DE1770740B2

DE1770740B2 - Neue pyrimidinnucleoside (polyoxine j, k und l) und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE1770740B2
Application number: DE19681770740
Authority: DE
Inventors: Saburo Murayama; Isono Kiyoshi Tokio; Nagatsu Junsaku Kunitachi; Suzuki (Japan)
Original assignee: Rikagaku Kenkyusho, Yamatocho, Saitama (Japan)
Priority date: 1967-06-30
Filing date: 1968-06-28
Publication date: 1976-12-16
Also published as: YU34208B; US3625940A; CH525953A; IT1009010B; DE1770740A1; FR1583937A; YU152468A; ES355613A1; GB1196853A; DK126199B; NL6809186A; IL30214A; NL142987B; IL30214A0; CS158621B2

Description

H₂NCH

HCOH
HOCH

OH OH

CH₂OCONH₂

CH₃-CH

OH OH

HOCH

CH₂OCONH₂

HOOC

OC- NCH

I H ' ' H₂NCH

HCOH

OH OH

(D

(ID Streptomyces cacaoi var. asoensis ATCC 19093 oder 19094 in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoff-, eine StickstoffqueUe und anorganische Stoffe enthält, bei einer Temperatur von 2S—35° C dadurch gekennzeichnet, dall man die angereicherten, antibiotisch wirksamen Stoffe in üblicher Weise aus dem Medium isoliert und in die einzelnen Verbindungen trennt.

Die Erfindung betrifft neue antibiotische Pynmidin-

nucleoside, nachfolgend als Polyoxine JK und L

bezeichnet sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

S neuen Polyoxine J, K und L zeigen spezifische

fungicide Wirksamkeiten gegen verschiedene Arten

von phytopathogenen Pilzen und sind als landwirt-

„ scha&che Fungizide zum Schutz von Pflanzen ver-

Dieneuen Polyoxine J, K und L besitzen die folgenden chemischen Strukturformeln:

J:

40

45

H,NCH

K:

COOH

(I")

HN'

CH₃-CH=^ N-CO ₀J^

HOCH

CH₂OCONH₂

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 durch Züchten ein :s Stammes OC-NCH O

I
H₂NCH

HCOH

OH OH

HOCH

CH₂OCONH₂

HOOC

°™_N)

OC-NCH O

I H

H₂NCH
HCOH

K: λ 2«Ν-Ηα ₌ 259 mμ (Ε\% 138).

λ Γ*^ΟΗ = 262 πΐμ (EJi 109).

L: λ ££^Ν-^Ησ = 259 πΐμ (EJ^, 170).

λ WN.OH ₌ 262 mμ (EJ* 132).

(IiI)

OH OH

HOCH

CH₂OCONH₂

Folgende physikochemischen Eigenschaften der Polyoxine J, K und L wurden ermitteit:

1. Zersetzungspunkte

Die Polyoxine J, K und L nachstehend auch mit J, K und L bezeichnet, zeigen K einen definierten Schmelzpunkt, sie zersetzen sich allmählich bei Temperaturen oberhalb 200° C.

2. Analysewerte der Elementarzusammensetzung

J, K und L enthalten die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff in den folgenden Gew.-Prozenten, wobei die Differenz zu 100 Sauerstoff ist:

J: C 41,71, H 5,25, N 13,90;
K: C 44,25, H 5,07, N 13,92;
L: C 40,45, H 5,09, N 14,37.

3. Molekulargewichte

Da J, K und L amphotere Verbindungen sind, wurden die Molekulargewichte durch Titration aus den Äquivalentgewichten bestimmt und ergaben sich zu:

J:	499.	4. Summenformeln
K:	59G.	C₁₇H₂₅N₅O₁₂.
L:	495.	C₂₂H₃₀N₆O₁₃.
	C₁₆H₂₃N₅O₁₂.
J:
K:
L:

5. Spezifische optische Drehungen

J: [α] Γ = +37,7° (C = 1%, in Wasser).

K: [ajr = -16,5° (C = 1%, in Wasser).

L: WΓ = +34,4° (C = 1%, in Wasser).

6. UV-Absorptionsspektren

Die Spektren für J, K und L in HCl 0,05 N HCl (durchgezogene Kurve) und in NaOH 0,05 N (gestrichelte Kurve) werden in den Abb. 1 bzw. 2 bzw. 3 gezeigt. Diese Spektren zeigen die folgenden Maxima:

Abbauuntersuchungen zeigen, daß die Absorption von J auf den Thymin-Rest und die Absorptionen von K und L auf den Uracil-Rest zurückzuführen ist.

