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Antikörperfraktionen oder deren Derivate, die an monoklonalen Antikörpern gegen Tumor- assoziierte Antigene binden, und die aus individuellem Blut durch Immunaffinitätsreinigung an spezifischen Liganden gewonnen werden, können in geeigneter Formulierung zur individuellen, autologen prophylaktischen oder therapeutischen Vakzinierung gegen Krebserkrankungen ver- wendet werden. Die Liganden der Immunaffinitätsreinigung sind monoklonale Antikörper oder deren Derivate, die gegen Tumor-assoziierte Antigene genchtet sind.
Das adaptive Immunsystem des Menschen besteht aus zwei wesentlichen Komponenten, der humoralen und der zellulären Immunität Die adaptive Immunantwort beruht auf der klonalen Selektion von B- und T-Lymphozyten und erlaubt im Prinzip die Erkennung jedes beliebigen Anti- gens sowie den Aufbau eines immunologischen Gedächtnisses Diese Merkmale des adaptiven Immunsystems werden generell bei Impfungen nutzbringend angesprochen.
Jede B-Zelle produziert einen Antikörper mit bestimmter Bindungsspezifität Dieser Antikörper befindet sich als spezifischer Rezeptor auch in der Membran der ihn produzierenden B-Zelle. Die humorale Immunantwort gegen als fremd erkannte Antigene beruht auf der selektiven Aktivierung derjenigen B-Zellen, die solche Antikörper produzieren, die an Epitope des jeweiligen Antigens binden können Für die Antikorpervielfalt spielen DNA-Rearrangements im Verlauf der B-Zelldiffe- renzierung eine entscheidende Rolle
Im menschlichen Serum befinden sich in grosser Menge Antikörper verschiedenster Spezifitä- ten, Isotypen und Subklassen Die Gesamtkonzentration aller Immunglobuline im Serum beträgt 15 - 20 mg/mi;
das heisst, das ca. 100 g Immunglobuline verschiedenster Spezifitaten dauernd im Blut zirkulieren Es ist nicht möglich, die genaue Anzahl aller Antikörper mit unterschiedlicher Spezifitat anzugeben, das theoretisch mögliche Repertoir durfte bei ca 1011 liegen Ein bestimmter Antikörper kann im allgemeinen verschiedene, einander ähnliche Antigene binden, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität und Aviditat
Das Immunsystem muss mit Hilfe endogener Regulationsmechanismen eine Homöostase bezuglich der Verteilung und Gewichtung dieser verschiedenen Spezifitaten aufrecht erhalten Ein wesentlicher Mechanismus dafur ist das "idiotypische Netzwerk", das von Niels Jerne vor ca 25 Jahren postuliert wurde (Jerne, N K Ann.lmmunol 125C 373-89,1974) Gegen jeden Idiotyp eines Antikörpers,
welcher seine Bindungsspezifität bestimmt, gibt es anti-idiotypische Antikörper, die also an den Idiotyp des ersten Antikörpers im Sinne einer Antigenerkennung binden. Jerne schlug vor, dass die Wechselwirkungen zwischen den Idiotyp-spezifischen Rezeptoren auf Lym- phozyten fur die Regulation des Immunsystems verantwortlich sein konnen.
Diese Wechselwirkun- gen finden offensichtlich tatsachlich statt, da gezeigt worden ist, dass im Zuge einer Immunantwort auch anti-idiotypische Antikörper gegen die durch die Immunantwort pnmar induzierten Antikörper entstehen Da es gegen jeden Antikörper anti-idiotypische Antikörper gibt, sind Lymphozyten gegenüber Idiotypen von Antikörpern grundsatzlich nicht tolerant
Einige anti-idiotypische Antikörper können im immunologischen Sinne das #
innere Abbild" eines Antiges darstellen Solche Antikörper können daher als Surrogat des nominalen Antigens zur Immunisierung verwendet werden, da die durch eine Immunisierung induzierten Antikörper zum Teil an das nominale Antigen binden können Dieser Ansatz wird seit langerer Zeit insbesondere in der Krebsimmuntherapie verfolgt Es gibt seit mehr als 10 Jahren eine Reihe von praktischen und klinischen Projekten, durch Vakzinierung mit monoklonalen anti-idiotypischen Antikörpern Immun- antworten gegen Tumor-assoziierte Antigene hervorzurufen (für eine Zusammenfassung siehe
M. Bhattacharya-Chatterjee, K. Foon, Anti-idiotype antibody vaccine therapies of cancer Cancer Treat.
Res 94 51-68,1998) Die meisten dieser monoklonalen anti-idiotypischen Antikörper sind munnen Ursprungs, es gibt aber auch Versuche mit humanen monoklonalen anti-idiotypischen Antikörpern (z. B Fagerberg J, et al., PNAS 92: 4773-77, 1995).
Einen Spezialfall stellen die Versuche der therapeutischen Immunisierung von Patienten mit
B-Zell Lymphomen dar Bei diesen Erkrankungen entartet ein bestimmter B-Zell Klon, der ein bestimmtes Immunglobulin mit einem dafür charakteristischen Idiotyp produziert und auch als
Rezeptor in der Zellmembran trägt Dieser Antikörper ist monoklonal und kann als Tumor-spezi- fisches Antigen für das individuelle B-Zell Lymphom gesehen werden. Es wurde gezeigt, dass solche Patienten-spezifische autologe Antikörper, in Zellkultur hergestellt und in geeignet immuno- gener Form als Impfstoff verabreicht, eine Immunantwort gegen den Idiotyp dieses Antikörpers hervorrufen können, die eine Wirkung gegen das B-Zell Lymphom aufweisen kann (Reichardt VL,
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et al., Blood 93 : 2411-9,1999).
Zusammenfassend ist bisher gezeigt worden, dass @ humane monoklonale anti-idiotypische Antikörper, die ein Tumor-assoziertes Antigen nach- ahmen, als Impfstoff in Krebspatienten eine Immunantwort auslösen können, die gegen die- ses Tumor-assoziierte Antigen gerichtet sein kann Solche humane monoklonale Antikörper
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gewonnen, die einen (meist murinen) Antitumorantikörper zur passiven Immuntherapie er- halten hatten und eine Immunantwort dagegen aufgebaut haben.
