen Organismus kodieren, verwendet werden, wie Bakterien- oder Virusproteine, insbesondere Viruskapsidproteine (Marrack und Kappler, 1994). Es sind generell u. a. alle diejenigen Proteine geeignet, die auch für Impfungen gegen Infektionskrankheiten verwendet werden. Zahlreiche dieser Proteine wurden bereits kloniert und sind auf rekombinantem Weg herstellbar (vgl. oben). Neben den kompletten cDNAs können DNA-Fragmente verwendet werden, die für Antigene kodieren, wobei die Größenbeschränkung nach unten dadurch gegeben ist, daß eine MHC-Präsentation oder eine Antikörpererkennung der exprimierten Antigene erfolgen muß, was im allgemeinen bei einer Größe von mindestens 8 Aminosäuren gegeben ist. Im Falle der Verwendung von Fragmenten werden vorzugsweise solche Sequenzabschnitte eingesetzt, die für Epitope kodieren. Es sind Methoden verfügbar, von immunogenen Proteinen die epitopen Regionen zu charakterisieren und somit die Voraussetzung für die Verwendung von Epitopen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu schaffen (Folgori et al., 1994). Bevorzugt werden für eine Tumorvakzine mehrere Fragmente eingesetzt; die verwendeten Mischungen können verschiedene Epitope desselben Proteins sein oder auch aus jeweils einem oder mehreren Epitopen verschiedener Proteine bestehen.For the transfection of the tumor cells, complete cDNAs representing a protein of a pathogenic organism encode, are used, such as bacterial or Virus proteins, especially virus capsid proteins (Marrack and Kappler, 1994). It is generally u. a. all those proteins also suitable for vaccinations against infectious diseases. Many of these proteins have already been cloned and can be produced by recombinant means (see above). In addition to the complete cDNAs, DNA fragments are used which code for antigens, the Downward size limitation is given by the fact that an MHC presentation or an antibody detection of the expressed antigens must be done in general given a size of at least 8 amino acids is. In case of using fragments preferably used such sequence sections encode for epitopes. Methods are available from immunogenic proteins to the epitope regions characterize and thus the prerequisite for Use of epitopes in the context of the present To create invention (Folgori et al., 1994). Prefers are several fragments for a tumor vaccine used; the mixtures used can different epitopes of the same protein from one or more epitopes each different Proteins exist.

Außer den für die natürlichen Proteine (bzw. Fragmente davon) kodierenden Sequenzen können auch Sequenzabschnitte für die Transfektion der Tumorzellen verwendet werden, die Mutationen aufweisen. Derartige Mutationen, die im Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren und/oder in Deletionen bestehen, dienen vor allem der Erhöhung der Stabilität des exprimierten Antigens, indem z. B. dessen Abbau in der Tumorzelle verlangsamt wird, oder der Verstärkung der Affinität des Antigens zum immunogenen Reaktionspartner.Except for those for the natural proteins (or fragments thereof) coding sequences can also Sequence sections for the transfection of the tumor cells can be used which have mutations. Such Mutations in exchange of one or more Amino acids and / or deletions are used all of increasing the stability of the expressed Antigen by e.g. B. its breakdown in the tumor cell is slowed down, or increasing affinity of the antigen to the immunogenic reactant.

Eine aufgrund der Mutation erzielte Verbesserung der Wirkung kann in Vergleichsversuchen getestet werden, indem z. B. nach Random-Mutation natürlicher Antigen- Sequenzen die erhaltenen Mutanten in Tumorzellen transfektiert und die erzielte Schutzwirkung mit der der natürlichen Antigene verglichen wird.An improvement in the result of the mutation Effect can be tested in comparative tests by z. B. after random mutation of natural antigen Sequences the mutants obtained in tumor cells transfected and the protective effect achieved with the the natural antigens is compared.

Eine weitere Modifikation der antigenen Sequenzen kann darin bestehen, Signal- bzw. regulative Sequenzen anzufügen, die im Hinblick auf die Erkennung des Antigens dessen möglichst vorteilhafte Präsentation fördern. Bei derartigen Signal- bzw. regulativen Sequenzen handelt es sich um natürliche oder von natürlichen Sequenzen abgeleitete, die normalerweise die Synthese und den Transport von zellulären Proteinen steuern, z. B. die GPI-Link-Sequenz (Powell et al., 1991; Chan et al., 1991; Robinson et al., 1991), die Signalsequenz von HSA oder die Insertion-Signalsequenz (Minev et al., 1994; Bacik et al., 1994).Another modification of the antigenic sequences can consist of signal or regulatory sequences add that with a view to the detection of the Antigen's most advantageous presentation promote. With such signal or regulative Sequences are natural or of derived natural sequences that normally the synthesis and transport of cellular proteins taxes, e.g. B. the GPI link sequence (Powell et al., 1991; Chan et al., 1991; Robinson et al., 1991), the Signal sequence from HSA or the insertion signal sequence (Minev et al., 1994; Bacik et al., 1994).

Die Expression des Erkennungsantigens durch die Tumorzelle bewirkt entweder, daß dieses als solches direkt an der Zelloberfläche präsentiert wird (dies ist insbesondere bei Antigenen der Fall, die von Antikörpern erkannt werden), oder daß es innerhalb der Zelle prozessiert wird und ein Fragment davon an der Zelloberfläche mittels MHC- bzw. HLA-Molekülen präsentiert wird. Expression of the recognition antigen by the Tumor cell either causes this as such is presented directly on the cell surface (this is particularly the case with antigens produced by Antibodies are recognized), or that it is within the Cell is processed and a fragment of it on the Cell surface using MHC or HLA molecules is presented.

Die Verabreichung von Antigen-Mischungen ist von Vorteil, insbesondere um die erste Erkennung der Tumorvakzine durch den Wirt zu verstärken bzw. im Hinblick auf die Anwendung auf breitere Bevölkerungsschichten.The administration of antigen mixtures is from Advantage, especially for the first detection of the To reinforce tumor vaccine by the host or in Terms of application to wider Strata of the population.

