DE1767285A1

DE1767285A1 - Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates des stabilen antihamophilen Faktors mit hohem Wirkungsgrad

Info

Publication number: DE1767285A1
Application number: DE19681767285
Authority: DE
Inventors: Edward Shanbrom
Original assignee: Baxter Laboratories Inc; Baxter Travenol Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1967-05-01
Filing date: 1968-04-22
Publication date: 1971-08-19
Also published as: FR1589414A; DK119626B; DE1767285B2; SE375008B; NL162838C; ES353435A1; DE1767285C3; JPS594402B1; IT1048951B; NL162838B; NL6806162A; BE713764A; GB1178958A

Description

DR. WALTER NIELSCH

Patentanwalt 2 Hamburg 70 ^!

SchloBstraDe 112 Postfad) 10914 Fernruf: 652 97 07

Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates des stabilen antihämophilen Paktors mit hohem Wirkungsgrad.

Baxter Laboratories, Inc. Morton Grove, Illinois 60053 Λ (Vereinigte Staaten von Wordamerika)

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen eines Konzentrates des antihämophilen Faktors (AHP, Paktor VIII).

Der Vorgang der Blutkoagulation ist eine wichtige Punktion, die normales Vollblut unter passenden Bedingungen auszuführen fähig ist, um unnötige Blutverluste durch offene Wunden oder durch innere Blutungen zu verhüten«

Es ist bekannt, daß normales Vollblut einen Paktor enthält, der abwesend oder in beträchtlichem Maße bei f Hämophüie(Bluterkrankheit) fehlend ist. Dieser Paktor wirkt mit der Globulinfraktion des Blutes zusammen und ist als antihämophiler Paktor (AHP, Paktor VIII) bekannt geworden.

Wissenschaftlern ist seit einiger Zeit etwas über AHP und seine Bedeutung bei der Blutkoagulation bekannt. Die Behandlung der Hämophüie hat bisher im allgemeinen in einer Auffüllungstherapie bestanden, wobei dem Patienten viele Liter frisches Vollblut oder speziell be-

- 2 handeltes Plasma transfundiert wurde.

Es ist bekannt, daß jedoch unter üblichen Lagerungsbedingungen Vollblut und flüssiges Plasma seine AHF-Aktivitat innerhalb eines Tages oder darum herum verliert. Da es möglich ist, frisches Plasma einzufrieren und zu lagern, hat die AHF-Aktivität in gefrorenem Plasma eine relativ kurze Lebensdauer von einigen Monaten oder darum herum.

Es ist auch möglich, während der Lagerung den Verlust an AHF-Aktivität herabzusetzen durch Trocknen frisch gefrorenen Plasmas. Aber bisher ist es nicht möglich gewesen, mit Gewißheit den Gehalt an AHP in diesem getrockneten Material mit Sicherheit zu kennen, weil der Gehalt an AHP in normalen Individuen, die das Plasma
spenden, außerordentlich von etwa 50$ bis etwa 200$ des Durchschnitts schwankt.

Die konventionelle Auffüllungstherapie besitzt weitere ernst zu nehmende Nachteile, weil die Hämophilie oft
allergische oder der Behandlung trotzende Zustände bei wiederholter Behandlung mit Plasma entwickelt. Außerdem neigen die großen Mengen an Plasma dazu, die durch die Hämophilie benötigt werden, ein übergroßes Blutvolumen oder eine Überladung des zirkulatorischen Systems zu
bewirken. Solche Überladungen rufen eine Überanstrengung des Herzens hervor und führen beim Patienten zum Herzversagen.

Wissenschaftler haben schon verschiedene Methoden für die Isolierung d.es AHP oder die Herstellung von Plasmafraktionen mit angereichertem AHP aus Human- oder Tierblut vorgeschlagen. In der Praxis haben sich Verfahren bisher als unzuverlässig erwiesen, weil die AHP-Aktivi-

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tat der Fraktionen während der Isolierung verloren zu gehen scheint. AHF ist ein labiles Spurenprotein, welches schwierig vollständig von anderen Plasmaproteinen zu isolieren ist, besonders Fibrinogen und die Ausbeute an AHF aus dem Plasma ist durch diese bisherigen Verfahren nicht hoch gewesen.

Die jUIF-Virkungen der bisher hergestellten Blutfraktionen für die HämophiLi-Therapie sind als gering bekannt und die Kosten der Behandlung sind hoch.

