DE1618382A1 - Verfahren zur Gewinnung von Helveticosid - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von Helvetico sid Helveticosid ist ein Herzglykosid mit der chemischen Struktur eines Strophantidin-digitox.osid., Vorstufen des Helveticosids kommen in erheblicher Menge in den Blättern von-verschiedenen Erysimumarten vor. Diese-Vorstufen, die noch weite-_ re Zucker enthalten, müssen.vor der Isolierung durch zelleigene, pilzliche oder bakterielle Enzyme in Helvgticosid überführt werden. 4jagata W., Tamm Ch., Reichstein.T., Holv. Chim, Acta 40, 41 (1957); Nagata W., Tamm Ch.. Re:#chst.ein T., Festschrift für Prof. A. Stolle S. 715, Birkhäuser Verlag Basel (1957)-7-Die Fermentation der Blätter kann unter insterilen Bedingun-0 gen bei Raumtemperatur oder-unter Zusatz-von Toluol bei 37 C durchgeführt werden. Hierbei erhält man verdünnte, dunkelbraune wäßrige Extrakte mit ei ner großen Menge von Be#gleitstoffen. Eine erste Reinigung kann man-wie bei anderen Cardenoliden durch Bleisalzfällung erreichen@ Als Ergebnis bekommt man Je- doch immer noch sehr rohe, verdünnte Lösungen,. die vor jeder weiteren Reinigung-erst eingedampft und gegebenenfalls ent-CD salzt werden müssen. Eine Extraktion mit organi-schen Lösungsmitteln ist infolge der guten Löslichkeit des Helveticosids in Wasser und der dabei auftretenden Emulsion Behr.erschwert. Die ' Feinreinigung erfolgte bisher entweder durch Gegenstron-Verteilung 2-Orszagh S. u. Bauer S*, CSSR-Pate nt 92 927,7 oder durch chromatographis.che Anreicherungsverfahren an Aluminiumoxyd 4" Nagata Y,';, Thamm Ch. Reichstr:;in T. 9 Helv. Chim. A- -t-CD c a 409 (1957)-7, oder Ionenaustauschern 7 Gmelin R., DAS 1 221 764 7- Sämtliche Verfahren waren mühsam, nur zur Bewältigung kleiner Mengen geeignet und führten zu Ausbeuten von 0,3 bis höchstens 0,4 bezogen auf das Trockengewicht der Blätter. Es wurde nun gefunden, daß man das Helveti.cosid dadurch gewinnen kann, daß man es aus verdünnten, rohen und salzhaltigen Lösungen an hydrophobe, makroporöse mit Divinylbenzol vernetzte Polystyrolharze adsorbiert, die nach-dem Verfahren der deutschen Patentschrift 1 045 102 hergestellt und unter der Bezeichnung Amberlite(D XAD-1 und*XAD-2 im Handel sind, die im Harz gebundenen Verbindungen wäscht, und durch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel in angereicherter Form desorbiert. Nach der Ablösung können die Harze wieder mit Wasser gewaschen werden und sind daher zu einem neuen Adeorptionsvorgang bereit.
• Die erfindungsgemäße Reaktion war um so überraschenderg als ci diese Harze - soweit-. bisher bekannt - nur Stoffe adsorbieren, die gewisse hydrophobe Eigenschaften., wie z.B. aromatische Gruppen, besitzen; stark hydrophile Substanzen, wie Salze, Zucker und ähnliche, jedoch nicht adeaebie.ren. Ein Glycosid' ist aber infolge seiner Zuckerkomponente weitgehend hydrophil. Der Vorteil des Verfahrens liegt daring daß man das Helveticosid aus ganz verdünnten und stark verunreinigten Lösungen quantitativ an das Harz adsorbieren, durch Waschen mit Wasser von allen Salzen., insbesondere auch von restlichen Bleiionen, befreien und dann durch Wahl eines geeigneten Wasser/lösungsmittelgemisches selektiv in konzentrierter Form eluieren kann. Nach dem Eindampfen kann das Helveticosid aus 40 %igem Methanol kristallin erhalten-werden.
• Das Helveticosid ist infolge einer Strophantin-ähnlichen Wirkung auf den Herzmuskel von großer chemotherepeutischer

  riAch jeerntete Blätter von Erysimum eräptdifolium

  urde, n -#-i Vakuum 2 Tage bei 40 0 C getrocknetg wobei.die

  nnc.. leii ersten Tag umgeschichtet wurden. Die getrock-

  v-urden in der Kuge.Imühle gemahlen und ergaben

  pulver, das sind 23 % des Frischgewichtes.