Vorzugsweise wird die Auswahl einer geeigneten Kombination von Erkennungsantigenen im Hinblick auf die Anwendung an einem Patienten, von dem man eine bereits gegen diese Antigene existierende Immunantwort von vornherein kennt bzw. diese vor Anwendung der Tumorvakzine bestimmt getroffen. Zweckmäßigerweise liegt für die erfindungsgemäß verwendete Tumorvakzine eine Auswahl von Antigenen in Form von gereinigten Plasmiden vor, die die jeweils dafür kodierende Sequenz enthalten.Preferably the selection of an appropriate one Combination of recognition antigens with regard to the Use on a patient from whom one is already immune response of these antigens from knows in advance or this before using the Tumor vaccine definitely hit. Conveniently is one for the tumor vaccine used according to the invention Selection of antigens in the form of purified plasmids the sequence coding for it contain.

Für die Transfektion der Tumorzellen können die für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen bekannten Standardmethoden verwendet werden, zu denen der Gentransfer mittels viraler Vektoren (Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus) oder physikalische Methoden (Transfektion mittels kationischer Peptide) zählen; Übersichten über gebräuchliche Methoden werden z. B. von Mitani und Caskey, 1993; Jolly, 1994; Vile und Russel, 1994; Tepper und Mule, 1994; Zatloukal et al., 1993, gegeben.For the transfection of the tumor cells, those for the Known transfection of higher eukaryotic cells Standard methods are used to which the Gene transfer using viral vectors (retrovirus, Adenovirus, adeno-associated virus) or physical methods (transfection by means of cationic peptides) count; Overviews of Common methods are e.g. B. from Mitani and Caskey, 1993; Jolly, 1994; Vile and Russel, 1994; Tepper and Mule, 1994; Zatloukal et al., 1993.

Ein bevorzugtes Verfahren für die Transfektion der Tumorzellen beruht auf der Grundlage der in der WO 93/07283 beschriebenen Methode, die auch auf die Herstellung von Tumorvakzinen anwendbar ist. Auf die Offenbarung der WO 94/21808 wird diesbezüglich Bezug genommen. Diese Methode benutzt ein Konjugat aus einem Liganden für die Zielzelle und einer Substanz mit Bindungsfähigkeit an die DNA, insbesondere einem Polykation wie Polylysin, und beruht auf rezeptorvermittelter Endozytose des Konjugat/DNA- Komplexes, wobei außerdem ein Mittel vorgesehen ist, das die Freisetzung des in die Zelle importieren Komplexes aus den Endosomen erleichtert, insbesondere ein inaktiviertes Adenovirus.A preferred one Procedure for transfection of tumor cells is based on the basis of those described in WO 93/07283 Method that also applies to the manufacture of tumor vaccines is applicable. The disclosure of WO 94/21808 referenced in this regard. This method uses a Conjugate of a ligand for the target cell and one Substance with binding ability to the DNA, in particular a polycation such as polylysine, and is based on receptor-mediated conjugate / DNA endocytosis Complex, which also provides a means which the release of the import into the cell Facilitated complexes from the endosomes, in particular an inactivated adenovirus.

Diese Methode ermöglicht die besonders flexible Anwendung der Erfindung, indem für einzelne Tumorvakzinierungen auf einfache Weise individuell, z. B. mit mehreren Erkennungsantigen-Sequenzen, transfizierte Tumorzellen verwendet werden. Dafür werden z. B. aus einem Vorrat von Plasmiden, die jeweils ein oder mehrere verschiedene für ein Erkennungsantigen kodierende Sequenzen enthalten, das bzw. die jeweils gewünschten ausgewählt, mit geeigneten Konjugaten, z. B. Transferrin-Polylysin-Konjugaten und Adenovirus- Polylysin-Konjugaten, komplexiert und die Tumorzellen mit den so erhaltenen Transfektionskomplexen inkubiert.This method enables the particularly flexible Application of the invention by for individual Tumor vaccinations in a simple way individually, e.g. B. with several recognition antigen sequences, transfected tumor cells can be used. Therefore z. B. from a stock of plasmids, each one or more different for a recognition antigen contain coding sequences, the or each desired selected, with suitable conjugates, e.g. B. Transferrin-polylysine conjugates and adenovirus Polylysine conjugates, complexed and the tumor cells incubated with the transfection complexes thus obtained.

Für die Herstellung geeigneter Vektoren steht eine große Auswahl von Standardplasmiden (s. z. B. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2. Auflage) zur Verfügung; diese müssen für die Eignung zur Herstellung der Tumorvakzine lediglich die an Vektoren generell gestellten Anforderungen erfüllen, daß sie geeignete Promotoren aufweisen, die eine effiziente Expression des Erkennungsantigens in der Wirtszelle ermöglichen; zweckmäßigerweise enthalten sie außerdem für die Züchtung in Bakterien erforderliche Sequenzen, wie Selektionsmarker.One stands for the production of suitable vectors large selection of standard plasmids (see e.g. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2nd edition) available; these must be suitable for the manufacture of the tumor vaccine only those generally made on vectors Meet requirements that they have suitable promoters have an efficient expression of Enable recognition antigen in the host cell; expediently they also contain for Breeding sequences required in bacteria, such as Selection marker.

Im Falle der Anwendung von Peptiden als Erkennungsantigene ist es auch möglich, statt die Zellen mit der kodierenden DNA zu transfizieren, die Peptide als solche in die Zellen einzubringen, was z. B. durch einfache Ko-Inkubation der Zellen mit den Peptiden ("in vitro loading") erzielt werden kann.In the case of using peptides as It is also possible to use recognition antigens instead of cells to transfect with the coding DNA, the peptides as such to introduce into the cells what z. B. by simple co-incubation of the cells with the peptides ("in vitro loading ") can be achieved.

Die Tumorzellen der erfindungsgemäß verwendeten Tumorvakzine sind autologe (patienteneigene) und/oder allogene Zellen. Allogene Tumorzellen (aus Tumorzellinien) können verwendet werden, sofern die auf ihnen vorhandenen Antigene zumindest teilweise mit denen der autologen Tumorzellen des Patienten übereinstimmen. Beispiele für allogene Zellen, die als Grundlage für die Tumorvakzine dienen können, sind z. B. in der WO 91/06866 und in der US-A 5,030,621, beschrieben.The tumor cells of the tumor vaccine used according to the invention are autologous (patient's own) and / or allogeneic cells. Allogeneic tumor cells (from tumor cell lines) can can be used, provided that they are on them Antigens at least partially with those of the autologous The patient's tumor cells match. examples for allogeneic cells as the basis for the Tumor vaccines can serve, for. B. in WO 91/06866 and in US-A 5,030,621, described.