Andere Nachteile bei früheren Versuchen, die bei der Isolierung von aHF festgestellt wurden, sind die Eigenschaften des AHF, daß es sehr leicht durch Hitze, Einfrieren, Auftauen und andauernde Lagerung denaturiert

Zu den verschiedenen Verfahren, die bisher für die Isolierung von AHF vorgeschlagen worden sind, gehören Chromatographie, stufenförmige Absorption und Elution und selektive Ausfällung. Verschiedene Ausfällungsmittel, die benutzt worden sind, sind Äthanol, Äthyläther, Ammoniumsulfat, Phosphat-Natriumcitrat, Amino- * säuren und Kältefällungsverfahren. Kürzlich wurde die klinische Verwendung von mit Glycin gefällter AHF-Fraktion des Vollplasmas durch Webster und Mitarbeiter (Amer. J. Med, Sciences, Vol. 250, Nr. 6, Seite 643-650 (1965)) beschrieben. Über klinische Versuche zur AHF-Auffüllungstherapie mit einer kältegefällten Fraktion des Vollplasmas in einem geschlossenen Beutelsystem wurde durch Pool und Mitarbeiter (New England J. Med., Vol. 273, Nr. 27_; Seiten 1443-1447 (1965)) ein Bericht veröffentlicht. Keine dieser zuletzt genannten Verfahren hat sich jedoch als eine vollständig ausführbare Methode zur !isolierung von AHF erwiesen.

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Die vorliegende Erfindung, die sich gegenüber den bisherigen Verfahren auszeichnet, betrifft ein Verfahren für die Darstellung eines stabilen hochwirksanien AHF-Xonzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktionierung des kältegefällten Konzentrates von Humanoder Tier-AHF erfolgt.

Der vorstehend benutzte Ausdruck "kältegefälltes Konzentrat des AHF" bezieht sich auf die Fällung, die beim Behandeln von Human- oder Tierblutplasma bei S= 4⁰C erhalten wird und von dem Überstehenden abgetrennt wurde. Bevorzugt wird, daß dieses kältegefällte Konzentrat des AHF durch sehr schnelles Einfrieren von frischem Plasma erhalten wird, aber gelagertes Plasma kann ebenfalls als Ausgangsmaterial bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Weiterhin wird bevorzugt,das Einfrieren in einem Temperaturbereich von etwa -20 C bis etwa -40⁰C und folgendem langsamen Tauen auf etwa 4⁰G durchzuführen.

Zusätzlich zu der Stabilität und der hohen Wirksamkeit der AHF-Aktivität, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, bei der das kältegefällte Konzentrat des AHF anstelle des Vollplasmas als Ausgangamaterial benutzt wird, hat es den großen Vorteil, die Retention von anderen Plasmakomponenten wie Albumin, Gammaglobulin und dergleichen zu gestatten, welche gewöhnlich zerstört werden, wenn das Vollplasma durch die bisher bekannten Verfahren zur Darstellung von AHF-Fraktionen behandelt wird, die zur Behandlung der Hämophilie bestimmt sind.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das kältegefällte Konzentrat des AIiF vorzugsweise fraktioniert, um ein stabiles hochwirksames AHF mittels einer oder mehrerer

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- 5 der folgenden Stufen zu erhalten:

a) Fällung mit Glycin,

Td) Fällung mit Polyäthylenglykol.

In der Glycin-Fällungsstufe wird das kältegefällte Konzentrat des AHF zuerst wieder aufgelöst und dann die wieder aufgelöste Fraktion mit einer wäßrigen Glycinlösung mit einer Molarität von etwa 1,3 Ms etwa 1,8 gefällt, gefolgt von der Abtrennung und Wiederauflösung des Niederschlages. J

Die Abtrennung des kältegefällten Konzentrates und der Glycin-gefällten Fraktion für die erfindungsgemäße Verwendung kann beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtration der entsprechenden Niederschläge oder durch ähnliche Verfahren erfolgen.

Die Wiederauflösung der abgetrennten Niederschläge kann durch Erwärmen und Rühren in mit Citrat versetzter Salzlösung erfolgen. Im Falle der Wiederauflösung des kältegefällten Konzentrates wird es bevorzugt, eine Glycinmit Citrat versetzte Salzlösung zu verwenden und das Volumen des kältegefällten Konzentrates auf etwa ein I

Zehntel des Volumens des Originalpläsmas, aus dem das kältegefällte Konzentrat gewonnen wurde, zu erhöhen. Die Glycin-gefällte Fraktion wird vorzugsweise mit Gitrat versetzter Salzlösung durchgeführt, um das Volumen der Fraktion auf etwa ein Zwanzigstel des Plasmavolumens, dem die Glycin-gefällte Fraktion entspricht, zu erhöhen.