@ humane Antikörper, die von einem B-Zell Lymphom produziert werden und daher einen de- finierten Idiotyp haben, Patienten-spezifisch als individuelle Impfung eine Immunantwort auslösen konnen, die gegen das B-Zell Lymphom gerichtet sein kann. Solche Patienten- spezifische Antikörper mussen mittels Hybridomtechnologie oder Immortalisierung der Zel- len des B-Zell Lymphoms individuell gewonnen werden Ihre Verwendung ist naturgemäss auf die Behandlung von B-Zell Lymphomen beschränkt
Im Folgenden ist nun die gegenständliche Erfindung naher erläutert
Der Pool von Antikörpern, welche in insgesamt grosser Menge im Blut jedes Menschen vorhan- den sind, beinhaltet Antikörper jeder möglichen Bindungsspezifität Daher beinhaltet dieser Anti- korperpool grundsätzlich auch Antikörper (Ab2)
gegen den Idiotyp von (bereits bekannten oder aber auch neuen) munnen monoklonalen Antikörpern (Ab1) gegen beliebige Tumor-assoziierte Antigene Entsprechend dem immunologischen Netzwerk enthält der gleiche Antikorperpool in jedem Menschen in gewisser Menge auch Antikörper gegen die Idiotypen der autologen Ab2 (= Ab3) Ab3 können nach der Netzwerktheone an dem Tumor-assoziierten Antigen binden, das durch den externen Ab1 definiert ist Eine Verschiebung des Gleichgewichtes Ab2/ Ab3 zugunsten von Ab3 muss zur Folge haben, dass das Immunsystem Tumorzellen, die dieses Antigen tragen, besser erkennen und angreifen kann
Basis der gegenständlichen Erfindung ist,
dass eine solche Verschiebung des immunologischen Gleichgewichtes durch Verabreichung einer individuellen autologen Ab2-Fraktion in Form einer immunogenen Vakzine erreicht werden kann Durch eine solche autologe Impfung können diejeni- gen B-Zellen selektiv stimuliert werden, die Ab3 produzieren Für eine solche Impfung sind nur kleine Mengen der Ab2-Fraktion notwendig, die nach an sich bekannten Methoden mit einem geeigneten Vakzinadjuvans immunogen formuliert werden
Ein weiterer integraler Bestandteil der gegenständlichen Erfindung ist,
dass die Gewinnung
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im Serum befindlichen Antikörper erfolgen kann Als Ligand wird ein - oder werden mehrere - monoklonale Antikörper gegen Tumor-assoziierte Antigene verwendet Verschiedenste Antikörper gegen verschiedene Tumor-assoziierte Antigene sind seit langem bekannt oder können mit an sich bekannten Methoden (z.B Hybridomtechnologie, Phagendisplay-Technik) hergestellt werden
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noklonale Antikörper gegen verschiedene Tumor-assoziierte Antigene gleichzeitig verwendet, so erhält man eine Fraktion unterschiedlicher Ab2, die auf dem gewählten Set von Tumor-assoziierten Antigenen beruht und deren gleichzeitige Verwendung als Impfstoff eine Immunantwort gegen alle diese Tumor-assoznerten Antigene hervorruft Damit wird also das immunologische Gleichgewicht in einem Schritt in Richtung der Erkennung eines Sets von (oft ko-exprimierten)
Tumorassoziierten Antigenen gerichtet Eine solche Vorgangsweise erhöht naturgemäss die Wirksamkeit der induzier- ten Immunantwort und verringert essentiell die Ausbildung von Antigen-negativen Varianten des Tumors ("tumor escape"), da es extrem unwahrscheinlich ist, dass eine Tumorzelle die Expression mehrerer Antigene gleichzeitig abschalten kann
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3 - 10 g immunglobulin pro ml eingesetzten Serums. Im allgemeinen besteht die so erhaltene Antikörperfraktion sowohl aus IgM als auch aus IgG. Es ist also möglich, aus einer für eine Blutab- nahme akzeptablen Menge von z.B 50 ml, die zu ca. 25 ml Serum führt, ca. 0,08 - 0,25 mg Ab2 zu gewinnen.
Diese Menge reicht an sich bereits zur Vakzinierung Falls es gewünscht ist, grössere Mengen von Ab2 zu gewinnen, können auch an sich bekannte Techniken der Plasmapherese, kombiniert mit Immunaffinitätsreinigung, eingesetzt werden
Grundsätzlich kann die oben beschriebene Methode auf allen bekannten oder neu entdeckten
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Tumor-assoziierten Antigenen beruhen.
Voraussetzung ist nur, dass ein oder mehrere monoklonale
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gung verwendet werden können Es eignen sich grundsätzlich sowohl munne monoklonale Anti- korper als auch Antikörper aus anderen Spezies (z.B Ratte) Weiters sind auch Maus-Human chimärische, humanisierte oder humane monoklonale Antikörper gegen Tumor-assoziierte Antige- ne einsetzbar Die Eigenschaft der für die Immunaffinitätsreinigung eingesetzten Antikörper ist durch ihre Bindungsregion, das heisst ihrem Idiotyp, determiniert Daher können im Prinzip statt
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gesetzt werden, solange diese Fragmente den Idiotyp der jeweiligen Ausgangs-Antikorper weiter- hin beinhalten Als Beispiele, jedoch nicht auf diese eingeschränkt, seien erwähnt F(ab)'2-Frag- mente, F (ab)'-Fragmente Fv-Fragmente,
die nach an sich bekannten biochemischen Metho- den (enzymatische Spaltung) oder nach an sich bekannten molekularbiologischen Methoden hergestellt werden können
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eingesetzten Antikörper gegen diese Antigene hängt mit der Antigencharaktenstik der Tumonndikation zusammen, gegen die geimpft werden soll.
Folgende bereits bekannte Tumor-assoziierte Antigene, die auf verschiedenen, insbesondere epithelialen Tumoren häufig expnmiert sind, sind beispielhaft angeführt, aber die Anwendung der hier beschriebenen Methode der autologen Vak- zinierung ist in keiner Weise auf diese Antigene beschrankt
Epitheliales Zell Adhasions Molekül (Ep-CAM) Carcino Embryonales Antigen (CEA) Lewis Y Kohlenhydrat
Sialyl Tn Kohlenhydrat
Globo H Kohlenhydrat
Ganglioside wie GD2/ GD3/ GM2
Prostate Specific Antigen (PSA)
CA 125
CA 19-9
CA 15-3
TAG-72
Neuronales Zeit Adhasions Molekul (N-CAM)
Her2/Neu Rezeptor
Gegen alle genannten Antigene sind (meistens mehrere)
monoklonale Antikörper beschrieben
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zur Gewinnung von Ab2 eignen
Die hier beschriebene Methode zur Gewinnung eines autologen Impfstoffes aus Serum eines Individuums ist naturgemäss nicht auf nur eine Anwendung beschränkt Die durch eine erste Imp- fung hervorgerufene Verschiebung des immunologischen Repertoirs in Richtung Antitumor-Wirk- samkeit kann durch Wiederholungen dieses Vorganges weiter verstärkt werden, z B kann einige Wochen nach Gewinnung der ersten autologen Vakzine durch Immunaffinitätsreinigung erneut Blut abgenommen und erneut eine autologe Vakzine präpariert und verabreicht werden. Dadurch wird auch gewährleistet, dass der jeweilige Status des immunologischen Gleichgewichtes in der indivi- duellen Vakzine immer berücksichtigt ist.
Dieser Vorgang kann in geeigneten Abstanden immer wieder durchgeführt werden (beispielshaft zunächst alle 4 - 8 Wochen, in weiterer Folge alle 6 Monate).
Die hier beschriebene neue Methode zur Impfung mit autologen Antikörpern eignet sich grund- sätzlich sowohl für therapeutische als auch prophylaktische Zwecke. Eine wiederholte therapeuti- sche Vakzinierung von Krebspatienten kann die Ausbildung neuer Metastasen unterdrücken und die Disseminierung der Erkrankung zumindest verlangsamen Therapeutische autologe Impfungen können insbesondere in folgenden Stadien der Erkrankung nutzbringend sein-
In frühen Krankheitsstadien, zum Beispiel nach erfolgreicher Operation eines Pnmärtumors (adjuvantes Stadium), werden durch die hier beschriebenen autologen Impfungen restliche, disse-
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minierte Tumorzellen zerstört und daran gehindert, sich als neue Metastasen zu etablieren.
Da- durch kann die rückfallsfreie Lebensspanne und damit auch die Gesamtüberlebenszeit solcher Patienten verlängert werden. Durch solche autologe Impfungen und in geeigneten Abständen durchgeführte Auffrischungsimpfungen kann gegebenenfalls ein lebenslanger Schutz vor der Aus- bildung von Metastasen erreicht werden.