Die Tumorzellen werden inaktiviert, und zwar derart, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression des Antigens ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren.The tumor cells are inactivated, in such a way that while maintaining their ability to Expression of the antigen their ability to divide to lose.

Die Isolierung, Züchtung, Transfektion, Inaktivierung der Zellen, sowie gegebenenfalls die Formulierung der Tumorzellen mit geeigneten Hilfs- und Trägerstoffen, wird nach bekannten Methoden vorgenommen; bezüglich autologer Zellen wird insbesondere auf die Offenbarung der WO 94/21808 verwiesen.Isolation, breeding, transfection, inactivation the cells, and where appropriate the formulation of the Tumor cells with suitable auxiliaries and carriers, is carried out according to known methods; in terms of autologous cells will focus in particular on the revelation referred to in WO 94/21808.

Der Anteil der modifizieren Zellen an der Gesamtzahl der Zellen kann variiert werden, vorzugsweise beträgt er mindestens etwa 10%.The proportion of modified cells in the total number the cells can be varied, preferably is he at least about 10%.

Das Erkennungsantigen wird von der Tumorzelle in einer Menge exprimiert und präsentiert, die einem ausgewogenen Verhältnis zwischen Erkennungsantigen und den auf der Zelle von vornherein enthaltenen Tumorantigenen entspricht, wodurch gewährleistet ist, daß, im Zuge der Memory-Response auf das Erkennungsantigen, die Tumorantigene miterkannt werden. Diese Menge kann z. B. mittels Serienversuchen festgelegt werden, in denen die Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen oder z. B. mit unterschiedlichen Vektoren, die eine verschieden starke Expression ermöglichen, transfiziert werden.The recognition antigen is generated by the tumor cell in one Quantity expressed and presented to you balanced relationship between recognition antigen and the one contained in the cell from the start Corresponds to tumor antigens, which ensures that, in the course of the memory response to the Recognition antigens, which are also recognized as tumor antigens. This amount can e.g. B. by means of series tests be set in which the cells under different conditions or z. B. with different vectors that have different strengths Allow expression to be transfected.

Die erfindungsgemäß verwendete Tumorvakzine kann gegebenenfalls mit zusätzlichen immunstimulierenden Maßnahmen kombiniert werden. Eine derartige Maßnahme kann darin bestehen, immunstimulierende Proteine, z. B. Zytokine, wie Interleukin-2, TNF-α, IFN-γ, etc. zuzusetzen und/oder die Tumorvakzine in Form einer Mischung von Tumorzellen, die das Erkennungsantigen exprimieren, mit anderen, ein oder mehrere immunstimulierende Proteine produzierenden Tumorzellen, wie sie z. B. in der WO 94/21808 beschrieben sind, oder Fibroblasten, zu verwenden.The tumor vaccine used according to the invention can optionally with additional immunostimulating measures be combined. Such a measure can be included consist of immunostimulating proteins, e.g. B. cytokines, such as interleukin-2, TNF-α, IFN-γ, etc. and / or the tumor vaccine in the form of a mixture of Tumor cells expressing the recognition antigen with other, one or more immunostimulating proteins producing tumor cells, as z. B. in WO 94/21808 described, or fibroblasts, too use.

Figure overview

Fig. 1: Expression von Heat1 auf transfizierten COS-7- Zellen, Fig. 1: Expression of Heat1 on transfected COS-7 cells,

Fig. 2: Western Blot von Heat-Shock-Protein-Derivaten, FIG. 2: Western blot of heat shock protein derivatives,

Fig. 3: Hemmung des Tumorwachstums durch M3-Zellen, die Heat1 exprimieren, Fig. 3: Inhibition of tumor growth by M3 cells expressing Heat1,

Fig. 4: Verlust der Tumorigenizität von Wildtyp-M3- Zellen in vorimmunisierten und mit Heat1 exprimierenden M3-Zellen behandelten Versuchstieren, Fig. 4: Loss of tumorigenicity of wild-type M3 cells in pre-immunized with and expressing Heat1 M3 cells treated animals,

Fig. 5: Immunhistologischer Nachweis der Beteiligung von T-Zellen an der Reaktion auf die Tumorvakzine. Fig. 5: Immunohistochemical proof of the involvement of T cells in the response to the tumor vaccine.

Um die prototypische Funktion des Antigen-Targeting von der der natürlichen Immunogenizität zu unterscheiden und um eine rasche Kontrolle der Qualität der Transfektionen mittels FACS-Analyse zu ermöglichen, wurde für die folgenden Beispiele, die die Erfindung illustrieren, als Erkennungsantigen stellvertretend ein Hybridmolekül, enthaltend ein verkürztes hsp65, das mit der Zelloberflächenmembran über ein GPI-Link verbunden ist, konstruiert.To the prototypical function of the antigen targeting of to distinguish that of natural immunogenicity and to quickly control the quality of the Enable transfections using FACS analysis, was for the following examples that illustrate the invention illustrate, as a recognition antigen representative Hybrid molecule, containing a truncated hsp65, the with the cell surface membrane connected via a GPI link is constructed.

example 1 a) Construction of the plasmid pHeat1, coding for the BCGhsp65 / HSA hybrid protein

Zur Herstellung des Expressionsvektors wurde in den Vektor pCDNA1 (Invitrogen) eine cDNA inseriert, die der Reihe nach für die folgenden Regionen kodierte: i) die Signalpeptidregion des Maus-HSA ("heat stable antigen") (Kay et al., 1990); ii) die Sequenz, kodierend für die Aminosäuren 30 bis 480 des BCG-hsp65-Proteins; iii) die GPI-Link-Attachment und Austauschsignalregion des Maus- HSA. Diese Sequenzen wurden wie folgt erhalten:The expression vector was produced in the Vector pCDNA1 (Invitrogen) inserts a cDNA that the Coded sequentially for the following regions: i) the Mouse HSA (heat stable antigen) signal peptide region (Kay et al., 1990); ii) the sequence coding for the Amino acids 30 to 480 of the BCG hsp65 protein; iii) the GPI link attachment and exchange signal region of the mouse HSA. These sequences were obtained as follows:

i) with presentation of the plasmid pAX111, a PCR Reaction with the primers 5′-TACGACTCACTATAGGGAGACCGG-3 ′ and 5′-GGCCCGGGCCCGGAGCAACAGCTGTTTG-3 ′ and the reaction products obtained with HindIII and ApaI digested;
ii) was obtained by digesting the plasmid pRIB1300 (Thole et al., 1987) with ApaI and AccI;
iii) PCR product of primers 5'- GCTCTAGAGTCTACAGAGGGGGTGGCAGCTCC-3 ′ and 5′- GCTCTAGAATTCTCCGTGTTTCTGTT-3 ′ (upon presentation of the Plasmids pAX111) cut with XBaI and EcoRI.