7. IR-Absorptionsspektren

Die IR-Absorptionsspektren für J, K und L, in Kaliumbromidtabletten gemessen, werden in den Abb. 4, 5 bzw. 6 gezeigt. Die Hauptabsorption trat bei den folgenden Wellenlängen auf:

J: 3300—3400, 1680, 1600, 1475, 1408, 1350,

1278, 1125, 1060, 783, 572 cm"¹.
K: 3300—3400, 1690, 1640, 1470, 1378, 1315,
1283, 1127, 1058, 780, 565 cm"¹.

L: 3300—3400, 1670, 1600, 1480, 1412, 1350,
1275, 1120, 1060, 770, 570 cm"¹.

8. Löslichkeiten

Jede der Verbindungen J, K und L ist leicht löslich in Wasser, aber schwerlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform, Benzol und Äther.

9. PK-Werte

Jede der Verbindungen J, K und L ist amphoter und besitzt drei titrierbare Gruppen. Die PK-Werte sind folgende:

J: 3,0, 7,1, 9,9.
K: 3,0, 7,2, 9,3.
L: 3,0, 7,1, 9,4.

10. Beständigkeiten

Jede der Verbindungen J, K und L ist etwas instabil in alkalischer Lösung, aber extrem beständig in sauren und neutralen Lösungen. Es tritt keine Zersetzung ein beim Erhitzen auf 100° C während 15 Minuten im pH-Bereich von 2,0—7,0. J, K und L sind auch gegenüber UV-Bestrahlung stabil.

Antimikrobielles Wirkungsspektrum

Tabelle I zeigt die minimalen Hemmkonzentrationen der Polyoxine J, K und L gegen phytopathogene Organismen und Bakterien. Die minimale Hemmkonzentration wurfje 48 Stunden nach der Inkubation unter Verwendung eines Kartoffel-Saccharose-Agarmediums bestimmt.

Tabelle I

j.

0.05N-NaOH ₌

= 264 τημ. (EJi 158).

_myL (EJ* 133).

Testorganismus	Minimale	50	Hemmkonzentration	L	12,5
	J	6,25	K	6,25
Alternaria kikuchiana	100	25	100
Cochliobolus miyabeanus	12,5	3,12	6,25
Pellicularia sasakii	1,56	100	1,56
Piricularia oryzae	100	1,56	100
Guignardia laricina	1,56
Corticium rolfsii	12,5

Fortsetzung

Testorganismus Minimale Hemmkonzentration

^g/ml)

J K L

Die folgenden Versuche zeigen die verbesserter fungiciden Wirkungen der Polyoxine: J, K und L gegenüber bisher bekannten Substanzen. Die jewei ligen Konzentrationsangaben in ppm sind die Konzentrationen der wirksamen Substanz in der Test

Sclerotinia cinerea
Cladosporium fulvum
Helmin thosporium
sigmoideum

lösung, die zum Einsatz gelangte.

6,25 12,5 6,25

1,56 50

25

3,12 100 3,12

Bei folgenden Mikroorganismen ist die minimale Hemmkonzentration der Polyoxine J, K und L jeweils > 50 μg/ml.

Trichophyton asteroides,
Trichophyton interdigitalis,
Trichophyton rubrum,
Candida albicans,
Candida tropicalis,
Candida crusei,
Cryptococcus neoformans,
Aspergillus fumigatus,
Aspergillus terreus,
Mucor racemosus,
Nocardis asteroides,
Trichomonas vaginalis,
Staphylococcus aureus 209 p, Micrococcus luteus,
Bacillus subtilis,
Mycobacterium smegmatis,
Mycobacterium 607,
Mycobacterium phlei,
Mycobacterium BCG,
Escherichia coli,
Pseudomonas aerugincsa,
Serratia marscens,
Proteus vulgalis,
Xanthomonas oryzae.

Die Polyoxine J, K und L zeigen hohe Wirksamkeit gegen z. B. Schwarzfleckigkeit bei Birnen (Alternaria kikuchiana), Blattpilz bei Tomaten (Cladosporium fulvum), Sproß-Trockenfäule bei japanischer Lärche (Guignardia laricina), Blattrost (Cochliobolus miyabeanus) und Braunfleckigkeit (Sclerotinia cinerea).