Wenn bereits Metastasen aufgetreten sind, kann durch die hier beschriebenen autologen Imp- fungen die Ausbreitung und Ausbildung weiterer Metastasen eingedämmt werden Dadurch wird das Krankheitsgeschehen stabilisiert, wobei bei Erhalt der Lebensqualitat eine Verlängerung der Lebenszeit erreicht werden kann
Die hier beschriebene Strategie autologer Impfungen kann auch in Patienten angewendet wer- den, die zuvor aus diagnostischen oder therapeutischen Gründen bereits einen monoklonalen Antikörper gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen verabreicht bekommen haben und dagegen eine
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diesem Antikörper als Liganden Antikörper dagegen (Ab2) in grösserer Menge als bei nicht behan- delten Individuen erhalten werden.
Die Impfung mit diesen Ab2 verstarkt dann die Ausbildung eventuell bereits intrinsisch entstandener Ab3 Die intrinsische Induktion von Ab3 mit potentiellen Antitumoreigenschaften via Induktion von Ab2 durch passive Immuntherapie mit munnen Antikor- pern gegen Tumor-assoziierte Antigene (Ab1), die i v. an Krebspatienten gegeben werden, wird seit vielen Jahren postuliert und untersucht (z B Koprowski H et al.;
PNAS 81' 216-19, 1984)
Die hier beschriebenen autologen Impfungen können prinzipiell auch dafür verwendet werden, prophylaktisch einen erhöhten Schutz gegen die Ausbildung von Krebserkrankungen in gesunden Individuen aufzubauen Eine solche Massnahme kann sich insbesondere in Risikogruppen als sinn- voll erweisen (hiezu gehoren z B Personen mit einer genetischen Disposition, bestimmte Krebser- krankungen zu entwickeln, was in steigendem Ausmass durch entsprechende Tests erhoben wer- den kann)
Ein genereller Vorzug der hier beschriebenen Strategie der individuellen autologen Impfung liegt in der Tatsache, dass der immunologische Status des jeweiligen Individuums bezüglich des idiotypischen Netzwerkes berücksichtigt wird,
da der entsprechende Impfstoff jeweils aus dem individuellen Serum hergestellt wird
Weiters kommt die immunisierte Person mit keinen Fremdantigenen in Berührung, sondern wird in geeigneter Form nur mit korpereigenen Bestandteilen behandelt, die eine Modulation des immunologischen Gleichgewichtes bewirken
Die durch Vakzinierung mit autologen Antikörpern induzierte Immunantwort ist durch die Bin dungsregion dieser Antikörper, das heisst ihrem Idiotyp, determiniert Daher können im Prinzip statt intakter Antikorperfraktionen auch Fragmente oder Derivate dieser Antikörper erfolgreich zur Vakzi- nierung eingesetzt werden, solange diese Derivate den Idiotyp der jeweiligen Ausgangs-Antikorper weiterhin beinhalten Als Beispiele, jedoch nicht auf diese eingeschränkt, seien erwähnt.
F (ab)'2- Fragmente und F(ab)'-Fragmente, die nach an sich bekannten biochemischen Methoden (enzyma- tische Spaltung) hergestellt werden konnen, sowie Antikorperdenvate, die nach an sich bekannten chemischen oder biochemischen Methoden hergestellt werden konnen, wie z B mit Fettsäuren an freien Aminofunktionen amidierte Antikörper zwecks Erhohung der Lipophilie zur Inkorponerung in Liposomen
Wie bei Impfstoffen üblich, können die autologen Antikorperfraktionen oder deren Fragmente und Derivate mit Vakzine-Adjuvantien gemeinsam formuliert werden Durch solche Adjuvantien wird die Immunantwort verstärkt Als Beispiele für Adjuvantien, jedoch nicht auf diese einge- schränkt, seien erwähnt Aluminium-hydroxid (Alu-Gel), Derivate von Lipopolysacchand, Bacillus Calmette Guenn (BCG), QS-21, Liposomenbereitungen,
Formulierungen mit zusätzlichen Antige- nen, gegen die das Immunsystem bereits eine starke Immunantwort gemacht hat, wie z B. Tetanus Toxoid oder Bestandteile von Influenza Viren, gegebenenfalls in einer Liposomenbereitung.
Die Impfstoffbereitung kann zur Verstärkung der Immunantwort auch mit entsprechenden hu- manen Zytokinen, die den Aufbau einer Immunantwort unterstützen, verabreicht werden. Hier ist insbesondere, wenn auch nicht ausschliesslich, Granulozyten-Makrophagen stimulierender Faktor (GM-CSF) zu erwähnen. Dieses Zytokin stimuliert durch Aktivierung von Antigen-prozessierenden
Zellen (z B dendritische Zellen) eine effiziente Immunantwort.
Gegebenenfalls können die autologen Antikörperfraktionen auch nach an sich bekannten und
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publizierten Methoden mit autologen, ex-vivo kultivierten dendritischen Zellen inkubiert werden Die so gepulsten dendritischen Zellen werden anschliessend dem jeweiligen Individuum wieder verab- reicht. Auf diese Weise kann eine besonders effiziente Immunantwort erreicht werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt werden soll, noch näher erlautert.
Es zeigen
Fig. 1 ein Chromatogramm einer Immunaffinitätsreinigung (mittels immobilisiertem Antikörper 17-1a) derAntikorperfraktion aus Serum eines Rhesusaffen ;
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nigten Antikörperfraktion,
Fig. 3 die Bindung von Serum-Antikorpern, die durch Affinitatsreinigung an Antikörper 17-1A gewonnen wurden : 17-1AELISA,
Fig 4 das Ergebnis einer autologen Impfung eines Rhesusaffen. Bindung von Serum-Ig an Katolll Tumorzellen (Zell-ELISA);
Fig. 5 schematisch das Prinzip der vorliegenden Erfindung.
In den nun folgenden Beispielen, die die vorliegende Erfindung weiter erlautern, aber nicht ein- schranken sollen, wurden folgende Materialien verwendet
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<tb> Mikrotiterplatten <SEP> Immuno <SEP> Plate <SEP> F96 <SEP> MaxiSorp <SEP> (Nunc) <SEP> fur <SEP> ELISA
<tb> Cell <SEP> Culture <SEP> Cluster <SEP> (Costar, <SEP> Cat <SEP> Nr <SEP> 3598) <SEP> fur <SEP> Zell-ELISA
<tb>
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<tb> (ATCC <SEP> HTB <SEP> 103)
<tb>
<tb> Kopplungspuffer <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> NaHC03
<tb> 0,5 <SEP> M <SEP> NaCI
<tb> pH-Wert <SEP> 8,0
<tb>
<tb> Reinigungspuffer <SEP> A <SEP> PBS <SEP> def
<tb> 0,2 <SEP> M <SEP> NaCI
<tb>
<tb> Reinigungspuffer <SEP> B <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> Glycin <SEP> / <SEP> HCI
<tb> 0,2 <SEP> M <SEP> NaCI
<tb> pH-Wert <SEP> 2,
9
<tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> RPMI <SEP> 1640 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> g/1 <SEP> NaHC03
<tb> 100 <SEP> U/ml <SEP> Penicillin <SEP> G
<tb>
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<tb> 4 <SEP> mM <SEP> Glutamin
<tb> 10 <SEP> % <SEP> foetales <SEP> Kälberserum <SEP> (hitzeinaktiviert)
<tb>
<tb> Bindungspuffer <SEP> 15 <SEP> mM <SEP> Na2CO3
<tb> 35 <SEP> mM <SEP> NaHC03
<tb> 3 <SEP> mM <SEP> NaN3
<tb> pH-Wert <SEP> 9,6
<tb>
<tb> PBS <SEP> deficient <SEP> (def): <SEP> 138 <SEP> mM <SEP> NaCI
<tb> 1,5 <SEP> mM <SEP> KH2P04 <SEP>
<tb> 2,7 <SEP> mM <SEP> KCI
<tb> 6,5 <SEP> mM <SEP> Na2HP04
<tb> pH-Wert <SEP> 7,2
<tb>
<tb> Fixierlösung <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> Glutardialdehyd <SEP> in
<tb> physiologischer <SEP> NaCI-Losung
<tb>
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<tb> Waschpuffer <SEP> A:
<SEP> 2% <SEP> NaCI
<tb>
<tb>
<tb> 0,2%Triton <SEP> X-100 <SEP>
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<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
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<tb> Waschpuffer <SEP> B- <SEP> 0,05 <SEP> % <SEP> Tween <SEP> 20 <SEP> in <SEP> PBS <SEP> deficient
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<tb> Blockierungspuffer <SEP> A.