Die Fragmente i) und iii) wurden getrennt in pUC19 (Pharmacia) subkloniert, die ein Insert enthaltenden Plasmide wurden mittels Restriktionsanalyse identifiziert und Fragment i) mit HindIII/ApaI- und Fragment iii) mit AccI und EcoRI-Verdau freigesetzt. Die isolierten drei Fragmente wurden in ein HindIII/EcoRI geschnittenes und gereinigtes pUC19- Plasmid hineinligiert; Klone mit der korrekten Reihenfolge i → ii → iii mittels enzymatischem Verdau bestätigt und unter der Kontrolle des CMV/T7-Promotors (Boshart et al., 1985) in den Expressionsvektor pCDNA1 überführt. Der Vektor pHeat2 wurde erhalten, indem ein EcoRI/Sali-Fragment des Plasmids pRIB1300, das die komplette kodierende Sequenz von hsp65 enthält, in pCDNA1 überführt wurde. Die Struktur der beiden Konstrukte wurde mittels Sequenzanalyse bestätigt.Fragments i) and iii) were separated into pUC19 (Pharmacia) subcloned, containing an insert Plasmids were analyzed using restriction analysis identified and fragment i) with HindIII / ApaI and Fragment iii) released with AccI and EcoRI digestion. The isolated three fragments were put into one HindIII / EcoRI cut and cleaned pUC19 Plasmid ligated into; Clones with the correct one Sequence i → ii → iii using enzymatic digestion confirmed and under the control of the CMV / T7 promoter (Boshart et al., 1985) into the expression vector pCDNA1 transferred. The vector pHeat2 was obtained by a EcoRI / Sali fragment of plasmid pRIB1300, which the contains complete coding sequence of hsp65, in pCDNA1 was transferred. The structure of the two Constructs were confirmed by sequence analysis.

b) Characterization of the recombinant proteins

Zellen der Maus-Melanomzellinie Cloudman S91 (Klon M3; ATCC No. CCL 53.1; Zatloukal et al., 1995) bzw. COS-7- Zellen (ATCC CRL1651) wurden in 6 cm Plastikschalen oder T25 Kulturflaschen, beschichtet mit 0.1% Gelatine, in DMEM-Medium, enthaltend 10% FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet und anschließend transfiziert.Cells of the mouse melanoma cell line Cloudman S91 (clone M3; ATCC No. CCL 53.1; Zatloukal et al., 1995) or COS-7 cells (ATCC CRL1651) were placed in 6 cm plastic dishes or T25 culture bottles, coated with 0.1% gelatin, grown in DMEM medium containing 10% FCS, 2 mM glutamine and antibiotics and then transfected.

Die Transfektion der Zellen mit dem Vektor pHeat1 wurde mittels der als "Adenovirus-unterstützten Transferrinfektion" bezeichneten Methode transfiziert (Cotten et al., 1992). Die Transfektionskomplexe wurden hergestellt, indem zunächst biotinyliertes, 8-Methoxypsoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl 1014 in 100 µl HBS (1.2 × 10¹² Partikel pro ml) mit streptavidinyliertem Polylysin 290 (StreptpL) in 100 µl HBS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Daraufhin wurden 6 µg Plasmid-DNA in 150 µl HBS beigegeben, gut gemischt und weitere 30 min inkubiert wurde. Dann wurde Polylysin-modifiziertes humanes Transferrin (TfpL) in 150 µl HBS beigegeben, gründlich gemischt und 30 min inkubiert.The transfection of the cells with the vector pHeat1 was carried out by means of the "adenovirus-supported Transferrinfektion "designated method transfected (Cotten et al., 1992). The transfection complexes were manufactured by first biotinylated, 8-methoxypsoralen / UV inactivated adenovirus dl 1014 in 100 µl HBS (1.2 × 10¹² particles per ml) with streptavidinylated polylysine 290 (StreptpL) in 100 µl HBS mixed and incubated for 30 min at room temperature has been. Then 6 ug plasmid DNA in 150 ul HBS added, mixed well and incubated for a further 30 min has been. Then polylysine-modified human Transferrin (TfpL) in 150 µl HBS added, thoroughly mixed and incubated for 30 min.

3 ô 10⁵ Zellen wurden mit Komplexen behandelt, die 3 × 10⁹ Adenoviruspartikel dl1014, 600 ng StreptpL, 6 µg pCMVL und 6.8 µg TfpL enthielten. Nach der Transfektion wurde das Kulturmedium gewechselt, und die Zellen wurden vor der Weiterverwendung 24 h stehen gelassen.3 × 10 × cells were treated with complexes that 3 × 10⁹ adenovirus particles dl1014, 600 ng streptpL, 6 µg pCMVL and 6.8 µg TfpL contained. After The culture medium was changed and the transfection Cells were left for 24 hours before further use calmly.

Dann wurden die Zellen unter Verwendung der von Zatloukal et al., 1995, beschriebenen Methode (FACS- Analyse, "Fluorescence Activated Cell Scanning") mit Antikörpern der Bezeichnung IIH9, IVD8, CBA1, HAT5, IIC8 ( es handelt es sich um kreuzreaktive monoklonale Antikörper gegen M. leprae oder M. tuberculosis (Young et al., 1.992); die Antikörper wurden bezogen von Hansen Disease Laboratories, CDC, Atlanta, GA.), J11d (ATCC Nr. TIB 183) sowie polyklonalem anti-BCG-Serum (Dako) gefärbt.Then the cells were removed using the of Zatloukal et al., 1995, described method (FACS- Analysis, "Fluorescence Activated Cell Scanning") with Antibodies of the designation IIH9, IVD8, CBA1, HAT5, IIC8 (it is cross-reactive monoclonal Antibodies against M. leprae or M. tuberculosis (Young et al., 1,992); the antibodies were obtained from Hansen Disease Laboratories, CDC, Atlanta, GA.), J11d (ATCC No. TIB 183) and polyclonal anti-BCG serum (Dako) colored.

