DE1949399B - Glycolphosphatidgemische und deren Herstellung - Google Patents

Description

Die bekannten Kephalinfraktionen enthalten bei Gewinnung aus pflanzlichem Material neben Lecithinen im wesentlichen Phosphatidylcolamin und im Falle der Gewinnung aus tierischen Quellen Phosphatidylcolamin und Phosphatidylserin. Diese Kephaline weisen je nach dem speziellen Ausgangsmaterial unterschiedliche Fettsäurereste mit im allgemeinen bis 24 Kohlenstoffatomen auf. Die für therapeutische Zwecke bevorzugten Kephalinfraktionen enthalten Phosphatidylcolamine bzw. Phosphatidylserine, die einen großen Prozentsatz an ungesättigten, insbesondere mehrfach ungesättigten Fettsäureresten besitzen. Wegen der starken Reaktionsfähigkeit, besonders der mehrfach ungesättigten Fettsäuren, ist deren Isolierung nicht einfach. Sie fallen im allgemeinen bei der Extraktion von Rohphosphatiden mit niederen Alkoholen an.

Die Kephaline bzw. die diese enthaltenden Phos· phatidfraktionen können unter anderem als natürliche Emulgatoren dienen, da sie neben den lipophilen Fettsäureresten noch die hydrophile Olycerinphosphorsäuregruppierung nebst den ebenfals hydrophilen Colamin· oder Serinresten aufweisen. Aller· dings ist die Emulgatorwirkung relativ gering, was »$ darauf zurückgeführt werden kann, daß die freie Aminogruppe durch die Phosphorsäuregruppe intramolekular satzartig gebunden ist.

Wegen der Anwesenheit der aus physikalischchemischen sowie biologischen Gründen wertvollen ungesättigten Fettsäuren finden kephalinhaltige Phosphatidgemische auch als Arzneimittel Verwendung. Als Emulgatoren für eine intravenöse Fetternährung sind sie allerdings nur mit Vorsicht einzusetzen, da die Kephaline als solche Aktivatoren der Blutgerinnung sind. Außerdem hat sich herausgestellt, daß die bisher für intravenöse Fetternährung verwendeten kephalinhaltigen Phosphatide unangenehme Nebenwirkungen wie Fieber und Schüttelfrost hervorrufen können. Wie jetzt erkannt wurde, müssen diese nachteiligen Wirkungen in erster Linie der Aminogruppe der Kephaline zugeschrieben werden.

Aus der USA.-Patentschrift 3 301 881 ist schon ein Verfahren bekannt, bei dem durui Behandlung wäßriger Phosphatidemulsionen mit organischen Säureanhydriden das Ktphalin ganz oder teilweise acyliert wurde, wodurch die primäre Aminogruppe

ao in ein Säureamid überführt wurde. Dadurch sollen die Phosphatide verträglicher werden und in wäßrigen Medien leichter disperg«ert werden können. Allerdings ist ihre Emulgierfähigkeit doch nicht besser als die der nicht acylierten Kephaline. Eb wäre daher wünschenswert, wenn man solche Emulgatoren einsetzen könnte, die nicht nur arm an Kephalinen sein würden, sondern bei denen diese Substanzen völlig fehlen, doch hat sich gezeigt, daß reine Lecithine keine ausreichenden emulgatorischen Eigenschaften aufweisen. Die gänzliche Abtrennung der Kephaline führt daher auch nicht zur Lösung des Problems.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß

durch DesaminJerung von Phosphatidylcolaminen oder Phosphatidylserinen für den vorstehend angegebenen Verwendungszweck geeignete und gut verträgliche Emulgatoren erhalten werden können.

Gegenstand der Erfindung sind Glycolphosphatidgemische der allgemeinen Formel

H₂C-O- R¹

HC-O —R²
H₂C — O — P — O — CH₂CHOH

O OH X

worin R¹ und R² in pflanzlichen und tierischen Phosphatidcn vorkommende Fettsäurereste mit 10 bis 24 C-Atomen darstellen und X ein Wasserstoffatom oder die — COOH-Gruppe ist.