<SEP> 5 <SEP> % <SEP> foetales <SEP> Kalberserum <SEP> (hitzeinaktiviert)
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<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<tb>
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<tb> Blockierungspuffer <SEP> B' <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Rinderserumalbumin
<tb>
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<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> NaN3
<tb>
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<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Verdünnungspuffer <SEP> A <SEP> 2% <SEP> foetales <SEP> Kälberserum <SEP> (hitzeinaktiviert)
<tb>
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<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<tb>
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<tb> Verdünnungspuffer <SEP> B <SEP> PBS <SEP> deficient
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<tb> Farbepuffer <SEP> 24,3 <SEP> mM <SEP> Zitronensaure
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<tb> 51,4 <SEP> mM <SEP> NazHP04 <SEP>
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<tb> pH-Wert <SEP> 5,
0
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<tb> Substrat <SEP> 40 <SEP> mg <SEP> o-Phenylendiamin <SEP> Dihydrochlorid
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<tb> 100 <SEP> ml <SEP> Farbepuffer
<tb>
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<tb> 20 <SEP> 1 <SEP> H202 <SEP> (30%)
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<tb> Stopplosung <SEP> 4 <SEP> N <SEP> HzS04
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<tb>
<tb> Formulierungspuffer <SEP> 10 <SEP> % <SEP> PBS <SEP> def, <SEP> pH <SEP> = <SEP> 5,
5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 90 <SEP> % <SEP> physiologische <SEP> NaCI-Lösung
<tb>
Die hier beschriebene Methode zur autologen Impfung wurde an gesunden Rhesusaffen erprobt Zu diesem Zweck wurde einem Rhesusaffen 10 ml penpheres Blut abgenommen und dar-
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Rhesusaffen wurde zunachst eine Immunaffinitatsmatrix nach folgender Vorschnft hergestellt Die ganze Prozedur wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt
7,5 g CH-Sepharose 4B (Pharmacia) wurden fur 15 Minuten in 20 ml 1 mM HCI suspendiert Das Gel wurde dann mit 1 Liter 1 mM HCI und anschliessend mit 200 ml Kopplungspuffer auf einem Sinterglasfilter AG3 gewaschen 100 mg munner Antikörper 17-1A (Panorex, Stammlosung 10 mg/ml, genchtet gegen das Tumor-assoziierte Antigen Ep-CAM)
wurden gegen 5 Liter Kopp- lungspuffer dialysiert und mit Kopplungspuffer auf 5 mg/mi eingestellt Diese Losung wurde mit der Gelsuspension in einem verschlossenen Gefäss vermischt. Ein Verhältnis von Gel Puffer von 1.2 ergibt eine fur die Kopplung geeignete Suspension. Diese Suspension wurde 24 Stunden bei 4 C rotiert Anschliessend wurde der Überschuss des Liganden mit 3 x 30 ml Kopplungspuffer weggewa- schen Überbleibende reaktive Gruppen wurden durch einstündige Inkubation bei 4 C mit 1 M Athanolamin geblockt. Dann wurde das Gel fur eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem 0,1 M Tris-HCI Puffer rotiert Letztlich wurde das Gel mit 3 Zyklen von Puffern mit alternierendem pH gewaschen.
Jeder Zyklus besteht aus 0,1 M Natnumacetat Puffer pH 4 mit 0,5 M NaCI, und an- schliessend 0,1 M Tris-HCI Puffer pH 8 mit 0,5 M NaCI Das Gel wurde bei 4 C aufbewahrt
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des nach obiger Vorschrift erhaltenen Gels wurde in eine Pharmacia HR5/5 Säule gefüllt 5 ml Serum wurden 1 10 mit dem Reinigungspuffer A verdünnt Diese Lösung wurde mit 1 m1/Minute über die Säule gepumpt und mit Reinigungspuffer A nachgewaschen, bis die UV-Basislinie des
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Detektors wieder erreicht ist (280 nm) Gebundene Immunglobuline wurden dann mit Reinigungs- puffer B eluiert und die Fraktion mit 1 M Na2HP04 unmittelbar nach Desorption neutralisiert.
Ein Chromatogramm dieser Reinigung (UV 280 nm) findet sich in Fig 1
50 1 der so gereinigten Antikörperfraktion wurden auf einer Grössentrennungssäule (SEC, Zor- bax 250 GF) analysiert. Als Laufmittel wurde 220 mM Phosphatpuffer pH 7 + 10% Acetonitril ver- wendet Wie aus dem Chromatogramm dieser Analyse ersichtlich ist Fig 2), beinhaltet die Antikor- perfraktion IgM und IgG im Verhältnis von ca. 3 :2. Gesamtmenge der Antikorperfraktion betrug ca. 40 g (bestimmt mittels SEC im Vergleich zu einem Standard)
Die so gewonnene Antikörperfraktion wurde in einem ELISA bezuglich der Bindung an Antikör- per 17-1A (der zur Affinitätsreinigung als Ligand verwendet wurde) getestet.