Andererseits wurden die Expressionsprodukte im Western- Blot nachgewiesen.On the other hand, the expression products were Blot detected.

i) Characterization in COS-7 cells

Das Heat1-Hybridprotein in COS-7-Zellen exprimiert, weil diese Zellen durch episomale Replikation des Vektors eine hohe Expression erlauben (Simmons, 1993). The Heat1 hybrid protein expressed in COS-7 cells because these cells are replicated by episomal Vectors allow a high expression (Simmons, 1993).

Das GPI-Austauschmotiv am N-Terminus des Konstrukts ergibt ein Endprodukt mit einer GPI-Verankerung, die gegen ein Protein auf der äußeren Oberfläche der Zellmembran gerichtet ist und daher eine Identifizierung von positiven Zellen mittels FACS- Analyse erlaubt. Das Ergebnis der Charakterisierung mit den diversen Antikörpern gegen Mitglieder der 65 kDa Heat Shock-Proteinfamilie aus verwandten Mykobakterien, die verwendet wurden, um das gereinigte rekombinante hsp65 und das Heat1-Protein zu erkennen, ist in Tab. I dargestellt.The GPI exchange motif at the N-terminus of the construct gives a final product with a GPI anchor that against a protein on the outer surface of the Cell membrane is directed and therefore a Identification of positive cells using FACS Analysis allowed. The result of the characterization with the various antibodies against members of the 65 kDa Heat shock protein family from related mycobacteria, which were used to make the purified recombinant hsp65 and the Heat1 protein can be seen in Table I shown.

Die Expression von Heat1 auf transfizierten COS-7- Zellen ist in Fig. 1 dargestellt: In der Figur zeigen die Tafeln a, b und c die Expression in COS-Zellen, die mit dem Plasmid pAX111, das die für Maus-HSA kodierende Sequenz enthielt, transfiziert waren; die Figuren d, e und f zeigen die entsprechenden Versuche mit pHeat1. Die Ergebnisse mit 24 h lang inkubierten Zellen, die mit dem monoklonalen Antikörper HAT5 gefärbt wurden, sind auf den Tafeln b und e, die mit J11d gefärbten in c und f, und die nur mit dem FITC-markierten Ziegen anti-Maus-Reagens behandelten sind in a und d dargestellt. Die Regionen entsprechend 0-95%, 95-99% und 99-100% der Kontrollen sind mit horizontalen Linien der Bezeichnung 1, 2 und 3 kenntlich gemacht, um die Wirkung der Transfektion sichtbar zu machen. Es zeigte sich, daß die Transfektion der Zellen mittels Adenovirus-unterstützter Transferrinfektion eine spezifische Expression des Heat1-Proteins bewirkte, die mit dem monoklonalen Antikörper HAT5 erkannt wurde. Nicht transfizierte COS-7-Zellen reagierten weder mit HAT5 noch mit dem Maus-HSA-spezifischen monoklonalen Antikörper J11d, während Zellen, die mit dem Plasmid pAX111 transfiziert waren, das für das Maus-HSA kodiert, mit J11d, nicht jedoch mit HAT5 angefärbt wurden.The expression of Heat1 on transfected COS-7 cells is shown in FIG. 1: In the figure, panels a, b and c show the expression in COS cells which are associated with the plasmid pAX111, which is the sequence coding for mouse HSA contained, were transfected; Figures d, e and f show the corresponding experiments with pHeat1. The results with cells incubated for 24 h, which were stained with the monoclonal antibody HAT5, are on panels b and e, those stained with J11d in c and f, and those treated with the FITC-labeled goat anti-mouse reagent only are shown in a and d. The regions corresponding to 0-95%, 95-99% and 99-100% of the controls are marked with horizontal lines labeled 1 , 2 and 3 to show the effect of the transfection. It was shown that the transfection of the cells by means of adenovirus-assisted transfer infection caused a specific expression of the Heat1 protein, which was recognized with the monoclonal antibody HAT5. Untransfected COS-7 cells reacted neither with HAT5 nor with the mouse HSA-specific monoclonal antibody J11d, while cells transfected with the plasmid pAX111, which codes for the mouse HSA, stained with J11d but not with HAT5 were.

ii) Characterization in M3 cells

Auch in der Maus-Melanomzellinie M3 wurde die Expression von Heat1 nachgewiesen mittels FACS-Analyse, wobei eine etwas geringere Anzahl von M3-Zellen eine hohe Expression zeigten als die COS-7-Zellen (23% gegenüber 50%, was offensichtlich auf eine bessere Transfektierbarkeit von COS-7-Zellen zurückzuführen ist).In the mouse melanoma cell line M3, too Expression of Heat1 detected by FACS analysis, with a slightly smaller number of M3 cells showed high expression than the COS-7 cells (23% against 50%, which is obviously a better one Transfectability attributable to COS-7 cells is).

iii) detection in Western blot

Lysate von Heat1-transfizierten COS-7-Zellen wurden auf 10% nicht-reduzierenden Gelen mit SDS-PAGE aufgetrennt und das rekombinante Protein mittels Western Blot unter Verwendung einer Mischung der oben aufgezählten Antikörper als Primärantikörper nachgewiesen. Die für die Vorimmunisierung zu verwendenden Präparate des rekombinanten bakteriellen hsp65 wurden quantitativ bestimmt, indem sie in einem Sandwich-ELISA unter Verwendung des polyklonalen anti-BCG-Serums als Beschichtungsantikörper und den monoklonalen Antikörpern IIH9 oder IIC8 als markierter Antikörper mit einem Standardpräparat verglichen wurden.Lysates from Heat1-transfected COS-7 cells were found on 10% non-reducing gels separated with SDS-PAGE and the recombinant protein using Western blot Use a mixture of the above Antibodies detected as primary antibodies. The for the pre-immunization preparations to be used recombinant bacterial hsp65 were quantitative determined by taking in a sandwich ELISA Use of the polyclonal anti-BCG serum as Coating antibody and the monoclonal Antibodies IIH9 or IIC8 as labeled antibodies were compared with a standard preparation.