Glycolphosphatidgemische, in denen die Fettsäurereste ungesättigt oder mehrfach ungesättigt sind, sind bevorzugt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zui Herstellung der Glycolphosphatidgemische der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel, das dadurcr gekennzeichnet ist, daß man bei Raumtemperatui oder unter schwacher Erwärmung zu einer Lösunj von Phosphatidylcolamin und/oder Phosphatidyiserit in einem organischen Lösungsmittel eine gekühlt) wäßrige salpetrige Säure hinzufügt und die durcl Diazotierung und Hydrolyse desaminierten Phospha tidverbindungen in an sich bekannter Weise isoliert

Die Fettsäuren pflanzlicher und tierischer Zellei besitzen bekanntlich immer eine gerade Anzahl voi C-Atomen und sind bis auf ganz seltene Ausnähmet geradkettiger Natur (Wolfgang Langenbeck

Lehrbuch der Organischen Chemie, 13./14, Auflage, 1053, Steinkopf-Verlag Dresden und Leipzig; Fortschritte der Medizin, Bd. 83, S, 517 bis 519, 1965). Die Phosphatide mit ungesättigten Fettsäuren, zu denen im wesentlichen die ölsäure sowie die Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure gehören, sind in pflanzlichen und tierischen (sowohl bei Warmblütern als auch bei Fischen) Fetten und ölen weit verbreitet. Sie sind wegen ihrer physiologischen Stoffwechselwirkungen von Bedeutung, weshalb die erfindungsgemäßen Glycolphosphatide mit ungesättigten oder mehrfach ungesättigten Fettsäureresten besonders wertvoll sind.

Die neuen Glycolphosphatidgemische, die man auch als Desaminokephaline bezeichnen kann, sind im Gegensatz zu den Kephalinen völlig alkohollöslich. Sie weisen gleichzeitig auch eine wesentlich größere Wasserlöslichkeit auf als die Phosphatidylcolamine und Phosphu'.idylserine. Da sie die störende Blutgcrinnungsakiivität der Kephaline nicht mehr besii/en, sind die neuen Glycolphosphatide für die intravenöse Fetternährung vorzüglich geeignet. Gleichreitig können sie auch als wirksamere öl-in Wasser-P-nulgatoren zur Herstellung von Fettpräparaten dienen. Auf Grund der reaktionsfähigen freien _a5 Hydroxylgruppe sind die Glycolphosphatide auch ■jv.r Herstellung weiterer, an der OH-Gruppe substituierter Verbindungen, z. B. Esterverbindungen, geeignet und d^her auch wertvolle Zwischenprodukte für neuartige Arzneimittel. Die Zusammensetzung der Fettsäuren schwankt je n« ;h verwendetem Kephalinausgangsmaterial. Irr. allgemeinen überwiegt der Anteil an Fettsäuren mit ώ.. Kohlenstoff zahl 16 und 18, was auch für die ungesättigten Fettsäuren gilt. Bei Kephalinen aus Eidotter enthalten die daraus hergestellten Glycolphosphatide unter anderem auch C₂₀- und Cjj-Fettsäuren, bei Gehirn als Ausgangssuhstanz auch noch C^-Fettsäuren.

Gegenüber den Kephalinen ist durch die Desaminierung zu den Glycolphosphatiden sog?r die Emulgierkraft verbessert, wie die nachfolgenden einfachen Versuche leicht erkennen lassen.

Ein einfacher Schütteltest zur Prüfung der Eignung als Emulgator bei einer Öl-in-Wasser-Emulsion wird wie folgt durchgeführt:

1 g eines Phosphatids wird in einem 100-ml-Schüttelzylinder in 10 g Sonnenblumenöl durch Erwärmen im Wasserbad auf 70'C unter Schütteln in Lösung gebracht. Nach dem Abkühlen auf 25⁰C werden 90 ml dest. Wasser von 25 C zugefügt und die Phasen durch scharfe Auf- und Abbewegungen des Zylinders jede 30 Sekunden emulgiert. Es wird die Zahl der Schüttelungen ermittelt, die notwendig sind, um eine Emulsion zu bilden, die wenigstens 30 Sekunden stabil ist.