Phytotoxizität

Von keiner der erfindungsgemäßen Polyoxine wurden phytotoxische Anzeichen beim Besprühen von Reispflanzen mit einer Konzentration von 800 ppm oder beim Besprühen von anderen Nutzpflanzen, wie Äpfel, Birnen und Tomaten mit einer Konzentration von 200 ppm festgestellt.

Toxizität

Beim Toxizitätsversuch mit Mäusen waren die Polyoxine J, K und L nichttoxisch bei intravenöser Injektion von 500 mg/kg oder oraler Verabreichung von 15 g/kg.

Beim Toxizitätsversuch mit Kaninchen erzeugte eine Lösung von 400 mg/ml keine Reizung, wenn sie in den Konjunctivalsack von Kaninchen eingeträufelt wurde.

Beim Toxizitätsversuch mit Fischen erwiesen sich alle Polyoxine J, K und L in Konzentrationen von 10 ppm als nichttoxisch während einer Einwirkungszeit von 75 Stunden.

Schwarzflecken-Krankheit (Alternaria kikuchiana) bei Birnen

Es wurden zwei Birnbäume in Töpfen je Standort (Sorten: Pyrus aromatica Kikuehi et Nakai) zum Test ausgewählt und mit festgelegten Konzentrationen der zu untersuchenden Substanz und der Vergleichssubstanz besprüht. Nach dem Trocknen an der Luft wurde eine Sporensuspension des Schwarzneckerregers durch einen Sprüher inokuliert. Nach dei Inokulation wurden die behandelten Pflanzen in eine Vakuumglocke gesetzt und bei einer Temperatur von 28⁰C gehalten. Nach 4 Tagen wurden 11 Blättei je Baum auf das Auftreten der Krankheiten nach den folgenden 5 Indexgraden geprüft:

Index fur das Auf- Befallene Fläche je Blatt

treten der Krankheit (Befallindex)

2
3
4
5

0—20% 20—40% 40—60% 60—80% 80—100%

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Tabelle II

40

45

Substanz

Konzen- Mittlerer Präventivtration Befallindex wert

je Blatt

(ppm) (%)

Polyoxin J

Polyoxin K

Polyoxin L

100
50

Äthylen-1,2-bis- 500
(dimethylthiocarbamoyl-thiocarbamoyldisulfid)

0,9

78,6

60

Kontrolle

1,2 71,4

1.1 73,8 1,8 57,2

4.2 0

Alternaria-Blattfleckkrankheit am Apfel

In Feldversuchen mit benetzbarem Polyoxinpulver, das jeweils die Polyoxine J, K und L enthielt, wurden Apfelbäume 8mal alle 10 Tage besprüht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 111 angegeben.

Tabelle 111

Behandlung

Konzen- Anzahl Präven- Verhältnis

tration

(ppm)

der

Krankheitsflecken
je Blatt

tivwert

kranke

Fleck-

bereiche/

Blattfläche

0 0,5

0,5

0 0

Polyoxin J 100 2.5 97,5

(benetzbares 50 5,8 94,2

Pulver)

Polyoxin K 100 8,5 91,5

(benetzbares 50 12.1 98,9 Pulver)

Polyoxin L 100 2,1 97,9

(benetzbares 50 5.4 94,6

Pulver)

Polyoxin B 100 3,5 96,5

(benetzbares

Pulver)

Unbehandelt — 100 0

Braunflecken-Krankheit (Cochliobolus miyabeanus) bei Reispflanzen

Festgelegte Konzentrationen einer Lösung der Polyoxine und der Vergleichssubstanz wurden auf Reispflanzen in Töpfen (Sorte: Jukkoku) gesprüht. Nachdem die Testpflanzen 1 Stunde an der freien Luft belassen worden waren, wurde eine Sporensuspension des Testpilzes mittels eines Sprühers inokuliert. Danach wurden sie innerhalb eines Gewächshauses gehalten, und nach 3 Tagen wurde die Anzahl der kranken Flecken geprüft (drei Töpfe je Standort). Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.