Ebenfalls wird bevorzugt, jede der entsprechenden wiederaufgelöBten kältegefällten Niederschlagskonzentrate und der Glycin-gefällten Fraktionen zu reinigen und durch zusätzliches Zentrifugieren und/oder Filtrieren zu klä-

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- 6 ren, um jeden unlöslichen Anteil zu entfernen.

Die vorstehende Fraktionierung eines kältegefällten Niederschlagskonzentrates des AHP durch Ausfällung mit Glycin ergibt ein AHF-Konzentrat von hoher Wirksamkeit, welches gefroren werden kann und sich bei der Lyophilisierung stabil erweist und bei üblichen Kühllagerungsbedingungen für einen Zeitraum von einem Jahr und langer aufbewahrt werden kann. Die Wirksamkeit eines in jeder Stufe vorliegenden Materials, welches durch das vor-" ßtehend geschilderte Fraktionierverfahren dargestellt wurde, kann sehr exakt bestimmt werden, so daß der verabreichende Arzt vom ersten Augenblick an genau weiß, wieviel AHF sein Patient erhält.

Da das wieder aufgelöste AHF-Konzentrat, welches durch das vorstehend genannte Fraktionierverfahren dargestellt wurde, mehr als die fünffache AHF-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens hat, kann dem Hämophilie-Kranken eine AHF-Menge verabreicht werden, die das Herz in anderer Weise verabreicht, nicht tolerieren würde. Ebenfalls hervorzuheben ist, daß die AHF-Aktivität in dem k vorstehend hergestellten Konzentrat weniger als ein Fünfzehntel der im Plasma anwesenden Proteinmenge beträgt, das die gleiche Menge an AHF-Aktivität besitzt. Dieser niedrigere Proteingehalt verringert das Risiko von allergischen Reaktionen beim Hämophiliekranken-Empfänger und reduziert die Möglichkeit der Überlastung des zirkulierenden Systems.

Ein anderes Beispiel für eine Ausführungsform, die zum Fraktionieren des kältegefällten Konzentrates des AHF gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, besteht in der Fällung mit Polyäthylenglykol. PoIyäthylenglykole sind hochmolekulare Polymere, die im

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allgemeinen durch Umsetzen von Äthylenoxyd mit Äthylenglykol oder Wasser hergestellt werden und die folgende Struktur

HO(C₂H₄O)_nG₂H₄OH

besitzen, in der η die durchschnittliche Zahl an Oxyäthylengruppen angibt. Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen die Polyäthylenglykole nicht toxisch sein und können einen Ilolekulargewichtsbereich von etwa 200 "bis etwa 20 000 besitzen.

Der "bevorzugte Molekulargewichtsbereich dieser liegt a

zwischen etwa 400 bis etwa 6000. PEG- 4000, welches ein Polyäthylenglykolprodukt mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000 ist, ist das bevorzugteste dieser Gruppe.

In der Polyäthylenglykol-Fällungsstufe wird bevorzugt 3 bis 4 Gew.-^ Polyäthylenglykol, bezogen auf das wieder aufgelöste AHF-Konzentrat unter Einbehaltung des Überstehenden, gefolgt von der Verwendung von etwa 10 Gew«-$> Polyäthylenglykol des Überstehenden unter Einbehaltung des Niederschlages, verwendet. Die letztere Ausfällung wird dann abgetrennt und in mit Citrat versetzter Salzlösung wiedergelöst.

Die Polyäthylenglykol-Fällungsstufe kann ebenso in Kombination mit der Glycin-Fällungsstufe verwendet werden. Wenn die Polyäthylenglykolfällungsstufe der Glyeinfällungsstufe vorausgeht, soll die Molarität der verwendeten Glycinlösung bei etwa 1,3 liegen.

Das AHP-Konzentrat, welches durch die aufeinanderfolgenden Ausfällungsstufen mit Glycin und Polyäthylenglykol, wie vorstehend beschrieben, erhalten worden ist, kann eingefroren werden und bleibt stabil auch bei der Lyophilisierung und bei der Aufbewahrung unter üblichen Kühllagerungsbedingungen für Zeiten von einem Jahr und

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länger. Das wiedereingesetzte AHF-Konzentrat hat dann mehr als die dreißigfache AHP-Aktivität eines gleichen Plasmavolumensj die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist weniger als in einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteine enthalten im Vergleich zu der gleichen AHP-Aktivität im Plasma.