  - ail

  Jes irockenpulvern wurden in 5 Liter Wasser suspendiert

  u1.- ze-i gelegentlichem Umrühren 7 Tage bei Raumtemperatur

  Die groben RUckstände wurden durch- ein auch

  a 1),# -ebt und nach und nach zweimal mit je 2: Litern- V.asser

  2 Ta-- stehen gelassen. Die rohen, dunkelbraunen Filtrate

  wur.. -%"ere--;niglti und Verunreinigungen durch Zugabe von 500 ml

  20 --leich#-ice.t.-itlösung aUE3gefällt..- -Die Suspension. wurde durch

  ein,- ".-:,itr.-Y.lärschicht K 3 abgesaugt.

  Das- duil.-kelgelbe, n och. etwas trUbe Piltrat (8,8 L-ite.r)_wurde

  auf eine Säule gegeben (6 cm Durchmesser, Höhe 6o cm)$ die

  mit.e--*r,.,er Suspension von' 1-92 kg feuchtem Absorbens wie oben

  ben,-Ilrieben, in Wasser gefüllt--worden war. Das Harz war zuvor

  mit '.,'.3-Itl-hanol und dann mit Wasser ausgewasollen worden. Das

  Filtrat wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeitvon-150 ml/-

  Stunde durch die Säule gegeben, wobei das Helvet-icoäid##an#dem

  Ilard-. adsorbiert wurde# Nach Aufgabe des Filtrates-wurde die

  Säule mit etwa -2 -Litern Wasser nachgewaschen.. bis das Eluat.-

  praktisch,farblos geworden uar. Das Helveticottid wurdehierauf

  mit einem Gradienten Wasser/LIethanoi aus der Säule eluiert.

  Der Gradient wurde hergestellt durch Eintropfen von Methanol

  in ein mit blagnetrührer vers-ehenes, Mischgefäß 9- in. welchem

  2 Liter destilliertes Wasser vorgelegt worden waren. Fraktlo-

  nen'mit je 25 ml wurden.in einem Fraktionakollektor-aufge-

  fangen und durch Tüpfelproben auf,Papier mit dem Neäde-Rea-

  genz (1 9 395-Dinitrobenzoesäure, gelöst J:ft-einer Mischung aus-

  .50 ml Methanol und 50 ml wäßriger 2 n-Kalilauge) auf die An-,wesenheit von Ilelveticosid geprüft. Es werden zunächst stark gelb gefärbte'Fraktionen erhalten, die keine Kedde-positiven Substanzen'enthalten. Die Farbe bellt sich dann auf und nachdem etwa 5 Liter Eluat nach Anlegen des Gradienten die Säule passiert haben und der Methanolgehalt des Eluates auf fast 70 lio gestiegen ist, wurde das Ilelvetico&id als hellgelbe Lösung, in einem Vakuum zur Trockene eingeengt. Der harzige Rückstand wird in heißem, 40 %igem Methano! gelöst und nach dem Abkühlen mit wenigen Kristallen an lIelveticosid beimpft und in den KUhlsöhrank gestellt. Das lielveticosid kristallisiert in Nadeln, die noch etwas bräunlich gefärbt sind. Ausbeute 4,1 gt das sind 0,82 % des Trockengewichtes der eingesetzten Blätter. Das Produkt kann durch Umkristallisier en aus 40 %igem Methanol, eventuell unter Zusatz von etwas a-Kohle, weiter gereinigt und- entfärbt werden.
• Das Produkt ist bei der Chromatographie auf Papier und auf der Dünnachichtplatte einheitlich. Der R .-Wert bei der Dünnschichtehromatographie'an Kieselgel G J:m System n-Butanol (3) Ameisensäure (1) Wasser (4) betrug 0,5.
• Die GlykoBidspaltung mit verdünnter Schwefelsäure ergab K-Strophantidin und Digitoxosee die ehromatographisch identifiziert würden.
• Die Schmelzpunkte des Produktes-sind von dem Wassergehalt der Kri.stalle -abhängig. Ein bei Raumtemperatur über Phosphorpentöxyd. getrocknetes Produkt schmolz bei 165 bis 1660 0, ein 0 0 bei 65 C-;getrockne#tes Produkt bei 178 bis 180 C. Elementaranalyse nach Trocknung über Phosphorpentoxyd bei 65 0 C:

  - Berechnet: C 29H4209 (M.: 53496) . C 65915 11 7992 0 26993

  Gefunden: C 64956 11 803 0 27943

  Die optische Drehung betrug lrt>Z;D 22 + 35t60;--0-, in

  l#.ie'thanol.

  Beispiel- 2

  1 Liter d:es nach Beispiel- 1 hergestellten wäßrige-n Extraktes

  aus 50 g getrockneten Blättern von Erysimum erepidifolium

  wurde wie beschrieben mit etwa 60 ml 20 #'oiger Bleiacetatlö-

  sung behandelt und geklärt-4 In diese Lösung wurden-200 g

  feuchter Absorbens wie: in Beispiel 1 eingerührt und das Earz

  nach etwa 10 hliinuten-ab'gesaugt. Der Rückstand wurde-hierauf

  auf der Nutsche mit-V#.lasser,-,40- und 60 %igem-*Methanol ge-

  waschen,--bis das Fil trat nur-,noch hellgelb gefärbt ist. Die,

  bisherigen Filtrate wurden ver#worfen. Das Helveticosid wurde

  hierauf nacheinander mit-je 250 ml 80- und 90-%igem.ketha-nol

  eluiert, in dem das Harz erst angerührt und dann abgesaugt

  wurde.-Die vereinigten Filtrate wurden mit etwas.a-Kohle eut--

  färbt, filtriert und im Vakuum zür.Trockne- eingeengt. Der

  Rückstand -wurde heiß in 40 %igem klethanol gelöst. Beim Er-

  kalten )#rristallisierte'da,9 HelveticQsid euä-i, Ausbeute 450 mg',

  das sind 0,76 % des Trockengewichtes -der-Blä tter.

  Beispiel 3

  500 g getrocknete und pulverisierte Blätter von Erysimum ere--

  pidifolium wurden mit-5 Litern Wasser und'etwas Toluol ange-

  CD

  rührt und 4 Tage bei 37oC stehen gelassen. Hierauf wurden die --

  Blätter durch ein Tuch abges:Lebt, das Filtrat-aufbewahrt und

  der Rückstand mit 2 Litern Wasser#und etwas_701uo! umgerührt-

  und nochmals 2 Taa-e stehen gelassen. Die Blätter wurden abge-

  ?Z - - . -- C>

  siebt und das Filtrat mit dem vorigen#vereinigt. Dieweitere

  Aufarbeitung-erfolgt wie-in- Beispiel 1-angegeben, Nach dem

  Kristallisieren aus 40 %igem'Meth' 2 28 g Helveti-

  cosid erhalten, das sind 09,46 do'r -trocknen Blätter-,

Claims (1)

1. Patentanspruch Verfahren zur Herstellung von Helveticosid, dadurch gekenn7 zeichnet, daß man verdünnte rohe und salzhaltlige Lösungen des Helvitiaosids mit hydrophoben, makr-oporöse.n mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzen in Berührung bringt, die im Harz gebundene Verbindung wäscht und durch mit Wasser Mischbare organische Lösungsmittel in angereicherter Form desorbiert.