40

45

Tabelle IV	Konzen	Mittlere	Präventiv
Substanz	tration	Zahl der	wert
		kranken
		Flecken
		je Blatt
	(ppm)		(%)
	100	3,5	89,2
Polyoxin j	100	3,4	89,5
Polyoxin K	100	4,6	85,8
Polyoxin L	100	5,5	83,0
Polyoxin B	500	6,5	80,0
2,4-Dichlor-
6-(o-chlor-
anilino)-
1,3,5-triazin		3Z5	0
Unbehandelt

55

60

In den deutschen Patentanmeldungen P 1492111.0 und 16 17 768 ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von neuen als Polyoxin A und Polyoxin B bzw. als Polyoxine D, E, F, G und H bezeichneten Pyrimidinnucleosiden durch Züchtung eines Stammes von Streptomyces cacaoi var. asoensis ATCC-Nr. 19 093 oder 19 094 vorgeschlagen worden.

Das Verfahren zur Herstellung der Polyoxine J, K und L umfaßt die gleiche Züchtung eines Stammes Streptomyces cacaoi var. asoensis ATCC-Nr. 19 093 oder 19 094 in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoff-, eine Stickstoffquelle und anorganische Stoffe enthält, bei einer Temperatur von 25—35°C und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die angereicherten, antibiotisch wirksamen Stoffe in üblicher Weise aus dem Kulturmedium isoliert und in die einzelnen Polyoxine J, K und L auftrennt.

Die erfindungsgemäß verwendeten polyoxinproduzierenden Mikroorganismen stamme gehören zu einer neuen Art der Gattung Streptomyces und wurden aus dem Boden von Bochu, Asogun, Kumamoto Prefecture, Japan, isoliert.

In der Praxis der Erfindung kann die Fermentation entsprechend dem üblichen Fermentationsverfahren für die bekannten Streptomyces-Arten durchgeführt werden. Als Kohlenstoffquellen werden z. B. Stärke, Dextrin, Glukose, Glycerin, Maltose, Fruktose verwendet. Fleischextrakte, Pepton, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnen pulver, Erdnußpulver, Baumwollsamenpulver, Hefe werden als Stickstoffquellen verwendet. Anorganische Stoffe, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Phosphate können zu dem fast neutralen flüssigen Nährmedium hinzugefügt werden. In das Medium wird der Stamm Streptomyces cacaoi var. asoensis eingeimpft, und die Züchtung wird unter Rühren bei einer Temperatur von 25—35°C ausgeführt. Im allgemeinen erreicht die Konzentration der produzierten Antibiotika ein Maximum nach etwa 40 bis 120 Stunden der Züchtung. Da dieser Zeitpunkt der maximalen Konzentration entsprechend den Bclüftungs- und Rührbedingungen variieren kann, selbst wenn dieselbe Temperatur und ein Züchtungsmedium gleicher Zusammensetzung verwendet werden, ist es ratsam, den Zeitpunkt in jedem Falle durch Bestimmung der Aktivität zu ermitteln.

Die üblichen physikochemischen Methoden können zur Isolierung der Polyoxine aus der Kulturbrühe angewendet werden. Zum Beispiel kann das Mycel zuerst durch Filtration unter Zugabe einer Filtrierhilfe, wie z. B. einer sauren oder neutralen Diatomeenerde, abfiltriert und das Filtrat sodann an Aktivkohle bei saurem oder neutralem pH-Wert adsorbiert werden. Die Polyoxine können von der Aktivkohle durch ein Lösungsmittel, wie ein Gemisch aus Wasser und wassermischbaren Lösungsmitteln, ζ. Β Methanol ÄthanoL Propanol, Butanol, Aceton Essigsäure und Pyridin, eluiert werden. Das Polyoxine amphotere Verbindungen sind, werden sie an Kationen- oder Anionenaustauscherharzen adsorbiert und lassen sich durch geeignete saure, alkalische oder Salzlösungen eluieren. Zum Beispiel kann dai Züchtungsfiltrat, nachdem man es angesäuert hat über eine Säule geschickt werden, die ein start saures Kationenaustauscherharz des Sulfonsäuretyp; mit 8% Vernetzung enthält; die Polyoxine werder daran adsorbiert und können mittels einer wäßriger Lösung von 5% Natriumchlorid oder eines Phosphat puffers von pH 43 eluiert werden. Das rohe Pulvei des Polyoxinkomplexes kann dann durch Säulen Chromatographie unter Verwendung eines Ionen austauschers, wie z. B. eines Ionenaustauschers au: sulfoäthyliertem vemetztem Dextran, Sulfoäthylcellu lose oder Sulfomethylcellulose oder durch Zonen elektrophorese gereinigt werden.