Ein Pool von hsp65-kreuzreaktiven Antikörpern erkannte ein Standardpräparat von rekombinantem hsp65 (Thole et al., 1987), einen gereinigten Extrakt von E.coli, der das rekombinante hsp65 exprimiert (B032) sowie das Heat1-Protein im Lysat von pHeat1-transfizierten COS-7- Zellen. Nicht-transfizierte Kontrollzellen und HSA- exprimierende COS-7-Zellen zeigten keine Reaktivität (Fig. 2). Das Heat1-Protein erschien in Mehrfachbanden, von denen zwei Hauptbanden deutlich identifiziert werden konnten: eine scharfe Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 60 kDa (in Übereinstimmung mit dem auf Grundlage der kodierenden Sequenz berechneten Molekulargewicht) und ein Pool bei ca. 70 kDa (möglicherweise Vorläufer des reifen Produkts, deren Molekulargewicht höher ist als erwartet, entweder weil der N-terminale Teil noch nicht durch die GPI-Gruppe ersetzt ist, und/oder weil einige mögliche Glykosylierungsstellen, die vom HSA-Teil des Heat1- Hybrids stammen, einen hohen Mannoseanteil aufweisen).A pool of hsp65 cross-reactive antibodies recognized a standard preparation of recombinant hsp65 (Thole et al., 1987), a purified extract from E. coli which expresses the recombinant hsp65 (B032) and the Heat1 protein in the lysate of pHeat1-transfected COS -7- cells. Non-transfected control cells and HSA-expressing COS-7 cells showed no reactivity ( FIG. 2). The Heat1 protein appeared in multiple bands, of which two main bands could be clearly identified: a sharp band with a molecular weight of approx. 60 kDa (in accordance with the molecular weight calculated on the basis of the coding sequence) and a pool at approx. 70 kDa ( possibly precursors of the mature product, the molecular weight of which is higher than expected, either because the N-terminal part has not yet been replaced by the GPI group and / or because some possible glycosylation sites derived from the HSA part of the Heat1 hybrid have one have a high proportion of mannose).

c) Production of the tumor vaccine

M3-Tumorzellen wurden gezüchtet, wie unter b) beschrieben. Wo erforderlich, wurden die Zellen mit 50 Gy mit einem Gammastrahlengerät (Nordion, Kanada) bestrahlt.M3 tumor cells were grown as in b) described. Where necessary, the cells were covered with 50 Gy with a gamma ray device (Nordion, Canada) irradiated.

Example 2 a) Pre-immunization of mice

6 bis 8 Wochen alte Mäuse wurden subkutan oder intraperitoneal mit6 to 8 week old mice became subcutaneous or intraperitoneally with

i) 5 × 10⁵ cells from living M. bovis BCG, strain Pasteur, approved for human use, mixed with incomplete Freund’s adjuvant (IFA) in a total volume of 100 µl; or with
ii) two 100 µg doses of recombinant hsp65 in IFA (Incomplete Freund’s adjuvant); or with
iii) approx. 10⁹ cells of E.coli M1456, containing the hsp65 expression plasmid, injected after irradiation with 50 Gy and left to rest for 4 to 15 weeks before the further treatments.

b) treatment of pre-immunized mice with a Tumor vaccine from Heat1 expressing M3 cells

i) Um das Auswachspotential der Heat1 exprimierenden Zellen zu bestimmen, wurden 10⁵ transfizierte Zellen ohne Bestrahlung den Mäusen nach der Ruheperiode subkutan injziert.i) To express the growth potential of Heat1 To determine cells, 10⁵ were transfected cells without radiation to the mice after the resting period injected subcutaneously.

Für die Impfung wurden 10⁵ der transfizierten M3-Zellen 24 h nach der Transfektion bestrahlt und 2 × mit einer Woche Abstand subkutan den Versuchstieren injiziert. Nach einer weiteren Woche erhielten die Mäuse zwecks Tumorsetzung 10⁵ Wildtyp-M3-Zellen. Das Wachstum der Tumore wurde mittels wöchentlicher Größenbestimmung der Tumore verfolgt. Der Tumorindex wurde nach der Formel TI = (x+0.5)×(y+0.5)×(z+0.5)-0.5³ berechnet, wobei x, y und z die Dimensionen darstellen und alle Angaben in mm ausgedrückt sind (diese Formel gibt einen Meßfehler von 0.5 mm wieder und ermöglicht es, quasi zweidimensionale Tumore, d. h. solche, die keine meßbare dritte Dimension haben, zu beurteilen, während der berechnete Tumorindex proportional dem Tumorvolumen bleibt).10⁵ of the transfected M3 cells were used for vaccination Irradiated 24 h after transfection and 2 × with one Week interval injected subcutaneously into the experimental animals. After another week, the mice were given the purpose Tumor placement 10⁵ wild-type M3 cells. The growth of the Tumors were identified by weekly sizing Tumors haunted. The tumor index was based on the formula TI = (x + 0.5) × (y + 0.5) × (z + 0.5) -0.5³ calculated, where x, y and z represent the dimensions and all data in mm are expressed (this formula gives a measurement error of 0.5 mm again and makes it quasi two-dimensional Tumors, d. H. those that have no measurable third dimension have to judge while the calculated tumor index remains proportional to the tumor volume).

Die immuntherapeutische Behandlung der Mäuse wurde durchgeführt, indem 10⁵ pHeat1-transfizierte M3-Zellen (nicht bestrahlt) subkutan injiziert wurden in
unbehandelte Mäuse;
mit löslichem rekombinantem hsp65 vorimmunisierte Mäuse;
mit ganzem BCG vorimmunisierte Mäuse.The immunotherapy of the mice was carried out by subcutaneously injecting 10⁵ pHeat1-transfected M3 cells (not irradiated) into
untreated mice;
Mice pre-immunized with soluble recombinant hsp65;
Mice pre-immunized with whole BCG.