Soja-Rohphosphatid

entöltes Soja-Rohphos phatid

alkoholufllösliche Fraktion aus Soja-Rohphosphatid..

Handels· produkt

Erfindungsgemäß des· amtntertes

Anzahl der Schüttelungen Substanz

10 16 40

1 1 1 Bei vorsichtiger Einwirkung der salpetrigen Säure nach dem Verfahren der Erfindung, z, B. in der K-ftlte, werden auch die mehrfach ungesättigten Fettsäurereste der Phosphatidylverbindungen chemisch nicht verändert. Die spektralanalytischen und gaschromatographischen Untersuchungen zeigten, daß die charakteristische IR-Bande des Kephalins bei 9,8 μ verschwunden ist, ohne daß die Doppelbindungen sich durch die Behandlung verändert haben.

Vorzugsweise erfolgt die Einwirkung der salpetrigen Säure in der Weise, daß man eine wäßrige Lösung eines Salzes der salpetrigen Säure und eines sauren Salzes einer organischen oder anorganischen Säure verwendet und diese wäßrige Lösung unter Rühren der kephalinhaltigen organischen Lösung zutropft. Diese milde Einwirkungsform der salpetrigen Säure ermöglicht, die Umsetzung bei Raumtemperatur oder unter schwacher Erwärmung sogar ohne Gefahr für die sterische Form der ungesättigten Fettsäurereste durchzuführen. Als Lösungsmittel für die kephalinhaltigen Ausgangssubstanzen eignen sich Alkohole oder chlorierte Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 4 C-Atomen. Auch Kohlenwasserstofflösungsmittel sind geeignet. Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Desaminierungsreaktion der Phosphatidylcolamine und/oder Phosphatidylserine hat sich besonders Chloroform als ein sehr brauchbares Lösungsmittel

erwiesen.

Das erfindungsgemäße Desaminierungsverfahren ermöglicht, die Glycolphosphatide leicht zu isolieren, da ihre große AlkohoUöslichkeit die Extraktion und Abtrennung von anderen Begleitphosphatiden sehr erleichtert.

Praktisch geht das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Glycolphosphatide so vor sich, daß entweder reines Kephalin, wie es beispielsweise durch säulenchromatographische Trennung von kephalinreichen Phosphatidraktionen auf Kieselgelsäulen durch Elution mit Chloroform-Methanol-Gemischen gewonnen werden kann, oder ein kephalinhaltiges Phosphatidgemisch — ölhaltig oder entölt — in einem Alkohol oder chlorierten Kohlenwasserstoff mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder in einem Kohlenwasserstofflösungsmittel wie Petroläther, Hexan, Cyclohexan. Benzol oder Mischungen dieser Lösungsmittel gelöst wird, diese Lösung dann unter Kühlung, bei Zimmertemperatur oder höheren Temperaturen mit der wäßrigen Lösung der salpetrigen Säure oder nacheinander oder gleichzeitig mit einer wäßrigen Lösung eines Alkali- oder Erdalkalisalzes der salpetrigen Säure und einem sauren Salz einer anorganischen bzw. organischen Säue, vorzugsweise Natrium-dihydrogenphosphat. Natrium-hydrogencitrat oder Kaliumhydrogenphthalat, versetzt und unter Luftabschluß gerührt wird, bis die den Kephalinphosphatiden zugehörige freie minogrupps nicht mehr mit Ninhydrin-Reagenz nachzuweisen ist. Danach wird bei Verwendung von Alkohol das Lösungsmittel ganz oder teilweise im Vakuum abgedampft ι und vorzugsweise durch einen chlorierten Kohlenwasserstoff ersetzt. Zur Entfernung der wasserlöslichen Anteile kann die Lösung noch zwei- bis dreimal mit Wasser ausgewaschen werden. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter Stickstoff resultiert i ein gelbes bis gelbbraunes plastisches Produkt.