Das kältegefällte Konzentrat des AHP, welches durch Glycinausfällung und/oder Polyäthylenglykolausfällung fraktioniert worden ist, kann zur Reinigung weiter mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt werden. Diese Reinigung kann entweder vor oder nach der Glycin- und/oder Polyäthylenglykolausfällung ausgeführt werden und kann durch Säulen- oder absatzweise Ladungsverfahren ausgeführt werden. Das nach diesem Verfahren gereinigte Konzentrat besitzt den zusätzlichen Vorteil, daß es sowohl intramuskulär wie auch intravenös verabreicht werden kann, wobei letztere Methode allgemein verwendet wird für solche AHP-Konzentrate, die nicht mit ECTEOLA-Celluloseharz behandelt worden sind. Das AHP-Konzentrat, welches mit ECTEOLA-Celluloseharz gereinigt worden ist, ist frei von Pibrogen durch Zugabe von Thrombin und durch Immuno-Elektrophorese gefunden worden.

Der hier benutzte Ausdruck "ECTEOLA-Celluloseharz" bezieht sich auf eine modifizierte Cellulose, die aktive basische Substituenten enthält, die in das Cellulosemolekül durch Reaktion mit Epichlorhydrin und Triäthanolamin eingeführt wurden. Verfahren zur Herstellung von ECTEOLA-Celluloseharzen sind allgemein von Sober und Peterson (J.Am. Chem. öoc'y., Vol. 76, Seiten 1711-12 (1956? a.a.O. Vol. 78, Seite 751-55 (1956); Vol. 78, Seiten 756-63 (1956); und Peterson und Sober, (Biochem. Preparations, Vol. 8, Seiten 43-44 (1961)) beschrieben worden.

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ECTEOLA-Celluloseharze sind im Handel erhältlich. Es wurde jedoch gefunden, daß es vorteilhaft ist, eingangs diese Harze einer Natriumhydroxyd-Behandlung und \7iederauswaschung zu unterziehen, bevor diese in der schon beschriebenen Reinigungsstufe eingesetzt werden.

In der Reinigungsstufe mit ECTEOLA-Celluloseharz wird das Harz vorzugsweise erst mit einer Chloridpufferlösung, die eine Konzentration von etwa 0,8 Gew.-$ Natriumchlorid besitzt, in das Gleichgewicht gebracht und dann in die M

Chromatographieglassäule eingefüllt. Das AHF-Konzentrat, welches gereinigt werden soll, wird zu der Säule gegeben und schließlich mit einer Chloridpufferlösung, die eine Molarität von etwa 0,5 besitzt, eluiert.

Andere Methoden zur Reinigung der AHF-Konzentrate der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet gegenwärtig sein.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung weiter. Auch ist die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele beschränkt, die lediglich zum Zwecke der Verdeutlichung und nicht zwecks Beschränkung ange- t

geben sind. Alle Teile und Prozentangaben beziehen sich auf die Gewichtsbasis, es sei denn, daß eine andere spezifische Angabe erfolgt ist.

Beispiel 1

Ein stabiles Human-AHF-Konzentrat mit hoher Y/irksarakeit wird durch die aufeinanderfolgende Fraktionierung des Humanblutplasmas hergestellt, zuerst durch Kältefällung und dann durch Glycinfällung in folgender Weise:

Reagenzien:

Mit Citrat versetzte Salzlösung:

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Ein Teil 0,1 molares Natriumeitrat auf vier Gewichtsteile 0,9$ Salz.

Glycin mit Ci brat versetzte Salzlösung: Das erforderliche Glycin wird zu der mit Citrat versetzten Salzlösung gegeben, um in Bezug auf das Glycin eine 0,1 molare Lösung zu erhalten.

Gepuffertes Waschwasser:

Zu destilliertem V/asser wird l/lOO Volumen gepufferte Citratlösung zugefügt, welche durch Einstellen 0,5 molaren Natriumcitrats mit 0,5 molarer Citronensäure auf pH 6,88 hergestellt worden ist.

Essigsäure:

Man stellt 1,0 normale und 0,1 normale wäßrige Lösungen

Glycin:

Man stellt eine 1,3 molare wäßrige Lösung her.

Arbeitsweise:

Humanblutplasma wird tiefgekühlt (^ 4⁰C) aus einem Spenderzentrum erhalten. Das Plasma wird in Pfaudlerkessel eingetaucht und auf einer Temperatur unter 4⁰C gehalten. Es wird im kontinuierlichen Fluß oder durch Einzelgefäßzentrifugierung zentrifugiert. Die erhaltene Kälteausfällung wird gesammelt und für weitere Fraktionierung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet.

Zu der Kälteausfällung wird Glycin- mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt. Die Menge beträgt ein Zehntel des Plaamavolumens, aus dem die Kälteausfällung stammt. Die Auflösung wird durch Mischen der Kälteausfällung und der Glycin- mit Citrat versetzten Salzlösung in

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einer warmen Umgebung (Raumtemperatur, aber nicht 30 G übersteigend) bewirkt.

