DE1807265B - Verfahren zur biotechnischen Herstel lung von L Threonin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von !.-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen in Sorbit als Kohlenstoffquelle und Diaminopimelinsäure und/oder Lysin enthaltenden Nährmedien.

L-Threonin ist als sogenannte essentielle Aminosäure für die Ernährung von Mensch und Tier von Bedeutung. Getreideprotein enthält nur wenig L-Threonin; daher wird !--Threonin als Ergänzungsaminosäure zur Verbesserung des Nährwertes von Getreideprotein verwendet.

Zur Herstellung von L-Threonin sind bisher synthetische und proteolytische Verfahren angewendet worden. Obgleich bereits Versuche zu einer fermentativen Herstellung von L-Threonin unternommen worden sind, waren diese Verfahren im industriellen Maßstab anfangs nicht erfolgreich, insbesondere nicht, wenn ein so kostspieliges Ausgangsmaterial wie t-Homoserin als Ausgangsmaterial verwendet wurde (vgl. USA.-Patentschrift 3 099 064; japanische Patent- Schrift 2986/61 und Sugawaraet al., »Amino Acid Und Nucleic Acid«, Bd. 10, S. 68 [1964]) oder wenn die Anreicherung des Produktes in der Fermentationsflüssigkeit gering war (USA.-Patentschriften 2 937 121 lind 2 937 122).

Aus der britischen Patentschrift 863 765 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von r.-Threonin «lurch aerobe Züchtung von Escherichia coli ATCC 13070 und ATCC 13071 in einem Sorbit oder Mannit ils Kohleistoffqueüe und die üblichen Nährstoffe lowie, bei Verwendung von Escherichia co!i ATCC 13071, 100 bis 140 mg/Liter Diaminopimelinsäure und, |iei Verwendung von Escherichia coli ATCC 13070, lOO bis 250 mg/Liter Diaminopimelinsäure und bis zu IOO mg/Liter i.-Methioninenthaltenden wäßrigen Nähr-•ledium bekannt.

Aufgabe der Erfindung ist ein verbessertes biotechnisches Verfahren zur Herstellung von L-Threonin.

Diese Aufgabe wird beim vorliegenden Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen in Sorbit, als Kohlenstoffquelle und Diaminopimelinsäure und/oder Lysin enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen dadurch gelöst, daß als Mikroorganismen Bacillus megaterium ATCC 21209, Arthrobacter paraffineus ATCC 21322, Aerobacter arogenes ATCC 21321 oder Serratia marcescens ATCC 21212 eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen gehören zu den A rten Aerobacter, Serratia, Arthrobacter und Bacillus. Das Wachstum der erfindungsgemäß verwendetenspeziellen Mikroorganismenstämme ist diaminopimelinsäureabhängig. Hinsichtlich ihrer Diaminopimeünsäureabhängigkeit bestehen zwei Möglichkeiten, entweder ist für das Wachstum unbedingt Diaminopimelinsäure erforderlich, oder es ist Diaminopimelinsäure oder Lysin für das Wachstum erforderlich.

Die erfindungsgemäß verwendeten Nährmedien enthalten als Kohlenstoffquelle Sorbit. Als Stickstoffquelle können verschiedene anorganische oder organische Salze oder Verbindungen verwendet werden, z. B. Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsu!fi< Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphoshpat, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw. Diese Stoffe können einzeln oder als Gemische von zweien oder mehreren verwendet werden. Anorganische Substanzen, die zu dem Medium hinzugegeben werden können, sind z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw.

Die erfindungsgernäß verwendeten Nährmedien müssen entweder Diaminopimelinsäure oder Lysin oder eine diese Stoffe enthaltende Substanz enthalten. Diese Zusatzstoffe können in verschiedenen Konzentrationen angewendet werden; eine Konzentration von etwa 10 bis etwa 300 mg/1 an Diaminopimelinsäure oder Lysin wird im allgemeinen bevorzugt.

Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, z. B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur, bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,5 durchgeführt.

Nach etwa 2 bis 4 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen sind wesentliche Mengen an L-Threonin in der Fermentationsflüssigkeit produziert und angereichert worden. Nach Abschluß der Züchtung kann das L-Threonin aus der Kulturflüssigkeit mit Hilfe der üblichen Arbeitsweisen gewonnen werden, z. B. durch Behandlung mit einem lonenaustai.scherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln, Adsorption, Ausfällung, Chromatographie od. dgl.