Der besondere Vorteil des Verfahrens unter Verwendung von Salzlösungen liegt darin begründet, daß es möglich ist, bei der Diazotierung der freien

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Aminogruppe auf die Säure ganz ζμ verzichten und die Freisetzung der salpetrigen Säure aus dem Nitrit durch saure Salze in situ so zu steuern, daß eine Umlagerung der in den Pbosplwtiden vorhandenen Fettsäuren zu trans-Fettsäuren praktisch unterbleibt. Auch eine Veränderung in der Fettsäurezusammensetzung der behandelten Produkte tritt nicht auf, Insbesondere bleibt der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, speziell an Poiyeufettsäuren mit ihren essentiellen Eigenschaften, durch das Verfahren unverändert.

In der Regel wird man die Diazotierung bis zur quantitativen Entfernung der primären NH₂-Gruppe des Kephalins durchführen; es ist aber auch unschwer möglich, mit weniger als den in den Beispielen angegebenen Mengen an Natriumnitrit und saurem Salz zu arbeiten, wobei eine teilweise Entfernung des Stickstoffs aus dem Kephalinmolekül erreicht wird, was bereits zu einer guten Verteilung dieser Phosphatidprodukte in wäßrigen Medien führt.

Ein weiterer Vorteil des vorliegenden Verfahrens der Anmeldung ist die Tatsache, daß die kephalinfreien Produkte günstige Eigenschaften aufweisen, z. B. deutlich bessere Säurezahlen und Phosphor-Werte als die entsprechenden Ausgangsprodukte, wie aus der nachfolgend aufgeführten Tabelle hervorgeht.

Tabelle 1

Substanz	Jodzahl	Säurezahl	0/ /n Phosphor
Handelsübliches Roh- phosphatid	86,5	20,3	2,1
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	87,2	9,4	2,34
Entöltes Rohphosphatid	70,3	30,1	3,1
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	77,4	5,5	3,28
Alkoholunlösliche Soja- phosphatid-Fraktion...	66,7	32,3	3,0
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	70,2	14,4	3,23
Alkohollösliche Soja- phosphatid-Fraklion...	85,0	18,0	3,1
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	86,7	4,0	3,12

Für die Umsetzung mit der salpetrigen Säure gemäß der Erfindung kann man die reinen Kephalinverbindungen oder auch die diese enthaltenden Phosphatidgemische verwenden. Die in diesen noch enthaltenen Lecithine können die Umsetzung nicht stören, denn sie werden von der salpetrigen Säure unter den milden Reaktionsbedingungen nicht ange· griffen, da sie keine primären Aminogruppen ent* halten.

Bei der Untersuchung der nach dem erflndungs· gemäßen Verfahren durch Desaminierung von Phos· phatidylcolamin erhaltenen neuen Glycdphosphatide wurden im ViMt des Sojaphosphatids als Ausgangsmaterial bei der gaschromatographlschen Untersuchung .eisende Fettsäuren ermittelt:

Tabelle II

Fettsäu rezusarn mensetzu ng des Phosphatidylglycols aus Sojaphosphatid

Laurinsäure 0,1 %

Myristinsäure 0,2%

Palmitinsäure 26,0%

Stearinsäure 2,0%

Ölsäure 7,0%

Linolsäure 60,0%

Linolensäure 4,5 %

Arachinsäure 0,2%

100,0%

Bei einem aus Ei erhaltenen Gemisch aus Phosphatidylcolamin und Phosphatidylserin wurde nach dem Desaminieren folgende Fettsäurezusammensetzung ermittelt:

'i «.belle III

Fettsäurezusammensetzung des Glycolphosphatids aus Ei-Kephalin (Gemisch aus Colamin- und Serin-

Kephalin)