Wenn die Kälteausfällung sich aufgelöst hat, kann diese, falls erforderlich, (in Abhängigkeit von der anwesenden Menge an roten Blutkörperchen und anwesenden denaturiertem Protein) durch weiteres Zentrifugieren und/oder Filtration geklärt werden.

Die aufgelöste Kältefällung wird dann auf pH 6,88 mit 0,1 normaler Essigsäure eingestellt. Durch geeignete ™

Mittel (beispielsweise Benutzung eines Kühlschrankes oder Verwendung eines Isopropanol-Trockeneisbades) wird die Lösung auf eine Temperatur von 6 bis 10 C abgekühlt. Zu der gekühlten Lösung wird die erforderliche Menge Glycin gegeben, um die Lösung in Bezug auf Glycin 1,2 molar zu erhalten. Die Mischung wird sanft 45 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von 2⁰C bis 1O⁰C gerührt und dann im kontinuierlichen Fluß oder gefäßweise zentrifugiert. Die sich ergebende Glycinausfällung wird gesammelt und vorsichtig gewaschen mit gepuffertem \7asser bei einer Temperatur zwischen 0 C bis 4 C.

Zu der Glycinausfällung wird mit Citrat versetzte Salzlösung zugefügt, die r.Ienge beträgt ein Zwanzigstel des Plasmavolumens, dem die Glycinausfällung entstammt. Die Auflösung wird durch Mischen der Glycinausfällung und der mit Citrat versetzten Salzlösung in einer warmen Umgebung (Raumtemperatur aber nicht 30 C übersteigend} bewirkt.

Wenn sich die Glycinausfällung aufgelöst hat, wird ec· bevorzugt,die Lösung durch Zentrifugieren und/oder Filtration unter Verwendung eines 293 mm Milliporefiltern (benutzte Llnnbrane: 1,2^-', 0,45 C" und 0,3 ^) zu klären.

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Das flüssige Blutplasmaprodukt, welches in der vorstehend geschilderten Weise durch aufeinanderfolgende Fraktionierung gewonnen worden ist, nämlich erst Kälteausfällung und dann durch Glycin-Ausfällung, besitzt eine AHF-Konzentration mit hoher Y/irksamkeit. Dieses flüssige Produkt wird dann abgepackt, tiefgekühlt (-6O⁰C) und in einem Schnellgefrierer (-20⁰C bis -30⁰C) für mindestens drei Stunden gelagert. Das gefrorene Produkt kann dann unter üblichen Kühllagerungsbedingungen (= 4⁰C, vorzugsweise -2O⁰C bis -3O⁰C) ohne Verlust seiner AHF-Aktivität für einen Zeitraum von einem Jahr und langer aufbewahrt werden. Dieses Produkt enthält, wenn es flüssig zur Verabreichung kommt, die fünffache AHP-Aktivität eines gleichen Volumens normalen Blutplasmas und es enthält nur ein Fünfzehntel der Proteinmenge, die Plasma mit dem gleichen Gehalt an AHF-Aktivität aufweist. Das in Lösung gegangene Produkt kann intravenös an Hämophiliekranke mit üblichen Transfusionsmethoden und Mitteln verabreicht werden.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt einschließlich der Stufe der Zugabe der mit Citrat versetzten Salzlösung zu der Glycin-Ausfällung. Der wiederaufgelöste Niederschlag wird auf pH 6,5 mit 1,0 normaler Essigsäure eingestellt. PoIyäthylenglykol mit dem mittleren Molekulargewicht 4000 wird der lösung in solchen Mengen zugesetzt, daß die PEG-Konzentration 3,5$ beträgt. Diese Mischung wird sanft bei Raumtemperatur 10 Minuten gerührt und 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Min, zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und auf pH 6,88 mit 1,0 normaler Natriumhydroxydlösung eingestellt. Zusätzliches PoIyäthylenglykol 4000 wird zu der Lösung zugegeben, um die endgültige PEG-Konzentration auf 10$ einzustellen. Die Mischung wird sanft bei Raumtemperatur 30 Minuten ge-

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rührt und bei 5000 Umdrehungen/Min, eine halbe Stunde zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird mit kaltem Wasser (2⁰C) gewaschen. Unter Aufwirbeln wird dann während fünf Minuten bei einer Temperatur bei -4⁰C ausgewaschen. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag in mit Citrat versetzter Salzlösung aufgelöst. Die geklärte Lösung wird unter Benutzung eines 293 mm Milliporefilters, wie im Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Dieses flüssige Endprodukt kann verschlossen eingefroren und durch Lagerung in einem Schnellgefrierer für mindestens drei Stunden gelagert Jj

werden. Danach kann es unter normalen Einfrierbedingungen für den nachfolgenden Gebrauch in der Hämophilie-Therapie aufbewahrt gehalten werden und zwar in dar Art des Endproduktes gemäß Beispiel 1.