Beispiel 1

Bacillus megaterium ATCC 21209, ein diaminopimelinsäurcabhängiger Stamm, wird 24 Stunden lang in einem 20 g/l Glucose. 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2.5 g/l NaCI und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure enthaltenden Kulturmedium gezüchtet. Impfkultur wird in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in einen 250-ml-Erlenmeycrkolben eingeimpft, der 20 ml eines wäßrigen Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:

30 g/l Sorbit 14 g/l (NH₄)_äSO₄

t g/l KH₄PO₄

0,3 g/l MgSO₄ - 7 H₄O

5 g/l Maisquellwasser 200 mg/1 Diaminopimelinsäure
20 g/l CaCO₃

Das Fermentationsmedium wird vor seiner Verwendung sterilisiert.

Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C 96 Stunden lang durchgeführt. Nach Abschluß der Züchtung beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit angereicherte Menge an i--Threonin 3,8 mg/ml.

Beispiel 2

Die in Tabelle 1 genannten diaminopimelinsäureabhängigen Bakterienstämme werden jeweils in einem 20 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 10 g/l Hefeextrakt, 2.5 g/l NaCl und 50 mg/1 Diaminopimelinsäure enthaltenden Kulturmedium gezüchtet. Die Impfkulturen werden in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in große Reagenzgläser eingeimpft, die je 10 ml eines Fermentationsinediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:

20 e/1 Sorbit

14 g/l (NH₄)₂SO₄

1 g/l KH₂PO₄

0,3 g/l MgSO₄ · 7 H₂O

5 g/l Maisquellwasser
100 mg/1 Diaminopimelinsäure
20 g/i CaCO₃

Das Fermencationsmedium wird vor seiner Verwendung sterilisiert.

Die Züchtung jedes der Stämme wird unter aerooem Schütteln bei 28⁰C 96 Stunder lang durchgeführt. Nach 96 Stunden sind die in der Tabelle angegebenen Mengen an i.-Threonin von den verwendeten Stämmen in den jeweiligen Fermentationsflüssigkeiten angereichert worden.

Verwendeier Stamm

Erhaltene Menge an u-Threonin

3,8 mg/ml
4,3 mg/ml

Aerobacter aerogenes ATCC 21321
Serratia marcescens ATCC 21212

Beispiel 3

Arthrobacter paraffineus ATCC 21322, ein diaminopimelinsäureabhängiger Stamm, wird in ein Kulturmedium eingeimpft, das 2°/₀ Sorbit, l°/₀ Fleischextrakt, 1 °/_ü Pepton, 0,5 °/₀ Hefeextrakt und 0,3 % NaCl enthält. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30⁰C durchgeführt, um eine Impfkultur zu erhalten.
2 ml der erhaltenen Impfkultur werden in einen 250-ml-ErlenmeyerkoIben eingeimpft, der 20 .nl eines sterilisierten Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:

30 g/l Sorbit

20 g/l (NH₄)₂SO₄

2 g/l KH„PO₄

2 g/l KoHPO₄

1 g/l MgSO₄ · 7 H₂O
_a5 10 mg/i FeSO₄ · 7 H,0

10 mg/1 MnSO₄ ■ 7 HoO
10 mg/1 ZnSO₄

5 rr.g/1 Thiamin

3 g/l Hefeextrakt
20 g/l CaCO₃

100 mg/1 mesG-Diaminopimelinsäure

Die Züchtung wird dann unter aerobem Schütteln

der Kultur bei 3O⁰C 96 Stunden lang durchgeführt.

Als Ergebnis sind in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit 4,9 mg/ml ι -Threonin angereichert worden.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechi.ischen Herstellung von L-Threonin durch Züchten von Mikroorganismen in Sorbit als Kohlenstoffquelle und Diaminopimelinsäure und/oder Lysin enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen, dadurchgekennzeichn e t, daß man als Mikroorganismen

   Bacillus megaterium ATCC 21209,
   Arthrobacter paraffineus ATCC 21322,
   Aerobacter aerogenes ATCC 21321,
   Serratia marcescens ATCC 21212

   einsetzt.