609 551/35

Die vollständige Trennung der F'olyoxine J, K und L kann durch Verteilungschromatographie unter Verwendung von Cellulosepulver oder Silicagel durchgeführt werden. Es kann mittels eanes geeigneten Lösungsmittels, z. B. eines Gemisches aus Wasser und wassermischbaren Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Aceton, Essigsäure, Pyridin und 75%iges Phenol, entwickelt werden. Dabei werden die Polyoxine J, K und L und die anderen Polyoxinkomponenten getrennt eluiert.

Durch Umkristallisierung aus wäßrigem Alkohol werden die Polyoxine J, K und L einzeln als weiße Pulver erhalten.

Beispiel 1

Es wurde ein Züchtungsmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Glukose 15g

Stärke 50 g

Sojabohnenmehi 20 g

Ammoniumsulfat 5 g

Trockenhefe 10 g

Natriumchlorid 5 g

Calciumcarbonat 2 g

Wasser 1000 ml

Das Medium wurde auf einen pH-Wert 7,6 eingestellt und sterilisiert.

Der Stamm Streptomyces cacaoi var. asoensis ATCC 19 093 wurde in das Züchtungsmedium eingeimpft und darin bei einer Temperatur von 27⁰C unter Rühren, das aufrechterhalten wurde, bis maximale Aktivität erzielt worden war, gezüchtet. Die Prüfung wurde durchgeführt unter Verwendung von Altemaria kikuchiana und Cochliobolus miyabeanus als Test-Organismen. Wenn der Stamm als Schüttelkultur in 300-ml-Erlenmeyerkolben, die 70 ml des Mediums enthielten, gezüchtet wurde, erreicht die Aktivität ihr Maximum nach 72—96 Stunden. Wenn die Züchtungsflüssigkeit aus der 48stündigen Schüttelkultur in einen Fermentationstank enthaltend 400 ml des gleichen Mediums eingeführt und die Züchtung unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 220 Upm und einem Luftdurchsatz von 400 Litern pro Minute durchgeführt wurde, erreichte die Produktion der Polyoxine ein Maximum nach etwa 96—120 Züchtungsstunden.

Die Aktivität betrug 1800 pg/ml auf der Basis von Polyoxin B.

Isolierung und Reinigung

430 Liter der Fermentationsflüssigkeit wurden mit 10%iger Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 2,0 angesäuert und dann auf 70⁰C erhitzt. Es wurden 9 kg Diatomeenerde hinzugefügt, dann wurde durch eine Filterpresse filtriert. Das Filtrat wurde mit 8 kg Aktivkohle und 8 kg Diatomeenerde behandelt, durchgerührt und filtriert Die Aktivkohle wurde mit 350 Liter Wasser ausgewaschen. Die aktiven Materialien wurden dann zweimal mit 100 Liter 60%igem wäßrigem Aceton eluiert. Die eluierte Lösung wurde im Vakuum konzentriert So wurden 54 Liter Flüssigkeit die das erwünschte Produkt enthielten, gewonnen.

50 Liter Aceton wurden zu der Flüssigkeit hinzugegeben, und die erhaltenen Ausfallungen wurden unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 920 g eines braunen pulverförmigen Rohproduktes erhalten wurden. 300 g dieses Pulvers wurden in Wasser aufgelöst und auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wurde durch eine Säule geschickt, die mit 4,5 Litern eines stark sauren Kationenaustauscherharzes gefüllt war (H-Form; 50— 100 mesh). Nach Waschen mit Wasser wurden die

ίο Polyoxine mit einer 5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Eluate wurden gesammelt und mit Kohle behandelt, um anorganische Salze zu entfernen. Nach Konzentrieren der Eluate aus der Kohle-Behandlung wurden 60 g eines hellbraunen Pulvers erhalten.