Beispiel 3

Beispiel 2 wird wiederholt einschließlich der zusätzlichen Reinigungsstufe der AHF-Praktion mit ECTSOLA-Celluloseharz in der folgenden Weise.

Reagenzien

ECTEOLA-Celluloseharz;

1.) Man mischt 60 g Natriumhydroxyd mit 150 ml './asser. "

2.) Man läßt die Mischung abkühlen.

3.) Man gibt 60 g Cellulose (Whatman Cellulose Pulver CP 11) in einen Becher und vermischt sorgfältig mit der vorstehend genannten Natriumhydroxydlösung.

4.) Man läßt die Mischung über Nacht (12 Stunden) stehen.

5.) Am nächsten Tage wird eine Lösung von 35 ml Triäthanolamin und 60 ml Epichlorhydrin hergestellt. Man mischt gut unter einem Abzug.

6.) Man gießt diese Lösung schnell zu der vorstehend genannten Cellulose und durchmischt gut. Das Reaktionsgefäß wird aus der Zugrichtung genommen. (Die

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Reaktion ist exotherm und die Temperatur steigt au:? etwa 100 C. Das Gemisch wird braun in ein bi^ zv/ei Stunden.

7.) Man kühlt das Gemisch auf Raumtemperatur unter dem Abzug.

8.) In kleinen Anteilen gibt man 350 ml 2 molare Kochsalzlösung zu.

9.) Diese l/lischung wird durch ein grobkörnig gesintertes Glasfilter filtriert.

10.) Der Niederschlag wird zweimal mit 500 ml IN Hatriumhydroxydlöaung gewaschen. (Dies entfernt die starke Verfärbung).

11.) Man suspendiert den Niederschlag in 350 ml III Salzsäure in der Filternutsehe» Man legt Vakuum an.

12.) Man wiederho.lt Stufe 11 mit 250 ml 1 N Natriumhydroxydlösung.

13.) Man wiederholt die Stufe 11 mit 250 ml IH Salzsäure.

14.) Man wiederholt Stufe 11 mit 250 ml IN Natriumhydroxydlösung.

15.) Man füllt den Niederschlag in einen 3 Literbecher.

16.) Man fügt 250 ml IN Natriumhydroxydlösung zu und mischt.

17.) Man fügt destilliertes Wasser zu der Mischung, um den Becher zu füllen; man mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.

18.) Man dekantiert das Überstehende.

19.) Man setzt V/asser zu dem Niederschlag, um den Becher zu füllen und mischt,

20.) Man wäscht die Mischung auf dem Filter mit l/asser (vier Liter oder mehr, bis ein negativer Test für Alkali mit l^iger alkoholischer Phenolphthaleinlösung erhalten wirej).

21.) Man führt eine Schlußwaschung mit zwei 250 ml Portionen absoluten Alkohols durch.

22.) Man breitet das Produkt auf Filterpapier aus. Man

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zerdrückt und breitet das Produkt aus, um es ü"ber Nacht zu trocknen.

Chloridpuffer:

0,8^ NaCl (8 g/l)

0,02 M Imidazol (1,36 g/L)

Man stellt auf pH 6,9 mit IH Salzsäure ein.

Eluierpuffer:

0,5 M NaCl -

0,02 M Imidazol (1,36 g/L) "

Man stellt auf pH 6,9 mit IN Salzsäure ein.

Ein im Handel erhältliches ECTEOLÄ-Celluloseharz, welches erst mit NaOH behandelt worden und ausgewaschen worden ist, beispielsweise wie in der folgenden Weise, kann an Stelle des vorstehend hergestellten ECTEOLA-Celluloseharzes verwendet werden.

Auswaschungscyclus von im Handel erhältlichem ECTEOLA-Celluloseharz

1.) Man mischt 60 g handelsübliches ECTEQLA-Cellulose-

harz mit 350 ml 2ΓΙ Kochsalslösung, ä

2.)-Man filtriert dieses Gemisch durch ein grobkörniges

gesintertes Glasfilter.
3.) Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 nl IH Natriumhydroxydlösung.

4.) Man wasch¹; einmal mit 350 ml IN Salzsäure. 5.) Man wäscht einmal mit 250 ml IN liatriumhydroxydlösung.

6.) Man wäscht einmal mit 250 ml IN Salzsäure. 7.) Man wäscht einmal mit 250 ml 3N Natriumhydroxyd-

8.) Man überiührt den Niederschlag in einen 3 Liter becher, fügt 250 ml IN Hatriumhydroxydlösung zu

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mischt.