100 1 Aliquots des für die Affinitätsreinigung eingesetzten Antikörpers gegen ein Tumor-asso- ziiertes Antigen (Antikörper 17-1A, Losung mit 10 g/min Bindungspuffer) wurden in den Lochern einer Mikrotiterplatte 1 Stunde bei 37 C inkubiert. Nach sechsmaligem Waschen der Platte mit Waschpuffer A wurden je 200 1 des Blockierungspuffers A zugesetzt und 30 Minuten bei 37 C inkubiert Nach Waschen der Platte wie oben beschrieben wurden je 100 1 Aliquots der zu testen- den affinitatsgereinigten Antikörperfraktion sowie normales Humanimmunglobulin in gleicher Kon- zentration als Negativkontrolle in Verdünnungen von 1 4 bis 1 65 000 in Verdünnungspuffer A 1 Stunde bei 37 C inkubiert Nach Waschen der Platte wie oben beschrieben wurden je 100 1 des Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-Human-Ig Antikörpers (Zymed)
in einer Verdunnung von 1 1000 in Verdünnungspuffer A zugesetzt und 30 Minuten bei 37 C inkubiert Die Platte wurde viermal mit Waschpuffer A und zweimal mit Farbepuffer gewaschen Die Antikorperbindung wurde durch Zusatz von je 100 1 des spezifischen Substrats nachgewiesen und die Farbreaktion durch Zugabe von je 50 1 Stopplosung nach ca 3 Minuten abgebrochen Die Auswertung erfolgte durch Messen der optischen Dichte (OD) bei 490nm (Wellenlänge der Referenzmessung ist 620nm)
Wie in Fig 3 ersichtlich ist, zeigt die affinitatsgereinigte Antikorperfraktion eine deutliche Bin- dung an den Antikörper 17-1A,
wahrend normales Human-Immunglobulin praktisch nicht bindet
Die durch Affinitätsreinigung erhaltene Antikorperfraktion wurde mit Aluminium-hydroxid als Adjuvans nach folgender Vorschrift formuliert
3 ml der nach Affinitatschromatographie erhaltenen Antikorperlosung (enthalt ca 40 g Anti korper) wurden mit 1 mg Aluminiumhydroxid (wässrige Suspension, Alhydrogel, Superfos) versetzt und die Suspension in einem "FILTRON" Zentnfugenröhrchen (MicrosepTM cut-off 10KD) bei 4000 x g 30 Minuten lang zentrifugiert Anschliessend wurde 2 x mit je 1 ml des Formulierungspuf- fers aufgeschlammt und bei 4000 x g 30 Minuten lang zentrifugiert Die Suspension wurde mit Formulierungspuffer auf 0,5 ml aufgefullt und die so erhaltene Suspension steril abgefullt
Der Rhesusaffe,
aus dessen Serum obiger autologer Impfstoff gewonnen wurde, wurde mit diesem Impfstoff subkutan in den Rucken geimpft Vor dieser ersten Impfung wurden 5 ml Blut zur Serumgewinnung (zur Bestimmung des Ausgangswertes für die Charakterisierung der Immunant- wort) abgenommen Zwei Wochen danach wurden erneut 10 ml Blut zur Serumgewinnung abge- nommen Mit 4 ml dieses Serums wurde die Gewinnung eines autologen impfs wiederholt, wie oben beschrieben Der so erneut gewonnene Impfstoff wurde dem Rhesusaffen wieder subku- tan in den Rucken injiziert 4 Wochen nach dieser Impfung wurden wieder 5 ml Blut zur Serumge- winnung abgenommen (zur Bestimmung des Effektes der beiden Impfungen).
Das Pra-Serum dieses Rhesusaffen und das Immunserum 4 Wochen nach der 2 Impfung wurde in einem Zell-ELISA auf Bindung von Antikörpern auf die Kato 111 Zellinie untersucht Zu die- sem Zweck wurde wie folgt vorgegangen
Die Löcher einer Mikrotiterplatte wurden mit je 100 1 einer Zellsuspension der Kato 111 Zellinie in der Konzentration von 2x106 Zellen/ml in Medium A über Nacht bei +37 C inkubiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde die Platte mit je 50 1 Fixierlösung pro Loch 5 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert Nach Absaugen des Überstandes wurden je 200 1 Blockierungspuffer
B zupipettiert und die Platte 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit je 200 1 Waschpuffer B wurden je 100 1 Aliquots der zu testenden Affenseren in Verdünnun- gen von 14 bis 1:56 000 in Verdünnungspuffer B 1 Stunde bei 37 C inkubiert.
Nach zweimaligem Waschen der Platte mit je 100 1 eiskaltem Waschpuffer B wurden je 100 1 eines Peroxidase konjugierten Ziegen-anti-Human-Ig Antikörpers (Zymed) in einer Verdünnung von 1. 1000 in Ver- dünnungspuffer A zugesetzt und 45 Minuten bei 37 C inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit je
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100 1 eiskaltem Waschpuffer B gewaschen. Die Antikörperbindung wurde durch Zusatz von je 100 I des spezifischen Substrats nachgewiesen und die Farbreaktion durch Zugabe von je 50 1 Stopplösung nach ca. 5 Minuten abgebrochen.
Die Auswertung erfolgte durch Messen der opti- schen Dichte (OD) bei 490nm (Wellenlänge der Referenzmessung ist 620nm)
Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, befinden sich im Immunserum des autolog geimpften Rhesuaffen Immunglobuline, die auf Kato 111 Tumorzellen binden können, während im Prä-Serum desselben Tieres solche Antikörper kaum nachweisbar sind
Auf Grund der Ergebnisse der oben beschriebenen Experimente ist beispielhaft gezeigt, dass die Vakzinierung mit individuellen autologen Antikörperfraktionen, die durch Immunaffmtätsrem- gung an einem monoklonalen Antikörper gegen ein Tumorassoziiertes Antigen erhalten wurden, eine humorale Immunantwort ausgelöst wurde, die auf menschlichen Tumorzellen, die dieses Tumor-assoziierte Antigen exprimieren, bindet
PATENTANSPRÜCHE:
1 Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats, welches Antikörper oder deren Fragmente und Derivate mit gleicher Bindungsaktivitat umfasst, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Antikörper, Fragmente oder Derivate aus menschlichem Serum durch Immunaffinitätsreinigung gewonnen werden, wobei als Liganden fur die Immunaffinitats- reinigung monoklonale Antikörper, die gegen Tumor-assoziierte Antigene gerichtet sind, oder deren Fragmente mit gleichem Idiotyp verwendet werden
<Desc / Clms Page number 1>
Antibody fractions or their derivatives which bind to monoclonal antibodies against tumor-associated antigens and which are obtained from individual blood by immunoaffinity purification on specific ligands can be used in a suitable formulation for individual, autologous prophylactic or therapeutic vaccination against cancer. The ligands for immunoaffinity purification are monoclonal antibodies or their derivatives which are targeted against tumor-associated antigens.
The adaptive immune system of humans consists of two essential components, humoral and cellular immunity. The adaptive immune response is based on the clonal selection of B and T lymphocytes and in principle allows the detection of any antigen and the development of an immunological memory Features of the adaptive immune system are generally addressed in a useful manner during vaccinations.
Each B cell produces an antibody with a specific binding specificity. This antibody is also a specific receptor in the membrane of the B cell that produces it. The humoral immune response against antigens recognized as foreign is based on the selective activation of those B cells which produce those antibodies which can bind to epitopes of the respective antigen. DNA rearrangements play a crucial role in the course of B cell differentiation for the variety of antibodies
In human serum there are a large amount of antibodies of various specificities, isotypes and subclasses. The total concentration of all immunoglobulins in the serum is 15-20 mg / ml;
that is, about 100 g of immunoglobulins of various specificities circulate continuously in the blood. It is not possible to specify the exact number of all antibodies with different specificities, the theoretically possible repertoire could be around 1011. A certain antibody can generally have different, similar antigens bind, albeit with different affinity and avidity
The immune system must maintain homeostasis with regard to the distribution and weighting of these different specificities with the help of endogenous regulatory mechanisms. An essential mechanism for this is the "idiotypical network" that Niels Jerne postulated about 25 years ago (Jerne, NK Ann.lmmunol 125C 373- 89,1974) Against any idiotype of an antibody,
which determines its binding specificity, there are anti-idiotypic antibodies which bind to the idiotype of the first antibody in the sense of antigen recognition. Jerne suggested that the interactions between the idiotype-specific receptors on lymphocytes could be responsible for the regulation of the immune system.
These interactions obviously actually take place, since it has been shown that in the course of an immune response, anti-idiotypic antibodies against the antibodies induced by the immune response pnmar also arise. Because there are anti-idiotypic antibodies against every antibody, lymphocytes are against idiotypes of antibodies basically not tolerant
Some anti-idiotypic antibodies can immunologically refer to the?