Caprinsäure 1,2%

Laurinsäure 0,4 %

Myristinsäure 2,0%

Myristoleinsäure 0,2 %

Palmitinsäure 22,6 %

Palmit Oleinsäure 0,7 %

Stearinsäure 23,0 %

ölsäure 17,2%

Linolsäura 16,0%

Linolensäure 2,0%

Arachinsäure 0,4%

Arachidonsäure 12,8 %

Behensäure 1,5%

100,0% Beispiel 1

200 g reines Kephalin (Phosphatidylcolamin), hergestellt aus alkoholunlöslicher Sojaphosphatidfraktion durch säulenchromatographische Trennung auf Kieselgel mit Chloroform-Methanol 80:20 als Elutionsmittel, werden in einem Gemisch von 1000 ml Chloroform und 1000 ml Methanol gelöst und unter Rühren und Einleiten von N₂ mit einer Lösung von 125 g Natriumnitrit in 200 ml dest. Wasser versetzt.

Die Mischung wird im Wasserbad auf 37° C erwärmt. Dann läßt man langsam eine Lösung von 230 g Natriumdihydrogenphospha¹: mal 2 Wasser in 200 ml dest. Wasser zutropfen. Nach insgesamt 2stündigem Rübren bei 37° C ist alles Kephalin diazotiert, und es läßt sich dünnschichtchromatographisch mit Ninhydriii-Reagenz keine Aminogruppe, d. h. kein Kephalin mehr nachweisen.

Zur Aufarbeitung wird vom Unlöslichen dekantiert, der Rückstand mit wenig Chloroform ausgewaschen

So und verworfen. Oie Chloroform-Lösungen werden in einen Scheidetrichter überführt und, falls erforderlich, mit so viel Wasser versetzt, bis sich zwei Schichten ausbilden. Die untere chloroformhaltige Schicht wird abgetrennt und mit etwa 400 ml Wasser

es gewaschen und erneut im Scheidetrichter von der Wasserphase getrennt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unter N₈ bleiben 190 g Olycolphosphatid zurück.

Beisüiel 1 Rückstand dekantiert, der Rückstand mit wenig

^v Chloroform ausgewaschen und dieses Chloroform

500 g alkoholunlösliehe Sojabohnenphosphatidfräk« zur dekantierten Lösung zugegeben, Die vereinigten tion, wie sie durch Entölen von handelsüblichem Lösungen werden dann mit 500 ml Wasser unter N₁ Sojaphosphatid mit Aceton und anschließendem S gerührt, die Lösung im Scheidetrichter kurz absitzen mehrmaligem Extrahieren des entölten Produktes lassen und dann die untere Chloroformschicht von mit Äthanol in der Wärme als Rückstand verbleibt dem Wäschwasser abgetrennt. Gas Auswaschen der (Kephalingehalt «twa 30%), werden in einem Gemisch Chlörttfofmlösung wird noch zweimal mit je 400 ml von 700 ml Chloroform und 500 ml Methanol unter Wasser wiederholt. Zum Schluß wird die Chloroform-Rühren und Einleiten von N, gelöst und mit einer ie lösung im Vakuum unter Stickstoff vom Lösungs-Lösung von 69 g NaNO, in 80 ml dest. Wasser vcr- mittel befreit. Es bleiben 1.8 kg (- 90%) eines setzt. Zu dieser Mischung läßt man dann unter Rühren gelbbraunen, plastischen Phosphatidgemisches zurück, eine Lösung von 138 g NaH₁PO₄ · 1-hydrat in 100 ml das folgende Kennzahlen aufweist: JZ -= 78. SZ dest. Wasser zutropfen. worauf das Reaktionsgemisch = 5,5. P - 3,3°/,. Im Emulsionsbildungs-Test. wie noch wetter bei Zimmertemperatur unter N₁ gerührt i$ er im Beispiel 2 beschrieben ist. wurde bereits nach wird. Nach 3,5 Stunden zeigt eine Probe der Substanz einer Drehung, gegenüber 16 beim Ausgangsmaterial, nach dUnnschichtchromatographischer Trennung auf eine stabile Emulsion erhalten. Kieselsäuregel-Platten im Laufmittel Chloroform-Methanol-Wasser (65:25:4) und nach Ansprühen Beispiel 4 mit Ninhydrin-Reagenz, daß kein Kephalin mehr *e

im Gemisch vorhanden ist. Die Lösung wird von 1 kg einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion.