9.) Man fügt destilliertes Y/asser zu dem Gemisch, um den Becher zu füllen, mischt, deckt ab und läßt über Nacht stehen.

10.) Man dekantiert die Flüssigkeit ab, fügt 3 Liter Wasser zum Niederschlag, mischt und filtriert.

11.) Man wäscht den Niederschlag mit Wasser bis der Phenojphthaleintest negativ ist.

12.) Man wäscht den Niederschlag zweimal mit 500 ml absolutem Äthylalkohol.

13.) Man breitet den Niederschlag zur Lufttrocknung auf Filterpapier aus.

Verfahrensweise:

Wenn das Ausgangsmaterial für die Reinigung mit ECTEOLA-Celluloseharz das Kältefällungskonzentrat des AHF oder die Polyäthylenglykol-gefällte Fraktion des AHF ist, wird die AHF-Fraktion erst in Chloridpuffer aufgelöst. Wenn das Ausgangsmaterial die Glycin-gefällte Fraktion des AHF ist, wird die AHF-Fraktion erst gegen Chloridpuffer für eine Stunde dialysiert, um Glycin zu entfernen und die Jonenstärke herabzusetzen. Die Reinigung der gepufferten AHF-Fraktion durch Säulentechnik mit dem vorstehend präparierten ECTEOLA-Celluloseharz vollzieht sich wie folgt:

Tas EOTEOM-Celluloseharz wird über Nacht (12 Stunden) in. einem 5⁰C Schrank im Gemisch mit Chloridpuffer im Verhältnis 15 g Harz zu 600 ml Puffer behandelt. Der erhaltene Harzbrei wird in eine Säule mit einem Durchmesser von 2j54 cm bis 3,81 cm Durchmesser und 45,72 cm Höhe eingefüllt. Nachdem der Puffer eich bis zu dem Spiegel des Harzes abgesenkt hat, wird die AHF-Fraktion auf 2 1/2 ml pro Minute eingestellt und die Menge der AHF-Fraktion, die zu einer Einzeleäule gegeben wird, ent-

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hält 1000 bis 2500 Einheiten AHF. (Eine Einheit AHF entspricht der AHF-Aktivität in einem cm des normalen Humanblutplasmas). Nachdem das AHF in die Säule gegeben worden ist, wird das Harz mit 200 bis 500 ml Chloridpuffer ausgewaschen. Wenn der Ohloridpuffer bis zu dem Spiegel des Harzes sich abgesenkt hat, wird der Eluierpuffer in die Säule gegeben. Das Eluat wird in Zehn-ml-Portionen gesammelt und auf Protein-Fibrogen- und AHF-Aktivität geprüft.

Die Eluatteile, die die größte wirksame AHF-Aktivität f

besitzen, werden zurückbehalten und durch die Zugabe von Vfo Albumin stabilisiert. Die stabilisierte Lösung wird dann unter Benutzung eines 293 mm Milliporefilters, wie im Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Ein Silberfilter der gleichen Größe kann anstelle des Milliporefilters benutzt werden. Das endgültige flüssige Produkt wird dann verschlossen eingefroren und dann in einem Schnellgefrierer noch mindestens 3 Stunden aufbewahrt und unter gewöhnlichen Kühlbedingungen in der Art des Endproduktes gemäß Beispiel 1 aufbewahrt.

Beispiel 4 j

Beispiel 1 wird wiederholt und zwar bis zu der Arbeitsstufe ,bei der die sich ergebende Glyeinausfallung in mit Gitrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst wird. Die aufgelöste Glycinausfallung wird auf pH 6,5 durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure eingestellt. Es wird Polyäthylenglykol 4000 zugefügt bis dessen Konzentration 3,5$ beträgt. Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt und dann 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minuten zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und mit 0,1 normaler Natriumhydroxydlösung auf pH 6,88 eingestellt. Es wird zusätzliches Polyäthylenglykol 4000 zu der lösung zugefügt

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bis die Polyäthylenglykolkonzentration 10$ erreicht. Das Gemisch wird milde bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt und eine halbe Stunde bei 5000 Umdrehungen zentrifugiert. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2⁰C) gewaschen. Das Schleuderwaschen wird durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 Umdrehungen/Minute bei einer Temperatur bei -4⁰C durchgeführt. Das Überstehende wird dekantiert und der Niederschlag wird in mit Citrat versetzter Kochsalzlösung aufgelöst.

