DE1618848A1 - Verfahren zur Herstellung von 3-alpha,5-Cyclo-6ss,19-oxido-5alpha-androstan-17-on - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 3-alpha,5-Cyclo-6ss,19-oxido-5alpha-androstan-17-onInfo
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Description
Patentanwalt 1 6 1 8 8 A
Berlin >9, Keiserdamm 28
31. Januar 196? P.
Sankyo Company, Limited in Tokyo (Japan).
====: sssssssss:===ss==s= ssssas = = =sssrsrä;a assss=====:=:= ss=s s
Verfahren zur Herstellung von 30C*5-Cyclo-6ß,19-oxido-5a-androstan-17~on.
g
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur
Herstellung einer Steroidverbindung. Sie bezieht sich insbesondere
auf ein neues Verfahren zur Herstellung von 3<tf>5-Cyclo-6ß,19-oxido«5oC-androstan-17-on
durch Fermentation.
Das oben genannte besondere Steroid der Androstanreihe ist eine Steroidverbindung, von der bekannt ist, daß sie
nützlich ist als ein wertvolles Zwischenprodukt für die
Herstellung verschiedener 19-Norsteroide, beispielsweise
von 19-Nortestosteronderivaten mit anabolischen oder
Schwangerschafts-Aktivitäten.
Die chemische Synthese des erwähnten besonderen Androstan® wurde früher mit Erfolg aufgezeigt (französisches
Patent No. 1.353.691, erteilt für K. Tanabe et al. am
20,1„1964). Es ist jedoch sehr erwünscht, ein vorteilhafteres
Verfahren zur Herstellung des genannten Androstane zu finden* ι
Als ein Ergebnis umfangreicher Forschungen nach einer
Methode zur mikrobiologischen Herstellung des genannten Androstane wurde nun unerwarteterweise gefunden, daß verschiedene
natürliche 3eC,5-Cyclo-6ß,19-oxido-sterole mit
einer Hydrocarbyl-Seitenkette in der 17-Stellung des Steroidskeletts
in befriedigender Weise umgewandelt werden können in 3o6,5-Cyclo-6ß,19-oxido-5oO-androstan-17-on mit oxydativem
Abbau der Sterol-Seitenkette durch die Einwirkung eines
Mikroorganismus, ausgewählt aus den Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium und Arthrobacter.
Es ist daher ein Zweck der Erfindung, ein neues und vorteilhaftes Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung
von ^^»^-Cyclo-eßji^oxido-Sji-androstan-iy-on mit Hilfe eines
Mikroorganismus der Gattungen Corynebacterium oder Arthrobacter aufzuzeigen.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung.
Sie Erfindung besteht also im Wesentlichen in einem neuen Verfahren zur Herstellung von 5e6,5-Cydo-6ß,19-ox±do-5et~androstan-17-on,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Sterol der allgemeinen Formel
(D
worin R eine Hydrocarbyl-Seitenkette mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen
ist, der Einwirkung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus den Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium
und Arthrobacter, unter aeroben Bedingungen oder der Ein-
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wirkung von Enzymen, die durch diese Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen erzeugt werden, unterwirft.
Bei dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen mikrobiologischen
Verfahren schließen typische Beispiele des als Substrat zu verwendenden Sterols (I) die folgenden Sterole
ein:
6, £-Cyclo-6ß, 19-oxido-
3o6,5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5<a-sitostan und
3o£,5-Cyclo-6ß, 19-OxIdO-^oC- stigmastan.
Typische Beispiele von Mikroorganismen, die sich für
die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als nützlich erwiesen haben, schließen Mikroorganismen ein, welche
zu den folgenden gehören:
Corynebacterium equi (IAM 1038),
Corynebacterium xerosis,
Arthrobacter simplex (IAM 1660)
und
Arthrobacter ureafaciens (IAM 1658).
Diese Mikroorganismen wurden in der Literatur beschrieben,
und sie sind dem Fachmann bekannt.
Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
können die oben beschriebenen Mikroorganismen als solche inokuliert und kultiviert werden in einem geeigneten Kulturmedium,
welches das genannte Sterol (I) als Substrat enthält, unter aeroben Bedingungen. Das Verfahren kann auch
ausgeführt werden, indem man die genannten Mikroorganismen nach der Adaptation verwendet, d.h. die Kultur, in der die
genannten Mikroorganismen zuvor in einem geeigneten, das genannte Sterol (I) enthaltenden Medium entwickelt wurde,
109808/198 0 .