Im Anschluß daran wurde das Tumorwachstum verfolgt: die Entwicklung der Tumore in den Gruppen von Mäusen, die unbehandelt waren und die mit rekombinantem hsp65 vorimmunisiert waren, verlief ähnlich wie in der Kontrollgruppe, die mit nicht-transfizierten M3-Zellen behandelt worden war, während die meisten mit BCG vorimmunisierten Mäuse tumorfrei blieben und ein Tier verlangsamtes Tumorwachstum zeigte. Der Verlauf dieser Experimente ist in Fig. 3 dargestellt, wobei der Tumorindex auf der Ordinate dargestellt ist: a zeigt die Versuche mit Heat1 exprimierenden M3-Zellen, die in naive Mäuse injiziert wurden; b zeigt den Verlauf der Tumorbildung bei Mäusen, die mit Lebend-BCG vorimmunisiert waren; für die in c dargestellten Versuche wurde lösliches rekombinantes hsp65 verwendet. Der Tumorindex ist als dicke Linie für jedes Tier eingezeichnet, das einen Tumor entwickelte, d.s. 3 von 4 in a, 1 von 4 in b und 4 von 4 in c. Diese Versuche zeigen somit, daß M3-Melanomzellen, die Heat1 exprimieren, ihre tumorigene Wirkung in BCG- vorimmunisierten Tieren verlieren.Thereafter, tumor growth was monitored: the development of the tumors in the groups of mice that were untreated and pre-immunized with recombinant hsp65 was similar to that in the control group treated with untransfected M3 cells during the most mice pre-immunized with BCG remained tumor-free and one animal showed slow tumor growth. The course of these experiments is shown in FIG. 3, the tumor index being shown on the ordinate: a shows the experiments with Heat1-expressing M3 cells which were injected into naive mice; b shows the course of tumor formation in mice that were pre-immunized with live BCG; soluble recombinant hsp65 was used for the experiments shown in c. The tumor index is drawn as a thick line for each animal that developed a tumor, ie 3 out of 4 in a, 1 out of 4 in b and 4 out of 4 in c. These experiments thus show that M3 melanoma cells expressing Heat1 lose their tumorigenic effect in BCG-preimmunized animals.

ii) Um die Schutzwirkung der Tumorvakzine gegen Tumorbildung nach Tumorsetzung mit Wildtyp-M3-Zellen festzustellen, wurde wie folgt vorgegangen:
Die Mäuse wurden zunächst vorimmunisiert, wie oben angegeben. Nach zwei Immunisierungen (einwöchiger Abstand) mit Tumorvakzinen aus 10⁵ pHeat1-trans fizierten, bestrahlten M3-Zellen wurden die Mäuse nach einer weiteren Woche Ruhepause mit 10⁵ Wildtyp-M3- Zellen behandelt, was einer 100fachen tumorigenen Dosis entsprach.ii) In order to determine the protective effect of the tumor vaccine against tumor formation after tumor setting with wild-type M3 cells, the procedure was as follows:
The mice were first pre-immunized as indicated above. After two immunizations (one week apart) with tumor vaccines from 10⁵ pHeat1-transfected, irradiated M3 cells, the mice were treated with 10⁵ wild-type M3 cells after another week's rest, which corresponded to a 100-fold tumorigenic dose.

Im Zuge dieser Versuche, deren Ergebnis in Fig. 4 dargestellt ist (die Art der Darstellung ist analog wie in Fig. 3), wurde eine erste Gruppe mit Lebend-BCG vorimmunisiert und nach 6 Wochen Ruhezeit mit der Tumorvakzine aus Heat1-transfizierten M3-Zellen immunisiert. Nur eines von 8 Versuchstieren entwickelte einen Tumor mit annähernder Wildtyp-Kinetik, während alle anderen nach der Tumorsetzung tumorfrei blieben (Fig. 4a). In einem Parallelversuch entwickelten einige Mäuse 2 Wochen nach der Tumorsetzung kleine, dunkel pigmentierte Flecken. Diese Flecken zeigten kein Wachstum und schienen die Gesundheit der Tiere nicht zu beeinträchtigen.In the course of these experiments, the result of which is shown in FIG. 4 (the type of presentation is analogous to that in FIG. 3), a first group was pre-immunized with live BCG and after 6 weeks of rest with the tumor vaccine from Heat1-transfected M3- Cells immunized. Only one of 8 experimental animals developed a tumor with approximately wild-type kinetics, while all others remained tumor-free after the tumor was set ( FIG. 4a). In a parallel experiment, some mice developed small, dark-pigmented spots 2 weeks after the tumor was set. These spots showed no growth and did not appear to affect animal health.

Eine zweite Versuchsgruppe von Mäusen erhielt bei ansonsten identischen Versuchsparametern die Präimmunisierung in Form von je 50 µg bakteriellem rekombinantem hsp65. Die Erfolgsrate war ähnlich wie in der ersten Gruppe, wobei auch hier nur ein Tier einen Tumor mit Wildtyp-Kinetik entwickelte (Fig. 4b).A second test group of mice received the pre-immunization in the form of 50 µg bacterial recombinant hsp65 each with otherwise identical test parameters. The success rate was similar to that in the first group, with only one animal developing a tumor with wild-type kinetics ( Fig. 4b).

In einer dritten Versuchsgruppe (Kontrolle für die Vorimmunisierung) wurden Mäuse mit ganzen bestrahlten E.coli Bakterien des Stammes M1456, die das rekombinante hsp65-Protein exprimieren, immunisiert. 6 von 8 Tieren aus dieser Gruppe entwickelten nach der Behandlung mit M3-Wildtypzellen Tumore, meistens mit Wildtyp-Kinetik (Fig. 4c).In a third test group (control for the pre-immunization), mice were immunized with whole irradiated E. coli bacteria of the strain M1456, which express the recombinant hsp65 protein. 6 of 8 animals from this group developed tumors after treatment with M3 wild-type cells, mostly with wild-type kinetics ( FIG. 4c).

Eine vierte Versuchsgruppe diente zur Kontrolle für die tumorspezifische Immunisierung. Die Mäuse dieser Gruppe wurden nach Prä-Immunisierung mit Lebend-BCG mit M3- Wildtypzellen behandelt, ohne vorher mit den Tumorvakzinen aus Heat1-transfizierten M3-Zellen immunisiert worden zu sein. Alle Tiere aus dieser Gruppe entwickelten Tumore (Fig. 4d).A fourth experimental group served as a control for tumor-specific immunization. After pre-immunization with live BCG, the mice in this group were treated with M3 wild-type cells without being previously immunized with the tumor vaccines from Heat1-transfected M3 cells. All animals from this group developed tumors ( Fig. 4d).