dem ausgeschiedenen halbfesten Phosphat abdekan- wie sie durch Entölung von handelsüblichen Roh·

tiert und so lange mit dest. Wasser versetzt, bis sich £hosphatiden mit Aceton und anschließendem wieder-

zwei Schichten gebildet haben. Dazu sind etwa 150 ml hohem Extrahieren des entölten Phosphatidgemisches

Wasser erforderlich. Die Wasserphase (obere Phase) »5 mit Alkohol gewonnen werden kann, wird in 31

wird in Scheidetrichtern abgetrennt und verworfen. Äthanol gelöst und unter Rühren und Einleiten von

Nach Zugabe von etwa 200 ml Wasser wird gut N, mit einer Lösung von 120 g NaNO, in 120 ml

durchgemischt und erneut von der Wasserphase Wasser und einer Lösung von 200 g NaH₁PO, · 1 H_tO

abgetrennt. Sollte die zweite Wasserphase noch merk- in 200 ml Wasser versetzt. Beide Salze werden unter

lieh sauer sein, wird ein weiteres Mal mit Wasser 30 Erwärmen in dest. Wasser in Lösung gebracht. Das

gewaschen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels Reaktionsgemisch wild bei 50 C unter Rühren und

im Vakuum unter N, resultieren aus der Chloroform- unter Einleiten von N, erwärmt. Nach etwa 1 Stunde

phase 400 g eines Phosphatidgemisches mit folgenden ist das gesamte Kephalin dia/otiert. Die Reaktions-

Kemvahlen: JZ 70. SZ 14. P 3.2"/₀. das lösung wird vom Rückstand dekantiert und der

an Stelle des Kephalins das neue Glycolphosphatid 35 Rückstand mit etwas Äthanol nachgewaschen. Durch

enthält. Destillation im Vakuum unter N, wird der Alkohol

Die verbesserte Emulsionsbildung dieses Produktes bis auf etwa 700 ml abdestilliert und zum Rückstand

zeigt der folgende Versuch: etwa 1.51 Chloroform zugegeben. Die Lösung wird

1 g des glycolphosphatidhaltigen Phosphatidge- zwei- bis dreimal mit ie etwa 300 ml Wasser ausmisches wird durch Rühren und Erwärmen auf 60 40 gewaschen und das Waschwasser verworfen. Die bis 70 C in 10 g Sonnenblumenöl gelöst. Nach Chloroform-Lösung wird im Vakuum unter N, ein-Abkühlen auf 20 C wird die Mischung in einen gedampft. Es bleiben 950 g (- 95° ,) eines kephalin-100-ml-Schüttelzylinder überführt und 90 ml dest. freien. Glycolphosphatid enthaltenden Gemisches zuWasser von 20 C zugefügt. Durch eine scharfe rück mit den folgenden Keimzahlen: JZ — 82. Drehung des Zylinders um 90 alle 30 Sekunden 45 SZ - 4. P ^ 3.2* „.

werden die beiden Phasen emulgiert. Gemessen wird

die Anzahl der Drehungen, die erforderlich sind, Beispiel 5

eine für 30 Sekunden stabile Emulsion zu erhalten.

Für das kephalinfreie Produkt sind nur zwei Dre- 1 kg handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid wird

hungen erforderlich, während bei Verwendung des 5° in 1,21 Dichloräthan und 600 ml Äthanol untei Ausgangsmaterials, d. h. der kephalinhaltigen aiko- N₂-Schutz gelöst und unter Rühren bei einer Temholunlöslichen Phosphatidfraktion, auch nach 50 Dre- p^{eratur von} 50° C nacheinander mit einer Lösung hungen keine Emulsion erhalten wurde. von 100 g NaNO₂ in 120 ml Wasser und 170 {