t. - 4 -
kann in ein geeignetes Kulturmedium, welches das genannte Sterol (I) als Substrat enthält, unter aeroben Bedingungen
eingebracht und kultiviert werden. Alternativ können die Mikroorganismen auch inokuliert und kultiviert werden in
einem geeigneten Kulturmedium, welches kein Substrat enthält, unter aeroben Bedingungen, und sukzessiv wird die aerobe
Kultur nach Hinzufügen des Substrats durchgeführt. Darüberhinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich durchgeführt
werden, indem man als einen Impfstoff die Enzyme (oder die Rohflüssigkeit davon) verwendet, die aus den
ψ wachsenden Mikroorganismen durch Zerreißen der Zellen durch
übliche Mittel gewonnen werden, beispielsweise durch eine "French Press", einen Schalloszillator, Lysozym, ein oberflächenaktives
Mittel, und dergleichen. In jedem Fall sollten bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die aeroben Bedingungen
eingehalten werden. Bas Kulturmedium kann zusammengesetzt
sein aus üblichen Bestandteilen, wie sie beim Kultivieren der oben beschriebenen Mikroorganismen allgemein verwendet
werden. Geeignete Kulturmedien enthalten eine Kohlenstoff-
. quelle, Stickstoff und erforderlichenfalls mineralische
Stoffe (anorganische Salze). Geeignete Kohlenstoffquellen
schließen ein Glucose, Sucrose, Xylose, Rohrzucker, Stärke, Glycerin und dergleichen. Geeignete Stickstoffquellen
schließen ein Getreidequellflüssigkeiten, Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl und dergleichen.
Geeignete mineralische Stoffe schließen ein Natriumchlorid, Ammoniumnitrat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Dikaliumhydrogenphosphat
und dergleichen.
Bei Ausführung der Fermentation kann irgend eines der aeroben Kulturverfahren, welches dem Fachmann geläufig ist,
109808/1980, _ 5 _
BAD ORIGINAL.
befriedigend angewendet werden, jedoch werden Schüttelkulturen,
stationäre Kulturen und Kulturen mit Belüftung bevorzugt angewendet. Das Kultivieren wird im allgemeinen bei einer
Temperatur von etwa 20 0G bis 4-0 0C, bevorzugt bei etwa
30 0C, durchgeführt.
Es ist erstrebenswert, daß der pH-Wert des Kulturmediums
innerhalb des pH-Bereiches von etwa 6,0 bis 9,0, bevorzugt bei etwa 7,0 bis 8,0, liegt. Die Fermentation wird im allgemeinen
während etwa 4· Tagen bis 8 Tagen, vorzugsweise etwa 5 bis 7 Tagen, durchgeführt. Das Substrat kann zu dem
Kulturmedium entweder in fein verteilter Form oder als eine
Lösung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Methanol, Aceton und dergleichen, hinzugefügt
werden.
Es wurde auch gefunden, daß die Hinzufügung eines
Inhibitors zum Kulturmedium bei einer Konzentration von etwa 10 ^ bis 10 y Mol die Ausbeute des gewünschten
3td,5-Cyclo-6ß,19-oxido-5oC-androstan-17-on verbessert.
Obwohl die Einzelheiten dieser Verbesserung noch nicht ganz aufgeklärt sind, nimmt man mit Sicherheit an, daß ein solcher
Inhibitor die Mikroorganismen wirksam an der weiteren Umwandlung des erhaltenen Androstane in andere unerwünschte
Verbindungen hindert. Geeignete Beispiele von Inhibitoren,
welche für diese Zwecke verwendet werden können, schließen
ein 2,2'-Bipyridin, (oCoC'-Dipyridyl), Pyrogallol, Thymol,
Thioharnstoff, NatriumdiäthyIdithiocarbamat, Äthylendiamintetraessigsäure
und die Salze davon (Dinatrium- und Tetranatriumsalze), Pentachlorphenol, Kaliumcyanid, Natriumazid
und dergleichen.
\
109001/1980
Die Isolierung des gewünschten Produktes aus der Permentationsbrühe
kann in einer für den Fachmann wohl bekannten Weise durchgeführt werden. Beispielsweise wird die Brühe
mehrmals mit Äthylacetat extrahiert, die vereinigten Extrakte werden nacheinander mit wäßrigem Natriumcarbonat und mit
Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet .und eingeengt, wobei ein öliger Rückstand verbleibt. Der
Rückstand wird durch eine Aluminiumoxydsäule mit Benzoln-Hexan
(1:1) chromatographyert, wobei man das gewünschte
Androstan erhält, das weiterhin durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie η-Hexan, gereinigt
werden kann.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Es wurde ein Kulturmedium hergestellt, welches die folgenden Bestandteile enthält:
Glucose 30
Peptone 30
Fleischextrakt 30
Das Kulturmedium wurde auf einen pH von 7»2 eingestellt
und auf dreißig 500 ml-Schüttelkolben aufgeteilt, von denen
ein jeder 100 ml des Mediums enthielt. Nach dem Sterilisieren
bei 120 0C (unter einem Druck von 15 lbs) während 15 Minuten
wurde ein Substrat von 500 mg 3*6,5-0yolo-6ß,19-oxido-
109808/1980
5a-cholestan, gelöst in 50 ml Dimethylformamid, in Portionen
von 1 ml zu jedem dieser Kolben hinzugefügt (alternativ kann das Substrat nach feiner Verteilung in einem Mörser in
Portionen zu je 10 mg den Kolben zugeteilt werden). Dann
wurde Corynebacterium equi (IAM 1038) inokuliert, und die Schüttelkultur wurde 6 Tage bei 30 0C und bei 120 Umdrehungen pro Minute ausgeführt. Am Ende dieser Zeit wurde der pH
der Fermentationsbrühe auf einen pH von 8,2 bis Q1A- eingestellt.