Der wiederaufgelöste Niederschlag wird durch Zugabe von 0,1 normaler Essigsäure auf pH 6,88 eingestellt und dann mit Glycin gemäß dem Arbeitsverfahren des Beispiels 1 ausgefällt, jedoch mit der Abweichung, daß die Molarität des Glycinreagenzes 1,8 beträgt. Die Glycinausfällung wird gewaschen und geklärt und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, eingefroren.

Das AHP-Konzentrat, hergestellt nach dem Verfahren dieses Beispiels, enthält weniger als 0,05$ (allgemein um etwa 0,01$) zurückgebliebenes Polyäthylenglykol, wobei jedoch das AHP-Konzentrat, welches nach der Arbeitsweise des Beispiels 2 hergestellt wird, Polyäthylenglykol in der Größenordnung von etwa 0,5$ Polyäthylenglykol enthält.

Das Endprodukt, welches durch das Verfahren nach diesem Beispiel erhalten wird ,ist substantiell löslicher als das ähnliche Produkt, welches nach dem vorstehenden Beispiel 2 erhalten wird.

Das Konzentrat, nach diesem vorliegenden Beispiel hergestellt, besitzt eine über 3Ofache AHP-Aktivität eines gleichen Plasmavolumens und die AHF-Aktivität dieses Konzentrates ist in weniger als einem Hundertstel der im Plasma anwesenden Proteinmenge anwesend und zeigt einen gleichen Zahlenwert an AHP-Aktivität.

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Verschiedene Modifikationen und Anpassungen der vorliegenden Erfindung können nach der Kenntnisnahme der vorstehenden Beschreibung und der zugehörigen Ansprüche durch einen Durchschnittsfachmann durchgeführt werden, ohne den Erfindungsgedanken und den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. Alle derartigen Variationen und Modifikationen gehören in den Bereich der Erfindung, wie diese in den folgenden Ansprüchen angegeben sind.

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Claims

- 20 Patentansprüche:

1.) Verfahren zum Herstellen eines stabilen, hochwirksamen AHP-Konzentrates, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kältefällungskonzentrat aus Human- oder Tier-AHF fraktioniert.

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fraktionierung mit einer wäßrigen Glycinlösung mit einer Molarität von etwa 1,3 Ms etwa 1,8 und nachfolgender Isolierung der Ausfällung durchführt.

3.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionierung in zwei aufeinanderfolgenden Stufen durch Ausfällung mit Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 20 erfolgt und in der ersten Stufe mit etwa 3 bis etwa 4 Gew.-fo Polyäthylenglykol, bezogen auf das Kältefällungskonzentrat des AHF,erfolgt und das erhaltene Überstehende abgetrennt wird und es dann mit 10 Gew.-Polyäthylenglykol, bezogen auf das Überstehende, versetzt wird und die sich ergebende Ausfällung abtrennt .

4.) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polyäthylenglykol mit einem Durchschnitts molekulargewicht von etwa 4000 einsetzt.

5.) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reinigungsstufe unter Verwendung von ECTEOLA-Cellulοseharz anschließt.

6.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Fraktionierung die aufeinanderfolgenden

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Unterlagen (M. 111 At». ₂ Nr. j sau 3

Pällungs- und Abtrennungsstufen gemäß Anspruch 3, die Fällungs- und Abtrennungsstufen nach Anspruch folgen läßt und die "benutzte wäßrige Glycinlösung eine Molarität von etwa 1,8 hat.

7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Polyäthylenglykol ein Durchschnittsmolekulargewicht von etwa 4000 hat.

8.) Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn- Λ

zeichnet, daß man zur Reinigung eine Behandlungsstufe mit ECTEOLA-Celluloseharz anschließt.

9.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Fällungs- und Abtrennungsstufen nach.Anspruch 2 die nachfolgenden Pällungs- und ATDtrennungsstufen nach Anspruch 3 anschließen.

10.) Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man Polyäthylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von etwa 4000 einsetzt.

11.) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, {

daß man zur Reinigung eine Behandlung mit ECTEOLA-Celluloseharz anschließt.

12.) Verwendung der nach einem oder mehreren der Verfahrensansprüche 1 "bis 11 erhaltenen stabilen hochwirksamen AHF-Konzentrate als intravenös zu verabreichendes Mittel zur Behandlung der Hämophilie bei Mensch und Tier.

13.) Verwendung der nach einem oder mehreren der Verfahr ensanaprüche 5, 8 und 11 erhaltenen stabilen hochwirksamen AHP-Konzentrate als intramuskulär 109834/1578

BAD ORIGINAL

zu verabreichendes Mittel zur Behandlung der Hämophilie bei Mensch und Tier.

14-.) Ein AHF-Konzentrat mit hoher Wirksamkeit und Stabilität, erhalten durch Fraktionierung eines kältegefällten Konzentrates von AHP.

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