Represent internal image of an antigen. Such antibodies can therefore be used as a surrogate of the nominal antigen for immunization, since the antibodies induced by immunization can bind in part to the nominal antigen. This approach has been pursued for a long time, particularly in cancer immunotherapy more than 10 years ago, a series of practical and clinical projects to elicit immune responses against tumor-associated antigens by vaccination with monoclonal anti-idiotypic antibodies (for a summary see
M. Bhattacharya-Chatterjee, K. Foon, Anti-idiotype antibody vaccine therapies of cancer Cancer Treat.
Res 94 51-68,1998) Most of these monoclonal anti-idiotypic antibodies are of mune origin, but there are also attempts with human monoclonal anti-idiotypic antibodies (e.g. Fagerberg J, et al., PNAS 92: 4773-77, 1995).
The attempts at therapeutic immunization of patients represent a special case
B-cell lymphomas represent In these diseases, a certain B-cell clone degenerates, which produces a certain immunoglobulin with a characteristic idiotype and also as
Receptor in the cell membrane carries This antibody is monoclonal and can be seen as a tumor-specific antigen for the individual B-cell lymphoma. It has been shown that such patient-specific autologous antibodies, produced in cell culture and administered in a suitable immunogenic form as a vaccine, can elicit an immune response against the idiotype of this antibody, which can have an action against B-cell lymphoma (Reichardt VL .
<Desc / Clms Page number 2>
et al., Blood 93: 2411-9, 1999).
In summary, it has been shown so far that @human monoclonal anti-idiotypic antibodies that mimic a tumor-associated antigen, as a vaccine, can trigger an immune response in cancer patients that can be directed against this tumor-associated antigen. Such human monoclonal antibodies
EMI2.1
who had received a (mostly murine) anti-tumor antibody for passive immunotherapy and who had built up an immune response against it.
@ Human antibodies, which are produced by a B-cell lymphoma and therefore have a defined idiotype, can trigger a patient-specific individual vaccination as an immune response that can be directed against the B-cell lymphoma. Such patient-specific antibodies must be obtained individually using hybridoma technology or immortalization of the cells of B-cell lymphoma. Their use is naturally limited to the treatment of B-cell lymphomas
The subject invention is now explained in more detail below
The pool of antibodies, which are present in large amounts in the blood of every human being, contains antibodies of every possible binding specificity. Therefore, this antibody pool basically also contains antibodies (Ab2)
against the idiotype of (already known or also new) munich monoclonal antibodies (Ab1) against any tumor-associated antigens According to the immunological network, the same antibody pool in every human being also contains a certain amount of antibodies against the idiotypes of the autologous Ab2 (= Ab3) Ab3 can bind to the tumor-associated antigen, which is defined by the external Ab1, according to the network theory. A shift in the Ab2 / Ab3 balance in favor of Ab3 must result in the immune system being able to better recognize and attack tumor cells that carry this antigen
The basis of the present invention is
that such a shift in the immunological balance can be achieved by administering an individual autologous Ab2 fraction in the form of an immunogenic vaccine. Such autologous vaccination can selectively stimulate those B cells that produce Ab3. Only small amounts are required for such a vaccination the Ab2 fraction necessary, which are formulated immunogenically using a suitable vaccine adjuvant according to methods known per se
Another integral part of the subject invention is
that winning
EMI2.2
Antibodies in the serum can be used as ligand, one or more monoclonal antibodies against tumor-associated antigens are used. Various antibodies against different tumor-associated antigens have long been known or can be used with methods known per se (for example hybridoma technology, phage display technology). getting produced
EMI2.3
If noclonal antibodies against different tumor-associated antigens are used at the same time, a fraction of different Ab2 is obtained which is based on the selected set of tumor-associated antigens and whose simultaneous use as a vaccine elicits an immune response against all of these tumor-associated antigens immunological balance in one step towards the detection of a set of (often co-expressed)
Targeted tumor-associated antigens Naturally, such a procedure increases the effectiveness of the induced immune response and essentially reduces the formation of antigen-negative variants of the tumor ("tumor escape"), since it is extremely unlikely that a tumor cell can switch off the expression of several antigens at the same time
EMI2.4
3 - 10 g of immunoglobulin per ml of serum used. In general, the antibody fraction thus obtained consists of both IgM and IgG. It is therefore possible to obtain approx. 0.08 - 0.25 mg Ab2 from an amount that is acceptable for blood collection, e.g. 50 ml, which leads to approx. 25 ml serum.
This amount is in itself sufficient for vaccination. If it is desired to obtain larger amounts of Ab2, known techniques of plasmapheresis, combined with immunoaffinity purification, can also be used
Basically, the method described above can be applied to all known or newly discovered
<Desc / Clms Page number 3>
Tumor-associated antigens are based.
The only requirement is that one or more monoclonal
EMI3.1
In principle, both monoclonal antibodies and antibodies from other species (eg rats) are suitable. Furthermore, mouse-human chimeric, humanized or human monoclonal antibodies against tumor-associated antigens can also be used Antibody cleaning used antibodies is determined by their binding region, that is, their idiotype. Therefore, in principle, can take place
EMI3.2
as long as these fragments continue to contain the idiotype of the respective starting antibodies. Examples (but not limited to these) include F (ab) '2 fragments, F (ab)' fragments Fv fragments,
which can be produced according to known biochemical methods (enzymatic cleavage) or according to known molecular biological methods
EMI3.3
Antibodies used against these antigens are related to the antigenic character of the tumor indication against which vaccination is to be carried out.
The following already known tumor-associated antigens, which are frequently exposed to various, in particular epithelial, tumors, are given as examples, but the use of the autologous vaccination method described here is in no way limited to these antigens
Epithelial Cell Adhesion Molecule (Ep-CAM) Carcino Embryonic Antigen (CEA) Lewis Y Carbohydrate
Sialyl Tn carbohydrate
Globo H carbohydrate
Gangliosides like GD2 / GD3 / GM2
Prostate Specific Antigen (PSA)
CA 125
CA 19-9
CA 15-3
TAG-72
Neural time adhesion molecule (N-CAM)
Her2 / New receptor
Against all mentioned antigens are (mostly several)
monoclonal antibodies
EMI3.4
suitable for the extraction of Ab2
The method described here for obtaining an autologous vaccine from the serum of an individual is naturally not limited to just one application. The shift in the immunological repertoire towards antitumor activity caused by a first vaccination can be further reinforced by repeating this process, eg B a few weeks after the first autologous vaccine has been obtained, blood can be drawn again by immunoaffinity cleaning and an autologous vaccine can be prepared and administered again. This also ensures that the respective status of the immunological balance is always taken into account in the individual vaccine.
This process can be carried out again and again at suitable intervals (for example, every 4 - 8 weeks, then every 6 months).
The new method for vaccination with autologous antibodies described here is suitable in principle for both therapeutic and prophylactic purposes. Repeated therapeutic vaccination of cancer patients can suppress the formation of new metastases and at least slow the dissemination of the disease. Therapeutic autologous vaccinations can be particularly beneficial in the following stages of the disease.
In early stages of the disease, for example after successful operation of a primary tumor (adjuvant stage), the autologous vaccinations described here cause residual, dissimilar
<Desc / Clms Page number 4>
mined tumor cells destroyed and prevented from establishing themselves as new metastases.
As a result, the relapse-free life span and thus the overall survival time of such patients can be extended. Such autologous vaccinations and booster vaccinations carried out at appropriate intervals can possibly provide lifelong protection against the formation of metastases.
If metastases have already occurred, the spread and formation of further metastases can be curbed by the autologous vaccinations described here. This stabilizes the course of the disease, whereby the quality of life can be prolonged if the quality of life is maintained
The strategy of autologous vaccinations described here can also be used in patients who have previously been given a monoclonal antibody against a tumor-associated antigen for diagnostic or therapeutic reasons and one against
EMI4.1
this antibody as a ligand antibody (Ab2), on the other hand, can be obtained in larger amounts than in untreated individuals.