Nach der Inkubation wurde die Fermentationsbrühe gesammelt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten
Extrakte wurden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von etwa 500 ml eingeengt. Das erhaltene Konzentrat
wurde zweimal nacheinander mit einer 2 #igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung und mit Wasser gewaschen und nach dem
Trocknen weiterhin zu einer öligen Substanz eingeengt, die dann durch eine Alumxniumoxydsäule mit Benzol-n-Hexan (1:1)
chromatographiert wurde. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels
wurde die erhaltene kristalline Substanz aus η-Hexan umkristallisiert, wobei man 3^i»5-Cyclo-6ß,19-oxido-5eG-androstan-17-on
erhielt, das bei 137 bis 13& °C schmilzt.
Bei Anwendung von Arthrobacter ureafaciens (IAM 1658)
erhielt man in ähnlicher Weise das gewünschte Androstan.
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß ein Kulturmedium der nachstehenden
Zusammensetzung angewendet wurde, wodurch in ähnlicher Weise das gewünschte Androstan erhalten wurde:
109808/1J60 ·
BAD ORIGINAL
Getreidequellflüssigkeit 21
Ammoniumnitrat 6
Dikaliumhydrogenphosphat 1,5
Magnesiumsulfat 1,5
Wasser bis zu 3 Liter
Das oben beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 3^>5-Cyclo-6ß,19-oxido-5o6-ergostan
(-sitöstan oder stigmastan) verwendet wurde, wobei man
ähnliche Ergebnisse erhielt.
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das Kulturmedium zusätzlich 2,2'-Bipyridin
bei einer molaren Konzentration von 1,0 χ 10 bis 8 χ ΙΟ"-' enthielt, wobei man das gewünschte Androstan
in einer weiter verbesserten Ausbeute erhielt.
Das oben beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß die folgenden Inhibitoren anstelle von 2,2·-Bipyridin verwendet wurden, wobei in ähnlicher Weise
günstige Resultate erhalten wurden: Pyrogallol, Thymol, Thioharnstoff, Natriumdiäthyldithiocarbamat, Äthylendiamintetraessigsäure
(freie Säure, Dinatriumsalz oder Tetranatriumsalz), Pentachlorphenol, Kaliumcyanid oder Natriumazid.
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde wiederholt
mit der Ausnahme, daß Arthrobacter simplex (IAM 1660)
109808/198Ö., _9_
BAD ORiGiNAL
anstelle von G. equi verwendet wurde, wobei das gewünschte Androstan in ähnlicher Weise erhalten wurde.
Durch Verwendung von Arthrobacter ureafaciens erhält
man ein ähnliches Ergebnis.
ι - 10
1Ö98Ö8/14M
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von 3üO»5-C!yclo-6ß,19-oxido-5o£-androstan-17-on,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel
worin R eine Hydrocarbyl-Seitenkette mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen
ist, der Einwirkung eines Mikroorganismus, ausgewählt aus den Mikroorganismen der Gattungen
Corynebacterium und Arthrobacter, oder der Einwirkung der
Enzyme, die durch diese Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen erzeugt werden, unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt ist aus einer Gruppe
von Mikroorganismen, bestehend aus Gorynebact erium equi
(IAM 1038), Corynebacterium xerosis, Arthrobacter simplex
(IAM 1660) und Arthrobacter ureafaciens (IAM 1658).
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Verbindung ausgewählt ist aus einer Gruppe von Verbindungen, bestehend aus
3<^»5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5öC-cholestan,
3o6,5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5tf6-ergostan,
3oi,5-Cyclo-6ß, 19-oxido-5ö£-sitostan und
5-Cyclo-6ß t ^-
109808/1980 - n -
A-. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Verfahren durchgeführt wird in Gegenwart eines Inhibitors, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
2,2'-Bipyridin, Pyrogallol, Thymol, Thioharnstoff, Natriumdiäthyldithiocarbamat,
Athylendiamintetraessigsäure und den Dinatrium- und Tetranatriumsalzen davon, Kaliumcyanid und
Natriumazid.
109808/1980
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