Example 3 Involvement of T cells in the response to the Tumor vaccine

In Versuchen mit IL-2 sekretierenden Tumorvakzinen war gefunden worden, daß u. a. makrophagenähnliche Zellen, Granulozyten und NK-Zellen für die Eliminierung dieser Inokula verantwortlich sind, während jedoch keine Beteiligung von T-Zellen nachgewiesen worden war.In experiments with IL-2 secreting tumor vaccines been found that u. a. macrophage-like cells, Granulocytes and NK cells for the elimination of these Inocula are responsible, but none T cell involvement had been demonstrated.

Für die entsprechende immunhistologische Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Tumorvakzine wurden von den Versuchstieren Schnitte hergestellt, wie von Zatloukal et al., 1995, beschrieben, und mit den folgenden Antikörpern inkubiert: 145-2C11-Biotin (CD3), RM4-5-Biotin (CD4), 53-6. 7-Biotin (CD8), B220-Biotin (CD45-R), M1/70 (Mac-1, CD11b), Gr-1 (RB6-8C5), (alle diese Antikörper wurden von Pharmingen bezogen); F4/80- Biotin (Serotec) und anti-Asialo-GM1-Antiserum (Wako Chemicals). Streptavidin-alkalische Phosophatase (Boehringer Mannheim) oder Kaninchen-anti-Kaninchen alkalische Phosphatase (Serotec) wurden als FITC-mar kierte Antikörper eingesetzt.For the corresponding immunohistological examination the effect of the tumor vaccine according to the invention cuts from the experimental animals, as from Zatloukal et al., 1995, and with the incubated the following antibodies: 145-2C11-biotin (CD3), RM4-5 biotin (CD4), 53-6. 7-biotin (CD8), B220-biotin (CD45-R), M1 / 70 (Mac-1, CD11b), Gr-1 (RB6-8C5), (all these antibodies were obtained from Pharmingen); F4 / 80- Biotin (Serotec) and anti-Asialo GM1 antiserum (Wako Chemicals). Streptavidin-alkaline philosophatase (Boehringer Mannheim) or rabbit anti-rabbit alkaline phosphatase (Serotec) were identified as FITC-mar Antibodies used.

Im Gegensatz zu den von Zatloukal et al., 1995, erhaltenen Ergebnissen wurde festgestellt, daß nach Injektion von pHeat1-transfizierten Zellen in Mäuse, die mit Lebend-BCG vorimmunisiert waren, mit anti-CD3- und anti-CD4-Antikörpern eine geringe, jedoch signifikante Anzahl positiver Zellen nachweisbar ist (Fig. 5: a: F4/80, b: CD11b, c: CD4 (jeweils 50fache Vergrößerung), d: CD3 (100fache Vergrößerung). Positive Zellen sind mit Pfeilspitzen markiert. Insgesamt ähnelte die qualitative Zusammensetzung der Zellpopulation derjenigen, die an der Stelle der Tumorsetzung in IL-2-Tumorvakzin-behandelten Mäusen beobachtet wurde (Zatloukal et al., 1995). In contrast to the results obtained from Zatloukal et al., 1995, it was found that after injection of pHeat1-transfected cells in mice pre-immunized with live BCG, with anti-CD3 and anti-CD4 antibodies a small, However, significant numbers of positive cells are detectable ( Fig. 5: a: F4 / 80, b: CD11b, c: CD4 (50x magnification each), d: CD3 (100x magnification). Positive cells are marked with arrowheads. Overall, the qualitative was similar Composition of the cell population of those observed at the site of tumor placement in IL-2 tumor vaccine-treated mice (Zatloukal et al., 1995).

Tabelle I Table I

Reaktivität von Antikörpern gegen hsp65-Derivate Reactivity of antibodies to hsp65 derivatives

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Claims

1. Use a vaccine that inactivated autologous and / or allogeneic incapable of proliferation Contains tumor cells which are modified such that they contain one or more antigens for treatment of tumors in individuals who already have one Immune response to the contained or contained Antigens exist.

2. Use according to claim 1, characterized in that the tumor cells are transfected with recombinant DNA, the one or more sequences coding for an antigen contains.

3. Use according to claim 2, characterized in that the recombinant DNA is plasmid DNA.

4. Use according to claim 2, characterized in that the recombinant DNA is a retroviral vector.

5. Use according to claim 2, characterized in that the recombinant DNA is an adenoviral vector.

6. Use according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized in that the antigen is from a human pathogen is derived.

7. Use according to claim 6, characterized in that the antigen is derived from a virus protein.

8. Use according to claim 7, characterized in that the antigen is a protein or protein fragment from Epstein Barr virus, influenza virus, adenovirus, hepatitis B- Virus, herpes simplex virus or cytomegalovirus, or a Derivative of it is.

9. Use according to claim 6, characterized in that the antigen is derived from a bacterial protein.

10. Use according to claim 9, characterized in that the antigen is derived from Mycobacterium protein.

11. Use according to claim 10, characterized in that the antigen is derived from Mycobacterium tuberculosis.

12. Use according to claim 10, characterized in that the antigen is derived from Mycobacterium bovis.

13. Use according to claim 12, characterized in that the antigen is derived from Bacillus Calmette Guerin.

14. Use according to one of claims 10 to 12, characterized characterized that the antigen is a heat shock protein or is a fragment or derivative thereof.

15. Use according to claim 14, characterized in that the hsp65 antigen or a fragment or derivative thereof is.

16. Use according to any one of claims 6 to 15, characterized characterized in that the antigen has a sequence is modified by a natural signal or regulatory sequence that is normally derived Controls synthesis and / or transport of cellular proteins.

17. Use according to claim 16, characterized in that the sequence is selected from the group GPI-Link Sequence, signal sequence of MSA and insertion Signal sequence.

18. Use according to any one of claims 6 to 15, characterized characterized that the antigen compared to the natural Antigen has one or more mutations.

19. Use according to claim 1, characterized in that it contains cells from a tumor cell line.

20. Use according to claim 1, characterized in that they also cells, especially tumor cells or Fibroblasts containing one or more cytokines express.

21. Use according to claim 20, characterized in that the cytokine is interleukin-2.

22. Use according to claim 1, characterized in that the tumor cells also have one or more cytokines contain.

23. Use according to claim 22, characterized in that the cytokine is interleukin-2.