Vaccination with these Ab2 then strengthens the formation of possibly already intrinsically formed Ab3. The intrinsic induction of Ab3 with potential antitumor properties via induction of Ab2 by passive immunotherapy with munical antibodies against tumor-associated antigens (Ab1), which i.v. given to cancer patients has been postulated and studied for many years (e.g. Koprowski H et al .;
PNAS 81 '216-19, 1984)
In principle, the autologous vaccinations described here can also be used to prophylactically build up increased protection against the development of cancer in healthy individuals. Such a measure can prove to be useful, especially in risk groups (for example, people with a genetic predisposition, certain To develop cancer diseases, which can be raised to an increasing extent by appropriate tests)
A general advantage of the strategy of individual autologous vaccination described here lies in the fact that the immunological status of the individual in relation to the idiotypic network is taken into account,
because the respective vaccine is made from the individual serum
Furthermore, the immunized person does not come into contact with any foreign antigens, but is treated in a suitable form only with the body's own constituents which bring about a modulation of the immunological balance
The immune response induced by vaccination with autologous antibodies is determined by the binding region of these antibodies, that is, their idiotype. Therefore, in principle, fragments or derivatives of these antibodies can be successfully used for vaccination instead of intact antibody fractions, as long as these derivatives are the idiotype of the respective one Also include parent antibodies As examples, but not limited to, are mentioned.
F (ab) '2-fragments and F (ab)' fragments, which can be produced by known biochemical methods (enzymatic cleavage), and antibody derivatives, which can be produced by known chemical or biochemical methods, such as, for example, antibodies amidated with fatty acids on free amino functions in order to increase lipophilicity for incorporation into liposomes
As is usual with vaccines, the autologous antibody fractions or their fragments and derivatives can be formulated together with vaccine adjuvants. The adjuvants increase the immune response. Examples of adjuvants, but not limited to them, are aluminum hydroxide (aluminum gel ), Derivatives of Lipopolysacchand, Bacillus Calmette Guenn (BCG), QS-21, liposome preparations,
Formulations with additional antigens against which the immune system has already given a strong immune response, such as tetanus toxoid or components of influenza viruses, if necessary in a liposome preparation.
To strengthen the immune response, the vaccine preparation can also be administered with appropriate human cytokines that support the development of an immune response. Granulocyte macrophage stimulating factor (GM-CSF) should be mentioned here in particular, if not exclusively. This cytokine stimulates by activating antigen processing
Cells (eg dendritic cells) have an efficient immune response.
If necessary, the autologous antibody fractions can also be prepared according to known and
<Desc / Clms Page number 5>
published methods are incubated with autologous, ex vivo cultured dendritic cells. The pulsed dendritic cells are then re-administered to the individual concerned. In this way, a particularly efficient immune response can be achieved.
The invention is explained in more detail with reference to the following examples and drawing figures, to which it should of course not be restricted.
Show it
Figure 1 is a chromatogram of immunoaffinity purification (using immobilized antibody 17-1a) of the antibody fraction from rhesus monkey serum;
EMI5.1
low antibody fraction,
3 shows the binding of serum antibodies obtained by affinity purification to antibody 17-1A: 17-1AELISA,
4 shows the result of an autologous vaccination of a rhesus monkey. Binding of serum Ig to Katolll tumor cells (cell ELISA);
Fig. 5 schematically shows the principle of the present invention.
The following materials were used in the following examples, which further explain the present invention but are not intended to restrict it
EMI5.2
<tb> Microtiter plates <SEP> Immuno <SEP> Plate <SEP> F96 <SEP> MaxiSorp <SEP> (Nunc) <SEP> for <SEP> ELISA
<tb> Cell <SEP> Culture <SEP> Cluster <SEP> (Costar, <SEP> Cat <SEP> Nr <SEP> 3598) <SEP> for <SEP> cell ELISA
<Tb>
EMI5.3
EMI5.4
<tb> (ATCC <SEP> HTB <SEP> 103)
<Tb>
<tb> Coupling buffer <SEP> 0.1 <SEP> M <SEP> NaHC03
<tb> 0.5 <SEP> M <SEP> NaCI
<tb> pH <SEP> 8.0
<Tb>
<tb> cleaning buffer <SEP> A <SEP> PBS <SEP> def
<tb> 0.2 <SEP> M <SEP> NaCI
<Tb>
<tb> cleaning buffer <SEP> B <SEP> 0.1 <SEP> M <SEP> glycine <SEP> / <SEP> HCI
<tb> 0.2 <SEP> M <SEP> NaCI
<tb> pH value <SEP> 2,
9
<Tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> RPMI <SEP> 1640 <SEP> + <SEP> 2 <SEP> g / 1 <SEP> NaHC03
<tb> 100 <SEP> U / ml <SEP> penicillin <SEP> G
<Tb>
EMI5.5
EMI5.6
<tb> 4 <SEP> mM <SEP> glutamine
<tb> 10 <SEP>% <SEP> fetal <SEP> calf serum <SEP> (heat inactivated)
<Tb>
<tb> Binding buffer <SEP> 15 <SEP> mM <SEP> Na2CO3
<tb> 35 <SEP> mM <SEP> NaHC03
<tb> 3 <SEP> mM <SEP> NaN3
<tb> pH <SEP> 9.6
<Tb>
<tb> PBS <SEP> deficient <SEP> (def): <SEP> 138 <SEP> mM <SEP> NaCI
<tb> 1.5 <SEP> mM <SEP> KH2P04 <SEP>
<tb> 2.7 <SEP> mM <SEP> KCI
<tb> 6.5 <SEP> mM <SEP> Na2HP04
<tb> pH value <SEP> 7.2
<Tb>
<tb> Fixing solution <SEP> 0.1 <SEP>% <SEP> glutardialdehyde <SEP> in
<tb> physiological <SEP> NaCI solution
<Tb>
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb> wash buffer <SEP> A:
<SEP> 2% <SEP> NaCI
<Tb>
<Tb>
<tb> 0.2% Triton <SEP> X-100 <SEP>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> Wash buffer <SEP> B- <SEP> 0.05 <SEP>% <SEP> Tween <SEP> 20 <SEP> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> blocking buffer <SEP> A.