Dieses Pulver wurde nochmals am Kationenaustauscher chromatographiert. Das Pulver wurde in 0,1 -m Phosphatpuffer vom pH-Wert 2,0 gelöst und an einer Säule adsorbiert, die mit 2 Litern des stark sauren Kationenaustauscherharzes (100—200 mesh) gefüllt und mit Phosphatpuffer vom pH-Wert 2,0 abgepuffert war. Die Polyoxine wurden mittels 0,1-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 4,3 eluiert. Die aktiven Eluate wurden, wie oben beschrieben, mit Kohle behandelt, um anorganische Salze zu entfernen, wobei sich eine Ausbeute von 35 g eines hellgelben Pulvers ergab. Dieses wurde durch Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Ionenaustauschers aus sulfoäthyliertem vernetzten! Dex-

trän weiter gereinigt. Hierzu wurde das gelöste Pulver auf eine Säule von 50 g des Austauschers, die zuvor mit 0,01-m Phosphat puffer (pH 2,0) gepuffert worden war, aufgebracht. Durch allmähliches Erhöhen der Pufferkonzentration bis auf 0,1-m wurden die Polyoxine eluiert. Es wurden 18 g eines gereinigten weißen Pulvers des Polyoxin-Gemisches erhallen.

Trennung von Polyoxin J, K und L

Das erhaltene Polyoxin-Gemisch wurde in Wa?- ser gelöst und die gebildete Lösung durch eine Säule gegeben, die mit 500 Litern eines schwach basischen Anionenaustauscherharzes aus Formaldehyd-Phenol-Polydiamin-Polykondensationsmaterialien (100— 200 mesh) gefüllt war.

Der Abfluß wurde mit dem Waschwässern vereinigt. Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei sich 10 g eines weißen Pulvers ergaben, das ein Gemisch der PoIyoxine A, B, G, H, J, K und L war; die Polyoxine D, E und F waren an dem Austauscherharz adsorbiert.

Weiterhin wurde eine Chromatographie an einer Cellulosesäule (55 χ 1000 mm) unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:2) durchgeführt.

Zunächst wurde Polyoxin H eluiert sodann folgten die Polyoxine K, A, J, G, L und B.

Wenn diese nicht vollständig getrennt waren, wurde die Cellulose-Säulenchromatographie nochmals unter Verwendung von 75%igem Phenol als Lösungsmittel vorgenommen, um die Polyoxine J, K und L vollständig abzutrennen.

Auf diese Weise wurden 0,1g Polyoxin J, 0,06 g Polyoxin K und 0,08 g Polyoxin L aus 10 g des Polyoxin-Gemisches erhalten.

Die Kristallisation schließlich wurde aus wäßrigem Äthanol durchgeführt. Die Polyoxine J, K und L wurden als farblose Pulver gewonnen.

Beispiel 2

Ein Züchtungsmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

Saccharose 60 g

Glukose 15 g

Trockenhefe 35 g

Sojabohnenmehl 15 g

Kaliumphosphat 2 g

Calciumcarbonat 4 g

Wasser 1000 ml

Die Züchtung wurde bei dem pH-Wert des Mediums in ähnlicher Weise wie nach Beispiel 1 durchgeführt. 72 bis 96 Stunden nach dem Beimpfen mit Streptomyces cacaoi var. asoensis ATCC 19 093 betrug die Aktivität 3 mg/ml auf der Basis von Polyoxin B bei Verwendung von Alternaria kikuchiana als Test-Organismus.

Die Polyoxine J, K und L wurden von dem Züchtungsmedium in ähnlicher Weise wie es im Beispiel 1 beschrieben worden ist abgetrennt.

Ausbeute: Polyoxin J 0,5 g, Polyoxin K 0,3 g und Polyoxin L 0,4 g aus 28 g des Polyoxingemisches.

Beispiel 3

Ein Züchtungsmedium der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:

Lösliche Stärke 70 g

Glukose 5 g

Sojabohnenmehl 15g

Natriumchlorid 2 g

Calciumcarbonat 4 g

Wasser 1000 ml

Der pH-Wert des Mediums wurde auf 7,0 einge stellt und die Züchtung in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 ausgeführt, mit der Abwandlung, daß das Beimpfen mit Streptomyces cacaoi var. asoensi; ATCC !9 094 vorgenommen wurde.

72 bis 96 Stunden nach dem Beimpfen des Mediums erreichte die Konzentration der Polyoxine 7 mg/ml, berechnet auf der Basis der Aktivität vor Polyoxin B gegenüber Alternaria kikuchiana als Test- Organismus.

Die Polyoxine J, K und L wurden von dem Züch tungsmedium in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 abgetrennt.

Ausbeute: Polyoxin J 1,2 g, Polyoxin K 0,65 g unc Polyoxin L 0,8 g aus 62 g des Polyoxingemisches.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche: 1. Pyrimidinnucleoside der Formeln

HOOC HN CH O

ι ■

co