NaH₂PO₄-IH₂O in 175 ml Wasser versetzt. Dabe Beispiele 55 ist es zweckmäßig, die Natriumhydrogenphosphat

2 kg lediglich durch wiederholte Behandlung mit lösung langsam zutropfen zu lassen. Nach 2,5 Stunder Aceton vom Öl befreites Sojabohnen-Rohphosphatid Rühren ist das Reaktionsgemisch kephalinfrei. Nacl werden in einem Gemisch von 41 Chloroform und dem Abkühlen auf Zimmertemperatur dekantier 11 Methanol \mter Rühren und Schutz eines inerten man die Lösung, wäscht den halbfesten Rückstau« Gases (Nj) gelöst und mit einer Lösung von 250 g 60 mit Dichloräthan nach, gibt die Waschflüssigkei NaNO₂ in 220 ml warmem dest. Wasser versetzt. zur Hauptlösung dazu und wäscht die Dichloräthan Das Reaktionsgemisch wird auf 50⁰C erwärmt und Äthanol-Lösung zwei- bis dreiirJ mit je etwa 250 m tropfenweise mit einer Lösung von 460 g NaH₂PO₄ · Wasser aus. Nach dem Abdestillieren des Lösungs 1 H₂O in 450 ml warmem dest. Wasser zugegeben. mittels im Vakuum unter N₁ bleiben 950 g ölhaltiges Nach insgesamt 2,5stündigem Rühren bei 50⁰C 65 kephalinfreies Rohphosphatid zurück. Zur stabile: unter N₂ war das Reaktionsprodukt kephalinfrei. Emulsion gemäß dem unter Beispiel 2 aufgeführte Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird die Test ist nur eine Drehung erforderlich gegenübe Chloroform-Methanol-Lösung vom anorganischen 10 beim handelsüblichen Rohphosphatid.

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9 ^W 10

Beispiel 6 Beispiel 8

1 kg einer alkoholunlöslichen Sojaphosphatidffak' 180 g Ei-ftohphosphatid, das aus frischem Eigelb

tiön, wie sie aueh im Beispiel 2 verwendet wurde, zunächst durch Behandlung mit Aeetoä zur Ent*

werden unter Rühren und Schutz eines inerten Gases $ femung der Neutraliipide und des Cholesterin« und

in Ii Hexan gelöst und naeh Erwärmen auf 5O⁰C darm durch Extrahieren des Ölfreien Rückstands mit

mit einer Läsung von 200 g Natfiurnnitfit in 325 ml Chloroform-Methanol 2:1 und Auswasehen der

Wasser versetzt. Zu dem fteaktiomgemiseh fügt man wasserlöslicher) Anteile nach J. FoUh und Mit'

tropfenweise eine Lösung von 400 g Natriumdihydro- arbeiter (J. Biol. Chem. 191, S. 833, 1951) hergestellt

genphosphat in 550 ml Wasser zu. Naeh insgesamt io Worden war, das sowohl Serinphosphatid als auch

2,5 Stunden intensivem Rühren ist die Phosphatid- Colaminphosphatid enthält, werden in einem Gemisch

fraktion kephalinfrei. Man läßt das Reaktionsprodukt von 1 1 Chloroform und 11 Methanol gelöst und

iweekmäßigerwerae im Eisschrank abkühlen und unter Rühren und Erwärmen auf 37 ° C nacheinander

dekantiert dann die überstehende Lösung ab. Der mit einer Lösung von 120 g Natriumdihydrogen-

Rückstand wird wiederholt mit Hexan ausgewaschen, 15 phosphat und 60 g Natriumnitrit in jeweils 200 ml

die Hexanlösungen werden vereinigt und dann etwa Wasser versetzt. Nach 3,5stündigem Rühren ist das

dreimal mit je 300 ml Wasser ausgeschüttelt. Die Reaktionsprodukt frei von ninhydrinpositiven Phos-

wässerigen Phasen werden abgetrennt, falls erforder- phatiden. Die chloroformhahige Lösung wird von

lieh durch kurzes Zentrifugieren, und verworfen; die der gebildeten Wasserphase abgetrennt und noch ein-