<SEP> 5 <SEP>% <SEP> fetal <SEP> calf serum <SEP> (heat inactivated)
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> blocking buffer <SEP> B '<SEP> 1 <SEP>% <SEP> bovine serum albumin
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> 0.1 <SEP>% <SEP> NaN3
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> Dilution buffer <SEP> A <SEP> 2% <SEP> fetal <SEP> calf serum <SEP> (heat inactivated)
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> in <SEP> PBS <SEP> deficient
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> Dilution buffer <SEP> B <SEP> PBS <SEP> deficient
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> Color buffer <SEP> 24.3 <SEP> mM <SEP> citric acid
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> 51.4 <SEP> mM <SEP> NazHP04 <SEP>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> pH value <SEP> 5,
0
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> substrate <SEP> 40 <SEP> mg <SEP> o-phenylenediamine <SEP> dihydrochloride
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> 100 <SEP> ml <SEP> color buffer
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> 20 <SEP> 1 <SEP> H202 <SEP> (30%)
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> Stop solution <SEP> 4 <SEP> N <SEP> HzS04
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> formulation buffer <SEP> 10 <SEP>% <SEP> PBS <SEP> def, <SEP> pH <SEP> = <SEP> 5,
5
<Tb>
<Tb>
<Tb>
<tb> 90 <SEP>% <SEP> physiological <SEP> NaCI solution
<Tb>
The method described here for autologous vaccination was tested on healthy rhesus monkeys. For this purpose, 10 ml of penpheric blood was taken from a rhesus monkey and
EMI6.2
Rhesus monkeys were first made an immunoaffinity matrix according to the following proposal. The whole procedure was carried out under sterile conditions
7.5 g of CH-Sepharose 4B (Pharmacia) were suspended in 20 ml of 1 mM HCl for 15 minutes. The gel was then washed with 1 liter of 1 mM HCl and then with 200 ml of coupling buffer on an AG3 sintered glass filter 100 mg of munner antibody 17-1A (Panorex, stock solution 10 mg / ml, overnight against the tumor-associated antigen Ep-CAM)
were dialyzed against 5 liters of coupling buffer and adjusted to 5 mg / ml with coupling buffer. This solution was mixed with the gel suspension in a closed vessel. A gel buffer ratio of 1.2 results in a suspension suitable for coupling. This suspension was rotated at 4 C for 24 hours. The excess of the ligand was then washed away with 3 × 30 ml of coupling buffer. Remaining reactive groups were blocked by incubation at 4 C with 1 M ethanolamine for one hour. Then the gel was rotated for one hour at room temperature with a 0.1 M Tris-HCl buffer. Finally the gel was washed with 3 cycles of buffers with alternating pH.
Each cycle consists of 0.1 M sodium acetate buffer pH 4 with 0.5 M NaCl, and then 0.1 M Tris-HCl buffer pH 8 with 0.5 M NaCI. The gel was stored at 4 C.
EMI6.3
the gel obtained according to the above instructions was filled into a Pharmacia HR5 / 5 column. 5 ml of serum were diluted 1 10 with the cleaning buffer A. This solution was pumped over the column at 1 ml / minute and washed with cleaning buffer A until the UV baseline of the
<Desc / Clms Page number 7>
Detector is reached again (280 nm). Bound immunoglobulins were then eluted with cleaning buffer B and the fraction was neutralized with 1 M Na2HP04 immediately after desorption.
A chromatogram of this purification (UV 280 nm) can be found in Fig. 1
50 l of the antibody fraction purified in this way were analyzed on a size separation column (SEC, Zorbax 250 GF). 220 mM phosphate buffer pH 7 + 10% acetonitrile was used as the eluent. As can be seen from the chromatogram of this analysis (FIG. 2), the antibody fraction contains IgM and IgG in a ratio of approx. 3: 2. Total amount of the antibody fraction was approx. 40 g (determined by SEC compared to a standard)
The antibody fraction thus obtained was tested in an ELISA for binding to antibody 17-1A (which was used as a ligand for affinity purification).
100 1 aliquots of the antibody used for affinity purification against a tumor-associated antigen (antibody 17-1A, solution with 10 g / min binding buffer) were incubated for 1 hour at 37 C in the wells of a microtiter plate. After washing the plate six times with washing buffer A, 200 l of blocking buffer A were added and incubated for 30 minutes at 37 ° C. After washing the plate as described above, 100 l aliquots of the affinity-purified antibody fraction to be tested and normal human immunoglobulin in the same concentration were added as a negative control in dilutions of 1 4 to 1 65 000 in dilution buffer A for 1 hour at 37 C after washing the plate as described above, 100 1 of the peroxidase-conjugated goat anti-human-Ig antibody (Zymed)
added in a dilution of 1 1000 in dilution buffer A and incubated for 30 minutes at 37 ° C. The plate was washed four times with washing buffer A and twice with color buffer. The antibody binding was detected by adding 100 1 of the specific substrate and the color reaction by adding 50 1 stop solution canceled after approx. 3 minutes The evaluation was carried out by measuring the optical density (OD) at 490nm (wavelength of the reference measurement is 620nm)
As can be seen in FIG. 3, the affinity-purified antibody fraction shows a clear binding to the antibody 17-1A,
while normal human immunoglobulin practically does not bind
The antibody fraction obtained by affinity purification was formulated with aluminum hydroxide as an adjuvant according to the following procedure
3 ml of the antibody solution obtained after affinity chromatography (contains approx. 40 g of antibody) were mixed with 1 mg of aluminum hydroxide (aqueous suspension, Alhydrogel, Superfos) and the suspension in a "FILTRON" centrifuge tube (MicrosepTM cut-off 10KD) at 4000 xg for 30 minutes centrifuged for long times, the mixture was then slurried twice with 1 ml of the formulation buffer and centrifuged at 4000 × g for 30 minutes. The suspension was made up to 0.5 ml with formulation buffer and the suspension thus obtained was filled sterile
The rhesus monkey,
From the serum from which the above autologous vaccine was obtained was vaccinated subcutaneously in the back with this vaccine. Before this first vaccination, 5 ml of blood were taken for serum collection (to determine the initial value for the characterization of the immune response). Two weeks later, 10 ml of blood was drawn again taken for serum collection With 4 ml of this serum, the collection of an autologous vaccine was repeated, as described above. The vaccine thus recovered was injected subcutaneously into the back of the rhesus monkey. 4 weeks after this vaccination, 5 ml of blood were again used for serum winung removed (to determine the effect of the two vaccinations).
The Pra serum of this rhesus monkey and the immune serum 4 weeks after the 2 vaccination were examined in a cell ELISA for the binding of antibodies to the Kato 111 cell line. For this purpose, the procedure was as follows
The wells of a microtiter plate were incubated with 100 l of a cell suspension of the Kato 111 cell line in the concentration of 2x106 cells / ml in medium A at +37 C overnight. After the supernatant had been suctioned off, the plate was added for 5 minutes with 50 l of fixing solution per hole
Incubated at room temperature After aspirating the supernatant, 200 1 blocking buffer were added
B pipetted in and the plate incubated for 1 hour at room temperature. After washing twice with 200 l of wash buffer B, 100 l aliquots of the monkey sera to be tested were incubated in dilutions from 14 to 1:56 000 in dilution buffer B at 37 C for 1 hour.
After washing the plate twice with 100 l of ice-cold wash buffer B in each case, 100 l of a peroxidase-conjugated goat anti-human-Ig antibody (Zymed) were added in a dilution of 1,100 in dilution buffer A and incubated at 37 C for 45 minutes , The plate was made three times each
<Desc / Clms Page number 8>
100 1 ice-cold wash buffer B washed. The antibody binding was detected by adding 100 l of the specific substrate and the color reaction was terminated after about 5 minutes by adding 50 l of stop solution.
The evaluation was carried out by measuring the optical density (OD) at 490nm (wavelength of the reference measurement is 620nm)
As can be seen from FIG. 4, there are immunoglobulins in the immune serum of the autologous inoculated rhesuaffe which can bind to Kato 111 tumor cells, whereas in the pre-serum of the same animal such antibodies are hardly detectable
Based on the results of the experiments described above, it has been shown, by way of example, that vaccination with individual autologous antibody fractions, which were obtained by immunoaffinity reduction on a monoclonal antibody against a tumor-associated antigen, triggered a humoral immune response which is due to human tumor cells which contain this tumor -express associated antigen binds
CLAIMS:
1 Process for the preparation of a pharmaceutical preparation which comprises antibodies or their fragments and derivatives with the same binding activity, characterized in that the antibodies, fragments or derivatives are obtained from human serum by immunoaffinity purification, using monoclonal antibodies as ligands for the immunoaffinity purification which are directed against tumor-associated antigens or whose fragments are used with the same idiotype