Hexanlösungen im 'akuum vom Lösungsmittel ao bis zweimal mit je 200 ml Wasser ausgeschüttelt,

befreit. Es resultieren 750 g eines Phosphatidgemisches, Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels im

das an Stelle des Kephalins das GlyGolphosphatid Vakuum unter Stickstoff bleiben 169 g eines kephalin-

enthält. freien, die entsprechenden Glycolphosphatide enthal·

B e s ο ' e 1 7 tenden Phosphatidgemisches zurück.

500 g einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion, Beispiel 9 die lach dem Verfahren der deutschen Patentschrift

1 047 597 gewonnen wurde, werden in einer Mischung 500 g einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion von 700 ml Chloroform und 500 ml Methanol gelöst (gewonnen wie unter Beispiel 4 beschrieben) werden und unter Rühren und Erwärmen auf 5O⁰C nach- 30 in 1,51 Äthanol gelöst und bei Zimmertemperatur einander mit einer Lösung von 70 g Natriumnitrit mit einer auf 0°C gekühlten wässerigen Lösung von in 200 ml Wasser und einer Aufschlämmung von salpetriger Säure versetzt, die aus 200 g Natrium-185 g Kaliumhydrogenphthalat in 100 ml Wasser ver- nitrit. L-löst in einer Mischung von 800 ml Wasser setzt. Nach 7 Stunden ist das Reaktionsgemisch und 250 ml Äthanol, durch Zutropfen von 470 ml kephalinfrei. Nach dem Abkühlen wird die über- 35 12,5°/„iger Salzsäure unter Eiskühlung hergestellt stehende Lösung vom Unlöslichen dekantiert, der wurde. Nach 3stündigem Rühren unter Stickstoff-Rückstand mit Chloroform nachgewaschen, die Wasch- schutz zeigte das Phosphatidgemisch keine Reaktion flüssigkeit mit der Chloroform-Methanol-Lösung ver- mehr auf Ninhydrin-Reagenz. Durch Zugabe von einigt und wiederholt mit etwa 120 ml Wasser aus- Chloroform bilden sich zwei Schichten, wovon die gewaschen. Dann wird die Chloroform-Lösung im 40 untere abgetrennt und mit Wasser nachgewascher Vakuum unter Stickstoff eingedampft. Ausbeute: wird. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im 450 g eines Glycolphosphatid enthaltenden, alkohol- Vakuum unter Stickstoffschutz resultieren 470 g eines löslichen Phosphatidgemisches. Glycolphosphatid enthaltenden Gemisches.

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Claims (5)

Patentansprüche:

1. GlycolphosphfttidgemJsche der allgemeinen Formel

H,C — O — R'

HC-O —R²

i
H_aC — O — P — O — CH₂CHOH

/N I

O OH X

worin R¹ und R² in pflanzlichen und tierischen Phosphatiden vorkommende Fettsäurereste mit 10 bis 24 C-Atomen darstellen und X ein Wasserstoffatom oder die — COOH-Gruppe ist.

2. Glycolphosphatidgemische nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäurereste ungesättigt oder mehrfach ungesättigt sind.

3. Verfahren zur Herstellung der Glycolphosphatidgemische nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Raumtemperatur oder unter schwacher Erwärmung zu einer Lösung von Phosphatidylcolamin und/oder Phosphatidylserin in einem organischen Lösungsmittel eine gekühlte wäßrige salpetrige Säure hinzufügt und die durch Diazotierung und Hydrolyse desaminierten Phosphatidverbindungen in an sich bekannter Weise isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man an Stelle von salpetriger Säure eine wäßrige Lösung eines Salzes der salpetrigen Säure und eines sauren Salzes einer anorganischen bzw. organischen Säure verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Chloroform und an Stelle von salpetriger Säure eine wäßrige Lösung von Natriumnitrit und Natriumdihydrogenphosphat verwendet.

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